Инженерия коферментной специфичности формиатдегидрогеназ из метилотрофных бактерий и растений

На правах рукописи

ЯСНЫЙ Илья Евгеньевич ИНЖЕНЕРИЯ КОФЕРМЕНТНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ ФОРМИАТДЕГИДРОГЕНАЗ ИЗ МЕТИЛОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ И РАСТЕНИЙ 02.00.15 – КАТАЛИЗ

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва – 2008

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии химического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова

Научный консультант:

доктор химических наук, профессор Тишков Владимир Иванович

Официальные оппоненты:

член-корр. РАН, профессор, доктор химических наук Габибов Александр Габибович профессор, доктор химических наук Витаутас-Юозапас Каятоно Швядас

Ведущая организация:

Институт биохимии им. А. Н. Баха РАН

Защита диссертации состоится 17 июня 2008 года в 16 часов на заседании совета Д 501.001.59 по защите докторских и кандидатских диссертаций по химическим наукам при Московском государственном университете имени М. В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ имени М. В. Ломоносова.

Автореферат разослан 12 мая 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук И. К. Сакодынская ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. NAD+ и NADP+ – коферменты, играющие огромную роль во всех живых клетках. NADP+ отличается от NAD+ всего лишь тем, что 2’-гидроксильная группа рибозы аденозина в молекуле NADP+ заменена остатком фосфорной кислоты. Однако в живых клетках NAD+ и NADP+ выполняют принципиально различные функции. NADPH используется в организме в реакциях синтеза различных соединений, а NAD+, напротив, участвует преимущественно в окислительных процессах, и полученный NADH расходуется на удовлетворение энергетических потребностей клетки. Подавляющее большинство ферментов, катализирующих реакции с участием NAD+ и NADP+, высокоспецифичны по отношению к определенному коферменту и лишь немногие дегидрогеназы проявляют близкую активность с NAD+ и NADP+. Это позволяет клетке осуществлять раздельную регуляцию процессов получения NADH, необходимого для синтеза АТР, и синтеза различных соединений с участием NADPH. Таким образом, реакции, катализируемые NAD+- и NADP+-зависимыми дегидрогеназами, представляют собой прекрасный пример реализации механизма высокоспецифичного молекулярного распознавания близких по структуре соединений.

NAD+-зависимая формиатдегидрогеназа (КФ 1.2.1.2) катализирует окисление формиат-иона до углекислого газа при сопряженном восстановлении NAD+ до NADH. Среди большого разнообразия ФДГ отдельную группу образуют ферменты, состоящие из двух идентичных субъединиц и не содержащие ионов металлов и простетических групп. ФДГ этой группы принадлежит к суперсемейству D-специфичных дегидрогеназ 2-гидроксиксилот. ФДГ катализирует очень простую реакцию, механизм которой включает только гидридный перенос без стадии кислотно-основного катализа. Субстрат этой реакции – формиат-ион – одно из простейших органических соединений. Поэтому ФДГ рассматривается как модельный фермент для изучения структуры и механизма действия всего суперсемейства D-специфичных дегидрогеназ 2 гидроксикислот. Наиболее изученным ферментом среди ФДГ данной группы является формиатдегидрогеназа из бактерий Pseudomonas sp.101 (PseФДГ).

Для ФДГ из бактерий Pseudomonas sp.101 в банке данных трехмерных структур PDB имеется несколько структур высокого разрешения как для апо-, так и для В данной работе приняты следующие сокращения: ФДГ – формиатдегидрогеназа, PseФДГ – ФДГ из Pseudomonas sp.101, AraФДГ – Arabidopsis thaliana, CboФДГ – Candida boidinii, SceФДГ –Saccharomyces cerevisiae, SoyФДГ – сои Glycine max, NAD+ и NADH – окисленная и восстановленная формы никотинамидадениндинуклеотида, NADP+ и NADРH – окисленная и восстановленная формы никотинамидадениндинуклеотидфосфата.

холофермента. В нашей лаборатории методом направленного мутагенеза были получены различные мутантные PseФДГ с измененной коферментной специфичностью, с повышенной химической и температурной стабильностью.

Вторая по изученности ФДГ – фермент из дрожжей Candida boidinii. Для нее в 2007 году была опубликована структура апо-фермента и получены мутантные формы с повышенной температурной и химической стабильностью, но по своим свойствам эти мутанты значительно уступают мутантным ФДГ из Pseudomonas sp.101 (Tishkov V.I., 2006).

Плохая изученность ФДГ из растений связана с тем, что выход этого фермента из природных и трансгенных растений очень низок, а экспрессия в E.coli приводила к образованию телец включения. Проблема экспрессии растительных ФДГ в клетках E.coli в активной и растворимой форме была решена в нашей лаборатории в конце 2004 г., когда были созданы рекомбинантные штаммы-продуценты для ФДГ из растений Arabidopsis thaliana и Glycine max. Их наличие сделало возможными исследования ФДГ из растений методом направленного мутагенеза.

NAD+.

