Кинетические закономерности инактивации и стабилизация ферментов бактериофагов, специфичных к грам-положительным микроорганизмам
На правах рукописи
ФИЛАТОВА ЛЮБОВЬ ЮРЬЕВНА КИНЕТИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ИНАКТИВАЦИИ И СТАБИЛИЗАЦИЯ ФЕРМЕНТОВ БАКТЕРИОФАГОВ, СПЕЦИФИЧНЫХ К ГРАМ-ПОЛОЖИТЕЛЬНЫМ МИКРООРГАНИЗМАМ 02.00.15 - катализ 03.00.23 - биотехнология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук
Москва – 2009
Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова
Научный консультант:
доктор химических наук, профессор Клячко Наталья Львовна
Официальные оппоненты:
доктор химических наук, профессор Чухрай Елена Семеновна кандидат биологических наук Мирошников Константин Анатольевич
Ведущая организация:
Институт биохимии имени А.Н. Баха РАН » декабря 2009 года в 1600 часов на заседании диссертационного
Защита состоится « совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова Автореферат разослан ноября 2009 года И. о. ученого секретаря диссертационного совета, доктор химических наук Гусаков А.В.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. В настоящее время существует большое количество проблем, связанных с лечением заболеваний, вызываемых одними из наиболее опасных грам-положительных микроорганизмов – стрептококками и стафилококками.
Во многих странах мира регистрируются случаи тяжелых заболеваний, вызываемых стрептококками, таких как ангина, импетиго, рожа, скарлатина, ревматизм, нефрит, эндокардит, и их количество увеличивается с каждым годом. В Англии и Уэльсе в 1994 – 1997 годах зарегистрировано 1913 случаев тяжелых инфекций, вызванных стрептококками группы А. При этом 508 заболевших (27%) погибли. В США ежегодно регистрируют 10 - тысяч случаев инвазивных стрептококковых инфекций. За последние годы также отмечен рост заболеваемости ревматизмом, зарегистрированы даже вспышки этого заболевания: в Индии заболеваемость ревматизмом составляет 11 человек на 1000 человек населения. В России ежегодно болезни стрептококковой этиологии поражают 2 – 3 млн. человек, 10% случаев имеет летальный исход.
Стафилококковые инфекции (фурункулы, ячмени, пиодермии, ангины, пневмонии, маститы, флебиты, менингиты, энодкардиты и т. д.) входят в число самых распространенных и наиболее тяжелых внутрибольничных инфекций, в том числе обусловленных образованием биопленок стафилококков на различных поверхностях. Например, в США регистрируется более ста тысяч случаев инфицирования стафилококком в год, что обходится экономике этой страны в 4.5 – 5.7 млрд. долларов ежегодно. В Ирландии количество заболеваний, вызываемых стафилококками, в 1999 году составляло 39% от общего числа заболеваний, а в 2002 году – 45%. В России заболеваемость инфекциями, вызываемыми стафилококками, составляет 10 – 15 человек на 1000 человек населения. Среди пациентов, зараженных метициллин-устойчивыми штаммами, смертность составляет 31%.
Традиционные методы лечения стрептококковых и стафилококковых инфекций предполагают активное использование антибиотиков, однако широкое применение антибиотиков приводит к стремительному росту числа новых бактериальных штаммов, устойчивых к ним. Так, в настоящее время 29.7% штаммов Streptococcus pyogenes устойчивы к эритромицину. Почти 90% штаммов золотистого стафилококка резистентно к пенициллину и другим антибиотикам пенициллинового ряда.
Бактериофаги – вирусы бактерий, продуцирующие в процессе жизненного цикла ферменты, которые способны разрушать бактериальные клеточные стенки и могут рассматриваться в качестве серьезной альтернативы антибиотикам. В литературе эти ферменты получили название «лизины» или «лизоцимы».
В данной работе будут рассматриваться ферменты, осуществляющие разрушение (лизис) клеточной стенки за счет гидролиза химических связей в пептидогликане - основном компоненте клеточных стенок грам-положительных бактерий. Фермент PlyC способен эффективно лизировать клетки стрептококков групп А, С и Е, а фермент LysK – клетки Staphylococcus aureus, в том числе штаммы, резистентные к метициллину и ванкомицину.
