Новые методы n-мерной планарной хроматографии
На правах рукописи
ХРЕБТОВА СВЕТЛАНА СЕРГЕЕВНА НОВЫЕ МЕТОДЫ n-МЕРНОЙ ПЛАНАРНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ Специальность 02.00.02 – Аналитическая химия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
Москва – 2011
Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Ордена Трудового Красного знамени Институте нефтехимического синтеза имени А.В.Топчиева РАН
Научный консультант:
доктор химических наук, профессор Березкин Виктор Григорьевич
Официальные оппоненты:
доктор химических наук Красиков Валерий Дмитриевич Учреждение Российской академии наук Институт высокомолекулярных соединений РАН, г. Санкт-Петербург кандидат химических наук, доцент Смоленков Александр Дмитриевич Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова, Химический факультет, г. Москва
Ведущая организация:
Химический факультет Санкт-Петербургского государственного университета, г. Санкт-Петербург
Защита состоится 12 октября 2011 года в 15 часов 00 минут в аудитории 446 на заседании диссертационного совета Д 501.001.88 при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, ГСП-1, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 3, Химический факультет.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.
Автореферат разослан сентября 2011 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук И.И. Торочешникова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы Метод тонкослойной хроматографии (ТСХ), открытый в 1938г Н.А.Измайловым и М.С.Шрайбер, является современным, простым и достаточно эффективным методом жидкостной хроматографии в аналитической практике. ТСХ активно и успешно используют в научных исследованиях, медицине, фармацее, контроле окружающей среды и промышленности. В России этот метод используют более, чем в лабораторий, однако за рубежом ТСХ применяют более широко. Так, например, Британская фармакопея 2009 года содержит ~2000 методик, в которых ТСХ используют для анализа фармпрепаратов, а ХII Государственная фармакопея РФ, к сожалению, содержит не более 10 аналитических методик с применением ТСХ. Широкое распространение ТСХ во всем мире обусловлено следующими преимуществами метода: простотой, высокой селективностью, удовлетворительной экспрессностью и высокой экономичностью.
Впервые Консденом, Гордоном и Мартином в 1944г был реализован метод двумерной (2D) хроматографии на бумаге – первый метод n-мерной планарной хроматографии. В 1951г Кирхнер и сотр. реализовали двумерный вариант в тонком слое, позволяющий на одной пластинке разделять принципиально большее число компонентов. Проведенная нами наукометрическая оценка современного состояния планарной хроматографии показала, что простейший вариант n-мерной ТСХ является в настоящее время одним из наиболее часто используемых методов. Интересно отметить, что в период 1980-1990 гг, так же, как и в период 2000-2010 гг доля публикаций по использованию в ТСХ 2D варианта составила 11%. Разрешающая способность 2D-ТСХ ограничена тем, что, во-первых, для разделения используют только две подвижные фазы и, во-вторых, эти две фазы используют для разделения всех компонентов разделяемой смеси. Поэтому актуальной задачей являлось развитие методов, в которых практически в одном аналитическом эксперименте используют различные селективные подвижные фазы, т.е. развитие методов -4 многомерной ТСХ. Это позволит существенно улучшить разделение компонентов смеси и, следовательно, расширить практическое применение метода.
Поскольку результат разделения в ТСХ определяется не только используемым методом, но и условиями его реализации (и, в первую очередь, используемой хроматографической камерой), представлялось необходимым уделить большее внимание изучению и оценке основных, используемых в ТСХ камер, обращая особое внимание на обоснование выбора наиболее оптимальной камеры, поскольку изучению этой важной области ТСХ уделялось недостаточное внимание, а в литературе отсутствовали данные, позволяющие сделать обоснованный выбор.
Цель работы: разработать новые, простые варианты n-мерной планарной хроматографии, характеризующиеся повышенной разрешающей способностью и экспрессностью.
Для достижения поставленной цели необходимо было выполнить следующие исследования:
• для объективного обоснования основных направлений работы следовало провести наукометрическую оценку современного состояния ТСХ;
• выявить особенности реализации хроматографических процессов в современных, наиболее часто используемых камерах для ТСХ, провести их сравнение с целью выбора оптимальной и при необходимости разработать новые, более оптимальные;
• изучить особенности механизма разделения в варианте ТСХ с контр пластинкой и предложить новые способы его реализации;
• показать аналитические возможности предложенного варианта ТСХ на практических примерах.
Научная новизна Проведенное наукометрическое исследование за период 1980-2010гг позволило выявить основные тенденции ее развития. Результаты наукометрического исследования показали, что в настоящее время метод -5 двумерной ТСХ активно и успешно используется, что свидетельствует о целесообразности дальнейшего развития n-мерной ТСХ, было показано, что в качестве адсорбента в ТСХ наиболее часто используют силикагель, разделение выполняют в N- (75%) и S-камерах (12%), выявлены 10 наиболее часто используемых подвижных фаз.
Предложен новый подход к развитию n-мерной ТСХ, в котором хроматограмму, полученную после первичного разделения разрезают на n пластинок, каждая из которых содержит группы частично разделенных соединений, далее каждую «дочернюю» пластинку проявляют, используя наиболее селективную для разделения содержащейся на ней группы частично или плохо разделенных соединений подвижную фазу. Реализованы варианты 3 х, 4-х и 5-ти-мерной ТСХ (возможно также реализовать n-мерную ТСХ с бльшим значением n), характеризующиеся высокой разрешающей способностью и экспрессностью, так как каждое разделение, следующее после первичного, возможно выполнять одновременно и независимо. На новый вариант ТСХ получено решение Роспатента о выдаче патента РФ на «Способ многомерной тонкослойной хроматографии».
Проведено исследование особенностей проведения разделения на пластинках ТСХ в наиболее распространенных камерах (N-,Smin-, 0-камерах).
Показано, что для получения воспроизводимых результатов при использовании N-камеры необходимо предварительно насыщать парами подвижной фазы атмосферу камеры и сорбционный слой пластинки ТСХ. Изучена зависимость результатов хроматографического разделения от степени предварительного насыщения слоя сорбента пластинки ТСХ парами подвижной фазы для наиболее часто используемых подвижных фаз при выполнении анализа в N камере;
так, например, для насыщения сорбционного слоя пластинки парами этилацетата достаточно 5 мин, а парами этанола – 50 мин.
