Использование пенициллинацилазы для получения энантиомерно чистых аминосоединений и их производных

На правах рукописи

Кудрявцев Павел Александрович Использование пенициллинацилазы для получения энантиомерно чистых аминосоединений и их производных 02.00.15 кинетика и катализ 03.01.06 биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 2010

Работа выполнена на факультете биоинженерии и биоинформатики и в отделе биокинетики Государственного учреждения Институт физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ имени М.В. Ломоносова.

Научные руководители: профессор, д.х.н. Швядас В.К.

ст.н.с., к.х.н. Гуранда Д.Ф.

Официальные оппоненты: профессор, д.х.н. Кочетков К.А.

к.фарм.н. А.В. Пихтарь

Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита состоится “” _ 2011 г. в 1600 часов на заседании Диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при МГУ имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991 Москва, Ленинские Горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, ауд. 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан “_” _ 20 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук И.К. Сакодынская

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. В настоящее время большинство биокаталитических промышленных процессов получения энантиомерно чистых соединений основано либо на реакциях ферментативного гидролиза в водной среде, либо на реакциях ацильного переноса в безводных органических растворителях. Общим недостатком этих методов является возможность получения только одного энантиомера соединения. Существенными проблемами биокатализа в неводной среде, ограничивающими его применение на промышленном уровне, являются чрезвычайно низкая активность ферментов, дороговизна и сложность утилизации органических растворителей. Исследования последних лет свидетельствуют о том, что возможности применения доступных гидролитических ферментов в естественной для них водной среде еще далеко не исчерпаны. Примером может служить предложенный в нашей лаборатории метод высокоэффективного и стереоселективного ацилирования аминов в водных растворах и интегральный биокаталический метод разделения энантиомеров, основанный на реакциях синтеза и гидролиза, катализируемых пенициллинацилазой (ПА) в водной среде. В этой связи дальнейшее развитие высокоэффективных и экологически безопасных биокаталитических методов препаративного получения энантиомеров различных подклассов первичных аминосоединений, основанных на ферментативных реакциях в водной среде, имеет важное научное и практическое значение.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение эффективности, хемо- и региоселективности ферментативного ацилирования в водной среде различных подклассов первичных аминосоединений, катализируемого ПА, подбор и оптимизация условий препаративного биокаталитического получения энантиомерно чистых полифункциональных производных аминотиолов и обоих энантиомеров первичных аминосоединений различных подклассов, а также разработка аналитического метода определения энантиомеров первичных аминов для характеристики оптической чистоты аминосоединений в ходе ферментативного расщепления рацематов и при выделении конечных продуктов. При достижении поставленных целей были решены следующие задачи:

1) Проведена оптимизация реакций ацильного переноса, катализируемых ПА в водной среде, с учетом растворимости компонентов с целью получения энантиомерно чистых соединений в препаративных количествах;

2) Изучена зависимость эффективности и хемоселективности ферментативного ацильного переноса при ацилировании аминотиолов различными ацильными донорами и возможность улучшения параметров биокаталитического процесса путем инженерии субстратов;

3) В препаративных количествах получены новые энантиомерно чистые тиолы и показано, что их применение позволяет провести количественное определение ряда энантиомеров первичных аминосоединений методом ВЭЖХ с предколоночной модификацией орто-фталевым альдегидом (ОФА);

4) Проведена оптимизация условий препаративного получения обоих энантиомеров различных подклассов аминосоединений и аминоспиртов интегральным биокаталитическим методом.

Научная новизна. Показана возможность проведения высокоэффективного и хемоселективного ацильного переноса на аминогруппы аминотиолов и аминоспиртов в водной среде, катализируемого ПА. Получены новые полифункциональные энантиомерно чистые N-ацильные производные цистеина и глутатиона, показана возможность количественного определения энантиомеров аминоспиртов и нефункционализированных аминов методом ВЭЖХ с предколоночной модификацией при использовании синтезированных хиральных SH-реагентов. Оптимизирован интегральный биокаталитический метод для препаративного получения обоих энантиомеров различных классов аминосоединений, а именно -аминокислот, аминоспиртов, гидрофобных аминов, основанный на реакциях гидролиза в водной среде.

Практическая значимость. Разработан высокоэффективный биокаталитический одностадийный метод препаративного получения энантиомерно чистых N ацильных производных аминотиолов, основанный на хемо- регио- и стереоселективном ацильном переносе в водной среде, катализируемом ПА.

Применение новых энантиомерно чистых функционализированных N-ацильных производных цистеина существенно расширяет возможности метода ВЭЖХ с предколоночной модификацией для хирального анализа первичных аминосоединений. Разработан универсальный метод определения оптической чистоты аминосоединений. Проведена оптимизация условий препаративного ферментативного получения полифункциональных N-ацильных производных аминосоединений. Разработаны методики препаративного разделения энантиомеров различных подклассов первичных аминосоединений интегральным биокаталитическим методом.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на международных конференциях Биокатализ – 2002, 2005, 2007;

100 лет хроматографии, Биокатализ в нетрадиционных средах (2008), международных симпозиумах по биокатализу и боитрансформации BioTrans-2005, 2009;

международном симпозиуме по соврменным методам органической химии (2006), международном биокаталитическом конгрессе (2007).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 2 статьи, 1 патентная заявка и тезисов докладов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, содержащего 184 ссылки. Работа изложена на страницах машинописного текста, содержит 16 таблиц, 15 схем и 15 рисунков.

Основные результаты работы Оптимизация реакций ацильного переноса, катализируемых пенициллинацилазой, с учетом растворимости компонентов Реакции ацильного переноса, катализируемые ПА, протекают в соответствии со следующей схемой.

