Дизайн, синтез и изучение связи структуры и анксиолитической активности n-ацилдипептидных аналогов холецистокинина-4
На правах рукописи
Кирьянова Екатерина Петровна Дизайн, синтез и изучение связи структуры и анксиолитической активности N-ацилдипептидных аналогов холецистокинина-4 02.00.10 – Биоорганическая химия
Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук
Москва – 2008 2
Работа выполнена в отделе химии Государственного учреждения научно исследовательского Института фармакологии имени В.В. Закусова Российской академии медицинских наук
Научный консультант: доктор биологических наук, Гудашева Татьяна Александровна
Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор, академик РАН, Мясоедов Николай Фёдорович доктор химических наук, профессор Вольпина Ольга Марковна
Ведущая организация: Научно-исследовательский Институт физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ имени М.В. Ломоносова
Защита состоится 30 сентября 2008 года. В 16 час. 00 мин. На заседании Совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском Государственном Университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, д.1, стр.40, МГУ, Лабораторный корпус “А”, аудитория
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова Автореферат разослан 20 июля 2008 года Учёный секретарь Совета, кандидат химических наук Смирнова И.Г.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы Состояние тревоги, чувство страха и паника возникают как у здоровых людей в результате эмоционального стресса, так и у больных при различных тревожно-фобических синдромах. К ним относятся невротические состояния с явлениями напряжения, беспокойства, повышенной раздражительности, а также тревожно-депрессивные состояния, нарушения сна, некоторые психосоматические заболевания (язвенная болезнь желудка и 12 ти перстной кишки) и др. Такое многообразие тревожных состояний, различающихся по своим механизмам, требует широкого набора средств для их лечения.
В настоящее время известно более 100 препаратов, способных в большей или меньшей степени снимать тревожные состояния [Воронина Т.А., Середенин С.Б., 2002]. Они относятся к классу психотропных средств и называются анксиолитиками или транквилизаторами, принадлежат к разным химическим группам и обладают различными механизмами действия. Почти половину из них составляют препараты бензодиазепинового ряда (диазепам, феназепам, клоназепам, лоразепам, оксазепам и др.), являющиеся агонистами ГАМК-бензодиазепинового рецепторного комплекса. Некоторые другие анксиолитики (буспирон, закоприд и др.) действуют через серотониновые рецепторы [Воронина Т.А., Середенин С.Б., 2002]. Для ряда анксиолитиков (мебикар, мепробамат, афобазол) механизм действия не установлен.
На сегодня наиболее широко применяемыми транквилизаторами остаются бензодиазепины, в первую очередь благодаря высокой активности. Однако данный класс анксиолитиков обладает и рядом нежелательных эффектов. Наиболее проблемными из них являются развитие привыкания и формирование зависимости. Помимо этого, бензодиазепины оказывают седативное, миорелаксирующее, снотворное, амнестическое действие. В последнее время из-за такого обширного списка побочных эффектов были введены жёсткие меры по контролю за назначением и применением транквилизаторов бензодиазепинового ряда. В результате этого число зарегистрированных в России бензодиазепинов уменьшилось более чем на 50% [Аведисова А.С., 2006]. Упомянутыми побочными эффектами обладают и некоторые транквилизаторы других классов соединений (мепробамат, оксилидин).
Таким образом, создание новых анксиолитиков, чьё противотревожное действие не будет сопровождаться нежелательными побочными действиями, актуально.
Новые анксиолитики могут быть созданы на основе нейропептидов, которые участвуют в регуляции тревожного состояния. Пожалуй, наиболее ярким из них является холецистокинин-4 (ХЦК-4), селективно взаимодействующий с ХЦК2-рецепторами. Было показано, что он оказывает выраженное анксиогенное действие на животных [Bourin M. et al., 1996] и провоцирует панические атаки у 100% пациентов с паническими расстройствами и приблизительно у 50% здоровых волонтёров [Bradwejn J. et al., 1991]. На основании этих данных учёными Великобритании, США, Испании, Италии, России было создано несколько селективных ХЦК-антагонистов, обладающих анксиолитическими свойствами [Bock M.G.
et al. 1989;
Horwell D.C., 1991;
Ballaz S. et al., 1997;
Macovec F. et al., 1999;
Ursini A. et al., 2000;
Проскурякова Т.В. и др., 2005 и другие]. Однако ни один из полученных потенциальных анксиолитиков не прошёл стадию клинических исследований, и на сегодня среди транквилизаторов отсутствуют лиганды ХЦК-рецепторов как пептидной, так и непептидной природы.
Наиболее перспективным направлением в создании новых лекарственных препаратов является конструирование пептидомиметиков на базе структур эндогенных пептидов. Этот подход позволяет использовать преимущества пептидных соединений, обеспечивая минимальную токсичность и отсутствие побочных эффектов у конструируемых потенциальных препаратов. Кроме того, использование структур, имитирующих пептиды, позволяет избежать свойственных эндогенным соединениям недостатков, таких, как ферментативная нестабильность и многофункциональность.
Целью настоящего исследования является создание на базе структуры ХЦК-4 нового эффективного потенциального анксиолитика, свободного от побочных эффектов, характерных для транквилизаторов бензодиазепинового ряда и не уступающего им по эффективности.
Задачи исследования:
1. Конструирование на базе ХЦК-4 новых пептидомиметиков с потенциально анксиолитическими свойствами и их синтез.
2. Изучение взаимосвязи структуры и активности в ряду синтезированных соединений и отбор наиболее перспективного потенциального анксиолитика.
3. Изучение биологически активной конформации синтезированных аналогов ХЦК-4.
4. Синтез ряда конформационно ограниченных соединений на базе аналогов ХЦК-4.
5. Разработка лабораторной прописи получения отобранного потенциального анксиолитика.
Научная новизна исследования В настоящей работе впервые получена оригинальная группа триптофансодержащих N ацилдипептидных аналогов ХЦК-4, обладающих анксиолитическими свойствами. Впервые показана возможность получения пептидных антагонистов ХЦК-4, целиком построенных из природных аминокислот. Эти соединения сконструированы с помощью модифицированного топохимического подхода Шемякина-Овчинникова-Иванова и представляют собой замещенные дипептиды с обратным ходом пептидной цепи по отношению к ХЦК-4 (ретро-аналоги).
Проведён конформационный анализ активных N-ацилдипептидных ретро-аналогов ХЦК-4 методом 1Н-ЯМР-спектроскопии в растворе, который показал, что предпочтительной конформацией активных соединений является -поворотная конформация типа II. На основе анализа связи структуры и функции получены данные о фармакофоре ретро-аналогов ХЦК-4. Показано, что для проявления анксиолитической активности необходимо наличие гидрофобных фенильной и индолильной групп (в ХЦК- входят в состав радикалов фенилаланина и триптофана), находящихся на расстоянии 13-ти -связей. Синтезированы активные конформационно ограниченные аналоги ХЦК-4, подтверждающие биологически активную II-поворотную конформацию дипептидных ретро-аналогов ХЦК-4.