При исследовании результатов разделения, полученных при использовании 0-камеры, показано, что хроматографические характеристики существенно зависят от толщины и типа прокладки, используемой для -6 отделения слоя сорбента от стеклянной стенки камеры. Отметим также, что данная камера, хотя и обладает определенными преимуществами, является более сложной в использовании, чем, например, N- или S-камеры.
В результате систематического изучения характеристик хроматографического разделения, полученных в S-камере с различными параметрами, предложен новый вариант Smin-камеры, отличительной особенностью которого является минимальное расстояние (d) между слоем сорбента на пластинке и стенкой камеры (d=0.1-0.2 мм). Это позволило существенно улучшить хроматографические характеристики метода ТСХ (продолжительность разделения сокращается на 25-30%, эффективность увеличивается на 20%). На конструкцию новой камеры получено решение Роспатента о выдаче патента РФ на «Сэндвич камера малого объема для тонкослойной хроматографии».
Изучены основные особенности хроматографических процессов в варианте ТСХ с контр-пластинкой и предложены новые варианты его реализации, позволяющие повысить разрешающую способность метода ТСХ, а также повысить его эффективность.
Практическая значимость проведенных исследований.
1. Новые варианты n-мерной хроматографии, в которых все разделения, реализуемые после первого, возможно выполнять одновременно и независимо, используя различные селективные подвижные фазы, позволили выполнять многомерное разделение, аналогичное по продолжительности проведению двумерного, и существенно улучшить результаты разделения.
2. Применение запатентованной конструкции предложенной в работе Smin камеры совместно с ФГУП ГосНИИгенетика к анализу смесей внутриклеточного пула рибонуклеозидов и рибонуклеотидов позволило значительно сократить продолжительность анализа (~30%), так как данная камера позволяет выполнять воспроизводимое разделение без предварительного насыщения, и улучшить эффективность разделения (~20%) по сравнению с традиционной N-камерой. Разработана новая элюирующая -7 система для определения внутриклеточного пула рибонуклеозидов и рибонуклеотидов, в которой токсичный раствор аммиака заменен на раствор карбоната натрия, без снижения селективности разделения.
3. Разработанный метод многомерной ТСХ при реализации в Smin-камере был применен для разделения смесей красителей, пигментов красителей и смолы пиролиза бензина, содержащей полиароматические углеводороды.
Апробация работы и публикации.
Основные результаты работы были изложены в 12 статьях в ведущих российских и зарубежных журналах и 2-х патентах РФ на изобретения, а также доложены и обсуждены на следующих международных и отечественных конференциях: Научной конференции ИНХС РАН, посвященной 75-летию Института (Москва, 2009), Всероссийской конференции «Теория и практика хроматографии. Хроматография и нанотехнологии» (Самара, 2009), 5th Conference on Separation and Related Techniques by Nordic Separation Science Society (Tallinn, Estonia, 2009), I Всероссийской конференции "Современные методы химико-аналитической фармацевтической продукции" (Москва, 2009), Съезде аналитиков России (Москва, 2010), I Всероссийской конференции «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез» (Краснодар, 2010), Conference “Interfacial phenomenon yesterday, today and tomorrow” (Lublin, Poland, 2010), International Symposium for High-Performance Thin-Layer Chromatography (Basel, Switzerland, 2011);
а также сделан доклад на семинаре во время стажировки (01.03.2011-29.03.2011) в Институте химии Университета Яна Кохановского в Кельцах (Польша).
Вклад автора Все проведенные экспериментальные исследования выполнены лично автором. Диссертантка принимала активное участие в интерпретации полученных результатов, написании статей, разработке патентов, подготовке докладов на конференциях и симпозиумах.
Положения, выносимые на защиту.
1. Обоснование актуальности темы диссертации;
-8 2. Новые более эффективные и экспрессные методы n-мерной планарной хроматографии;
3. Особенности хроматографического разделения в основных типах хроматографических камер и новом варианте Smin-камеры, характеризующимся минимальным расстоянием между стенкой камеры и слоем сорбента пластинки;
4. Сравнительная оценка основных типов камер в ТСХ: N-камеры, S камеры и 0-камеры;
5. Особенности процесса хроматографического разделения в варианте ТСХ с контр-пластинкой и новые методы его реализации.
Объем и структура работы. Диссертационная работа объемом страницы машинописного текста состоит из общей характеристики работы, глав, выводов, 2 приложений, содержит 50 рисунков, 38 таблиц и списка литературы из 164 наименований.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1 глава. Основные тенденции развития планарной хроматографии содержит данные наукометрического исследования по изменению основных характеристик планарной хроматографии за последние 30 лет, что позволило выявить основные тенденции ее развития. Основное внимание было уделено рассмотрению следующих наиболее важных характеристик ТСХ: методы хроматографии, тип хроматографической камеры, способ проявления пластинки, предварительная подготовка камеры и пластинки к процессу хроматографического разделения, способы нанесения анализируемых проб на пластинку, подвижные и неподвижные фазы, и т.п. Полученные данные подтверждают актуальность темы диссертационной работы.
2 глава. Развитие n-мерной ТСХ. Новые методы ТСХ с повышенной разрешающей способностью включает обзор литературы по тематике многомерной планарной хроматографии, современное определение n-мерной ТСХ, обсуждение существующих вариантов двумерной хроматографии, теоретические основы метода, а также его практическое значение.
-9 Трехмерная планарная хроматография, основанная на использовании известных принципов традиционной двумерной ТСХ. Ранее 1, были высказаны только теоретические соображения о существенном увеличении разрешающей способности ТСХ при реализации трехмерного варианта (3D) в объемном «кубике» сорбента на одной пластинке. Стандартная схема реализации трехмерной ТСХ, основанная на простом развитии метода двумерной ТСХ, приведена на рис.1.
1D 3 соединения 1D 3 соединения 3D 11 соединений 2D 5 соединений 2D 5 соединений 3D 17 соединений а б Рис. 1. Хроматограммы разделения смесей красителей, полученные в результате реализации трехмерной ТСХ, стрелками указано направление движения подвижной фазы;
пластинки ПТСХ-АФ-В-УФ (ИМИД, Россия);
а) проба, состоящая из 21 красителя (компоненты указаны в табл.2), б) проба, состоящая из 11 красителей (кристаллический фиолетовый, ксилен ханол, нейтральный голубой, бромтимоловый синий, метаниловый желтый, акридиновый оранжевый, индофенол, ариабел красный, судан синий, судан II, диметиламиноазобензол). Разделение выполнено в N-камере без предварительного насыщения.