Основной проблемой, ограничивающей использование в медицине рассматриваемых ферментов, является недостаток сведений о них как о биокатализаторах, их низкая стабильность при хранении и отсутствие данных об их кинетических характеристиках и механизмах инактивации.
Цели и задачи исследования. Цель настоящей работы – изучение физико-химических свойств и разработка подходов к стабилизации бактериолитических ферментов PlyC и LysK для создания лекарственных препаратов нового поколения для лечения инфекций, вызываемых стрептококком групп А, С и Е и золотистым стафилококком.
В соответствии с целью в диссертационной работе были поставлены следующие задачи:
1. Исследование кинетических характеристик и параметров инактивации ферментов LysK и PlyC.
2. Дискриминация механизмов инактивации ферментов LysK и PlyC.
3. Выбор стабилизирующих агентов из соединений разных классов и методов стабилизации ферментов LysK и PlyC с учетом особенностей их использования в медицине и ветеринарии:
-учет механизмов инактивации;
-простота и дешевизна методов;
-соответствие требованиям фармакологии;
-удобная форма использования (раствор, порошок).
4. Оценка эффективности функционирования ферментов LysK и PlyC и их стабилизированных препаратов на культурах живых клеток.
Научная новизна.
1. Впервые изучено влияние рН, температуры и солевого состава среды на каталитическую активность ферментов LysK, лизирующего клетки Staphylococcus aureus и PlyC, лизирующего клетки Streptococcus pyogenes.
2. Впервые идентифицированы механизмы термоинактивации ферментов LysK и PlyC.
3. Для LysK показано возможное присутствие в молекуле фермента остатка гистидина, ответственного за катализ, и катиона кальция, который играет структурную роль.
4. Для ферментов LysK и PlyC впервые предложены простые и эффективные способы стабилизации, при использовании которых они сохраняют 100% активности в течение 2 – месяцев инкубации при температуре хранения (22°С).
5. Показана воспроизводимость результатов функционирования фермента PlyC на культурах «убитых» и «живых» бактериальных клеток Streptococcus pyogenes.
Практическая значимость работы. Стабильные препараты бактериолитических ферментов LysK и PlyC имеют перспективы для применения в качестве средств гигиены полости рта (лечение ангин, тонзиллитов), средств для внутреннего введения на ранних и поздних стадиях развития инфекций, средств для лечения заболеваний кожных покровов (рожа, фурункулы, нагноения).
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих конференциях: International student’s forum (Omaha, Nebraska, USA, 2008), Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2008» (Москва, Россия, 2008), XVIth International Conference on Bioencapsulation (Dublin, Ireland, 2008), Международный форум по нанотехнологиям (Москва, Россия, 2008), V Международный Московский биотехнологический конгресс «Биотехнология 2009: состояние и перспективы развития» (Москва, Россия, 2009), I Международная летняя научная школа «Нано 2009. Наноматериалы и нанотехнологии в биологии и медицине» (Москва, Россия, 2009), конференция «Biocatalysis 2009: Fundamentals and Applications» (Arkhangelsk, Russia, 2009), Третья международная конференция «Современные достижения бионаноскопии» (Москва, Россия, 2009).
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 3 статьи и тезисов докладов конференций.
Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (три главы), описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения (три главы), выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит страницы печатного текста, 56 рисунков, 15 таблиц и 160 ссылок.
Список использованных в работе сокращений. S. pyogenes – Streptococcus pyogenes, St. aureus – Staphylococcus aureus, pI – изоэлектрическая точка, SDS – додецилсульфат натрия, 1/2 – время полуинактивации фермента, КД – круговой дихроизм, ЭДТА – натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, kин – кинетическая константа скорости инактивации, S - сведберг, BS3 - бис-сульфосукцинимидилсуберат натрия, A/A0 – остаточная активность фермента, НПАВ – неионогенное поверхностно-активное вещество, ПБ – полибрен (ионен на основе тетраметилгексаметилендиамина и триметилендибромида).