Впервые получены пептидные агонисты ХЦК-4 на основе D-аминокислот, являющиеся его дипептидными ретро-энантио-аналогами. С помощью компьютерного конформационного анализа показано фармакофорное подобие ХЦК-4 и его ретро-энантио аналогов с анксиогенной активностью.
Научно-практическая ценность На серию N-ацилзамещённых дипептидных аналогов ХЦК-4 с анксиолитической и анксиогенной активностью получен патент Российской Федерации (№ 2227144). Наиболее активное и технологичное соединение, амид N-(6-фенилгексаноил)глицил-L-триптофана (ГБ-115), отобрано для расширенных фармакологических исследований в качестве потенциального анксиолитика. Этот дипептид находится на стадии завершения доклинических исследований. Разработана лабораторная пропись получения ГБ-115.
Апробация работы Результаты работы докладывались на 27-м Европейском пептидном симпозиуме (Сорренто, Италия, 2002), на 2-м Съезде Российского научного общества фармакологов (Москва, Россия, 2003), на 18-м Американском пептидном симпозиуме (США, 2003), на 8-й Региональной конференции Европейской коллегии нейропсихофармакологии (Москва, Россия, 2005), на 4-й Международной конференции ”Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам” (Москва, Россия, 2006), на III-м Съезде фармакологов России (Санкт-Петербург, Россия, 2007), на III-м Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Пущино, 2007).
Публикации По результатам работы опубликовано 4 статьи и 8 тезисов докладов на научных конференциях.
Структура и объём диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, списка литературы. Работа изложена на 183 страницах машинописного текста, содержит 23 таблицы, 11 схем и 64 рисунка. Библиографический указатель включает 18 отечественных и 370 иностранных источников.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Дизайн N-ацилдипептидных аналогов ХЦК-4 с анксиолитическими свойствами Из всех известных в настоящее время нейропептидов, участвующих в регуляции тревожного состояния (вещество P, холецистокинин, кортиколиберин, галанин, нейропептиды S и Y и др.), наиболее удобной основой для создания новой структуры, обладающей анксиолитическими свойствами, является тетрапептид ХЦК-4, поскольку он обладает наименьшей полифункциональностью и наименьшей длиной пептидной цепи.
Для создания аналогов ХЦК-4 с анксиолитической активностью был применен топохимический принцип, сформулированный в 1969 году Шемякиным М.М., Овчинниковым Ю.А. и Ивановым В.Т. [Shemyakin M.M. et al., 1969]. Согласно этому принципу пептид, состоящий из D-аминокислот (АК), расположенных в порядке, обратном природному, и исходный пептид из L-аминокислот могут обладать одинаковой активностью. В результате анализа этого принципа мы сделали предположение, что только обращение конфигурации всех аминокислотных остатков (АК остатков) пептида либо только изменение направления хода пептидной цепи с сохранением конфигурации АК остатков приведёт к обращению знака биологической активности (схема 1). Таким образом, в результате применения топохимического принципа к структуре ХЦК-4 (L-Trp-L-Met-L Asp-L-Phe-NH2) был сконструирован его ретро-аналог L-Phe-L-Asp-L-Met-L-Trp-NH2, структура которого легла в основу будущего нового анксиолитика.
На следующем этапе в структуре ХЦК-4 были выделены наиболее важные фармакофорные фрагменты. Известно, что при взаимодействии ХЦК-4 с рецептором ключевую роль играют остатки двух ароматических АК: триптофана и фенилаланина [Low C.M.R. et al., 2000]. Это позволяет допустить, что другие АК остатки ХЦК-4 играют роль спейсера и могут быть заменены пептидной цепью, содержащей аминокислотные остатки без боковых радикалов, такие как глицин, -аланин, -аминомасляная кислота (GABA).
ретро-энантио-изомер исходный пептид агонисты L-AK1.....L-AKn D-AKn.....D-AK направления цепи направления цепи изменение изменение Изменение конфигурации L-AKn.....L-AK1 D-AK1.....D-AKn антагонисты ретро-изомер энантио-изомер - пути перехода между аналогами с изменением знака биологического ответа Схема 1. Схематическое изображение топохимического принципа и его модификаций Далее мы предположили, что индолильный и фенильный фрагменты боковых радикалов Trp и Phe являются главными фармакофорными элементами, участвующими в гидрофобном взаимодействии с рецептором. В связи с этим мы сохранили остаток триптофана, а остаток фенилаланина заменили на фенилалканоильный радикал. Это дало право именовать конструируемую структуру «трипептоидной», поскольку к аминокилотным остаткам триптофана и Gly/-Ala/GABA добавился имитатор остатка третьей АК фенилаланина. Данная замена может позволить увеличить биологическую стабильность молекулы, так как фенилаланин относиться к основным мишеням атак химотрипсино- и термолизиноподобных пептидаз. Одновременно в структуру был введён ещё один спейсер: углеводородная цепочка фенилалканоильной группы.
В результате была сконструирована группа «трипептоидных» ретро-аналогов ХЦК-4, представляющих собой N-ацилдипептиды, с предполагаемой анксиолитической активностью (рис.1).
O O O H H L N C N NH (CH2)m (CH2)n H H 2C N H Рис. 1. Общая структура «трипептоидных» ретро-аналогов ХЦК-4 (m=1-3, n=1-5) 2. Синтез и изучение взаимосвязи структуры и активности в ряду N-ацилдипептидных ретро-аналогов ХЦК- Для выявления оптимальной структуры дипептидного ретро-аналога ХЦК-4 с анксиолитической активностью было синтезировано пятнадцать замещённых дипептидов:
I: PhCH2CO-Gly-L-Trp-NH2 IX: Ph(CH2)4CO-Gly-D-Trp-NH II: Ph(CH2)3CO-Gly-L-Trp-NH2 X: Ph(CH2)5CO-Gly-D-Trp-NH III: Ph(CH2)4CO-Gly-L-Trp-NH2 XI: Ph(CH2)3CO-Gly-L-Trp-NHCH IV: Ph(CH2)5CO-Gly-L-Trp-NH2 XII: Ph(CH2)4CO-Gly-L-Trp-NHCH V: Ph(CH2)5CO--Ala-L-Trp-NH2 XIII: Ph(CH2)4CO-Gly-L-Trp-OC2H VI: Ph(CH2)5CO-GABA-L-Trp-NH2 XIV: Ph(CH2)5CO-Gly-L-Trp-OC2H VII: Ph(CH2)5CO-Gly-L-His-NH2 XV:Ph(CH2)4CO-Gly-L-Trp-OH VIII: Ph(CH2)5CO-Gly-L-Phe-NH Синтез дипептидов был осуществлён в пять стадий (схема 2).
На первой стадии синтеза получали хлорангидриды соответствующих фенилзамещённых карбоновых кислот посредством их взаимодействия с хлористым тионилом, которые затем вводили в реакцию ацилирования глицина, -аланина или аминомасляной кислоты в условиях Шоттен-Баумана. На третьей стадии проводили этерификацию L- или D-триптофана по методу Бреннера-Хабера [Brenner M. and Huber W., 1953]. Для получения соединений VII и VIII использовали коммерчески доступные гидрохлориды эфиров L-гистидина и L-фенилаланина. Ключевую стадию – образование пептидной связи – осуществляли методом смешанных ангидридов для всех соединений, кроме VII, в случае которого эфир дипептида получали методом активированных эфиров с использованием N-оксисукцинимида. Аммонолиз/аминолиз алкиловых эфиров дипептидов осуществляли путем взаимодействия последнего с газообразным аммиаком/метиламином в метаноле. Дипептид XV со свободной карбоксильной группой получали омылением этилового эфира соответствующего дипептида 1N NaOH.