Для того, чтобы оценить, является ли предложенный вариант 3D-ТСХ более эффективным, по сравнению с одномерным и двумерным разделением, представлялось целесообразным выяснить изменение эффективности разделения при переходе от 1D- к 3D-разделению. Результаты разделения смесей красителей в вариантах 1D-, 2D- и 3D-ТСХ на пластинках размером 7х7см приведены в табл.1.
Giddings J.C. Unified Separation Science. New York: John Wiley and Sons, 1991. –320 p.
Гейсс Ф. Основы тонкослойной хроматографии. М.: Научный совет РАН по хроматографии, 1990. Т.1. –405 с., Т.2. –348 с.
- 10 Таблица 1. Хроматографические характеристики разделения смесей красителей, приведенных на рис.1, полученные в результате реализации 3D-ТСХ.
Средняя Средняя Количество Варианты продолжительность разделенных зон эффективность ( N ) n-мерного анализа ( t, мин) разделения рис.1а рис.1б рис.1а рис.1б рис.1а рис.1б 1D ТСХ 3 из 21 3 из 11 960 810 38 2D ТСХ 5 из 21 5 из 11 1060 920 74 3D ТСХ 17 из 21 11 из 11 1190 1000 86 Приведенные в табл. 1 данные показывают, что при увеличении числа независимых разделений на одной пластинке увеличивается как число разделенных компонентов, так и эффективность разделения. Вариант 3D-ТСХ является более эффективным на ~30%, по сравнению с 2D, и на ~40%, по сравнению с 1D-ТСХ. К сожалению, вариант трехмерной ТСХ является более продолжительным по сравнению с одномерной и двумерной ТСХ, что ограничивает его применение. Однако нередко влияние этого недостатка можно существенно снизить, используя уменьшенные по размеру пластинки ТСХ.
Предложенный вариант трехмерной ТСХ позволяет разделять более сложные смеси, по сравнению с двумерной ТСХ (хотя, не всегда для полного разделения пробы достаточно трех подвижных фаз), однако он требует большей работы при интерпретации результатов, также вариант не обладает достаточной селективностью, так как все используемые подвижные фазы одновременно применяют ко всем соединениям разделяемой пробы.
Новый подход к развитию многомерной ТСХ. В основе разработки нового варианта многомерной ТСХ лежит, во-первых, осознание того факта, что при первом разделении исследуемой смеси аналитик получает, как правило, такое разделение, в котором можно выделить несколько групп соединений (например, три): 1) группа хорошо сорбируемых соединений (с низкими значениями Rf), 2) группа средне сорбируемых соединений (со средними значениями Rf) и 3) группа плохо сорбируемых соединений (с высокими значениями Rf). С целью независимого использования различных подвижных фаз для последующего разделения компонентов пробы, пластинку после первого разделения разрезали под прямым углом (к траектории движения подвижной фазы в первом направлении) на три меньших по ширине - 11 прямоугольных пластинки, каждая из которых содержала, например, одну из частично разделенных групп соединений.
Для последующих «вторых» разделений, нам представлялось целесообразным использовать, не одну, а, например, три подвижные фазы с различной силой растворителя (в соответствии с тремя выделенными группами первично разделенных соединений). Поэтому после первого разделения, каждую из трех прямоугольных частей первоначальной хроматографической пластинки помещали в отдельную камеру, содержащую подвижную фазу, наиболее селективную для разделения содержащейся на ней группы соединений. Каждую из трех “дочерних” пластинок проявляли подвижной фазой, движущейся под углом 90о, по отношению к направлению первого проявления. На рис.2 показана схема реализации 4D-ТСХ.
в в б б а а 1 Рис. 2. Схема реализации 4D-ТСХ. 1 – первичное разделение пробы;
2 – выделение близких (по удерживанию) групп соединений и разрезание пластинки для дальнейшего детального разделения групп компонентов;
3 – одновременное независимое разделение выделенных групп соединений с использованием различных подвижных фаз. Разделение выполнено в N камере без предварительного насыщения на пластинках ПТСХ-АФ-В-УФ (ИМИД, Россия).
В табл. 2 приведены полученные характеристики величин удерживания (Rf), эффективности (N – число теоретических тарелок) компонентов, входящих в состав исследуемой смеси и продолжительности разделения (t, мин) 4D-ТСХ.
Как следует из приведенных в табл.2 данных, применение нового варианта n-мерной ТСХ позволило получить полное разделение сложной смеси красителей, состоящей из 21 компонента, которые существенно различались по физико-химическим свойствам и структуре. Полученный положительный результат обусловлен возможностью использовать для разделения каждой группы выделенных соединений (см. рис.2) наиболее селективную подвижную фазу.
- 12 Таблица 2. Хроматографические характеристики разделенных компонентов 4D-ТСХ в N камере без предварительного насыщения (n=7, p=0.95, sr=0.10-0.15) Величина Продолжи Этап Подвижная Наименование и удерживания, Эффективность, тельность разделения фаза номер компонента N R этапа, мин f Первое разделение исследуемой пробы 1. Метиловый Толуол – красный 0.56±0.03 1 этанол 2. Сиба-Ф II 0.62±0.05 (6.5:3.5, v:v) 3. Флуоресцин 0.65±0.05 Последующие разделения отдельных групп первого разделения на прямоугольных пластинках 4. Тимоловый синий 0.07±0.01 5. Кристаллический 0.60±0.05 фиолетовый Этанол - 6. Метаниловый 0.40±0.03 уксусная 2* желтый кислота 7. Бромфеноловый 0.75±0.04 (9:1, v:v) синий 8. Метиловый синий 0.51±0.04 9. Ксилен ханол 0.58±0.03 10. Акридиновый оранжевый 0.04±0.01 11. Нейтральный голубой 0.82±0.04 12. Бромтимоловый синий 0.05±0.01 3* Ацетон 13. Бромфеноловый красный 0.66±0.03 14. Кислотный красный 0.83±0.04 15. Метиловый оранжевый 0.11±0.03 16. Индофенол 0.05±0.01 17. Ариабел красный 0.13±0.01 18. Cудан синий 0.26±0.02 4* Толуол 19. Судан II 0.39±0.02 960 20. Диметил аминоазобензол 0.52±0.03 21. Розалинин I 0.80±0.03 * этапы 2,3,4 осуществляются одновременно и независимо.
Одним из достоинств предложенного варианта, например, по сравнению с трехмерной ТСХ, является то, что на каждом этапе разделения не происходит дополнительного размывания зон соединений при использовании новых подвижных фаз, так как каждую пластинку ТСХ независимо проявляют только двумя фазами.