Схема 2. Минимальная кинетическая схема активированного ацильного k2 k KS переноса, катализируемого ES EA E+S E + P ПА. E – фермент, S, P1, P2 и P + – субстрат, продукты P N гидролиза и синтеза, N – k нуклеофил, ES и EP – KN комплексы фермента с субстратом и продуктом k4 KP EAN EP E+P синтеза, EA – ацилфермент, k- EAN – комплекс ацилфермента с нуклеофилом Уравнения, описывающие накопление продуктов реакции представлены ниже N S P (1 + 0 N ) ( S + P ) (1 + 0 N ) dP k2 dP2 k = E 0 = E (1 + 0 (1 + ) N ) (1 + 0 (1 + ) N ) dt K S dt K S k E E= k KP 0 = где =,, k2 N ( S + P ) 1 + k2 k3 K N 1 + S + P + K S KN KS KS KP k3 (1 + 0 (1 + ) N ) k = k Накопление продукта ацильного переноса P в рамках данной схемы проходит через кинетический максимум, поэтому для получения максимальной концентрации продукта ацильного переноса в общем случае реакцию необходимо останавливать в момент достижения им максимальной концентрации. Уравнение (dP/dt) = 0 не имеет аналитического решения, поскольку в его выражении присутствует концентрация P2, которая неявным образом зависит от кинетических параметров. Тем не менее, в ряде частных случаев можно получить хорошую верхнюю оценку или даже точное выражение для выхода продукта ацилирования.

В зависимости от растворимости всех компонентов реакций ацильного переноса на первичные аминосоединения (аминокислоты, аминоспирты, гидрофобные амины), катализируемые ПА в водной среде, на практике можно разделить на четыре группы (талица 1).

Таблица 1. Максимальный выход продукта ацильного переноса в расчете на нуклеофил.

Растворимый продукт Ограниченно растворимый ацилирования продукт ацилирования Psat Растворимый = 1 = 1 (2) (1) ацильный донор 0 N0 0 N Ограниченно Psat = 1 P = 1 (4) растворимый 0 S sat (3) 0 S sat N ацильный донор где Ssat и Psat – растворимости ацильного донора и продукта ацилирования соответственно, = S0/N0 – исходный избыток ацильного донора Из полученных уравнений следует, что только в одном случае (ограниченно растворимый ацильный донор/растворимый продукт) максимально достижимый выход ограничен величиной меньшей 100%. В данном случае максимальный выход, достигаемый при условии насыщенной концентрации ацильного донора в момент его достижения, не зависит от общих концентраций реагентов, а значит и нет необходимости их повышения. В остальных трех случаях теоретически может быть достигнут выход продукта ацильного переноса равный 100%. При этом увеличение выхода продукта ацилирования происходит при увеличении концентрации нуклеофила. Наиболее эффективным повышение концентраций оказывается в случае растворимого ацильного донора и плохо растворимого продукта ацилирования. Эти выводы были использованы при планировании и проведении стадии ферментативного ацилирования с целью получения энантиомерно чистых соединений.

Получение энантиомерно чистых тиолов методом ферментативного хемоселективного ацилирования Стремление к проведению селективных превращений, затрагивающих лишь определенную функциональную группу в молекуле комплексного субстрата, исключая тем самым протекание побочных реакций, является одной из основных тенденций тонкого органического синтеза. Традиционная химическая конденсация полифункциональных субстратов включает дополнительные стадии введения и последующего снятия защитных групп, что делает процесс трудоемким, существенно снижает выход и качество целевого продукта, в том числе за счет рацемизации или разрушения лабильных промежуточных соединений. В отличие от химических превращений, ферментативные реакции протекают в мягких условиях. Тонкая организация активного центра ферментов обеспечивает, наряду с высокими скоростями, исключительную структурную и стереоизбирательность их действия, обеспечивающего синтез сложных, полифункциональных соединений в одну стадию. Тем не менее, в настоящее время даже при использовании биокатализа проведение хемоселективного ацилирования аминогруппы в присутствии меркаптогруппы является одной из сложных задач. По нашему мнению именно применение воды в качестве растворителя для ферментативных реакций позволяет достичь наиболее эффективной дискриминации по нуклеофильной реакционной способности между амино- и меркаптогруппами.

Для изучения хемоселективности и эффективности катилизировать ацильный перенос в таких превращениях были исследованы реакции ацилирования цистеина и глутатиона, катализируемые ПА из A.faecalis в водной среде. В условиях депротонирования аминогруппы (pH 10-10,5) ферментативное ацилирование цистеина протекает весьма эффективно, исключительно по аминогруппе.

Накопление целевого продукта имеет кинетический максимум и за 15-120 минут, в зависимости от специфичности ПА к ацильному донору, выход продукта 82-95% (таблица 2).

В рассматриваемом ряду ацильных доноров наибольшая скорость синтеза достигается при использовании фенилацетамида (аналога природного субстрата), а так же амидов R-миндальной кислоты и R-фенилглицина. При этом высокий выход целевого продукта обеспечивается достаточно высоким отношением начальных скоростей синтеза и гидролиза (S/H). Примечательно, что в случае менее специфичных амидов феноксиуксусной и S-миндальной кислот – их близких струтурных аналогов, при общем замедлении реакции наблюдается увеличение эффективности ацильного переноса (S/H) и, соответственно, достигается больший выход продукта ацилирования. Аналогичные закономерности наблюдались и при ацилировании других аминокислот.

При использовании в качестве ацильного донора амида D-фенилглицина, ферментативное ацилирования также протекает хемо- и региоселективно исключительно по аминогруппе цистеина. Свободная аминогруппа ацильного части образующегося продукта обладает низкой основностью. Это позволило в дальнейшем осуществить ее хемоселективное ацилирование химическим путем в водной среде в области pH близкой к нейтральной. Таким образом удалось избежать необходимости введения защитных групп.