Все природные ФДГ высокоспецифичны к Однако формиатдегидрогеназы из различных источников отличаются по степени специфичности к NADP+. Наибольшую коферментную специфичность к NAD+ по сравнению с NADP+ проявляет ФДГ из дрожжей Saccharomyces cerevisiae (эффективность катализа с NAD+ в 3,0109 раза больше, чем с NADP+). В случае ФДГ из Pseudomonas sp.101 эффективность катализа с NADP+ выше и уступает эффективности катализа с NAD+ только в 2400 раз. Данные о коферментной специфичности растительных ФДГ в литературе отсутствуют.

В нашей лаборатории были получены мутанты ФДГ из Pseudomonas sp.101, специфичные к NADP+. Однако оказалось, что первая генерация мутантов имеет узкий рН-оптимум связывания кофермента в щелочной области (до рН 7,4).

Получение второй генерации мутантов позволило расширить рН-оптимум связывания кофермента до рН 9,0. Для практического применения необходимо расширение рН-оптимума связывания NADP+ до рН 10,0. Для ФДГ из Candida boidinii также был получен NADP+-зависимый фермент, кинетические свойства и термостабильность которого значительно (на порядок и более) хуже по сравнению с таковыми для NADP+-зависимых ФДГ из Pseudomonas sp.101. Для растительных ферментов данных об изменении коферментной специфичности нет.

Таким образом, проблема детального исследования коферментной специфичности ФДГ методом направленного мутагенеза является важной фундаментальной и практической задачей.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы было:

1. Получение мутантов NADP+-зависимой PseФДГ с расширенным рН-опти мумом связывания кофермента в диапазоне рН 7,0–10,0. Как уже отмечалось выше, ранее в нашей лаборатории были получены NADP+-зависимые PseФДГ, эффективно связывающие кофермент при рН не выше 9,0.

2. Повышение продуктивности генетических конструкций для экспрессии NADP+-зависимых PseФДГ. Использованные ранее штаммы-продуценты E.coli обеспечивали низкий уровень экспрессии выход мутантных NADP+-зависимых PseФДГ (не более 1–2% от общего растворимого белка клетки). Для применения новых мутантных ФДГ на практике необходимо было повысить уровень их экспрессии.

3. Повышение химической и температурной стабильности NADP+-зависимых мутантов PseФДГ. Ранее были получены мутанты NAD+-зависимой PseФДГ с увеличенной температурной и химической стабильностью. Решено было объединить в одном мутанте замены, обеспечивающие специфичность PseФДГ к NADP+, с заменами, увеличивающими химическую и температурную стабиль ность PseФДГ.

4. Получение NADP+-зависимых мутантов ФДГ из растений резуховидки Таля Arabidopsis thaliana и сои Glycine max. В литературе данные о коферментной специфичности растительных ФДГ, и, тем более, о создании NADP+-зависимых форм ФДГ из растений отсутствуют.

Научная новизна. В данной работе были созданы подходы, позволяющие с помощью направленного мутагенеза расширить рН-оптимум связывания кофермента NADP+-зависимыми мутантами PseФДГ. Было показано, что возможно независимое объединение мутаций, которые обеспечивают улучшение различных свойств PseФДГ – повышенную температурную и химическую стабильность, с одной стороны, и специфичность к NADP+, с другой. Таким образом, мы продемонстрировали аддитивность таких мутаций.

Полученные данные свидетельствуют о том, что с помощью всего одной аминокислотной замены можно на порядок повысить сродство растительных ФДГ из A.thaliana и G.max к NADP+. Таким образом, впервые были получены ФДГ из растений с измененной коферментной специфичностью. В результате проведен ных экспериментов было показано, что подход к изменению коферментной специфичности, разработанный в нашей лаборатории в приложении к бактериальным ФДГ, универсален и его можно использовать для изменения коферментной специфичности ФДГ из эволюционно далекого источника (растений).

Практическая значимость работы. Формиатдегидрогеназа используется в процессах синтеза оптически активных соединений с участием NAD(P)+ зависимых дегидрогеназ в качестве фермента, способного регенерировать кофермент. Полученная нами NADP+-зависимая форма биокатализатора была успешно испытана в ряде зарубежных лабораторий.

Создание высокоэффективных штаммов-продуцентов рекомбинантной NADP+-зависимой ФДГ из бактерий и растений дает основу для разработки процессов получения NADP+-зависимых мутантов ФДГ в больших количествах.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих Международных и российских конференциях: 1-й Международный Конгресс «Биотехнология – состояние и перспективы развития» (Москва, Россия, 2002), 7-я Пущинская школа-конференция молодых ученых (Пущино, Россия, 2003), Конференция «И.В.Березин – 80 лет» (Москва, Россия, 2003), Международная конференция «Ломоносов – 2006» (Москва, Россия, 2006), 4-й Международный Конгресс «Биотехнология – состояние и перспективы развития» (Москва, Россия, 2007), III Конференция молодых ученых, аспирантов и студентов по молекулярной биологии и генетике (Киев, Украина, 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и тезисов докладов конференций. Обе статьи опубликованы в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, опубликованный на сайте ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (3 главы), описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы.