Новый вариант n-мерной ТСХ, характеризуется высокой селективностью (эта же смесь методом 3D-ТСХ не была разделена полностью (рис.1а)), высокой разрешающей способностью (разделенные зоны не перекрывают друг друга) и высокой экспрессностью.
- 13 Предложенный подход к разделению многокомпонентных смесей может быть также реализован как 3-х, 5-ти и n-мерный, «мерность» будет определяться в каждом случае поставленной задачей.
3 глава. Изучение особенностей реализации ТСХ в камерах различного типа. Обзор литературы по тематике аппаратурного оформления ТСХ показал отсутствие четких рекомендаций по выполнению хроматографического разделения и использованию различных камер, а также неоднозначность мнений по оптимальной реализации эксперимента: например о необходимости насыщения камеры, о ее оптимальной конструкции и т.п.
Для подробного изучения были выбраны следующие основные типы камер, отличающиеся конструкцией и объемом газового пространства, контактирующего со слоем сорбента (V) (рис. 3): N-камера (V~1500 см3), S камера (V30 см3), и 0-камера («нулевая» камера) (V=0).
В настоящее время N-камера является наиболее широко используемой камерой (более чем в 60% публикаций хроматографисты выполняют разделение в N-камере). При реализации хроматографического разделения в N камере без предварительного насыщения погрешность результатов разделения составляет ~15%, что может объясняться постоянной сорбцией, которая зависит от многих плохо контролируемых факторов, паров подвижной фазы слоем сорбента во время разделения. Отметим также, что осуществить ненасыщенную ТСХ в N-камере невозможно, причем процесс разделения без операции предварительного насыщения N-камеры выполняют наиболее часто.
Реализация проявления в N-камере существенно зависит от степени насыщения камеры, которая определяется продолжительностью насыщения, а также от того, насыщали ли предварительно парами подвижной фазы слой сорбента, на котором затем проводили разделение. Хроматографисты полагают, что они работают в режиме насыщенной ТСХ, хотя они обычно ограничивались только насыщением камеры и лишь в 2% публикаций предварительно насыщали сорбционный слой пластинки парами растворителя. В данной работе было выполнено разделение при различных условиях насыщения.
- 14 а 2 б в 2 Рис. 3. Основные типы хроматографических камер, используемых для реализации восходящего режима проявления: а – N-камера, б – S-камера;
в – 0-камера для реализации ТСХ с закрытым сорбционным слоем. 1- камера, 2 – крышка камеры, 3 – пластинка ТСХ, 4 – подвижная фаза, 5 – покровные стекла, 6 – полимерная пленка (например, тефлоновая).
Хроматограммы, полученные при разделении в насыщенной N-камере на слое сорбента, предварительно насыщенном парами подвижной фазы, и в ненасыщенных N-, S-, 0-камерах, приведены на рис.4.
Разделение в Насыщенная ТСХ Разделение в Рис.4. Хроматограммы, Разделение в ненасыщенной в N-камере ненасыщенной ненасыщенной полученные при N-камере Smin-камере 0-камере разделении смеси красителей в различных типах камер;
пластинки ПТСХ-АФ-В-УФ (Сорбфил), подвижная фаза – толуол.
г в б а Результаты хроматографического разделения, приведенные на рис. 4а,б, позволяют сделать вывод о том, что предварительное насыщение значительно снижает (на ~50%) подвижность разделяемых соединений (Rf), однако при этом повышается и сходимость характеристик разделения до 5%. Однако продолжительность хроматографического процесса в насыщенной камере значительно меньше (на ~50 %), по сравнению с продолжительностью аналогичного разделения в N-камере без предварительного насыщения (если не учитывать время, затраченное на насыщение), а разделение при этом хуже.
В работе предложен простой экспериментальный метод оценки степени насыщения слоя сорбента прами подвижной фазы. При проведении этого исследования использовали гравиметрический метод. Полученные данные позволили определить время, необходимое для достижения определенной - 15 степени насыщения (). Полученные экспериментальные данные по кинетике адсорбции паров подвижной фазы слоем сорбента удовлетворительно описываются следующим уравнением кинетики адсорбции: a(t ) = b[1 e k t ] (где а – общий вес адсорбированных на пластинке паров подвижной фазы за время t, k – константа скорости, b – предельная величина (вес) паров подвижной фазы, адсорбированных пластинкой). Экспериментальные данные по кинетике были получены для 10 наиболее часто используемых подвижных фаз для пластинок «ИМИД» (Россия) и «Merck» (Германия). Погрешность результатов гравиметрического метода составляет менее 5%.
Результаты хроматографического разделения, полученного на пластинках, сорбционный слой которых имеет различную степень насыщения, показали, что при проявлении пластинки в насыщенной N-камере (без операции предварительного насыщения адсорбционного слоя парами подвижной фазы) возможно получить разделение, близкое к разделению, полученному в ненасыщенной предварительно N-камере на пластинке, сорбционный слой которой был насыщен в течение 2-10 мин (при этом составляет 45-60%, причем значения подвижностей разделенных зон и величины их размывания будут близкими по величине). Однако, чем больше степень насыщения, тем ниже погрешность результатов разделения.
Сравнивая общие затраты времени на реализацию различных методов ТСХ, несомненно, необходимо учитывать общую продолжительность процесса, которая включает сумму времен: 1) предварительного насыщения и 2) собственно разделения.
На рис. 5 приведена зависимость степени разделения (Rs) от степени предварительного насыщения сорбционного слоя пластинки парами элюента ().
Как следует из данных рис.5, значения критерия Rs для компонентов исследуемой смеси заметно уменьшаются при переходе от ненасыщенной ТСХ (Rs3.0-5.0) к насыщенной (Rs1.2-1.6), причем наибольшее уменьшение величины Rs происходит в области, соответствующей минимальной степени адсорбционного насыщения пластинки = 45-70%.
- 16 Сиба -FII-Индофенол Rs Индофенол-Ариабел красный Ариабел красный-Судан синий Судан синий-Судан II Судан II-Дим етилам иноазобензол степень насыщения, % 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Рис.5. Зависимость критерия разделения Rs (среднее значение) для исследуемых красителей от степени насыщения пластинки ТСХ парами подвижной фазы (толуола). Условия разделения: N-камера, пластинки ПТСХ-AФ-B-УФ (ИМИД, Россия), T=24°C.