Таблица 2. Параметры синтеза N-ацильных производных цистеина Продукт Ацильныый Цистеин, V0/E0, c-1 (S/H)0 Выход, % донор, M M NPC 0,25 0,2 131 20 NPOC 0,25 0,2 1,0 36 NPGC 0,3 0,2 501 23 R-NMC 0,3 0,2 553 22 S-NMC 0,3 0,2 52 67 H X1 X2 X O O ПА из A.faecalis COOH H2N X1 H + COOH * * водная среда (O) NH2 X3 (O) n X3 NH pH 10, 25 oC n HS HS (S)-Cys (H, H, H), n=0 NPC (H, H, H), n=1 NPOC pKa(-SH)=8. (OH, H, H), n=0 R-NMC (X1, X2, X3) = pKa(-NH3+)=10. (H, OH, H), n=0 S-NMC (NH2, H, H),n=0 NPGC (H, H, OH), n=0 p-OH-NPC (выход 82-95%, ee 99.9) H O O H2N O H вода/ацетон (1/1 V/V) COOH + HN H NH pH 8, 0-5 oC Cl O * HS H HN COOH pKa(-SH)=10. * pKa(-NH3+)=7. HS Схема 2. Получение N-ацильных производных S-цистеина.

Ферментативное ацилирование глутатиона, как и цистеина, проводили в водной среде (pH 10,5, 25оС). В качестве ацильных доноров использовали амиды фенилуксусной и отдельных энантиомеров миндальных кислот. В ходе реакции синтезируется исключительно N-ацильное производное глутатиона. Глутатион является менее специфичным нуклеофилом, по сравнению с цистеином (параметр S/H примерно в 10 раз меньше). Тем не менее, ферментативный ацильный перенос протекает достаточно эффективно. Выход целевого продукта составляет 65-80% в зависимости от ацильного донора. Следует отметить, что все рассмотренные реакции протекают очень быстро – начальные скорости накопления продуктов синтеза (приведенные к концентрации фермента) составляют сотни обратных секунд, и существенно превышают каталитические константы ферментативного гидролиза специфических субстратов с той же ацильной частью.

Таблица 3. Параметры синтеза N-ацильных производных глутатиона.

Продукт Ацильный Глутатион, M S/H выход, % донор, M N-Phac-GSH 0,45 0,3 2 N-R-Mac-GSH 0,6 0,4 3 N-S-Mac-GSH 0,6 0,4 7 Полученные результаты свидетельствуют о высокой хемоселективности ПА в водной среде по отношению к аминогруппе в присутствии меркаптогруппы.

Разработанный биокаталитический метод хемоселективного синтеза энантиомерно чистых N-ацильных производных цистеина и глутатиона характеризуется высокой эффективностью и позволяет получать соответствующие соединения в препаративных количествах.

Применение новых хиральных тиолов для определения энантиомеров первичных аминосоединений методом ВЭЖХ с предколоночной модификацией Наличие меркаптогруппы у новых N-ацильных производных цистеина и глутатиона (схема 3) определяет интерес к этим соединениям не только с точки зрения их потенциальной физиологической активности, но и с точки зрения применения в качестве хиральных SH-реагентов для количественного определения энантиомеров первичных аминосоединений методом ВЭЖХ с предколоночной модификацией. Модификация первичных аминогрупп ОФА в присутствии тиола приводит к образованию изоиндольных аддуктов с характерным максимумом поглощения при 340 нм и флуоресцирующих при 450 нм. Образующиеся диастереомерные изоиндольные аддукты (схема 4) можно разделить на обычной (не хиральной) колонке, например, на фазе C18. Использование коммерчески доступных SH-реагентов (NAC и других гомохиральных соединений) для этих целей ограничено и позволяет анализировать в основном энантиомеры аминокислот. Более того, задача хирального анализа аминоспиртов и особенно нефункционализированных аминов как косвенными, так и прямыми метода является весьма сложной. Применение полученных новых энантиомерно чистых N-ацильных производных цистеина и глутатиона, содержащих дополнительный хиральный центр и функциональные группы, позволяет улучшить эффективность разделения и расширяет области использования данного метода для аминоспиртов и аминов.

O O HO O O HO O O OH OH OH NH NH NH HS HS HS R-NMC S-NMC NPC Ph O O OH O NH O O NH G O O OH NH SH NH SH HS NPPC NPOC NPG Схема 3. Структуры новых энантиомерно чистых тиолов.

Было показано, что дериватизация аминогрупп ОФА и полученными в рамках данной работы функционализированными тиолами приводит к образованию изоиндолов с характерными спектральными свойствами. Были подобраны условия количественного определения первичных аминогрупп. При более чем двух кратном избытке ОФА и пятикратном избытке SH-реагента над аминогруппами наблюдается насыщение по ним, а изменение оптической плотности происходит пропорционально концентрации аминогрупп (Рис. 1).

Коэффициент молярного поглощения при 340 нм составляет порядка 6000 М-1см-1).

Были подобраны оптимальные для хирального анализа условия хроматографирования на традиционной обращено-фазовой аналитической колонке C18 – скорость потока, состав элюента (pH, содержание ацетонитрила). В частности найдено, что лучшее разделение изоиндолов достигается при pH элюента 6,8. Образовавшиеся изоиндольные аддукты стабильны в течение нескольких часов в условиях ВЭЖХ анализа (таблица 4) – обязательном требовании количественного определения энантиомеров аминосоединений.

R O A CHO HN COOH 1. + H CHO HS 1. R H2N R2 0. H 0. R R O O HN HN 0. COOH COOH + H H S S 0. 0.00 0.03 0.06 0.09 0.12 0.15 0.18 0. R1 R cамина, мМ R N R N H H Схема 4. Реакция модификации рацемата Рисунок 1 Зависимость предельной оптической аминосоединения с ОФА и хиральным плотности от концентрации лейцинола. Условия: 25° меркатосоединением с образованием C;

боратный буфер pH 9,6;

cNAC = 1 мM;

cОФА = 0,4 мM диастереомерынх изоиндольных аддуктов Структуры исследованных аминосоединений представлены на схеме 5.

NH2 NH * * OH X X CH 1. 2-Naphthyl- 13.