Ph-(CH2)nCOОН SOCl2, 55-60°С Ph-(CH2)nCOСl Х-Аaa-OH R1OH, SOCl2, -10°С NH(CH2)mCOOH, NaOH, 0°С Х-Аaa-OR1HCl Ph-(CH2)nCO-NH(CH2)mCO-OH i-BuOCOCl, N-этилморфолин, -10°С (для I-VI, VIII-XV) Ph-(CH2)nCO-NH(CH2)mCO-Х-Аaa-OR NH3(газ) / NHCH3(газ) CH3OН, tкомн NaOH, tкомн Ph-(CH2)nCO-NH(CH2)mCO-Х-Аaa-R Ph-(CH2)nCO-NH(CH2)mCO-Х-Аaa-OH где Ааа – аминокислотный остаток L- или D-триптофана, L-гистидина или L фенилаланина;
n: 1, 3-5;
m: 1-3;
R1: CH2CH3 или CH3;
R2: NH2 или NHCH3;
Х: L- или D - конфигурация.
Схема 2. Общая схема синтеза сконструированных дипептидов # Фармакологическая активность синтезированных дипептидов была изучена с помощью теста «приподнятый крестообразный лабиринт» (ПКЛ), который является одной из основных моделей, используемых для выявления анксиолитической (противотревожной) и анксиогенной (протревожной) активности [Pellow S. et al., 1985]. Данный тест позволяет определить эффективность действия потенциального анксиолитика или анксиогеника по, соответственно, росту или уменьшению таких показателей, как время пребывания или заходы подопытного животного в открытые рукава лабиринта.
# Фармакологические исследования были проведены в ГУ НИИ фармакологии им. В.В.
Закусова РАМН под руководством академика РАМН Середенина С.Б.;
ответственные исполнители с.н.с. к.б.н. Колик Л.Г., с.н.с. к.б.н. Константинопольский М.А.
Таблица 1. Данные фармакологического исследования «трипептоидных» аналогов ХЦК-4 в тесте ПКЛ на беспородных крысах Соединение Показатели Дозы, % заходов % времени мг/кг в/б в открытые пребывания в № Формула (n) рукава открытых рукавах 0 (10) 17,8 5, PhCH2CO-Gly I 0,1 (11) 17,0 5, -L-Trp-NH2 0,2 (11) 8,9 1,4* 0 (8) 5,4 1, Ph(CH2)3CO-Gly- 0,4 (8) 3,1 1, II 0,8 (8) 17,9* 6,9* -L-Trp-NH 1,6 (8) 22,6* 7,4* 0 (16) 14,8 4, 0,05 (8) 30,8 11, Ph(CH2)4CO-Gly III 0,1 (16) 33,9* 12,4* -L-Trp-NH2 0,2 (14) 32,5* 13,9* 0,4 (8) 15,4 2, 0 (14) 13,0 4, 0,01 (14) 27,2 10, Ph(CH2)5CO-Gly IV 0,05 (16) 34,1* 12,5* -L-Trp-NH2 0,1 (8) 42,1* 13,0* 0,2 (8) 31,0* 11,9* 0 (8) 3,1 0, Ph(CH2)5CO--Ala- 0,05 (8) 9,8 0, V 0,1 (8) 16,7 4,8* -L-Trp-NH 0,2 (8) 13,8 7,5* 0 (8) 33,5 6, Ph(CH2)5CO-GABA- 0,05 (8) 35,9 12, VI 0,1 (7) 28,9 11, -L-Trp-NH 0,5 (8) 38,4 21,1* 0 (10) 32,5 12, Ph(CH2)5CO-Gly VII 0,05 (7) 37,8 12, -L-His-NH2 0,1 (6) 46,5 20, 0 (10) 32,5 12, Ph(CH2)5CO-Gly VIII 0,05 (5) 26,1 8, -L-Phe-NH2 0,1 (7) 32,9 18, 0 (8) 26,5 10, Ph(CH2)4CO-Gly- 0,05 (8) 15,8 2, IX 0,1 (8) 18,8 3, -D-Trp-NH 0,2 (8) 8,3* 2,5* Ph(CH2)5CO-Gly- 0 (10) 29,5 2, X 0,1 (10) 4,9* 1, -D-Trp-NH 0 (8) 4,2 0, Ph(CH2)3CO-Gly- 0,8 (8) 7,0 1, XI 1,6 (8) 6,3 0, -L-Trp-NHCH 3,2 (8) 16,6 5, Ph(CH2)4CO-Gly- 0 (12) 18,4 6, XII 0,1 (10) 6,4 2, -L-Trp-NHCH 0 (16) 10,3 1, Ph(CH2)4CO-Gly XIII 0,1 (8) 15,6 5, -L-Trp-OC2H5 0,2 (8) 24,4* 6,0* 0 (14) 0 Ph(CH2)5CO-Gly- 0,05 (14) 16,2* 2,2* XIV 0,1 (14) 10,8 2, -L-Trp-OC2H 0,2 (14) 11,8 1, 0 (16) 12,9 1, Ph(CH2)4CO-Gly XV 0,1 (8) 20,4 5, -L-Trp-OH 0,2 (8) 11,8 2, 0 (8) 15,8 10, 0,05 (10) 16,6 10, –– Диазепам 0,5 (8) 18,4 11, 2,0 (10) 32,1* 22,3* Примечание: n - число животных, * р0,05, статистическая достоверность отличия от контроля по Манн-Уитни (Mann-Whitney U-тест);
в/б – внутрибрюшинное введение вещества.
Согласно данным фармакологических исследований (табл.1) на беспородных крысах в тесте ПКЛ в группе амидов триптофансодержащих дипептидов с увеличением длины фенилалканоильного заместителя (соединения II-IV) происходит увеличение анксиолитической активности. Это выражается в уменьшении величины минимально действующей (пороговой) дозы. При увеличении длины внутреннего спейсера от Gly до GABA (соединения IV-VI) происходит спад анксиолитической активности. Таким образом, наиболее эффективным оказалось соединение IV: амид N-(6-фенилгексаноил)глицил-L триптофана (пороговая доза 0,05 мг/кг). В данном соединении расстояние между предполагаемыми фармакофорными элементами, фенильной и индолильной группами, составило 13 -связей, что соответствует расстоянию между этими гидрофобными фрагментами в природном нейропептиде ХЦК-4.
Отсутствие активности у соединений VII и VIII подтверждает предположение о важной фармакофорной роли индолильного фрагмента, используемого нами при конструировании новых структур с анксиолитической активностью.