Диссертация содержит 119 страниц печатного текста, 25 рисунков, 20 таблиц и 150 ссылок.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Методы исследования. В работе использовали различные методы генетической инженерии (Sambrook J., 2001). Направленный мутагенез проводи ли с помощью полимеразной цепной реакции (Ho S.N., 1989). Мутантные и немутантные формы PseФДГ, SoyФДГ и AraФДГ, экспрессированные в клетках E.coli, выделяли и очищали по стандартной методике, разработанной для PseФДГ (Tishkov V.I., 1999), с незначительными модификациями для растительных ферментов.

Активность и кинетические константы ФДГ определяли спектрофото метрически по накоплению NAD(P)H при длине волны 340 нм (340 = 6220 М-1см-1) на спектpофотометpе «Shimadzu UV 1601PC» при 30 °С. Термостабильность мутантных ФДГ и рекомбинантных ферментов дикого типа измерялась, как описано ранее (Rojkova A.M., 1999).

Анализ трехмерных структур ФДГ проводили с помощью программ «Swiss PdbViewer v3.7», «RasMol v2.7» и «Accelrys DS Vizualizer v1.7». Для PseФДГ использовались данные рентгеноструктурного анализа для апо- (2NAС) и холо форм (2NAD) фермента. Моделирование структуры NADP+-зависимых мутантов PseФДГ проводили в сотрудничестве с к.ф-м.н. Упоровым И.В. на станции молекулярной графики SGI Indy (Silicon Graphics, США) с использованием пакета программ Insight II (Accelrys Software, США).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Расширение pH-оптимума активности NADP+-зависимых PseФДГ Известно, что в случае формиатдегидрогеназы максимальная скорость реакции Vmax постоянна в диапазоне значений рН 6,0–11,0, поэтому уменьшение эффективности катализа при высоких значениях рН связано только с падением сродства фермента к коферменту.

Двойные NADP+-зависимые мутанты. Первая генерация NADP+ зависимых ФДГ из Pseudomonas sp.101, полученная в нашей лаборатории, состояла из двух точечных мутантов, PseФДГ M8 и M9. Хотя мутант PseФДГ M9 и вторая генерация NADP+-зависимых мутантов, полученных на его основе (PseФДГ М9-10 и М9-20) проявили высокое сродство к NADP+, мутант PseФДГ М8 обладает более высокой каталитической активностью и повышенным сродством к формиату (KМ по формиату 14 мМ). Поэтому мы решили провести эксперименты по расширеню рН-оптимума связывания NADP+ для этого мутеина путем введения второй дополнительной мутации аналогично мутанту PseФДГ М9. Вторые мутации были введены в ген PseФДГ M8 методом полимеразной цепной реакции. Плазмиды выделили, наличие только требуемых мутаций подтвердили секвенированием. Для получения мутеинов было проведено культивирование рекомбинантых штаммов-продуцентов NADP+ зависимых ферментов, и новые мутантные ферменты были очищены до чистоты не менее 98%. В результате были получены двойные мутанты PseФДГ M8-10 и M8-20.

Кинетические параметры новых мутантов представлены в табл. 1, а данные по термостабильности – на рис. 1.

ln A M9- M9- M8- M8- 1 M 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 t, сек Рис. 1. Термостабильность мутантов на основе замен M8 и М9 при температуре 62С.

рН 7,0, 0,1М КФБ Таблица Кинетические параметры мутантных PseФДГ на основе замены M Мутант Параметр M8* M9-10** M9-20** M8-10 M8- kcat, c-1 2,0±0, 1,9±0, 2,5±0,2 1,2±0,1 1,9±0, HCOO KМ, мM рН 7 46±5 87± 45±1 35±4 43± н.д. н.д. н.д.

рН 8 39±4 40± н.д. н.д. н.д.

рН 9 65±6 70± NADP+ KМ, мM рН 7 0,29±0,03 0,29±0,02 0,61±0,05 0,31±0,03 0,49±0, рН 8 1,1±0,1 0,33±0,03 1,0±0,1 0,33±0,03 0,51±0, н.д.

рН 9 0,32±0,02 1,1±0,1 0,33±0,03 0,84±0, н.д.

pH 10 0,56±0,05 1,5±0,2 0,50±0,04 1,0±0, kin, 62°,10-4 c-1 2,3±0,2 7,2±0,2 7,1±0,2 7,3±0,2 7,0±0, Результаты экспериментов позволяют утверждать, что полученные двойные мутанты (особенно двойной мутант PseФДГ M8-20) обладают достаточно * Тишков В. И., 1993.

** Садыхов Э. Г., 2001.

широким рН-оптимумом связывания кофермента и при этом имеют несколько лучшую KМ по формиату, чем мутанты на основе PseФДГ M9. Однако их KМ по NADP+, особенно при высоких значениях рН, намного хуже, чем у ферментов на основе PseФДГ M9. Поэтому для дальнейшей работы решено было использовать мутанты на основе PseФДГ M9.

Процесс термоинактивации (рис. 1) всех изученных мутантов описывается кинетикой реакции первого порядка, поскольку наблюдается линейная зависимость логарифма остаточной активности от времени. Тангенс угла наклона прямых дает значение константы скорости инактивации.