8. Ph-CH2 NH 2. p-Cl-Ph- 9. Ph * 3. Ph-CH2-CH2- COOH 10. (CH3)2CH-CH2 4. Ph 11. CH3-CH2 5. (CH3)2CH-(CH2)3 12. CH3 14. NH 6. CH3-(CH2)4 * 7. (CH3)2CH(OH)-(CH2)3- CF Схема 5. Структуры исследованных аминосоединений Таблица 4. Стабильность в элюенте изоиндольных аддуктов, образованных при модификации с NAC и R-NMC 1 2 время, NAC R-NMC NAC R-NMC NAC R-NMC ч (±) (±) R S R S R S S R 0 100 100 100 100 100 100 100 100 100 1 101 99 99 99 99 99 98 100 99 3 99 101 101 98 97 97 97 99 95 6 98 100 100 98 94 94 96 98 90 12 97 99 99 96 90 89 93 98 81 Таблица 5. Сравнение эффективности разделения энантиомеров аминосоединений при использовании NAC и R-NMC NAC R-NMC a № EC б EC б k1 k R R 26 30% 13 37% 1 1,00 0 1,04 1, 16 27% 9.4 37% 2 1,00 0 1,05 1, 31 27% 20 35% 3 1,00 0 1,05 1, 15 25% 21 33% 4 1,00 0 1,02 1, 46 27% 23 37% 5 1,00 0 1,03 0, 49 27% 19 33% 6 1,02 0,45 1,03 1, 2,7 30% 1,8 37% 7 1,23 3,47 1,10 2, 17 25% 15 27% 8 1,04 0,86 1,13 4, 13 25% 10 27% 9 1,03 0,81 1,13 3, 19 22% 3,4 37% 10 1,05 1,34 1,06 1, 3,0 25% 7,9 27% 11 1,11 1,61 1,16 3, 3,8 20% 1,5 27% 12 1,13 2,40 1,08 1, 2,3 25% 2,2 30% 13 1,13 2,16 1,27 4, 26 27% 10 33% 14 1,06 1,76 1,05 1, a структуры представленные на схеме 3;

EC б содержание ацетонитрила (V/V) в подвижной фазе Таблица 6. Сравнение эффективности разделения энантиомеров аминосоединений при использовании NAC и полученных новых ацильных производных цистеина.

NAC NPC NPOC R-NMC S-NMC NPPC a № R R R R R R 1 1,00 0 1,00 0 1,04 0,71 1,04 1,32 1,05 1,50 1,03 1, 3 1,00 0 1,03 1,14 1,03 0,80 1,05 1,42 1,06 1,77 1,05 1, 8 1,03 1,15 1,06 1,146 1,04 1,06 1,07 1,70 1,10 2,97 1,05 1, 11 1,08 1,93 1,00 0 1,06 1,41 1,08 2,28 1,08 2,49 1,08 1, 13 1,13 2,16 1,17 3,75 1,12 3,00 1,27 4,37 1,59 9,45 1,26 2, a номер аминосоединений представлены на схеме Рисунок 2. Сравнение эффективности разделения энантиомеров 2-амино-4 фенилбутана: А – с использованием NAC на колонке Luna C18, Б – на хиральном носителе CrownPack CR(+), В – при использовании R-NMC на колонке Luna C18.

Полученные результаты (таблицы 5 и 6) показывают, что хроматографическое разрешение образующихся диастереомерных изоиндольных аддуктов сильно зависит от природы аминокомпонента и SH-реагента. Лучшее разделение наблюдается в случае аминокислот, для аминоспиртов разделение лучше, чем для аналогичных нефункционализированных аминов. При использовании NAC и более гидрофобных гомохиральных NPC и NPOC в редких случаях удается добиться удовлетворительного разделения изоиндольных аддуктов энантиомеров аминоспиртов, а изоиндолы нефукционализированных аминов совсем не разрешаются. В противоположность гомохиральным тиолам, применение диастереомерных R-NMC, S-NMC, NPPC значительно увеличивает разрешение изоиндолов для всех рассмотренных классов соединений. Применение S-NMC позволяет разрешить до базовой линии (R 1,5) все испытуемые соединения (рисунок 2).

Хиральная дискриминация диастереомерных изоиндолов во многом обусловлена их конформационной жесткостью за счет внутримолекулярных взаимодействий. Высокая селективность в отношении производных аминокислот и аминоспиртов может быть объяснена специфическими внутримолекулрными взаимодействий между функциональными группами тиола и аминосоединения, в частности, водородной связью. Повышение селективности для диастереомерных R-NMC, S-NMC, NPPC-изоиндолов может быть обеспечена вовлечением дополнительного хирального манделил/фенилглицильного остатка во внутримолекулярные взаимодействия.

Использование N-ацильных производных глутатиона не дает преимуществ по сравнению с NAC для разрешения энантиомеров аминов, не смотря на наличие у трех хиральных центров и дополнительных функциональных групп в их молекулах. Это, возможно, связано с большим молекулярным размером этих соединений: в результате взаимодействие их остатков в изоиндолах с неподвижной фазой начинает доминировать в общем вкладе взаимодействия молекулы, что приводит к нивелированию вклада хирального остатка аминокомпонента.

Разработанный метод характеризуется высокой воспроизводимостью (sr 0,5– 1,0 %) и чувствительностью. Предел обнаружения энантиомеров первичных аминосоединений составляет 2-4 пмоль при спектрофотометрическом детектировании, и 0,6-2 фмоль при флюориметрическом. Исключением является нафтилэтиламин, флуоресценция которого на три порядка ниже по сравнению с другими аминами (предположительно из-за внутримолекурного тушения).

Таким образом, была разработана методология использования полифункциональных энантиомерно чистых N-ацильных производных цистеина для определения энантиомеров различных классов аминосоединений, включая аминоспирты и гидрофобные амины, методом ВЭЖХ с предколоночной модификации ОФА. Разработанный метод анализа оптической чистоты аминосоединений был в дальнейшем использован для определения энантиомеров в ходе протекания стереоселективных ферментативных реакций. Применение новых энантиомерно чистых функционализированных тиолов впервые позволило провести количественную характеристику стереоселективности реакций ферментативного ацилирования первичных аминосоединений и гидролиза их N ацильных производных.