Соединения IX и X, включающие в себя остаток D-триптофана, в тесте ПКЛ проявили ярко выраженную анксиогенную активность. Обращение знака биологического эффекта при изменении конфигурации говорит о стереоспецифичности действия сконструированных дипептидов и указывает на специфическое лиганд-рецепторное взаимодействие. Также следует отметить, что соединение X, соответствующее ХЦК-4 по количеству -связей между ароматическими индолильным и фенильным фрагментами, оказалось более активным, чем соединение IX с меньшим числом -связей. Это ещё раз подтверждает предположение о необходимости наличия 13-ти -связей в синтетической молекуле линейного пептида между индолильной и фенильной группами для проявления полноценной не только анксиолитической, но и анксиогенной биологической активности.
Изучение влияния природы С-концевого замещения в «трипептоидных» аналогах ХЦК-4 на анксиолитическую активность на примере соединений XI-XV позволило выявить, что замена С-концевой амидной группы на эфирную не влияет на уровень активности. В ряду эфиров уровень активности зависит от длины спейсера так же, как и в ряду амидов.
Дипептиды с С-концевой N-метиламидной группой или свободной карбоксильной группой оказались неактивными.
Таким образом, из всех синтезированных на этом этапе дипептидов анксиолитической активностью обладали соединения II-VI, XIII и XIV, из которых наиболее активными оказались соединения IV (амид N-(6-фенилгексаноил)глицил-L-триптофана) и XIV (этиловый эфир N-(6-фенилгексаноил)глицил-L-триптофана) (пороговая доза для обоих соединений 0,05 мг/кг внутрибрюшинно). Однако, поскольку амиды являются соединениями, более устойчивыми к гидролизу и протеолизу, чем сложные эфиры, в качестве наиболее перспективного потенциального анксиолитика из группы «трипептоидных» аналогов ХЦК-4 было отобран амид IV. Необходимо отметить, что по эффективной дозе данное соединение было активнее классического бензодиазепинового транквилизатора диазепама в 40 раз (таблица 1).
3. Изучение биологически активной конформации N-ацилдипептидных ретро аналогов ХЦК- 3.1. Исследование типа поворотной конформации, ответственной за анксиолитическую активность N-ацилдипептидных аналогов ХЦК- Одним из наиболее важных шагов в изучении новых структур, обладающих фармакологической активностью, является выяснение их биологически активной конформации, то есть пространственного строения в комплексе с рецептором. Известно, что биологически активной конформацией соединений пептидной природы обычно являются поворотные структуры, например, - или -изгиб, формируемые тремя или четырьмя аминокислотными остатками, соответственно. Наиболее часто в этой роли выступает поворотная структура [Ball J.B. et al., 1993;
Gudasheva T.A. et al., 1998].
Соединение IV (амид N-(6-фенилгексаноил)глицил-L-триптофана), отобранное из группы синтезированных трипептоидных аналогов ХЦК-4 как наиболее перспективное, содержит аминокислотный остаток глицина, который, согласно литературным данным [Chou P.Y. and Fasman G.D., 1977], способствует формированию поворотной структуры молекулы. На основании этих данных было сделано предположение, что в основе биологически активной конформации сконструированных соединений находится поворотная конформация. Для проверки этого предположения было синтезировано соединение, в котором остаток глицина заменён на L-пролин: амид N-(6-фенилгексаноил)-L пролил-L-триптофана (XVI). Поскольку строение пролина ещё более, чем глицин, способствует поворотной структуре [Boussard G. and Marraud M., 1979;
Stradley S.J. et al., 1990;
Perkin J.C.S. and Thomas R.J., 1981], сохранение и тем более увеличение анксиолитической активности в новом соединении должно свидетельствовать в пользу поворотной биологически активной конформации рассматриваемых соединений.
Синтез соединения XVI осуществлён по общей схеме, описанной в пункте 2.
Результаты фармакологических исследований пролинсодержащих дипептидов в тесте ПКЛ представлены в таблице 2.
Таблица 2. Данные фармакологического исследования конформационно ограниченных аналогов соединения IV в тесте ПКЛ на беспородных крысах Соединение Показатели Дозы, % времени мг/кг % заходов пребывания в/б № Формула в открытые в открытых (n) рукава рукавах 0 (6) 25,9 10, 0,01 (8) 47,7* 30,4* Ph(CH2)5CO-L-Pro-L-Trp-NH2 0,05 (6) 42,7* 27,2* XVI 0,1 (6) 37,9 20, 0,5 (5) 40,7 20, 0 (6) 33,9 7, Ph(CH2)5CO-L-Pro-L-Trp-OC2H5 0,01 (6) 38,5 10, XVII 0,05 (7) 36,9 9, 0 (10) 25,3 6, Ph(CH2)5CO-L-Pro-L-Trp-NHCH3 0,01 (5) 35,2 12, XVIII 0,05 (7) 39,3* 24,3* O H N COOC2H (CH2)5 N 0 (6) 32,7 22, H H O 0,01 (8) 35,8 38, XIX 0,05 (8) 53,5* 56,8* N H CH3 O O N OC2H (CH2)5 N H 0 (12) 25,8 15, H O 0,01 (6) 28,2 12, XX 0,05 (8) 36,5 23, NH 0 (6) 44,6 15, 0,05 (6) 36,6 17, XXI N 0,5 (6) 32,1 17, O L-Trp-OCH O 0 (6) 44,6 15, 0,05 (6) 48,5* 51,5* XXII N OC2H NH 0,5 (6) 35,3 24, O L-Trp-OCH Примечание: n - число животных, * р0,05, статистическая достоверность отличия от контроля по Манн-Уитни (Mann-Whitney U-тест);
в/б- внутрибрюшинно.
Как показали фармакологические исследования, пролинсодержащее соединение XVI является более активным анксиолитиком, чем его глицинсодержащий прототип (минимально действующая доза для соединения IV 0,05 мг/кг, для соединения XVI – 0, мг/кг). Эти результаты свидетельствуют в пользу поворотной биологически активной конформации ретро-аналогов ХЦК-4.
Для выявления типа поворотной структуры в сконструированных «трипептоидных» аналогах ХЦК-4, обладающих анксиолитической активностью, был проведён конформационный анализ соединений IV и XVI в растворе методом 1Н-ЯМР ## спектроскопии.
Как упомянуто выше, наиболее часто в биологически активных пептидах встречается -поворотная структура, которая стабилизируется за счёт внутримолекулярной водородной связи (ВМВС) между карбонильной группой остатка (i) (в нашем случае ацильной группы) и амидным водородом остатка (i+3) (в нашем случае С-концевая амидная группа) с образо ванием 10-ти членного цикла (рис.2). Таким образом, для установления наличия -изгиба теоретически достаточно выявить наличие данной ВМВС в структуре соединения. В случае наличия -поворотной структуры (рис.2) в соединениях IV и XVI ВМВС будет образовы ваться между карбонильной группой остатка (i) и амидным водородом остатка (i+2). Для наших соединений таковым является амидный водород пептидной связи (NHTrp в табл. 3).
H H N N O O 3 2 (i+1) 2 3 (i+1) O O 2 (i+2) (i+2) N N H H HN HN N N.....