Как следует из рис. 1, термостабильность двойных мутантов PseФДГ М8-10 и М8-20 ниже по сравнению с исходным PseФДГ М8. Аналогичные результаты были ранее получены и для двойных NADP+-зависимых мутантов на основе PseФДГ М9. Введение второй мутации и в том, и в другом случае приводит к увеличению константы скорости термоинактивации примерно в три раза.

Тройные NADP+-зависимые мутанты. Ранее в нашей лаборатории на основе мутанта PseФДГ M9 были получены три двойных мутанта NADP+ зависимой рекомбинантной формиатдегидрогеназы PseФДГ M9-10, M9-20 и M9 30 с расширенным рН-оптимумом связывания кофермента. Кинетические исследования показали, что при рН выше 9,0 сродство всех мутантов к коферменту ухудшается.

Нашей задачей было получить мутанты PseФДГ с рН-оптимумом связывания NADP+, расширенным до значения рН 10,0. Для этого решено было ввести дополнительные мутации в двойные мутанты PseФДГ M9-10 и M9-20. Предва рительно для выбора мутаций, которые могли бы обеспечить наилучший результат, было проведено компьютерное моделирование структур возможных мутантов с NADP+. Для проведения моделирования в качестве исходных данных использовали ранее полученные модельные структуры двух мутантных форм PseФДГ (М9-10 и М9-20) в комплексе с NADP+. В структуры этих мутантов вводили дополнительные аминокислотные замены, проводили оптимизацию конформации белковой глобулы и анализировали взаимодействие аминокислот ных остатков с 2'-фосфатной группой кофермента и между собой. В результате моделирования были отобраны три наиболее перспективных тройных мутанта.

На основании результатов моделирования было высказано предположение, что наибольшего эффекта следует ожидать от тройного мутанта PseФДГ M9-21.

Новые мутантные PseФДГ получали с помощью полимеразной цепной реакции. В качестве исходной матрицы использовали плазмиды рFDH6 M9-10 и рFDH6 M9-20. Для доказательства наличия только требуемых мутаций участки генов с мутациями были отсеквенированы по обеим цепям.

Были получены высокоочищенные препараты мутантных PseФДГ (не менее 98% чистоты), изучены их кинетические свойства и термостабильность. На рис. представлены рН-зависимости КМ по NADP+ двойных и тройных мутантов PseФДГ в интервале pH от 7,0 до 10,0.

Из рис. 2 видно, что введение третьей мутации позволило расширить диапазон эффективного связывания кофермента до значения рН 10,0 для всех трех тройных мутантов NADP+-зависимой PseФДГ – M9-11, M9-12 и M9-21.

Полученные результаты согласуются с данными нашего компьютерного моделирования. Видно, что мутант PseФДГ M9-21 обладает немного более высоким сродством к коферменту, чем два других тройных мутанта.

Для всех полученных мутантов при pH 7,0 были измерены константы Михаэлиса по второму субстрату – формиату (табл. 2), к которому NADP+ специфичные мутанты имеют более низкое сродство, чем фермент дикого типа.

1, 0, M9- 0,8 M9- M9- 0,7 M9- M9- KM, мM 0, 0, 0, 0, 0, 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5 10, pH Рис. 2. рН-зависимости КМ по NADP+ для двойных и тройных мутантов PseФДГ. 30C, 0,1М КФБ Из таблицы видно, что константа Михаэлиса по формиату как двойного мутанта PseФДГ M9-20, так и тройного PseФДГ M9-21 в полтора раза выше, чем у двойного мутанта PseФДГ М9-10 и тройных PseФДГ М9-11 и М9-12. Видно, что введение еще одной аминокислотной замены в двойной мутант PseФДГ М9-20 не привело к изменению КМ по формиату. Введение в двойной мутант PseФДГ М9 10 третьей замены в одном случае не повлияло на сродство фермента к формиату, а в другом константа Михаэлиса несколько улучшилась.

Таблица КМ по формиату и по NADP+ мутантов PseФДГ при рН 7, КМ по NADP+, мM Мутанты PseФДГ КМ по формиату, мM Двойной M9-10 48 ± 8 0,27 ± 0, Тройной (новый) M9-11 47 ± 7 0,24 ± 0, Тройной (новый) M9-12 40 ± 7 0,32 ± 0, Двойной M9-20 66 ± 10 0,38 ± 0, Тройной (новый) M9-21 69 ± 9 0,22 ± 0, Для всех полученных мутантов была изучена термостабильность при температуре 62оС. На рис. 3 представлены зависимости логарифма остаточной активности мутантов от времени. Как следует из этого рисунка, введение третьей мутации не сказывается на термостабильности фермента.