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Обзор литературы включает три главы. В главе I рассмотрены различные типы классификаций, особенности строения клеточных стенок и факторы патогенности стрептококков и стафилококков. В главе II охарактеризована роль литических ферментов в жизненном цикле бактериофагов, рассмотрена классификация и особенности механизмов действия пептидогликангидролаз. Также обсуждены перспективы применения фаговых лизинов в качестве антимикробных препаратов. В главе III дан подробный анализ существующих в настоящее время способов стабилизации ферментов, приведены примеры, иллюстрирующие их эффективность.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ Используемые ферменты и субстраты. В качестве субстратов использовали препарат клеток Staphylococcus aureus (штамм 209 В-580), любезно предоставленный сотрудниками ОАО «Вектор» г. Новосибирска и препарат клеток Streptococcus pyogenes (штамм D-28/ N62/59, Пражская коллекция, клетки типа М 29), любезно предоставленный сотрудниками факультета профилактической медицины ММА им. И.М. Сеченова. Методики выращивания клеток были стандартизованы. В целях обеспечения безопасности работы клетки были «убиты» в мягких условиях без нарушения целостности клеточных стенок.
Рекомбинантный фермент, лизирующий клетки Staphylococcus aureus (LysK), в виде водного раствора (20 мМ трис, 150 мМ хлорид натрия, 1% глицерин, pH 7.5) в концентрации 3.5 мг/мл любезно предоставил профессор Донован Д.М. (Animal Biosciences and Biotechnology Laboratory, Animal and Natural Resources Institute, ARS-USDA Beltsville Agricultural Research Center).
Рекомбинантный фермент, лизирующий клетки Streptococcus pyogenes (PlyC) в виде водного раствора (20 мМ калий-фосфатный буфер, pH 6.3) в концентрации 8 мг/мл любезно предоставлен компанией New Horizons Diagnostics Columbia MD (США).
Оба фермента секвенированы, известны их аминокислотные последовательности и олигомерная организация. Молекула фермента LysK состоит из одной субъединицы массой 56 кДа. Молекула PlyC является олигомером и содержит тяжелую и легкую субъединицы массами 50 и 8 кДа при общей массе молекулы 114 кДа. Показано, что молекула PlyC содержит одну субъединицу PlyCA и 8 субъединиц PlyCB (Nelson et al, 2006).
На основе сравнения аминокислотной последовательности молекулы фермента LysK с аминокислотными последовательностями других белков при помощи базы данных консервативных доменов Pfam (www.sanger.ac.uk/Software/Pfam) в данной работе было показано, что LysK, как и большинство фаговых лизинов, имеет модульное строение. В состав молекулы LysK входят два каталитических домена - CHAP (характерен для амидаз), Amidase-2 (характерен для пептидаз) и один домен связывания - SH3 5. При этом довольно большое количество участков аминокислотной последовательности не имеет гомологичных структур (рис. 1 А), что затруднило построение пространственной структуры.
Методом масс-спектрометрии было показано, что молекула фермента LysK обладает по отношению к пептидогликану St. aureus двумя типами активности – амидазной (гидролиз связи между N-ацетилмурамовой кислотой и L-аланином) и пептидазной (гидролиз связи между глицином и D-аланином) (Donovan et al, 2008). Строение пептидогликана St. aureus и места действия на него фермента LysK показаны на рис. 1 Б.
Для фермента PlyC методами сайт-специфического мутагенеза было установлено, что за катализ отвечают остатки Cys333 и His420 (Nelson et al, 2006). На основе сравнения аминокислотных последовательностей субъединиц PlyCA и PlyCB молекулы фермента PlyC с аминокислотными последовательностями других белков при помощи базы данных консервативных доменов Pfam (www.sanger.ac.uk/Software/Pfam) в данной работе было показано, что большая субъединица PlyCA содержит каталитический домен CHAP. Для малой субъединицы PlyCB гомологичных ей структур выявлено не было. Установлено, что PlyC обладает по отношению к пептидогликану S. pyogenes амидазной активностью (Fishetti et al, 1972). Гипотетическая структура молекулы PlyC и место действия фермента на пептидогликан S. pyogenes показаны на рис. 2 А и Б.
Следует отметить, что фермент LysK активен только по отношению к клеткам стафилококков, а PlyC – стрептококков групп А, С и Е. Высокую специфичность действия бактериолитических ферментов связывают с наличием доменов связывания, которые реагируют только на определенные компоненты клеточных стенок, например, полисахаридные фрагменты, тейхоевые кислоты, белки. Именно этим и объясняют тот факт, что отдельный фермент специфичен не только к конкретному виду микроорганизмов, но и к конкретным штаммам этого микроорганизма. В целом, при сравнении бактериолитических ферментов одного класса было показано, что каталитические домены у них имеют довольно высокую гомологию, в то время как область связывания неконсервативна (Мирошников и др., 2006).