Проведенное исследование для N-камеры позволяет сделать вывод о том, что максимальную степень разделения возможно достичь в ненасыщенных условиях на ненасыщенных пластинках или после предварительного насыщения в течение нескольких минут, однако при этом сходимость результатов серии экспериментов весьма низкая (~15%).
Многие годы усилия хроматографистов были направлены на создание таких условий эксперимента, которые было бы несложно воспроизвести, и воспроизводимо повторить, причем хроматографический процесс не был бы длительным. Многие известные хроматографисты, работающие в области планарной хроматографии, многократно отмечали, что наличие газовой атмосферы, окружающей пластинку, отрицательно влияет на воспроизводимость хроматографического процесса и на результаты хроматографического разделения2,. В связи с этим, представлялось целесообразным реализовать хроматографическое разделение в 0-камере 4, которую можно рассматривать как плоскую прямоугольную квази-колонку.
При реализации процесса в данной камере эффективность разделения, как Issaq H.J. (Ed) A Century of Separation Science. New York: M. Dekker, 2002. – P. 755.
Berezkin V.G., Buzaev V.V. New thin-layer chromatography plate with a closed sorbent layer and details of its application // J. Chromatogr. A. 1997. V. 758. P. 125-134.
- 17 известно, несколько выше, чем при проведении ТСХ в N-камере, а продолжительность эксперимента заметно меньше (на 25-30%).
Хроматограммы, полученные при разделении в 0-камере, приведены на рис.4в.
Хроматограммы на рис.4б) и в) позволяют заключить, что при осуществлении разделения в 0-камере подвижность разделяемых соединений выше, чем в N-камере без предварительного насыщения (на ~20%). В 0-камере размывание зон разделенных соединений несколько выше (на ~10%), чем в N камере, однако сходимость результатов разделения (sr) в данной камере составляет менее 10%.
Неоднократно хроматографисты отмечали, что “только при использовании ненасыщенной S-камеры удается получить правильную оценку хроматографических характеристик”2. Однако на основании проведенной наукометрической оценки литературы, можно сказать, что в настоящее время S-камеры используются только в ~12 % публикаций.
Следует отметить, что различные авторы предлагали и использовали различные конструкции S-камер. Вначале это была камера с величиной характеристического расстояния между адсорбционным слоем и стенкой камеры d=3 мм и впоследствии величина d была уменьшена до 1 мм. Однако роль величины расстояния d в литературе не обсуждалась.
С целью обоснования оптимальной конструкции S-камеры нами была изучена зависимость характеристик хроматографического процесса от важнейшей характеристики S-камеры – величины d (в пределах от 0.05 мм до мм) для однокомпонентных подвижных фаз. Результаты, полученные при выполнении данного исследования, приведены на рис. 6, поскольку пластинки ТСХ отечественного и зарубежного производства имеют различную структуру поверхности, то приведены экспериментальные данные для двух видов пластинок.
Berezkin V.G., Kormishkina E.V. Study of a New Version of Classical Thin-Layer Chromatography with a Closed Adsorbent Layer // J. Planar Chromatogr. 2006. V.19. P. 81-85.
- 18 Область, 27 изученная авторами продолжительность анализа, мин Эффективность, N (ТТ) Область S-камер, изучавшаяся в ТСХ (1959-2008 гг) dопт=0,2 мм для пластинок “ИМИД” dопт=0,1 мм для пластинок “Merck” 17 характеристическое растояние d, мм 0 0,3 0,6 0,9 1,2 1,5 1,8 2,1 2,4 2,7 Рис. 6. Зависимость продолжительности разделения (t, мин) и эффективности разделения (N) от величины d для пластинок 10х10см;
подвижная фаза – толуол;
значения эффективности приведены средние для смеси из 6 компонентов.
На основании представленных на рис. 6 данных видно, что с увеличением расстояния d продолжительность анализа увеличивается, но неравномерно. Так, например, при увеличении расстояния d от 0.4 мм до 2 мм продолжительность анализа изменяется незначительно (на ~5%), однако эта характеристика увеличивается резко (на 20%) при изменении величины d от 0.05 мм до 0.3 мм.
Отметим, что полученные данные об ускорении процесса разделения полностью согласуются с результатами, полученными нами при оценке времени диффузии молекул подвижной фазы, в зависимости от величины d, используя уравнение диффузии Эйнштейна d2=2Dt (где d – среднее расстояние диффузии, D – коэффициент диффузии, t – время). Продолжительность (t) диффузии молекул подвижной фазы, например, на расстояние d=1.0 мм в раз больше, чем время диффузии молекул на расстояние d=0.1 мм.
Отметим, что c увеличением расстояния d изменяется также и эффективность разделения исследуемых соединений. Максимальная эффективность разделения получена в S-камере с минимальным расстоянием d.
Так эффективность разделения при осуществлении разделения на пластинках Silica gel F254 (Merck, Германия) в S-камере с расстоянием d=0.1 мм выше эффективности разделения, достигаемой в N-камере в среднем на ~25%, на пластинках ПТСХ-АФ-В (ИМИД, Россия) в S-камере с d=0.2 мм – на ~20%.
Следовательно, по наиболее важным хроматографическим параметрам - 19 (продолжительности, эффективности и величинам подвижности), оптимальной является S-камера с величиной d=0.2 мм для пластинок ПТСХ-АФ-В (ИМИД, Россия) и с величиной d=0.1 мм для пластинок Silica gel F254 (Merck, Германия).
При использовании для разделения S-камеры с межплоскостным расстоянием d=0.2 мм продолжительность анализа сокращается на 20% (по сравнению с разделением в N-камере), при использовании S-камеры с расстоянием d=0.1 мм – на 35%. Аналогичные зависимости получены для 10 наиболее широко используемых подвижных фаз.
С целью дополнительного увеличения разрешающей способности метода ТСХ представляло интерес изучить вариант Smin-камеры с сухой контр пластинкой. Использование в Smin-камере вместо покровного стекла пластинки ТСХ с адсорбционным слоем позволит фактически использовать для разделения пробы дополнительный объем подвижной фазы в результате ее адсорбции на слое контр-пластинки. Механизм расхода подвижной фазы на проведение процесса разделения в Smin-камере с контр-пластинкой приведен на рис. 7.
Рис.7. а) Схема реализации эксперимента в Smin-камере с сухой контр-пластинкой.