M9- M9- M9- M9- M9- Рис. 3. Зависимость логарифма остаточной активности мутантов PseФДГ от времени при 62°С. рН 7,0, 0,1М КФБ Таким образом, в результате проведенных экспериментов удалось сущест венно (на 1 единицу рН) расширить рН-оптимум связывания NADP+ у мутантных NADP+-специфичных формиатдегидрогеназ из Pseudomonas sp.101. Целесобраз ность практического применения того или иного мутанта зависит от условий проведения процесса. Если технологический процесс проводится при малом избытке формиата, более целесообразно применение тройного мутанта PseФДГ М9-12. Если лимитирующим фактором процесса является сродство к NADP+, более выгодно применять мутант PseФДГ М9-21, который хуже связывает формиат, но имеет повышенное сродство к коферменту.

Повышение эффективности экспрессии тройных мутантов NADP+-зависимых PseФДГ Полученные нами ранее гены тройных мутантов PseФДГ M9-11 и M9-12 с расширенным рН-оптимумом активности были клонированы в плазмиду рFDH6.

Данная генетическая конструкция создана на основе плазмиды pUC19, в которую в дополнение к lac-промотору был встроен также и tac-промотор. Однако даже под контролем двух промоторов выход ферментов по активности с NADP+ составлял всего 150–300 ед/л. Чтобы повысить выход мутантных ферментов, решено было переклонировать участок, содержащий мутации, в плазмиду pFDH8, производную от pEТ23а. Данная плазмида содержит высокоэффектив ный промоторный участок ДНК-зависимой РНК-полимеразы бактериофага Т7. В случае NAD+-зависимой PseФДГ использование этой плазмиды для экспрессии позволило достичь выхода ФДГ в активной форме на уровне 50% от общего количества растворимых белков E.coli. В результате клонирования в плазмиду pFDH8 были получены плазмиды pFDH8 M9-11, pFDH8 M9-12, pFDH8 M8-10, pFDH8 M8-20. Результаты экспрессии рекомбинантных ферментов показаны в табл. 3.

Таблица Сравнение эффективности биосинтеза в клетках E.coli мутантных NADP+-специфичных PseФДГ при использовании различных систем экспрессии* Плазмида pFDH6 M9-12 pFDH8 M9-11 pFDH8 M9-12 pFDH8 M8-10 pFDH8 M8- Система T7 T7 T7 T lac+tac экспрессии Выход, ед/л (активность 150±20 1470±90 2330±150 1340±90 910± по NADP+) Выход активного 60±8 930±80 590±50 540±40 360± белка, мг/л * приведены средние данные из трех независимых культивирований.

Из табл. 3 видно, что при переходе на новую систему экспрессии выход фермента повышается как в случае двойных, так и в случае тройных мутантов. В зависимости от типа мутанта наблюдается увеличение уровня экспрессии от 6 до 15 раз.

В табл. 4 представлены кинетические параметры мутантных ферментов, экспрессированных в новой системе.

Таблица Кинетические параметры тройных мутантов ФДГ Мутант Параметр M9-12 M9- kcat, c-1 1,7±0,2 1,6±0, KМHCOO-, мM pH 7 39±3 47± рН 8 37±2 60± рН 9 45±3 60± NADP+ KМ, мM рН 7 0,32±0,01 0,25±0, рН 8 0,32±0,01 0,38±0, рН 9 0,31±0,02 0,35±0, pH 10 0,30±0,02 0,34±0, -4 - kin, 62°С,10 c 7,2±0,1 7.3±0, Из таблицы видно, что экспрессия в данной системе, как и следовало ожидать, не приводит к изменению кинетических параметров (см. табл. 2).

Повышение химической и температурной стабильности NADP+-зависимых PseФДГ Ранее в нашей лаборатории был получен мутант NAD+-зависимой PseФДГ SM(8)S с аминокислотными заменами, повышающими химическую и темпера турную стабильность. В ген этого мутантного фермента решили ввести мутации M9-10 и M9-20. Плазмиды рFDH SM(8)SМ9-10 и рFDH SM(8)SМ9-20 выделили, участки с геном PseФДГ отсеквенировали по обеим цепям для доказательства наличия только требуемых мутаций.

Из данной таблицы видно, что объединение мутаций позволило получить ферменты, сочетающие полезные качества ферментов-предшественников. С одной стороны, новые мутанты имеют высокое сродство к NADP+ в диапазоне рН 7,0–9,0, с другой стороны, термостабильность этих ферментов возросла на 12– 15%.

Кинетические свойства новых мутантов приведены в табл. 5.

Таблица + Кинетические свойства NADP -зависимых мутантных ферментов на основе мутанта PseФДГ SM(8)S Мутант Параметр М9-10 М9-20 SM(8)SМ9-10 SM(8)SМ9- NADP+ 0,29±0,02 0,31±0,03 0,35±0,04 0,32±0, KМ, мМ pH NADP+ 0,33±0,03 0,33±0,03 0,33±0,05 0,34±0, KМ, мМ pH NADP+ 0,32±0,02 0,32±0,03 0,36±0,06 0,32±0, KМ, мМ pH - 1,9±0,1 2,0±0,1 2,1±0,1 2,0±0, kcat, с -4 - 6,9±0,4 7,0±0,4 6,5±0,3 6,1±0, kin, 62°,10 c Ранее в нашей лаборатории был получен мутант ФДГ из Pseudomonas sp. Glu170Asp с повышенной термостабильностью. Решено было ввести такую мутацию и в ген NADP+-зависимой PseФДГ.