Разделение энантиомеров аминосоединений Разработка биокаталитических методов препаративного получения энантиомеров различных подклассов первичных аминосоединений проводили в рамках общей схемы интегрального биокаталитического метода. Суть его заключается в последовательном проведении исчерпывающего стереоселективного ацилирования активного энантиомера рацемата первичного аминосоединения (схема 1, стадия 1) и, после отделения, стереоселективного гидролиза N-ацильного производного аминосоединения (схема 6, стадия 3), катализируемых ПА в водной среде.

1. Энантиоселективное ферментативное ацилирование CH CH CH H3C O Alcaligenes ПА NH H3C + + H2N H2N водная среда, pH 10 CH CH CH NH O 2. Разделение 3. Энантиоселективный ферментативнй гидролиз CH Alcaligenes ПА CH H3C O NH H3C + H2N водная среда, pH 7- CH CH OH O Схема 6. Интегральный биокаталитический метод разделения энантиомеров аминов.

Практическая реализация интегрального биокаталитического метода разделения энантиомеров аминосоединений (аминокислот, аминоспиртов, аминов) на препаративном уровне различных классов стала одной из основных задач данной работы.

Разделение энантиомеров неприродных -аминокислот Стереоселективные реакции ацильного переноса на -аминокислоты были исследованы на примере -аминопентановой кислоты (норвалин) и аминогексановой кислоты (норлейцин). Для выбора оптимального ацильного донора было проведено исследование кинетических параметров ацилирования аминокислот различными ацильными донорами (таблица 7). Во всех исследованных случаях стереоселективность реакции ацилирования превышала 500.

0. 0. Б А p-OH-PhAcNH R-MAA p-OH-PhAcOH 0. R-MA 0. продукт R-продукт S-продукт 0. 0. c,M c,M 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0 10 20 30 40 50 0 10 20 30 40 50 t,min t,min Рис. 2. Кинетические кривые ацилирования nor-Leu амидом R-миндальной кислоты (А) и ацилирования nor-Val амидом п-гидрокси-фенилуксусной кислоты (Б).

Таблица 7. Кинетические параметры ацилирования норвалина и норлейцина.

Условия эксперимента: концентрации аминокислоты – 0,2 М, ацильного донора – 0,25 М, пенициллинацилазы из A.faecalis – 1 мкМ, pH 10.

nor-Val nor-Leu - V, сек- Ацильный донор S/H V, сек S/H PhAcNH2 5,6 615 7,9 R-MA 8,8 343 5,4 S-MA 58 109 18,8 PhOAcNH2 - - 40 p-OH-PhAcNH2 43 150 - Из приведенных данных следует, что наиболее эффективный ацильный перенос достигается при использовании амидов феноксиуксусной, S- миндальной и пара-гидроксифенилуксусной кислот. Последние два амида характеризуются значительно более высокой растворимостью, чем первый, что способствует достижению более высокого выхода продукта ацилирования. Напротив, наряду с плохой растворимостью, феноксиацетамид является и медленным ацильным донором, что значительно увеличивает расход фермента. Учитывая низкую стоимость и доступность, пара-гидроксифенилацетамид является наиболее предпочтительным ацильным донором для ацилирования неприродных аминокислот.

Для достижения более полного разделения энантиомеров норлейцина была исследована интегральная кинетика его ацилирования в высококонцентрированном растворе при использовании иммобилизованного препарата ПА. Повышение концентрации в данном случае не ведет к повышению максимально достижимого выхода продукта ацильного переноса, но позволяет сократить необходимый для достижения максимального выхода избыток ацильного донора и существенно облегчить дальнейшее выделение аминокислоты из реакционной среды. Применение иммобилизованного фермента, с одной стороны, уменьшает расход фермента, так как очень высокие концентрации реагентов приводят к существенной инактивации нативного препарата фермента, а, с другой стороны, благодаря высокой растворимости продукта ацильного переноса, позволяет останавливать реакцию в момент достижения кинетического максимума накопления продукта простым фильтрованием реакционной смеси.

Полученный после фильтрования отработанный фермент содержит лишь незначительное количество нерастворенного ацильного донора, который можно удалить простым промыванием, после чего использовать препарат ПА как для последующей стадии гидролиза, так и для повторного проведения полного цикла интегрального биокаталитического метода.

Выход и оптическая чистота полученных энантиомеров норвалина представлены в таблице 8.

Таблица 8. Показатели препаративного разделения энантиомеров норвалина Ацильный донор Продукт синтеза D-энантиомер Стадия ацилирования гидроксифенилацетамид Выход 48% Выход 51% ee 99% ee 92% L-энантиомер Стадия гидролиза Выход 99% ee 99% Норвалин и норлейцин относятся к неприродным -аминокислотам, поэтому для них нет дешевого микробиологического способа получения ни L-энантиомера, ни тем более D-антипода. Описанный подход, основанный на двух ферментативных реакциях, катализируемых ПА в водной среде, позволяет получить в препаративных количествах из исходного рацемата аминокислот оба энантиомера высокой энантиомерной чистоты с высоким выходом.

Разделение энантиомеров аминоспиртов С точки зрения возможных методов разделения энантиомеров аминоспирты можно разделить на две группы: аминоспирты, которые могут быть получены восстановлением аминокислот (с концевой OH группой) и аминоспирты, которые получить таким образом нельзя (без концевой OH группы).

При разделении аминоспиртов первой группы были выбраны следующие соединения: 2-аминобутанол (1), фенилаланинол (2), фенилглицинол (3).

H3C NH OH OH H2N OH NH 1 Схема 7. Структура аминоспиртов.

Определение энантиоселективности ферментативного ацилировния аминоспиртов 1-3 амидами пара-гидроксифенилуксусной и миндальных кислот показало, что в данном ряду только фенилглицинол может быть препаративно разделен интегральным биокаталитическим методом (таблица 9).