..... H H O O H H (i+3) (i+3) Ph(CH2) Ph(CH2) (i) (i) -изгиб -изгиб Рис. 2. Возможные поворотные структуры на примере дипептида IV Хорошо известно, что при переходе от растворителя ДМСО-d6, способного участвовать в образовании межмолекулярных водородных связи, к CDCl3 в спектре 1Н-ЯМР величина химического сдвига протона, участвующего в ВМВС, изменяется незначительно.
Было показано (таблица 3, выделено серым), что в соединениях IV и XVI разница химических сдвигов при смене растворителей мала для одного из протонов С-концевой амидной группы, что и доказывает участие данного протона в ВМВС. В случае соединения IV это было подтверждено также и тем, что величина не зависит ни от концентрации вещества, ни от температуры (данные не приводятся). Поскольку значение для NHTrp оказалось велико, было сделано предположение, что -поворотная структура для соединений IV и XVI скорее всего не реализуется.
## ЯМР-исследования были проведены совместно с с.н.с. к.х.н. Лезиной В.П.
Расчет по эмпирической формуле Боссарда-Маррауда [Boussard G. and Marraud M., 1985] показывает, что содержание -изгиба в соединении IV составляет 65%, а в соединении XVI – 90%.
а) Таблица 3. Значения и содержание -поворотной конформации в неполярной среде (с=0,027 М, 25°С) Значение, м.д.
% -изгиба б) Соединение своб связ NHind NHTrp NHGly NH NH амид амид IV в) 1,59 0,91 1,23 1,76 0,57 2,75 1,35 - под Arom 0,27 XVI а) Значения представляют собой разницу химических сдвигов в ДМСО-d6 и CDCl3.
б) Процентное содержание -поворотной конформации в неполярном растворителе рассчитывалось по формулам [Boussard G. and Marraud M., 1985]: % [ -изгиба] = 100 – (для соединения IV);
% [ -изгиба] = 100 – 39 (для соединения XVI).
в) Ввиду плохой растворимости соединения IV в чистом CDCl3 использовался CDCl3, содержащий 8% ДМСО-d6.
Таким образом, бльшая активность в тесте ПКЛ сопутствует пролинсодержащему соединению с бльшим вкладом -поворотной конформации. Следовательно, можно предположить, что биологически активной конформацией «трипептоидных» аналогов ХЦК 4 является -поворотная конформация.
В результате сравнительного конформационного анализа амидов, эфиров и N метиламидов глицин- и пролинсодержащих дипептидов методом 1Н-ЯМР-спектроскопии в растворе было выявлено, что дипептиды с С-концевой амидной группой (соединения IV и XVI), обладая одинаковым типом биологической активности, схожи и по своим конформационным свойствам: в обоих соединениях происходит формирование ВМВС с участием протона С-концевой амидной группы (таблица 4). В то же время конформационные свойства эфиров и N-метиламидов этих двух групп соединений сильно различаются. В неактивном пролинсодержащем эфире XVII (таблица 2), наблюдается сильная ВМВС, участвующая в формировании -изгиба, тогда как в активном глицинсодержащем эфире XIV такая ВМВС отсутствует. У всех N-метиламидов есть ВМВС, однако в биологически неактивных глицинсодержащих дипептидах XI и XII (таблица 1) она образует -изгиб с участием NH-протона триптофана пептидной связи, тогда как в биологически активном пролинсодержащем дипептиде XVIII (таблица 2) ВМВС формирует -изгиб с помощью NH-протона С-концевой N-метиламидной группы (таблица 4).
Таблица 4. Результаты конформационного исследования методом 1Н-ЯМР-спектроскопии в растворе для глицин- и пролинсодержащих дипептидов с различным С-концевым замещением Активность Тип изгиба (ДМСО-d6 - CDCl3), м.д.
Соединение NHсвобамид Trp Gly NHCH NHind № Формула NH NH NH связ NH амид Ph(CH2)5CO-Gly- 1, + 0,91 1,23 --- 1, IV L-Trp-NH2 а) 0, Ph(CH2)5CO-Gly б) + 1,64 1,88 --- --- 2, XIV L-Trp-OC2H Ph(CH2)3CO-Gly - 1,54 1,30 --- 2, XI 0,93 L-Trp-NHCH Ph(CH2)4CO-Gly - 1,52 1,29 --- 2, XII 0,92 L-Trp-NHCH Ph(CH2)5CO- под Arom + 1,35 --- --- 2, XVI 0, L-Pro-L-Trp-NH Ph(CH2)5CO-L - --- --- --- 2, XVII 0,82 Pro-L-Trp-OC2H Ph(CH2)5CO-L + 1,48 --- --- 2, XVIII 0,80 Pro-L-Trp-NHCH а) Ввиду плохой растворимости соединения IV в среде CDCl3 использовали CDCl3, содержащий 8% ДМСО-d6.
б) Возможен -изгиб, не стабилизированный ВМВС.
Таким образом, соединения с -поворотной структурой активны, а с -поворотной – неактивны. Это свидетельствует в пользу того, что -изгиб является биологически активной конформацией «трипептоидных» аналогов ХЦК-4, обладающих противотревожными свойствами.
3.2. Выявление типа -поворотной конформации, ответственной за анксиолитическую активность «трипептоидных» аналогов ХЦК- 3.2.1. Конформационный анализ в растворе методом 1Н-ЯМР-спектроскопии Следующий этап исследования заключался в установлении возможного типа -изгиба, реализуемого в биологически активной конформации. Известно 11 типов -изгибов [Ball J.B. et al., 1993], которые классифицируют согласно значениям двугранных углов и головных остатков (i+1) и (i+2) (рис.2). Среди них наиболее распространёнными являются I, II и III типы. Таким образом, для выявления типа -изгиба рассматриваемого соединения в растворе было необходимо установить значения торсионных углов для (i+1) и (i+2) аминокислотных остатков в каждом из исследуемых дипептидов. В нашем случае этими аминокислотными остатками являются остатки глицина/пролина и триптофана.
Информацию о величине торсионного угла i можно получить из значений вицинальных констант спин-спинового взаимодействия 3J(H-NC-H), используя уравнение Карплуса–Быстрова [Быстров В.Ф., 1984]:
J(H-NC-H) = 9,4cos2(60 – i) – 1,1cos(60 - i) + 0,4.
На основании этой зависимости было вычислено несколько значений угла i для каждого аминокислотного остатка соединений IV и XVI. В таблице 5 приведены значения вицинальных констант спин-спинового взаимодействия и соответствующие им рассчитанные значения торсионного угла i для обоих дипептидов как в среде ДМСО-d6, так и в среде CDCl3. В дальнейшем рассматривались данные для последнего растворителя.
Таблица 5. Вицинальные константы спин-спинового взаимодействия и соответствующие им торсионные углы i (с =0,027 М, 25°С) CDCl3 ДМСО-d X X L-Trp L-Trp Соединение 3 3 3 J J J J Х,° Trp,° Х,° Trp,° (H-NC-H) (H-NC-H) (H-NC-H) (H-NC-H) а) 99, -71 79, -86 96, -73 75, - IV 5,3 7,8 5,6 8, 21,-169 41, -154 24,-167 45, - (X=Gly) 75, -88 72, - XVI б) -60 б) - 8,1 - 8, - 45, -152 48, - (X=L-Pro) а) Ввиду плохой растворимости соединения IV в среде CDCl3 использовался CDCl3, содержащий 8% ДМСО-d6.