-GlcNAc-MurNAc-GlcNAc LysK CHAP L-Ala D-iGln SH3 Amidase CHAP L-Lys -Gly-Gly-Gly-Gly-Gly D-Ala 38 160 200 336 409 475 D-Ala LysK Amidase Б A Рис. 1. А. Схематическое изображение третичной структуры молекулы LysK. Б. Точки действия фермента LysK на пептидогликан Staphylococcus aureus.
-GlcNAc-MurNAc-GlcNAc PlyC CHAP L-Ala D-Glu L-Lys L-Ala L-Ala L-Ala D-Ala А Б Рис. 2. А. Схематическое изображение молекулы PlyC. Б. Точки действия фермента PlyC на пептидогликан Streptococcus pyogenes.
Измерение активности ферментов. Субстратом для обоих ферментов служит пептидогликан клеточных стенок, концентрация которого спектрофотометрически не определяется. В связи с этим концентрацию субстрата выражали в единицах поглощения при 600 нм., а скорость реакций - в единицах поглощения на единицу времени.
Суспензии клеток стрептококка и стафилококка тонкодисперсные, не оседающие в течение длительного времени. Это дало возможность для определения скорости реакции использовать метод слежения за изменением мутности суспензий, происходящим в результате действия ферментов (рис. 3, 4). Изменение мутности суспензий адекватно отражало изменение концентрации пептидогликана.
0. A600, ед. погл.
0. A600, ед. погл.
0. 0. 0. 0. 0. 0.15 0. 0.10 0. 0. 0. 0. 0. 100 200 300 400 500 100 200 300 400 500 Время, с Время, с Рис. 3. Типичная кинетическая кривая, Рис. 4. Типичная кинетическая кривая, описывающая зависимость мутности описывающая зависимость мутности суспензии клеток S. pyogenes от времени с суспензии клеток St. aureus от времени с описанием метода определения скорости описанием метода определения скорости реакции по тангенсу угла наклона реакции по тангенсу угла наклона начального участка. Условия эксперимента: начального участка. Условия эксперимента:
клетки суспендированы в 20 мМ калий- клетки суспендированы в 20 мМ калий фосфатном буфере с рН 6.3, 37°С, А600 = 0.3 фосфатном буфере с рН 7.5, 37°С, А600 = 0. ед. погл., концентрация фермента 0.08 г/мл. ед. погл., концентрация фермента 5 г/мл.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Выявление оптимальных условий функционирования ферментов. В настоящей работе были получены зависимости активностей ферментов от их концентраций и от содержания субстратов. Зависимости активностей ферментов от их содержания линейны в широком диапазоне концентраций (0.1 – 20 г/мл), а от концентраций субстратов имеют вид кривых с насыщением. Следует отметить, что оптическая плотность суспензий клеток прямо пропорциональна содержанию клеток во всем диапазоне значений, исследованных в работе.
Таким образом, взаимодействие ферментов с клетками можно описать простейшей двухстадийной схемой Михаэлиса-Ментен.
В настоящей работе впервые была исследована зависимость параметров функционирования ферментов от рН среды. Величины Km и kcat определяли линеаризацией данных в двойных обратных координатах Лайнуивера-Берка. Так как содержание субстрата выражено в единицах поглощения, а не в единицах концентрации, то определяемые эфф эфф параметры являются величинами эффективными, обозначаемыми как K m и kcat. Для фермента LysK, активного по отношению к St. aureus, было установлено, что эффективные значения каталитических констант уменьшаются при рН ниже 6 и выше 9.6, величины эфф K m от рН не зависят. Из этого можно заключить, что существует три формы фермента и фермент–субстратного комплекса: кислая, нейтральная и основная, причем переходы между ними контролируются группами с рК 6 и 9.6 (при 22°С). Значения рК также следует рассматривать как кажущиеся величины (рКэфф), потому что, например, рН околоклеточного пространства может отличаться от рН среды, что приводит к изменению истинных значений рК ионогенных групп молекулы фермента.
При исследовании температурных зависимостей эффективных констант ионизации было показано, что группе с рКэфф 6 (при 22°С) соответствует эффективная теплота ионизации 30±3 кДж/моль. Эффективные величины константы и теплоты ионизации соответствуют остатку гистидина. Наличие остатка гистидина, ответственного за катализ, подтверждает тот факт, что фермент инактивируется в течение нескольких минут при инкубации с диэтилпирокарбонатом в молярном соотношении 1:1.