Таблица 9. Стереоселективность ацилирования аминоспиртов с концевой OH группой, катализируемого ПА из A.faecalis.

Амин 1 2 а а 200б Стереоселективность 16 а – ацильный донор амид R-миндальной кислоты б – ацильный донор амид пара-гидроксифенилуксусной кислоты Разделение энантиомеров фенилглицинола было проведено препаративно при использовании в качестве ацильного донора пара-гидроксифенилацетамида и высоких концентраций реагентов. Выходы и оптическая чистота энантиомеров представлены в таблице 10.

Таблица 10. Показатели препаративного разделения энантиомеров фенилглицинола.

Стадия ацильного Продукт синтеза R-энантиомер переноса Выход 51% ee 97,8% ee 99% Стадия гидролиза S-энантиомер Выход 99% ee 99% Ввиду низкой стереоселективности ферментативного ацилирования, аминобутанол и фенилаланинол не могут быть напрямую стереоселективно ацилированы с помощью пенициллинацилазы. В качестве возможного способа увеличения стереоселективности ферментативного превращения было исследовано влияние тетрагидропиранильной модификации OH группы (схема 8) R TosOH R O + + H3N O CHCl + H3N OH O Схема 8. Модификация гидрокисируппы аминоспиртов.

В результате такой модификации происходит существенное увеличение бокового радикала аминоспирта, что может положительно сказаться на эффективность дискриминации энантиомеров в активном центре фермента, а также на выход продукта ацилирования за счет снижения его растворимости (уравнение 4).

Проведенные исследования показали, что, несмотря на ожидания, введение ТГП модификации не позволяет увеличить стереоселективность (таблица 11).

Таблица 11. Кинетические параметры ферментативного ацилирования 2-амино-1 бутанола и фенилглицинола и их O-ТГП производных.

Vs, с-1 0, M-1 выход амин модификация форма E а Нет ± 120 21 70% 4,8(S) б Есть S 23 3,3 45% 1,2(S) H2N б Есть R 12 2,9 42% Нетв ± 65 15 80 16(S) OH Естьг ± 11 3,7 40 3,7(S) CH3 г Есть S 9,0 2,3 Естьг R 4,5 1,5 Нета ± 100 11 45% 2,3(R) H2 N б Есть S 24 2,0 75% ~3-4(S) б Есть R 11 ~0,6 18% HO а – 0,3 M фенилацетамид, 0,2 M (±)-амин, б – 0,2 M фенилацетамид, 0,1 M O-ТГП-амин, в – 0,3 M D-PGA, 0,2 M (±)-амин, г – 0,2 M D-PGA, 0,1 M O- ТГП-амин В качестве аминоспиртов из второй группы были исследованы реакции ферментативного ацильного переноса на аминогруппу следующих соединений.

NH HO NH NH NH2 OH OH OH OH 1 Схема 9. Структура аминоспиртов.

Во всех исследованных случаях реакции ацильного переноса идут с достаточно высокой эффективностью, что может быть использовано для получения N-ацильных производных соответствующих аминоспиртов (таблица 12).

Таблица 12. Кинетические параметры ферментативного ацильного переноса с участием R-амида миндальной кислоты и соответствующего аминоспирта.

0, М- аминоспирт E 5* 10* 35 1, 3(S) 3 (R) 80 4 (S) 0, 4® Препаративное разделение энантиомеров транс-аминоциклогексанола в рамках интегрального биокаталитического метода было проведено при использовании амида R-миндальной кислоты в качестве ацильного донора.

Выходы и оптическая чистота полученных энантиомеров представлены в таблице 13.

Таблица 13. Показатели препаративного разделения энантиомеров транс аминоциклогексанола.

Стадия Продукт синтеза R-энантиомер ацильного Выход 52% Выход 47% переноса ee 98% ee 92% Стадия S-энантиомер гидролиза Выход 99% ee 99% Таким образом, было показано, что ферментативное ацилирование аминоспиртов, в ряде случаев является высоко и стереоселективным.

Интегральный биокаталитический метод может быть использован для препаративного получения энантиомеров. Опыт с введением ТГП модификации OH группы показал, что улучшения дискриминации энантиомеров аминоспиртов при модификации субстрата данным реагентом добиться не удается. Необходим либо подбор более подходящего модификатора, либо инженерия фермента.

Следует подчеркнуть, что получение энантиомеров транс-циклогексаноламина не может быть проведено при восстановлении энантиомерно чистых аминокислот и возможно лишь прямое разделение. Разработанный метод разделения энантиомеров при помощи ПА является уникальным. Описанный в литературе метод разделения энантиомеров транс-циклогексаноламина с помощью липазы требует предварительной защиты аминогруппы, без введения которой стереоселективность мала (15-30), а ацилирование протекает как по NH2 группе, так и по OH группе.

Разделение энантиомеров гидрофобных аминов При разделении гидрофобных аминов интегральным биокаталитическим методом с целью получения обоих энантиомеров в качестве ацильного донора может быть использован только D-фенилглицинамид. Это связано с тем, что продукты ацилирования данных соединений с помощью фенилацетамида и других нейтральнх ацильных доноров представляют собой очень гидрофобные, плохо растворимые в воде соединения. Вследствие этого проведение второй стадии интегрального метода разделения – гидролиза N-ацильного производного активного энантиомера – затруднено. Низкая растворимость соединений в воде приводит к низкой скорости гидролиза, сильному конкурентному ингибированию образующейся в ходе гидролиза кислотой и, возможно, неблагоприятной термодинамикой процесса. N-фенилглицильные производные имеют преимущества по всем этим пунктам: они обладают достаточно высокой растворимостью в условиях гидролиза (pH 6-7), образующийся в ходе реакции фенилглицин обладает более высоким значением pK аминогруппы (10), чем амид (7,5), благодаря чему практически полностью находится в цвиттерионной форме во время гидролиза, которая не ингибирует фермент и не осложняет протекание гидролиза.