Мутацию Glu170Asp решили ввести в плазмиду pFDH8 SM(8)S M9-20.

Плазмиды с введенной мутацией выделили и отсеквенировали для доказательства наличия только требуемых замен.

Кинетические свойства мутанта PseФДГ SM(8)SM9-20-E170D представлены в табл. 6.

Таблица Кинетические свойства мутанта PseФДГ SM(8)SM9-20-Glu170Asp Мутант Параметр PseФДГ SM(8)SM9-20 PseФДГ SM(8)SM9-20-E170D NAD+ 1,10±0,07 1,17±0, KМ, мМ, pH NADP+ 0,32±0,04 0,22±0, KМ, мМ, pH kcat, с-1 2,0±0,1 2,1±0, -4 - 6,1±0,2 5,2±0, kin, 62°,10 c Как и в случае мутанта E170D NAD+-зависимой PseФДГ, мутант PseФДГ SM(8)S-M9-20-E170D оказался более термостабильным, чем исходный фермент PseФДГ SM(8)S-M9-20. При этом его сродство к коферменту оказалось даже выше, чем у исходного фермента.

Получение NADP+-зависимых форм растительных ФДГ Впервые растительные ФДГ были выделены одновременно с бактериаль ными и дрожжевыми ферментами еще в конце 40-х – начале 50-х годов прошлого века. В начале 90-х годов было установлено, что растительные ФДГ локализованы в митохондриях. Из-за низкого содержания фермента в растениях и трудности его выделения свойства формиатдегидрогеназ из растений охарактеризованы намного хуже, чем бактериальных ФДГ. Даже использование трансгенных растительных систем экспрессии не позволило нарабатывать эти ферменты в больших количествах.

Оптимальным для изучения свойств фермента является его гетерологичная экспрессия, например, в клетках E.coli. Первые попытки экспрессии раститель ных ФДГ в клетках E.coli приводили к образованию телец включения. Как уже отмечено выше, задача экспрессии растительных ФДГ в клетках E.coli в активной и растворимой форме впервые была успешно решена в нашей лаборатории.

Были созданы генетические конструкции и получены рекомбинантные раститель ные ФДГ из двух источников – резуховидки Таля Arabidopsis thaliana (AraФДГ) и сои Glycine max (SoyФДГ).

В табл. 7 представлены кинетические свойства рекомбинантных PseФДГ, AraФДГ и SoyФДГ, экспрессированных в клетках E.coli. Результаты исследования коферментной специфичности показали, что AraФДГ более специфична к NAD+, чем ФДГ из сои и PseФДГ. SoyФДГ оказалась в 2 раза менее специфична к NAD+, чем PseФДГ. Также отметим, что по сравнению с PseФДГ KM по NADP+ растительных ферментов дикого типа значительно ниже (в 20 раз для AraФДГ и в 200 раз для SoyФДГ). Однако в случае PseФДГ величина kcat оказалась выше, чем у растительных формиатдегидрогеназ (табл. 7).

Таблица Коферментная специфичность бактериальной и растительных ФДГ Удельная NADP k NAD k cat Источник / cat KМNAD+, KМNADP+, KМHCOO-,мМ активность, мкМ мМ ФДГ NADP NAD KМ KМ eд/мг Pseudomonas 4,210- 10,0±0,7 60±5 200 7,0±0, sp. Arabidopsis 5,010- 6,5±0,5 20,0±0,8 10±2 2,8±0. thaliana 8,710- 6,2±0,4 17,4±1,6 1,00±0,05 1,2±0, Glycine max Нашей задачей стало получение NADP+-зависимых мутантов растительных ферментов. Для выбора нужных аминокислотных замен мы провели сравнение аминокислотных последовательностей ФДГ из различных источников в районе коферментсвязывающего домена (рис. 4). Анализ последовательностей показал, что все рассмотренные ФДГ содержат консервативный остаток аспарагиновой кислоты, отвечающий за образование водородных связей с 2’- и 3’-ОН-группами рибозы аденозина. При связывании NADP+ в активном центре ФДГ возникает электростатическое отталкивание между отрицательно заряженной карбоксильной группой остатка аспарагиновой кислоты и 2’-фосфатной группой кофермента. Поэтому необходимым условием изменения коферментной специфичности является удаление отрицательного заряда в этом положении.

Ранее также было показано (Serov А.Е., 2002), что вторым важным моментом в обеспечении коферментной специфичности ФДГ является тип аминокислотного остатка в положении +1 к остатку аспарагиновой кислоты. Для эффективного связывания NADP+ в этом положении необходимо наличие остатка аргинина.