При исследовании влияния рН на функционирование фермента PlyC было установлено, что активность фермента от рН практически не зависит (рН 3 – 11). Константы ионизации цистеина и гистидина не просматриваются.
Показано, что температурный оптимум функционирования обоих ферментов составляет 37°С.
2. Дискриминация механизмов инактивации ферментов LysK и PlyC.
Особенности механизма инактивации фермента LysK. Для фермента LysK в настоящей работе было показано, что зависимости остаточной активности от времени описываются уравнением второго порядка в интервале температур 20 - 40°С, рН 6 - 9, интервале концентраций 0.05 – 0.5 мг/мл.
Зависимость эффективных констант инактивации второго порядка от рН показана на рис. 5. Из рис. 5 видно, что при значениях рН, близких к изоэлектрической точке (8.6) константы инактивации второго порядка имеют наибольшее значение. Подобная зависимость указывает на то, что инактивация протекает за счет агрегации.
Белок–белковые взаимодействия можно подавить путем разбавления растворов фермента. На рис. 6 приведены зависимости времен полуинактивации от концентрации LysK при трех значениях рН – 6.1, 7.5 и 8.6 и температуре 37°С. Из рис. 6 видно, что чем меньше концентрация фермента, тем больше время полуинактивации и чем ниже рН, тем фермент более стабилен.
Зависимости натуральных логарифмов констант инактивации второго порядка при рН 6.1, 7.5 и 8.6 от температуры (при температурах ниже 40°С) приведены на рис. 7. Исходя из уравнения Аррениуса установлено, что энергии активации процесса инактивации имеют следующие значения: при рН 6.1 - 178±5 кДж/моль, при рН 7.5 - 172±8 кДж/моль, при рН 8. - 160±2 кДж/моль. Эти данные свидетельствуют о том, что термостабильность LysK коррелирует с величинами активационных параметров (чем выше их значения, тем выше термостабильность). Близость значений энергий активации свидетельствует о том, что лимитирующая стадия инактивации при указанных рН, температурах и концентрациях фермента LysK одна и та же – межмолекулярные взаимодействия белковых глобул.
3.0 logkин, (M *c ) - 1/2, ч - 2. 2. 1. 1.0 0. 0.1 0.2 0.3 0.4 0. 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 8.5 9. Концентрация LysK, мг/мл pH констант Рис. 6. Зависимость времени Рис. 5. рН зависимость инактивации второго порядка при 37С. полуинактивации от концентрации концентрация фермента LysK при рН 6.1 ( ), 7.5 ( ), 8. Условия эксперимента:
фермента в инкубируемых образцах была ( ) и 37°С.
0.2 - 0.5 мг/мл, LysK был растворен в буфере с рН 6 – 9, содержащем 20 мМ трис и 20 мМ фосфата калия.
Рис. 7. Температурная зависимость констант инактивации второго порядка при lnkин, (M-1c-1) рН 6.1 ( ), 7.5 ( ) и 8.6 ( ) в координатах уравнения Аррениуса. Условия эксперимента: фермент LysK в концентрации 0.2 – 0.5 мг/мл был растворен в буфере, содержащем 20 мМ трис и 20 мМ фосфата калия, интервал температур – 22 40°С.
- - 3.20 3.25 3.30 3.35 3. 3 - (1/T)*10, K Характер процесса инактивации был исследован при помощи методов нативного и SDS электрофореза в полиакриламидном геле. Растворы фермента в концентрации 0.2 - 0.5 мг/мл (рН 7.5) инкубировали разные промежутки времени при 22 - 40°С, затем отбирали аликвоты для проведения электрофореза. Данные SDS электрофореза показали отсутствие появления новых полос с более низкими или более высокими молекулярными массами, что свидетельствует об отсутствии процессов агрегации за счет ковалентных взаимодействий или протеолиза. Таким образом, основная причина инактивации – агрегация молекул фермента за счет нековалентных взаимодействий (солевые мостики, водородные связи, гидрофобные взаимодействия). Агрегационный механизм инактивации подтверждают данные нативного электрофореза (рис. 8). На электрофореграмме видны полосы не инактивированного фермента и LysK после инкубации в течение 48 ч при 37°С. Видно, что молекулярная масса полностью инактивированного фермента выше, чем неинактивированного, образующиеся при инактивации LysK агрегаты практически не могут войти в гель. Данные седиментационного анализа согласуются с результатами нативного электрофореза. Методом седиментации показано наличие белковых глобул массой 50 кДа для неинактивированного LysK, для полностью инактивированного фермента было обнаружено наличие небольшого количества частиц массой 550 кДа, массы остальных частиц находились за пределами измерения прибора.