б) Данный угол является постоянной величиной и взят из литературных данных [Aubry A. et al., 1985].
С учётом результатов исследований Чандрасекарана [Chandrasecaran R. et al., 1973] из восьми полученных значений i оставлены четыре значения, соответствующие геометрически возможным углам. Из последних были отобраны углы, близкие к характерным для идеальных -изгибов. Таким образом, были рассмотрены следующие значения торсионных углов : для соединения IV Gly -71°, Trp -86° и 79°;
для соединения XVI Pro -60°, Trp -88° и 75°. Полученные углы соответствуют -изгибам либо типа I, либо типа II (идеальные значения углов 2= -60°, 3=-90° или 2= -60°, 3=+80°, соответственно).
Для того, чтобы сделать выбор между двумя типами -изгибов, нами изучено проявление ядерного эффекта Оверхаузера (ЯЭО) в спектрах 1Н-ЯМР. Согласно ряду исследований [Rao B.N.N. et al., 1983;
Pietrzynski G. et al., 1991], посвящённых изучению N метиламидов N-ацилзамещённых пролинсодержащих дипептидов (R-L-Pro-L-Xaa-NHCH3), наличие ЯЭО между СН (i+1) остатка и NH (i+2) остатка свидетельствует в пользу поворотной конформации типа II. Поскольку для пролинсодержащего соединения XVI в среде CDCl3 установлено проявление ЯЭО (7%) между протонами НNTrp и CHPro (рис.3), есть основания полагать, что в соединении XVI реализуется -поворотная конформация типа II. Допуская возможное применение данных исследований не только к пролинсодержащим соединениям, можно сделать вывод о возможной реализации II поворотной конформации и в глицинсодержащем соединении IV, поскольку методом 1Н ЯМР-спектроскопии для него было также выявлено проявление ЯЭО (4%) между протонами НNTrp и CHGly.
H N O (i+1) O (i+2) N H H N N ЯЭО.....H H O (i+3) Ph(CH2) (i) Рис. 3. ЯЭО в амиде XVI Таким образом, на основании результатов проведённых исследований показано, что в растворе в амидах IV и XVI скорее всего реализуется -поворотная конформация типа II.
Для более строго доказательства, что именно эта конформация и является биологически активной, нами был проведен синтез и изучены фармакологические свойства конформационно ограниченных аналогов соединения IV.
3.2.3. Синтез и фармакологические свойства конформационно ограниченных аналогов Нами был синтезирован пространственно ограниченный аналог соединения IV этиловый эфир 3R-[(фенилгексаноил)амино]-2-оксо-1-пирролидин-3-индолил-2S пропионовой кислоты (соединение XIX, таблица 2), обладающий предпочтительной II поворотной конформацией. В качестве пространственного ограничения в данном случае был использован -лактамный фрагмент [Freidenger R.M. et al., 1980], способствующий образованию -изгиба II типа.
Синтез соединения XIX, содержащего аминолактамный фрагмент, осуществлён по методу Фрейдингера [Freidenger R.M. et al., 1982] из этилового эфира N-(6 фенилгексаноил)-D-метионил-L-триптофана, полученного по общей схеме 2. С помощью иодистого метила из данного эфира дипептида была получена соль сульфония (схема 3), которую в присутствии гидрида натрия циклизовали в лактам. Так как в условиях циклизации этиловый эфир полностью гидролизуется – образующуюся кислоту этерифицировали при помощи хлористого тионила в этаноле.
S S I O O H H O O H H H MeI N N N N C H OC2H5 OC2H O (H2C)5 (H2C)5 O H H N N H H O O H 1. NaH, 0°C, ДМФА - CH2Cl2, 1:1 N C N CH OC2H (H2C) O H 2. SOCl2, C2H5OH N H Схема 3. Схема синтеза -лактамного аналога XIX В результате фармакологических исследований в тесте ПКЛ для данного соединения была выявлена анксиолитическая активность, по действующим дозам не уступающая исходному амиду N-(6-фенилгексаноил)глицил-L-триптофана IV (минимально действующая доза для соединения XIX составила 0,05 мг/кг в/б, таблица 2). Полученные результаты свидетельствуют в пользу того, что для рассматриваемой группы «трипептоидов» биологически активной конформацией, обеспечивающей анксиолитические свойства, является -поворотная конформация типа II.
В качестве следующего пространственно-ограниченного аналога был синтезирован N (метил)-замещённый дипептид: этиловый эфир N-(6-фенилгексаноил)глицил-N(метил) L-триптофана (соединение XX, таблица 2). Как известно, N-метилзамещение не способствует образованию II-поворотной конформации у пептидов. Синтез соединения XX осуществляли по общей схеме 2. По результатам фармакологических исследований в тесте ПКЛ для данного соединения не было выявлено анксиолитической активности (таблица 2). Этот результат также свидетельствует в пользу сделанного нами вывода о биологически активной II-поворотной конформации трипептоидных аналогов ХЦК-4.
Кроме того, рассмотрены пространственно-ограниченные соединения, имеющие структуру более жесткую, чем -лактам. В качестве шаблона был взят дибензоазепиновый каркас, и на его основе были получены метиловый эфир 2-(10,11-дигидро-5Н дибензо[b,f]азепин-5-илкарбониламино)-3S-(1Н-индол-3-ил)-пропионовой кислоты (соединение XXI) и метиловый эфир 2-(3-этоксикарбониламино-10,11-дигидро-5Н дибензо[b,f]азепин-5-илкарбониламино)-3S-(1Н-индол-3-ил)-пропионовой кислоты (соединение XXII) (таблица 2). Оба дибензоазепиновых аналога синтезировали путем ацилирования метилового эфира L-триптофана соответствующим N-хлоркарбонил дибензоазепиновым производным в ДМФА.
Фармакологические исследования в тесте ПКЛ показали наличие анксиолитической активности у соединения XXII в дозах, сравнимых с таковыми для наиболее активных «трипептоидных» аналогов ХЦК-4, тогда как соединение XXI оказалось неактивным (таблица 2). Различие в активности между двумя дибензоазепиновыми аналогами предположительно можно объяснить наличием у активного соединения XXII бокового заместителя в положении С-3 дибензоазепинового кольца. По-видимому, именно сложноэфирный этильный радикал имитирует фенильную группу при взаимодействии вещества с рецептором, поскольку в данном случае предполагаемый имитатор фенильного кольца расположен от индолильной группы примерно на том же расстоянии, что и в ХЦК-4, и в соединении IV. В пользу этого предположения говорят результаты наложения структур XXII и IV в моделях Дрейдинга (рис.4).