Взаимодействие положительного заряда гуанидиниевой группы остатка аргинина с 2'-фосфатной группой NADP+ облегчает связывание кофермента. В случае дрожжевых ФДГ дикого типа наличие в этом положении остатка тирозина приво дит к очень высокой коферментной специфичности этих формиатдегидрогеназ к NAD+ по сравнению с NADP+ (разница в каталитической эффективности более, чем на 6 порядков). Природные бактериальные и растительные ФДГ, у которых в положении +1 к консервативному остатку аспарагиновой кислоты находится остаток аргинина, способны гораздо более эффективно катализировать окисление формиата в присутствии NADP+ (разница в каталитической эффективности всего в 3-4 порядка). Из литературных источников известно, что другие NADP+-зависимые дегидрогеназы также содержат остаток аргинина в положении +1 к консервативному остатку аспарагиновой или глутаминовой кислоты. Можно было предположить, что для изменения коферментной специфичности ФДГ из растений будет достаточно одной мутации, удаляющей отрицательно заряженную карбоксильную группа остатка аспарагиновой кисло ты. Замена консервативного остатка аспарагиновой кислоты на менее объемные и незаряженные остатки аланина и серина должна привести к повышению сродства ФДГ к NADP+. Было решено получить мутанты SoyФДГ Asp200Ala, Asp200Ser и мутант AraФДГ Asp201Ser.

Мутации были введены в гены ферментов методом направленного мутагенеза с помощью полимеразной цепной реакции.

В качестве матрицы для получения мутантов взяли плазмиды pSoyFDH2 и pAraFDH2. Мутантные плазмиды выделили, наличие только требуемых мутаций подтвердили секвенированием. После культивирования рекомбинантных штаммов-продуцентов E.coli, ферменты выделили в активном растворимом виде и очистили по стандартной методике, разработанной для бактериальных ферментов. Кинетические свойства мутантных ферментов приведены в табл. 9.

A B B C —————.—————————————..———.....———————. Бактерии PseФДГ MHVGTVAAGRIGLAVLRRLAPFDV-HLHYTDRHRLPESVEKELN-- MorФДГ MHVGTVAAGRIGLRVLRLLAPFDM-HLHYTDRHRLPEAVEKELN-- ParФДГ MHVGTVAAGRIGLAVLRRFKPFGM-HLHYTDRHRLPREVELELD-- Растения AraФДГ KTIGTVGAGRIGKLLLQRLKPFGC-NLLYHDRLQMAPELEKETG-- SoyФДГ KTVGTVGAGRIGKLLLQRLKPFNC-NLLYFDRLRIDPELEKEIG-- AplФДГ KTVGTVGAGRIGRLLLLTLNPVHC-DLLYHDRVKIDPEVEQHTG-- Дрожжи SceФДГ KIISTVGAGRIGYRVLERLVAFNPKKLLYYDYQELPAEAINRLNEAS DhaФДГ KVIATVGAGRIGYRVLERLIAFNPKKLLYYDYQDLPKEAIDKLNQAS CmeФДГ KTIATIGAGRIGYRVLERLLPFNPKELLYYDYQALPKEAEEKVG-- Грибы MgrФДГ KVVGTVAVGRIGERVLRRLKPFDCKELLYFDYQALAPEVEKEIG-- NeuФДГ KVVGTVGVGRIGERVLRRLKPFDCKELLYYDYQPLSAEKEAEIG-- AspФДГ KVVGTVGVGRIGERVLRRLKPFDCKELLYYDYQPLRPEVEKEIG-- XX X X Рис. 4. Сравнение последовательностей ФДГ из различных источников. Полужирным шрифтом выделены остатки консенсусной последовательности G(A)XGXXG, консервативный остаток Asp и следующий за ним остаток. Представлены последовательности ФДГ из Pseudomonas sp.101 (PseФДГ), Moraxella sp.

(MorФДГ), Paracoccus sp.12-A (ParФДГ), Arabidopsis thaliana (AraФДГ), Glycine max (SoyФДГ), яблока Malus x domestica (AplФДГ), Saccharomyces cerevisiae (SceФДГ), Debaryomyces hansenii (DhaФДГ), Candida methylica (CmeФДГ), Mycosphaerella graminicola (MgrФДГ), Neurospora crassa (NeuФДГ), Aspergillus nidulans (AspФДГ) Таблица Свойства NADP+-зависимых мутантных формиатдегидрогеназ из растений Увеличение VNADP+ эффективности NAD+ NADP+ Фермент KМ, мM KМ, мМ VNAD+ катализа с NADP+, раз* 2,2±0,4 1,4±0,1 2,1 SoyФДГ D200A 2,0±0,4 0,48±0,4 1,7 SoyФДГ D200S 1,9±0,3 1,8±0,2 4,7 AraФДГ D201S 1,02±0,25 0,27±0,03 0,5 PseФДГ М * Увеличение эффективности катализа с NADP+ было рассчитано как отношение (kcat/KМ)NADP+ для мутанта к (kcat/ KМ)NADP+ для фермента дикого типа.

Замены остатка аспарагиновой кислоты в обеих растительных ФДГ привели к повышению эффективности катализа с NADP+ более, чем на порядок. Замена остатка аспарагиновой кислоты на остаток серина в SoyФДГ приводит к более эффективному связыванию NADP+ с ферментом по сравнению с заменой на остаток аланина. Как видно из модельной структуры (рис. 5), остаток аспарагиновой кислоты пространственно сближен с 2’-фосфатной группой кофермента. Замена этого остатка на остаток серина, способный образовывать водородную связь с кислородными атомами 2’-фосфатной группы, должна приводить к лучшему связыванию кофермента, чем замена на гидрофобный остаток аланина, что и продемонстрировали наши исследования.