Возможности разделения энантиомеров гидрофобных аминов с помощью пенициллинацилазы были исследованы на примере производных 1 фенилэтиламина (схема 10).

OMe OMe CH AcHN MeO CH CH3 CH CH CH NH NH NH OMe NH CH3 NH CH CH CH3 CH CH O NH2 NH NH2 NH2 NH 7 8 Схема 10. Структуры исследованных гидрофобных аминосоединений.

Многие из перечисленных аминов являются частью давно используемых или новых фармацевтических препаратов. Параметры интрегральной кинетики ацилирования аминов 1-10 приведены в таблице 14.

Из полученных данных (таблица 14) следует, что введение небольших заместителей в бензольное кольцо (амины 1-4) не приводит к существенным изменениям эффективности ацилирования по сравнению с фенилэтиламином, однако в значительной степени снижает стереоселективность. Тем не менее, во всех четырех случаях стереоселективность достаточно высока для разделения энантиомеров интегральным биокаталитическим методом.

Существенно большее влияние на параметры реакции ацилирования оказывают заместители в алифатической части молекулы (соединения 5-10).

Удлинение алифатического радикала на одну метиленовую группу или введение разветвления приводит к ухудшению как эффективности, так и стереоселективности ацилирования почти на порядок.

Таблица 14. Кинетические параметры интегральной кинетики ферментативного ацилирования аминов амидом D-фенилглицина. Концентрация ацильного донора в случае аминов 1-3 составила 0,25 М, в остальных случаях – 0,35 М.

Концентрация Энантиомер VS0/E0, c-1 Выхода, % Амин S/H E амина, M R 300 35, 1 0,2 66 S 4,6 0, R 189 13, 2 0,2 165 S 1,15 0, 3 0,13 166 10,5 150 4 0,17 108 6 150 R 43 1, 5 0,21 150 S 0,29 0, R 20 0, 6 0,2 107 S 0,19 0, 7 0,15 0,23 н.о. R - 0, 8 0,2 31 S - 0, 9 0,2 1,7 0,06 н.о. 1, 10 0,2 0,05 0,01 - 0, а выход в расчете на рацемат амина В этом ряду высокое значение стереоселективности и эффективности ацильного переноса наблюдается только для фенилпропиламина (5). Разделение было проведено препаративно. Показатели препаративного получения обоих энантиомеров 5 приведены в таблице 15.

Таблица 15. Показатели эффективности разделения энантиомеров фенилпропиламина.

Продукт синтеза S-энантиомер Стадия ацилирования Выход 52% Выход 47% ee 96% ee 95% R-энантиомер Стадия гидролиза Выход 95% ee 99% Несмотря на высокую стереоселективность ацилирования амина 6 и, вероятно, 7 и 9, низкая эффективность их ацилирования амидом D-PG недостаточна для количественного превращения активного энантиомера. Для таких аминов на стадии ацилирования невозможно добиться высокой оптической чистоты не вступающего в реакцию неактивного энантиомера. В то же время повышение выхода продукта ацильного переноса можно добиться за счет понижения его растворимости при использовании более гидрофобных ацильных доноров.

Таблица 16. Параметры ацилирования аминов с помощью фенилацетамида (0,35 М).

Растворимость, Растворимость Теор.

Выходб, Концентрация VS0/E0, а Амин S/H М продукта, мМ Выход, c- амина, M % % 0, 0,15 65 0,3 0,15 49 0,15 19 0,11 0,25 1,0 40 0,15 8 0,05 0,14 0,16 44 а выход, рассчитанный по уравнению 4, в котором N0 принимали равным растворимости амина, деленный на два, для расчета на рацемат амина. Значение параметра приняли равным двум, что является верхней оценкой для данных соединений.

б выход в расчете на рацемат амина Применение в качестве ацильного донора амида ФУК вместо амида D-PG позволило существенно повысить выход продуктов ацилирования аминов 6 и 9, благодаря их низкой растворимости в воде. В случае амина 6 удалось провести близкое к количественному ацилирование активного энантиомера. Оптическая чистота оставшегося энантиомера амина превысила 90%. Таким образом, описанный метод может быть использован для получения S-энантиомера соединения 6 и R-энантиомера его фенилацетильного производного.

В случае ацилирования аминов 7 и 9 максимальный теоретический выход составляет около 45%, однако для его достижения необходимо использование не менее десятикратного избытка фенилацетамида над амином.

Таким образом, применение интегрального биокаталитического метода, основанного на реакциях, катализируемых ПА в водной среде, позволяет разделить рацематы первичных аминосоединений (аминокислот, аминоспиртов, гидрофобных аминов) на индивидуальные энантиомеры с высоким выходом и оптической чистотой. По своей эффективности и производительности описанный метод значительно превосходит известные из литературы методы разделения энантиомеров.

Список сокращений Интегральный биокаталитический метод – метод получения энантиомеров первичных аминов, включающий стадию ферментативного ацилирования и гидролиза, катализируемых ПА.

ПА – пенициллинацилаза ФУК – фенилуксусная кислота D-PG – D-фенилглицин S/H – отношение начальных скоростей синтеза и гидролиза ee – оптическая чистота, (cR-cS)/(cR+cS) E – стереоселективность, отношение начальных скоростей превращения отдельных энантиомеров NAC – N-ацетилцистеин ОФА – орто-фталевый альдегид ВЭЖХ – высокоэффективная жидкостная хроматография R – разрешение пиков – коэффициент селективности k – коэффициент емкости PhAcNH2 – фенилацетамид R,S-MA – R,S-миндальные кислоты R,S-MAA – амиды R,S-миндальных кислот PhOAcNH2 – феноксиацетамид p-OH-PhAcNH2 – пара-гидроксифенилацетамид ТГП – тетрагидропиранил Основные результаты и выводы 1. Показано, что ферментативный ацильный перенос на аминогруппы аминотиолов и аминоспиртов, катализируемый ПА из A.faecalis в водной среде, протекает хемо-, регио- и стереоселективно с высокой эффективностью. На основе этого были разработаны:

одностадийный биокаталитический метод получения энантиомерно чистых N-ацильных производных цистеина и глутатиона;

хемоэнзиматический метод получения энантиомерно чистых тиолов общей структуры N-ацил-(R)-фенилглицил-(R)-Cys.