N OH HO NN O N O O N N O O OH N N Рис. 4. Наложение молекул XXII и IV (жирные линии) в моделях Дрейдинга Рассмотренное наложение описывает трехмерную структуру молекул, находящихся в ненапряжённом состоянии. В модели структура соединения IV была закреплена в II поворотной конформации. Полученное успешное совмещение основных фармакофорных элементов и пептидной цепи соединения IV с элементами соединения XXII явилось дополнительным доказательством того, что именно II-поворотная конформация является биологически активной конформацией N-ацилзамещённых дипептидных аналогов ХЦК-4.
3.3. Фармакофорное подобие тетрапептида ХЦК-4 и его «трипептоидного» ретро энантио-аналога В п.2 описан синтез и результаты фармакологических исследований ретро-энантио аналога ХЦК-4 амида N-(6-фенилгексаноил)глицил-D-триптофана (соединение X, энантиомер соединения IV). Исследования в тесте ПКЛ выявили наличие у него анксиогенной активности, аналогичной активности ХЦК-4. Это, а так же высокая фармакологическая активность соединения X (активная доза 0,1 мг/кг в/б), позволяет предположить наличие общего с ХЦК-4 фармакофора, ответственного за анксиогенную активность. В силу отсутствия доступных нам данных о трёхмерной структуре ХЦК2 рецептора, с которым взаимодействует ХЦК-4, был применён подход, заключающийся в компьютерном наложении молекулы соединения X на молекулу ХЦК-4 в биологически активной конформации, описанной в работе [Foucaud M. et al., 2006] и любезно предоставленной для нашего исследования лабораторией Доктора Д.Фурми (Dr. D.Fourmy, Франция). Расчёты проведены с использованием программного комплекса SYBYL 7.1 на кафедре органической химии Химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова (зав.
кафедрой акад. Зефиров Н.С.) совместно со с.н.с. к.х.н. Баскиным И.И. и в.н.с. к.х.н.
Палюлиным В.А.
При поиске возможной биологически активной конформации соединения X использован ряд пространственных ограничений: использование торсионных углов, характерных для II’-изгиба (энантиомерный аналог II-изгиба) и фиксация индолильной и фенильной групп соединения X друг относительно друга аналогично их расположению в биологически активной конформации ХЦК-4. Из пяти возможных конформаций, полученных в результате компьютерного расчёта, была отобрана оптимальная, сочетающая минимальное значение свободной энергии и максимально возможное наложение индолильного и фенильного фрагментов двух молекул (рис.5).
Рис. 5. Изображение наложения отобранной конформации соединения X и ХЦК- При сравнении полученной конформации активного трипептоидного аналога ХЦК-4 X с конформацией ХЦК-4 выявлено совпадение общих черт структурного скелета (рис.5).
Помимо хорошего наложения основных фармакофорных элементов, индолильного и фенильного, наблюдается совпадение векторов С(О)-группы боковой цепи Asp у ХЦК-4 и С(О)-фрагмента фенилгексаноильной группы (рис.5, стрелки), что позволяет сделать вывод о возможной роли данного фрагмента в качестве имитатора С(О)-группы боковой цепи Asp. Полученные данные содержат информацию о пространственном расположении всех фармакофорных групп и могут служить основой для создания новых конформационно жестких аналогов ХЦК-4.
На основании полученных результатов можно предположить, что выявленная конформация соединения X (рис. 5) является биологически активной конформацией для всех сконструированных дипептидных аналогов ХЦК-4, обладающих анксиогенной активностью, и характеризуется следующим:
- биологически активная конформация ретро-энантио-аналогов ХЦК-4 с анксиогенной активностью является II’-поворотной;
- взаимное пространственное расположение фенильной и индолильной групп аналогично таковому в ХЦК-4, расстояние между их центрами по прямой равно 13,7.
4. N-ацилдипептидный ретро-аналог холецистокинина-4 ГБ-115 – перспективный селективный анксиолитик 4.1. Фармакологический профиль В результате расширенных фармакологических исследований ретро-аналога ХЦК- амида N-(6-фенилгексаноил)-глицил-L-триптофана (соединение IV, получившее шифр ГБ 115), проведённых в ГУ НИИ фармакологии им. В.В.Закусова РАМН, было показано, что в зависимости от вида и линии животных диапазон действующих доз составлял 0,0025-0, мг/кг внутрибрюшинно. Эффекты дипептида ГБ-115 сохранялись и при пероральном применении (0,1-0,2 мг/кг).
Помимо этого было установлено, что ГБ-115 не оказывает миорелаксирующего эффекта в диапазоне анксиолитических доз и не влияет на когнитивные процессы, что положительно характеризует данное соединение по сравнению с бензодиазепиновыми транквилизаторами. Также было выявлено отсутствие у данного соединения психостимулирующих свойств. Было показано, что ГБ-115 является практически нетоксичным (LD50 5 г перорально).
4.2. Оптимизация синтеза ГБ- Необходимым этапом создания лекарственного препарата является разработка промышленного метода синтеза субстанции, которая начинается с создания лабораторной прописи. В ходе этой работы были отобраны наиболее простые, эффективные и экономически выгодные методы на каждой стадии: 1) получение хлорангидрида фенилгексановой кислоты с помощью хлористого тионила;
2) ацилирование глицина полученным хлорангидридом в условиях Шоттен-Баумана в присутствии NaOH;
3) этерификация L-триптофана в присутствии хлористого тионила при комнатной температуре;
4) образование пептидной связи (синтез этилового эфира N-(6 фенилгексаноил)глицил-L-триптофана);
5) аммонолиз полученного сложного эфира.
Ключевой стадией синтеза ГБ-115 является образование пептидной связи. Было проведено сравнение различных методов конденсации (таблица 6):
- метод смешанных ангидридов (с изобутилхлорформиатом);
- метод активированных эфиров (с использованием N-оксисукцинимида и ДЦГК в качестве конденсирующего агента);
- карбодиимидный метод (в вариации «ДЦГК – ОБТ-метод» с использованием 1 оксибензотриазола).
Было изучено влияние растворителей (ДМФА, этилацетат и хлористый метилен) на выход продукта в случае метода смешанных ангидридов. Максимальный выход (57%) показан в методе с использованием ДМФА в качестве растворителя на стадии активации (таблица 6).
Последним усовершенствованием выбранной методики была замена многостадийной очистки продукта конденсации обработкой реакционной смеси холодной водой, что приводило к кристаллизации продукта и позволило существенно увеличить общий выход реакции. Полученное вещество без дополнительной очистки вводили в реакцию аммонолиза.
Таблица 6. Результаты оптимизации способа получения этилового эфира N-(6 фенилгексаноил)глицил-L-триптофана Метод []D20, € а) Выход, Растворитель Tпл., С пептидного (с 2, ДМФА) синтеза % ДМФА 57 +5,0 масло Этилацетат/ДМФА 52 +5,1 масло метод смешанных CH2Cl2/ ДМФА 31 +5,0 масло ангидридов б) 81 +5,0 50-53 ДМФА метод ТГФ/ДМФА 33 +5,1 масло активированных эфиров карбодиимидный Этилацетат 46 +5,0 масло метод а) Повышение стоимости реагентов по сравнению с оптимальным способом синтеза, в расчёте на 1 моль продукта (в евро, €).