б) Схема массообмена подвижной фазы в системе Smin-камеры с сухой контр пластинкой. 1, емкость с подвижной 6 фазой, 2, разделяющая пластинка, 3, сухая контр-пластинка, 4, ограничитель, 5 6 5, “мокрая” часть разделяющей пластинки, 6, фронтальный участок 2 жидкой подвижной фазы, 7, насыщенная парами подвижной фазы часть контр 1 пластинки, 8, сухая часть контр пластинки, на которой происходит адсорбция паров подвижной фазы, 9, а б пары подвижной фазы.
Следует отметить принципиальную особенность процесса разделения в Smin-камере с контр-пластинкой (рис. 7б): десорбция подвижной фазы с разделяющей пластинки и ее последующая адсорбция на контр-пластинке имеет место только в области фронта подвижной фазы на разделяющей пластинке, поскольку в области, находящейся позади фронта подвижной фазы, нет условий для следующего двухстадийного процесса: 1) десорбция - 20 подвижной фазы в газовую фазу, и 2) последующая адсорбция насыщенных паров на контр-пластинку по следующей причине: часть адсорбционного слоя контр-пластинки уже “занята” – поскольку она уже содержит равновесно адсорбированные молекулы подвижной фазы. Это позволяет обосновать механизм улучшения разделения в рассматриваемой Smin-камере с контр пластинкой, который был подтвержден экспериментально.
Использование сухой контр-пластинки в Smin-камере, позволило, во первых, увеличить разрешающую способность метода (~25 %), что особенно важно для разделения соединений с низкими значениями величин подвижности (Rf0.2), во-вторых, существенно (до 50%) увеличить величины Rf (особенно в области малых значений подвижности Rf=0-0.3), в-третьих, повысить эффективность разделения в 2.0-2.5 раза. Однако необходимо отметить, что при разделении в Smin-камере с сухой контр-пластинкой происходит также некоторое увеличение продолжительности эксперимента (на 20-50%, в зависимости от размеров используемой пластинки), однако во всех случаях хроматографические характеристики заметно улучшаются, по сравнению с разделением в тех же условиях, но без использования контр-пластинки.
Сравнение хроматографических характеристик, полученных в различных типах хроматографических камер. Для характеристики различных камер на рис. 8 приведены полученные зависимости расстояния, пройденного фронтом подвижной фазы (Zf2) от времени (t).
Согласно полученной зависимости, продолжительность разделения в Smin камере с минимальным расстоянием (0.1 мм) на ~10% выше, чем в 0-камере;
однако существенно меньше (на ~35%), чем в N-камере.
Полученные характеристики эффективности Н (ВЭТТ) приведены в табл.
3, в которую также включены величины степени разделения Rs исследуемых соединений.
- 21 2 Z, см 1 2 60 Рис.8. Зависимость пройденного расстояния для различных камер от продолжительности движения фронта подвижной фазы.
1 – 0-камера;
2 – Smin-камера (d=0.1мм);
3 – Smin-камера (d=0.2мм);
4 – N-камера.
Пластинки Silica gel F254 (Merck, Германия), подвижная фаза – толуол, T=24oC.
0 5 10 15 20 25 30 35 продолжительность движения фронта подвижной фазы, мин Таблица 3. Изменение эффективности и степени разделения для пластинок Silica gel F (Мерк, Германия) при проведении процесса в Smin-, 0- и N-камерах, подвижная фаза – толуол, расстояние для разделения 8 см, Т=24оС.
№ N-камера** Smin-камера* 0-камера Хроматографируемое соединение Н, мкм Rs Н, мкм Rs Н, мкм Rs 1 Сиба-Ф II 20 19 Rs1,2=3.7 Rs1,2=3.6 Rs1,2=1. 2 Индофенол 31 23 3 Ариабел красный 20 Rs2,3=3.1 18 Rs2,3=3.1 26 Rs2,3=2. 4 Cудан синий 27 Rs3,4=2.6 23 Rs3,4=2.5 21 Rs3,4=2. 5 Судан II 18 Rs4,5=3.7 15 Rs4,5=3.7 20 Rs4,5=3. 6 Диметиламиноазобензол 13 Rs5,6=2.9 13 Rs5,6=2.8 24 Rs5,6=2. * Smin – Smin-камера с d=0.1 мм ** разделение проводили без предварительного насыщения N-камеры.
Как следует из данных табл.3, эффективность хроматографической системы и величины Rs при использовании для разделения 0- и Smin-камер близки между собой, однако заметно выше, чем в N-камере. Полученные результаты позволяют заключить, что применение 0- и Smin-камер позволяет реализовать максимальную эффективность и лучшее разделение в режиме ненасыщенной ТСХ.
Важной хроматографической характеристикой разделяемых соединений, которая часто используются для их идентификации, является величина удерживания Rf. Сравнение значений величин подвижности, полученных при разделении хроматографируемых соединений в различных камерах (в N-, Smin и 0-камерах), приведено в табл. 4.
- 22 Таблица 4. Сравнение величин Rf исследуемых соединений, полученных в камерах различного типа на пластинках ПТСХ-АФ-В-УФ (ИМИД, Россия) в режиме ненасыщенной ТСХ, подвижная фаза – этанол, длина для разделения 8 см, Т=24оС (n=7, p=0.95).
Smin-камера* N-камера** 0-камера Разделяемое соединение Rf Rf Rf sr sr sr Тимоловый синий 0.08±0.04 0.07 0.07±0.02 0.05 0.05±0.03 0. Нейтральный красный 0.40±0.05 0.07 0.41±0.03 0.04 0.37±0.07 0. Оранжевый желтый 0.84±0.06 0.05 0.84±0.04 0.03 0.78±0.08 0. Родамин 0.95±0.07 0.05 0.95±0.05 0.03 0.84±0.08 0. * Smin – Smin-камера с d=0.2 мм;
** разделение пластинок проводили без предварительного насыщения N-камеры.
Как следует из данных табл.4, значения величин подвижности Rf, полученных в Smin-и 0-камерах, практически совпадают, что свидетельствует о незначительном влиянии газовой фазы на хроматографические процессы в Smin камере. При разделении проб в ненасыщенной N-камере, значения Rf заметно ниже (на ~20%), чем в Smin- и 0-камерах. Однако отметим, что сходимость характеристик разделения, полученных в Smin-камере, выше, чем в N-камере без предварительного насыщения и в ненасыщенной 0-камере.
Важно отметить, что хроматографичекий процесс в 0-камере является примером строго ненасыщенного хроматографического процесса в ТСХ. На основании проведенных исследований можно сказать, что процесс в Smin-камере также является квази-ненасыщенным (почти ненасыщенным). Хроматограмма, полученная при реализации разделения в Smin-камере, приведена на рис. 4г и аналогична хроматограмме, приведенной 4в, однако с меньшим размыванием хроматографических зон.