NAD+ Asp Leu Arg Рис. 5. Модельная структура SoyФДГ в комплексе с NAD+ His His NAD+ + NAD His His Arg Arg Arg Arg Leu Leu Asp Asp Asp Asp NAD+ + NAD Рис. 6. Сравнение рентгеновской структуры PseФДГ (в комплексе с NAD+, слева) и модельной структуры AraФДГ (в комплексе с NAD+, справа) Таким образом, можно выделить два существенных результата наших исследований коферментной специфичности растительных формиатдегидрогеназ:

1. Нам впервые удалось за счет одной аминокислотной замены изменить специфичность растительных ФДГ из A.thaliana и G.max от NAD+ к NADP+. В ходе кинетических исследований оказалось, что этого недостаточно для получения фермента, способного связывать NADP+ с такой же эффектив- ностью, как NADP+-зависимая ФДГ из Pseudomonas sp.101. Причина данного различия, вероятно, состоит в том, что в структуре растительных ферментов отсутствуют аминокислотные остатки, обеспечивающие наличие дополни тельного положительного заряда в районе связывания 2’-фосфата кофермента.

2. Наши данные свидетельствуют об универсальности механизма распознава ния кофермента у ФДГ, выделенных из эволюционно отдаленных источни ков. Разработанные в нашей лаборатории подходы, которые позволили изменить коферментную специфичность ФДГ из Pseudomonas sp.101, можно использовать и для повышения сродства к NADP+ растительных ФДГ.

ВЫВОДЫ NADP+-зависимой 1. Получены двойные и тройные мутанты формиатдегидирогеназы бактерий Pseudomonas sp. 101 с расширенным рН-оптимумом связывания кофермента. Введение третьей мутации позволило расширить рН-оптимум связывания кофермента до значения рН 10,0.

2. Сконструированы плазмиды, позволяющие осуществлять высокоэффектив ную экспрессию рекомбинантных NADP+-зависимых PseФДГ в клетках E.coli.

Выход активного растворимого белка составил до 1 г/л среды.

Химическая и температурная стабильность полученных NADP+-зависимых 3.

мутантов PseФДГ была увеличена за счет введения мутаций, снижающих скорость химической и температурной инактивации PseФДГ. Показано, что введение таких мутаций не влияет на кинетические свойства фермента с NADP+.

4. Впервые изменена коферментная специфичность ФДГ из растений A.thaliana и G.max. C помощью всего одной мутации удалось добиться значительного роста сродства фермента к коферменту.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Serov A. E., Fedorchuk V. V., Yasny I. E., Popova A. S., Matorin A. D., Davydova E. E., Tishkov V. I. Structural basis of coenzyme specificity of bacterial formate dehydrogenase // Proceedings of the 1st International Congress "Biotechnology – State of the art & prospects of development”. М., 2002. P. 441.

2. Ясный И. Е., Петров А. С., Попова А. С. рН-зависимость термостабильности нативной и мутантной формиатдегидрогеназ // Тезисы 7 Пущинской школы-конференции молодых ученых. Пущино, 2003. С. 362.

3. Ясный И. Е., Тишков В. И. Белковая инженерия коферментной специфичности и изучение механизма действия формиатдегидрогеназы методом направленного мутагенеза // Тезисы докладов конференции «И.В.Березин – 80 лет». М., 2003.

4. Ясный И. Е., Петров А. С., Садыхов Э. Г., Серов А. Е., Тишков В. И. Инженерия коферментной специфичности растительных формиатдегидрогеназ // Тезисы докладов Международной конференции «Ломоносов – 2006». М., 2006. С. 64.

5. Садыхов Э. Г., Серов А. Е., Ясный И. Е., Войнова Н. С., Алексеева А. А., Петров А. С., Тишков В. И. NAD+-зависимые формиатдегидрогеназы из Arabidopsis thaliana и сои:

экспрессия в клетках E.coli и кинетические свойства рекомбинантных ферментов // Вестник Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 2006. Т. 47. №2. С. 79–82.

6. Тишков В. И., Ясный И. Е., Садыхов Э. Г., Маторин А. Д., Серов А. Е. Исследование NADP+-зависимых термостабильности мутантных формиатдегидрогеназ из Pseudomonas sp.101 // Докл. Акад. Наук. 2006. Т. 409. №2. С. 216–218.

7. Yasny I. E., Serov A. E., Ouporov I. V., Tishkov V. I. Thermal stability of NADP+-dependent mutant formate dehydrogenases // The Fourth Moscow International Congress "Biotechnology: State of the art and prospects of development”. М., 2007. P. 450.

8. Yasnyi I. E., Serov A. E., Voinova N. S., Tishkov V. I. Сoenzyme specificity of plant formate dehydrogenases // Conference for young scientists, PhD-students and students on molecular biology and genetic. Kiev, 2007. P. 153.