2. Применение новых функционализированных энантиомерно чистых тиолов позволяет увеличить разрешение энантиомеров первичных аминосоединений при их высокоэффективной жидкостной хроматографии с предколоночной модификацией орто-фталевым альдегидом и делает возможным количественное определение энантиомеров ряда аминоспиртов и аминов.

3. Структура ацильного донора определяет эффективность, стереоселективность и полноту реакций ферментативного ацилирования первичных аминосоединений, катализируемых ПА из A.faecalis в водной среде. На основании этого были разработаны методики препаративного биокаталитического получения обоих энантиомеров ряда первичных аминосоединений. При получении энантиомеров -аминокислот наиболее эффективными ацильными донорами являются амиды S-миндальной и пара-гидроксифенилуксусной кислот;

при получении энантиомеров аминоспиртов – амиды пара-гидроксифенилуксной и R-миндальной кислот;

при получении энантиомеров гидрофобных аминов – амид D фенилглицина.

Список публикаций 1. Guranda D.T., Kudryavtsev P.A., Khimiuk A.Y., vedas V.K. Efficient chiral analysis of primary amines and amino alcohols by HPLC with precolumn derivatization using novel N-(R)-mandelyl-(S)-cysteine. J. Chromatogr. A, 2005, 1095, p.89-93.

2. Cernobrovkin M.G., Shapovalova E.N., Guranda D.T., Kudryavtsev P.A., vedas V.K. Shpigun O.A. Chiral high-performance liquid chromatography analysis of alpha-amino acid mixtures using a novel SH reagent-N-R-mandelyl-L-cysteine and traditional enantiomeric thiols for precolumn derivatization.

J. Chromatogr. A, 2007, v.1175, p. 89-95.

3. Гуранда Д.Ф., Кудрявцев П.А., Чернобровкин М.Г., Шаповалова Е.Н., Шпигун О.А., Швядас В.К. Способ определения энантиомеров первичных аминосоединений. Заявка на изобретение рег. номер. 2006123123.

Изобретения и полезные модели. Бюллетень №2, 20.01.2008.

4. Guranda D.T., Kudryavtsev P.A., Khimiuk A.J., Pchelintsev N.A., Shapovalova I.V., vedas V.K. New chiral thiols for HPLC determination of enantiomers of primary amines after pre-column modification with o-phthaldehyde. Abstracts of Int. Conf. “Biocatalysis-2002: Fundamentals and applications”. Moscow, Russia.

2002, p.88.

5. Guranda D.T., Kudryavtsev P.A., Khimiuk A.J., vedas V.K. Determination of enantiomers of primary amines by HPLC with pre-column modification with o phthaldehyde. Abstracts of Int. Conf. “100 Years of Chromatography”. Moscow, Russia. 2003, P-276, p. 388.

6. Kudryavtsev P.A., Baranov M.S., Panin N.V., Alekseev R.S., Ulanovskaya M.A., Guranda D.T. Chemo-enzymatic synthesis of polyfunctionalized thiols and their application for chiral HPLC analysis. Abstracts of the Int. Conf. “Biocatalysis 2005”. St. Petersburg, Russia. 2005, p.87.

7. Guranda D.T., Kudryavtsev P.A., Ulanovskaya M.A., Alekseev R.S., vedas V.K.

Polyfunctionalized thiols as novel SH-reagents for chiral HPLC analysis of primary amino compounds and monitoring of stereoselective biocatalytic transformations. Abstracts of the VII Int. Symp. on biocatalysis&biotransformations; “BioTrans-2005”. Delft, The Netherlands. 2005, p.309.

8. Guranda D.T., Kudryavtsev P.A., Ushakov G.A., Panin N.V., Bibin A.V., Sidorova A.V., vedas V.K. Biocatalytic resolution of amino compounds by using penicillin acylase in aqueous medium. Int. Symp. Advanced Science in Organic Chemistry. Sudak, Crimea, Ukraine. 2006, C-043.

9. Кudryavtsev P.A., Guranda D.T., Ushakov G.A., Panin N.V., Bibin A.V., Godina A.F., vedas V.K. Biocatalytic resolution of amino compounds by using penicillin acylase in aqueous medium. Abstracts of the Int. Conf. “Biotechnology-2007”.

Moscow, Russia. 2007, p.60.

10. D.T. Guranda, P.A. Kudryavtsev, N.V. Panin, V.K. Svedas, Synthesis of novel functionalized thiols catalyzed by penicillin acylase in aqueous medium. Their application as effective SH-reagents for chiral HPLC analysis of primary amino compounds, Int. Conference Biocatalysis-2007, Moscow-St.Petersburg, June 17 24, 2007, Abstracts, p.60-61.

11. Kudryavtsev P.A., Guranda D.T. Synthesis of functionalized thiols catalyzed by penicillin acylase in aqueous medium, and their application for chiral HPLC analysis. Abstracts of the Int. Conf. “Biocatalysis in non-convential media”.

Moscow, Russia. 2008, p.33.

12. Guranda D., Kudryavtsev P., Godina A., vedas V. Synthesis of functionalized thiols catalyzed by penicillin acylase in aqueous medium and their application for chiral HPLC analysis. Abstracts of the Int. Symp. “BioTrans”. Bern, Switzerland.

2009, p.323.

13. D. Guranda, P. Kudryavtsev, A. Godina, G. Ushakov, V. Sedlyarov, V. Svedas, Penicillin acylase-catalyzed resolution of amino compounds in aqueous medium, Proceedings of the International Conference “Enzyme Engineering XX”, Groningen, The Netherlands, September 20-24, 2009, p. 131-132.