Проведена оценка использования Smin-камеры и традиционной N камеры (без предварительного насыщения) при реализации многомерных разделений. В табл.5 приведены основные хроматографические характеристики, полученные при реализации 2D-ТСХ в различных камерах.
Интересно отметить, что хотя величины Rf, полученные при реализации 2D-ТСХ в N- и Smin-камерах, близки друг к другу, однако для всех рассмотренных соединений величины удерживания, полученные в N-камере, несколько меньше, чем в Smin-камере, независимо от используемой подвижной фазы, т.е. Rf(N-камера)/Rf(Smin-камера)1.0. Проведение 2D-ТСХ в Smin-камере так же позволяет получить несколько лучшее по эффективности разделение, - 23 чем при использовании N-камеры. Как и следовало ожидать, реализация двумерной ТСХ в Smin-камере позволяет сократить продолжительность хроматографического разделения более, чем на 20%, как и при выполнении одномерного разделения.
Таблица 5. Основные хроматографические характеристики разделяемых соединений, полученные при реализации 2D-ТСХ (пластинки Silica gel (Merck, Германия));
n=7, p=0.95.
Величины Rf Эффективность Н, мкм R f (N ) N-камера Smin-камера Smin-камера H ( S min ) (d=0.1 мм) R ( S ) N-камера (d=0.1 мм) H ( N ) Соединение f min 1 направление, подвижная фаза – ацетон Бриллиантовый 0.05±0.01 0.06±0.01 75 0.83 0. зеленый Родамин С 0.29±0.03 0.31±0.02 34 0.94 0. Эритрозин 0.56±0.04 0.58±0.02 22 0.97 0. Неразделенная зона 0.91±0.04 0.93±0.02 22 0.98 0. sr 0.07-0.15 0.03-0. 2 направление, подвижная фаза - этилацетат Родамин С 0.08±0.01 0.11±0.01 63 0.73 0. Эритрозин 0.36±0.03 0.39±0.02 48 0.92 0. Нейтральный красный 0.40±0.03 0.45±0.02 45 0.89 0. Метиловый красный 0.85±0.05 0.90±0.01 13 0.94 0. Оранжевый G 0.95±0.05 0.97±0.01 10 9, 0.98 0. sr 0.07-0.12 0.03-0. Общее время t, мин 43.3±0.5 35.9±0. Сравнение результатов разделения, полученных в N- и Smin-камерах, было также проведено и при реализации 4D-ТСХ, результаты которого подтверждают закономерности, выявленные при двумерном разделении в Smin камере: а именно при использовании для разделения Smin-камеры получено более эффективное и экспрессное разделение. Таким образом, проведенное исследование подтверждает преимущества использования Smin-камеры, положительные характеристики которой сохраняются и при выполнении многомерного разделения.
4 глава. Практическая реализация предложенных подходов В работе показана целесообразность использования Smin-камеры для разделения рибонуклеозидов и рибонуклеотидов внутриклеточного пула с использованием трехкомпонентных подвижных фаз. Использование Smin-камеры позволило не только повысить разрешающую способность разделения аналитов (на ~20%), - 24 но и сократить продолжительность анализа (на ~30%). Следует отметить, что использование Smin-камеры позволило также исключить стадию предварительного насыщения, которая в данном случае составляла 45 мин. Для разделения вышеуказанных компонентов предложена элюирующая система, позволившая заменить токсичный раствор 25-% аммиака, входящего в состав элюента, на раствор карбоната натрия, причем селективность разделения при этом не изменилась.
На основании сравнительного анализа предложенной Smin-камеры и коммерчески-доступной горизонтальной DS-камеры (Chromdes, Польша), которая с 1990г была использована более чем в 150 работах, при разделении различных смесей (эфиров, красителей методом 1D-ТСХ и витаминов методом 2D-ТСХ) сделан вывод о практической равноценности вышеуказанных камер.
Проведенное исследование позволяет рекомендовать к использованию в аналитической практике Smin-камеру, конструкция которой отличается простотой и малой стоимостью, наряду с коммерчески доступной горизонтальной DS-камерой.
Основные выводы 1. Проведено наукометрическое исследование развития ТСХ (методы, аппаратура, области применения и т.д.) за последние 30 лет, позволившее выявить основные тенденции ее развития.
2. Разработан новый подход к развитию n-мерной ТСХ, позволяющий существенно повысить разрешающую способность метода при существеном сокращении продолжительности эксперимента. Новый подход основан на независимом и одновременном использовании различных селективных подвижных фаз для разделения отдельных фракций исследуемой смеси, полученных при первом разделении.
3. Изучена зависимость хроматографических характеристик от величины d.
Показано резкое увеличение эффективности и сокращение продолжительности анализа в области малых значений величины d. Показана целесообразность - 25 практического использования при реализации в Smin-камере традиционной одномерной и n-мерной ТСХ.
4. Выявлены достоинства и недостатки основных хроматографических камер, используемых в ТСХ.
5. В результате исследования малоизученной S-камеры с контр-пластинкой выяснены основные особенности хроматографического процесса в этой камере.
Использование для разделения Smin-камеры с сухой контр-пластинкой позволяет, во-первых, существенно (до 50%) увеличить величины Rf (особенно в области малых значений Rf (0.0-0.3)), во-вторых, повысить эффективность разделения в 2.0-2.5 раза, и, в третьих, увеличить разрешающую способность метода (~на 25%).
Основные результаты диссертации изложены в 12 статьях в следующих российских и зарубежных журналах:
1. Berezkin V.G., Kulakova N.Y., Khrebtova S.S. Three-Dimensional Thin-Layer Chromatography with open and closed adsorption layer // J. Planar Chromatography. 2009.
V. 22, № 5. P. 313–319.
2. Березкин В.Г., Хребтова С.С., Кулакова Н.Ю. Четырехмерная тонкослойная хроматография // Доклады Академии наук. – 2009. – Т. 429, № 3. – С. 343–346.
3. Березкин В.Г., Хребтова С.С., Редина Е.А., Егорова Е.В. Комбинированный вариант планарной хроматографии // Журнал аналитической химии. – 2010. – Т.65, № 5. – С. 507-512.
4. Berezkin V., Khrebtova S., Kulakova N. Four-dimensional TLC on plates with open and closed adsorbent layers // Chromatographia. 2010. V. 71, № 9-10. P. 907-911.