б) Вариант метода смешанных ангидридов с последующим выливанием в холодную воду.
Амид N-(6-фенилгексаноил)глицил-L-триптофана получали аммонолизом этилового эфира N-(6-фенилгексаноил)глицил-L-триптофана в метаноле, насыщенном аммиаком с последующей перекристаллизацией из этанола. Общий выход по всем стадиям составил 34% (см. схему 4).
SOCl2, 55-60°C (94%) 1) Ph(CH2)5COOH Ph(CH2)5COCl 1. Ph(CH2)5COCl, NaOH, 0°C (69%) Ph(CH2)5CO-Gly-OH Gly-ONa 2) 2. HCl C2H5OH, SOCl2, -10°C (85%) L-Trp-OC2H5 HCl 3) L-Trp-OH 1. iBu- х ло рф о р ми а т, N-э т илмо рф о ли н, -10-15°C, Д М Ф А 4) Ph(CH2)5CO-Gly-OH 2. L-Trp-OC2H5 HCl, N-эт илморф о ли н, -5-10°C, Д М Ф А (81%) Ph(CH2)5CO-Gly-L-Trp-OC2H NH3(газ ) / CH3OH, t к o мн.
5) Ph(CH2)5CO-Gly-L-Trp-OC2H (71%) Ph(CH2)5CO-Gly-L-Trp-NH Схема 4. Оптимизированная схема синтеза ГБ- Таким образом, нами была разработана лабораторная пропись синтеза амида N-(6 фенилгексаноил)-глицил-L-триптофана (ГБ-115), пригодная для наработки субстанции перспективного лекарственного препарата.
ВЫВОДЫ 1. Разработан подход к дизайну пептидных антагонистов пептидных рецепторов, являющийся развитием топохимического принципа.
2. Сконструирована и синтезирована новая группа N-ацилдипептидных триптофансодержащих аналогов холецистокинина-4 с анкиолитической или анксиогенной активностью.
3. Изучена связь структуры и активности в ряду полученных аналогов холецистокинина. Показано, что соединения на основе D-триптофана обладают анксиогенной, а соединения на основе L-триптофана – анксиолитической активностью.
Показано, что основными фармакофорными элементами являются фенильное и индольное ароматические ядра. Выявлена зависимость активности от расстояния между ароматическими фармакофорами: оптимальным является расстояние в 13 -связей, равное таковому между этими фармакофорами в природном ХЦК-4.
4. С помощью 1Н-ЯМР-спектроскопии изучена зависимость активности от предпочтительной конформации N-ацилдипептидного аналога в растворе. Аналоги с предпочтительной -поворотной структурой активны, соединения с -поворотной структурой неактивны.
5. С использованием конформационно ограниченных соединений показано, что наиболее вероятно биологически активной конформацией N-ацилдипептидных ретро аналогов ХЦК-4 является -поворотная структура II-го типа.
6. С использованием компьютерного моделирования показано фармакофорное подобие дипептидных аналогов с анксиогенной активностью и природного ХЦК-4.
7. Наиболее активный N-ацилдипептидный аналог ХЦК-4, амид N-(6 фенилгексаноил)глицил-L-триптофана (ГБ-115), отобран в качестве перспективного селективного анксиолитика и в настоящее время находится на завершающей стадии доклинических исследований.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Philippova E. (Kir’yanova), Gudasheva T., Briling V., Konstantinopolskiy M., Kolik L., Seredenin S. Design of novel dipeptides with anxiolytic activity on the base of CCK-4. // Journal of peptide science. 2002. V. 8. Suppl. To V. 8. S209.
2. Gudasheva T.A., Philippova E.P. (Kir’yanova), Briling V.K., Konstantinopolskiy M.A., Kolik L.G., Seredenin S.B. Design of novel dipeptides with anxiolytic activity on the base of CCK-4. // Peptides 2002 (Proceedings of the 27EPS). Р. 508 – 509.
3. Gudasheva T.A., Philippova E.P. (Kir’yanova), Kolik L.G., Seredenin S.B. GB-115 – orally active dipeptide CCK-4 analog with anxiolytic activity. // Program and abstracts of 18th American Peptide Symposium. 2003. Р. 393.
4. Гудашева Т.А., Филиппова Е.П. (Кирьянова), Колик Л.Г., Середенин С.Б. Дизайн дипептидов с потенциальной анксиолитической активностью и анализ взаимосвязи «структура активность». // Фундаментальные проблемы фармакологии. Сборник тезисов 2-го Съезда Российского научного общества фармакологов. Москва. 2003. Ч. I. С. 148.
5. Kir’yanova E.P., Kolik L.G., Gudasheva T.A. Biologically active conformation of сholecystokinin-4 retropeptide analogues with anxiolytic activity. // European neuropsychopharmacology. 2005. V. 15 (S2). Р. 152.
6. Гудашева Т.А., Лезина В.П., Кирьянова Е.П., Троицкая В.С., Колик Л.Г., Середенин С.Б.
Синтез, анксиолитическая активность и конформационный анализ ретропептидных аналогов холецистокинина-4. // Химико-фармацевтический журнал. 2006. Т. 40. №7. С. 21 – 26.
7. Кирьянова Е.П., Колик Л.Г., Гудашева Т.А. Пространственно-ограниченные аналоги селективного анксиолитика ГБ-115 и его предполагаемая биологически активная конформация. // Материалы 4-й Международной конференции “Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам”. Москва. 2006. С. 38.
8. Гудашева Т.А., Кирьянова Е.П., Колик Л.Г., Константинопольский М.А., Середенин С.Б.
Дизайн и синтез дипептидных аналогов холецистокинина-4 с анксиолитической и анксиогенной активностью. // Биоорганическая химия. 2007. Т. 33. № 4. С. 413 – 420.
9. Гудашева Т.А., Кирьянова Е.П., Колик Л.Г., Середенин С.Б. Создание дипептидного анксиолитика ГБ-115, свободного от побочных эффектов. // Тезисы докладов III Российского симпозиума “Белки и пептиды”. Пущино. 2007. С. 65.
10. Кирьянова Е.П., Лезина В.П., Колик Л.Г., Константинопольский М.А., Никитин С.В., Гудашева Т.А. Биологически активная конформация селективного анксиолитика ГБ-115 дипептидного ретроаналога холецистокинина-4. // Психофармакология и биологическая наркология (Материалы III-го Съезда фармакологов России). 2007. Т. 7 специальный выпуск.
Ч. 1. С. 1723.
11. Вичужанина Е.В., Кирьянова Е.П., Колик Л.Г., Гудашева Т.А. Дибензоазепиновые аналоги холецистокинина-4 с анксиолитической активностью. // Психофармакология и биологическая наркология (Материалы III-го Съезда фармакологов России). 2007. Т. 7 специальный выпуск.
Ч. 1. С. 1640.
12. Бойко С.С., Колыванов Г.Б., Жердев В.П., Гудашева Т.А., Кирьянова Е.П., Середенин С.Б.
Фармакокинетика у крыс нового триптофансодержащего дипептида ГБ-115 со свойствами селективного анксиолитика. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2007. Т.
144. № 9. С. 285 – 288.