5. Хребтова С.С., Тяглов Б.В., Королькова Н.В., Миронов А.С., Березкин В.Г.
Новый метод определения внутриклеточного пула рибонуклеозидов и рибонуклеотидов на пластинках для ТСХ «Сорбфил» // Биотехнология. – 2010. – №3.
– C. 84-90.
6. Berezkin V.G., Khrebtova S.S. Investigation of TLC chromatographic processes in N-chamber // Chromatographia. 2010. V. 72, № 11/12. P. 1169-1176.
7. Березкин В.Г., Хребтова С.С. S-камера малого объема для тонкослойной хроматографии // Заводская лаборатория. Диагностика материалов.–2011– Т. 77, № 1.– С. 4-7.
8. Березкин В.Г., Хребтова С.С. Особенности тонкослойной хроматографии в камерах различного типа // Журнал физической химии. – 2011. – Т. 85, № 2. – С. 365–371.
9. Berezkin V.G., Khrebtova S.S. About some specific features of thin layer chromatography in ultra small volume S-chamber and chamber with closed sorption layer // Chromatographia. 2011. V. 73, №3. P. 329-337.
10. Berezkin V.G., Khrebtova S.S. The use of an Smin-chamber for implementation of two and multidimensional TLC // Mendeleev Communications. 2011. V. 21, №. 2. P. 101-102.
11. Berezkin V.G., Khrebtova S.S., Witkiewicz Z. The rapid analysis by two dimensional TLC on the plates of small size using the Smin-chamber // Aparatury Badawczej i Dydaktycznej. 2011. V. XVI, № 4 (in print).
12. Berezkin V.G., Khrebtova S.S. The development of planar chromatography in 1980 1990 and 2000-2010 (the scientometric study) // J. Planar Chromatography Modern TLC.
2011. V. 24, № 6 (in print).
в 2 патентах на изобретения:
- 26 13. Березкин В.Г., Хребтова С.С. Сэндвич камера малого объема для тонкослойной хроматографии / Решение Роспатента о выдаче патента от 17.03. (заявка № 2010122283/28 от 02.06.2010).
14. Березкин В.Г., Хребтова С.С. Способ многомерной тонкослойной хроматографии / Решение Роспатента о выдаче патента от 06.06.2011 (заявка № 2010118257/28 от 07.05.2010).
а также доложены на следующих международных и отечественных конференциях:
15. Хребтова С.С., Редина Е.А., Березкин В.Г. Сочетание восходящей и нисходящей хроматографии в ТСХ // Научная конференция ИНХС РАН, посвященная 75-летию Института (Москва, 6-8 апреля 2009): тезисы докладов. – С. 104.
16. Хребтова С.С., Кулакова Н.Ю., Березкин В.Г. Новый вариант ТСХ: четырехмерная хроматография // Научная конференция ИНХС РАН, посвященная 75-летию Института (Москва, 6-8 апреля 2009): тезисы докладов. – С. 105.
17. Кулакова Н.Ю., Хребтова С.С., Березкин В.Г. Трехмерная тонкослойная хроматография // Научная конференция ИНХС РАН, посвященная 75-летию Института (Москва,6-8 апреля 2009): тезисы докладов.– С. 106.
18. Березкин В.Г., Кулакова Н.Ю., Хребтова С.С. Трехмерная тонкослойная хроматография // Всероссийская конференция "Теория и практика хроматографии.
Хроматография и нанотехнологии" (Самара, 6-10 июля 2009): тезисы. – С. 78.
19. Березкин В.Г., С.С. Хребтова, Н.Ю. Кулакова. Новый вариант многомерной тонкослойной хроматографии // Всероссийская конференция "Теория и практика хроматографии. Хроматография и нанотехнологии" (Самара, 6-10 июля 2009): тезисы. -С. 79.
20. Березкин В.Г., Хребтова С.С., Редина Е.А. Комбинированный восходящий нисходящий вариант ТСХ // Всероссийская конференция "Теория и практика хроматографии. Хроматография и нанотехнологии (Самара, 6-10 июля 2009): тезисы. – С.80.
21. Berezkin V.G., Khrebtova S.S., Kulakova N.Yu. Four-Dimensional Thin-Layer Chromatography // 5th Conference on Separation and Related Techniques by Nordic Separation Science Society (Tallinn, Estonia 26-29 august 2009):
Abstract
book. – P. 107.
22. Березкин В.Г., Хребтова С.С., Тяглов Б.В. Определение нуклеотидов методом планарной хроматографии // I Всероссийская конференция "Современные методы химико-аналитической фармацевтической продукции" (Москва, 1-4 декабря 2009):
тезисы. - С. 23-24.
23. Березкин В.Г., Хребтова С.С. S-камера со сверхмалым газовым объемом и ее основные аналитические характеристики // Съезд аналитиков России “Аналитическая химия – новые методы и возможности” (Клязьма, 26-30 апреля 2010): сборник тезисов. – С.43-44.
24. Хребтова С.С. Особенности хроматографического процесса в насыщенной и ненасыщенной ТСХ // Съезд аналитиков России “Аналитическая химия – новые методы и возможности” (Клязьма, 26-30 апреля 2010): сборник тезисов. – С. 313-314.
25. Березкин В.Г., Хребтова С.С. Повышение разрешающей способности метода ТСХ // «Аналитическая хроматография и капиллярный электрофорез» (Туапсе, 27.09-1.10.10):
материалы конференции. – С. 61.
26. Berezkin V.G., Khrebtova S.S. S-chamber and its main analytical characteristics // Conference “Interfacial phenomenon yesterday, today and tomorrow” (Lublin, Poland, 1- October 2010).
27. Berezkin V.G., Khrebtova S.S. The new variant of multidimensional planar chromatography // International Symposium for High-Performance Thin-Layer Chromatography (Basel, Switzerland, 6-8 July 2011): book of abstracts. – P. 23.
28. Berezkin V.G., Khrebtova S.S. The development of planar chromatography in 1980 2010 (scientometric study) // International Symposium for High-Performance Thin-Layer Chromatography (Basel, Switzerland, 6-8 July 2011): book of abstracts. – P. 73.
29. Berezkin V.G., Khrebtova S.S. A new variant of the S-chamber with an ultra small gas volume // International Symposium for High-Performance Thin-Layer Chromatography (Basel, Switzerland, 6-8 July 2011): book of abstracts. – P. 75.