Схема процесса инактивации LysK показана на рис. 9. Первую часть схемы иллюстрируют данные кинетических измерений, вторую – данные электрофореза и седиментации. Необратимость инактивации была доказана измерением активности охлажденных растворов фермента.
kин Агрегированный LysK + Активные Неактивные Мономолекулярный LysK Неактивные Рис. 8. Нативный электрофорез LysK до Рис. 9. Схема процесса инактивации LysK процесса инактивации и полностью при рН 6 – 9, 20 - 40°С, концентрации инактивированного при рН 7.5, 37°С, фермента 0.05 – 0.5 мг/мл.
концентрации фермента 0.5 мг/мл.
Высокотемпературная инактивация фермента LysK дает возможность судить о сложности процесса инактивации. На рис. 10 А и Б показаны зависимости времен полуинактивации от температуры при фиксированном рН (7.5) и разных концентрациях фермента и при фиксированной концентрации фермента (0.5 мг/мл) и разных значениях рН.
Из рис. 10 А и Б видно, что в области температур 40 - 42°С наблюдается резкое уменьшение стабильности LysK независимо от концентрации и рН раствора фермента.
Б А log1/2, (c) log1/2, (с) 3 2 1 20 25 30 35 40 45 20 25 30 35 40 45 t, C t, C Рис. 10. Зависимость времени полуинактивации LysK от температуры. А. Условия эксперимента: концентрация LysK 0.05 ( ), 0.2 ( ), 0.5 ( )мг/мл, рН 7.5. Б. Условия эксперимента: концентрация LysK 0.5 мг/мл, рН 6.1 ( ), 7.5 ( ), 8.6 ( ).
С целью проверки данных, полученных с помощью изучения кинетики инактивации, и для получения дополнительной информации о механизме инактивационного процесса, LysK был охарактеризован с помощью спектров кругового дихроизма (КД). Спектры КД были получены для раствора фермента LysK концентраций 0.2 и 0.5 мг/мл, рН 7.5, температурах 22, 37 и 45°С. Показано, что при разных температурах и степенях инактивации содержание различных элементов вторичной структуры меняется незначительно.
Спектры флуоресценции получены для раствора фермента LysK концентраций 0.02 и 0.05 мг/мл, рН 7.5, температурах 22, 37 и 45°С. Показано, что максимум флуоресценции находится при длине волны 340 нм и его положение не зависит от температуры и времени инкубации при какой-либо температуре. Следовательно, при инактивации фермента не происходит изменения микроокружения остатков триптофана.
Среди прочих особенностей инактивации фермента LysK можно отметить следующие.
Во-первых, на активность и стабильность LysK вне зависимости от температуры, концентрации фермента (рН 7.5) не влияют реагенты тиолдисульфидного обмена:
дитиотреитол, меркаптоэтанол, глутатион. Следовательно, хотя гипотетически остаток цистеина и входит в реакционный центр, его окисление не являетя причиной инактивации.
Во-вторых, при инкубировании LysK в присутствии ЭДТА вне зависимости от температуры, концентрации фермента (рН 7.5) не происходит изменения активности, но уменьшается стабильность. Это может свидетельствовать в пользу наличия в молекуле фермента катиона металла, играющего структурную роль.
В-третьих, при инкубировании фермента LysK в присутствии различных солей на активность и стабильность влияет только природа катиона. При проведении исследования влияния катионов металлов на активность и стабильность фермента было обнаружено стабилизирующее влияние катионов кальция в концентрации 1 – 5 мМ и необратимое ингибирование и дестабилизация катионами Co3+, Cu2+, Zn2+ в концентрации 10 М – 1 мМ.
В четвертых, фермент LysK полностью теряет активность при инкубации в течение нескольких минут в присутствии полианионов: полиакриловых кислот и декстран сульфатов различных молекулярных масс. Этот факт свидетельствует о том, что в молекуле фермента имеется положительно заряженная группа, либо ответственная за катализ, либо находящаяся вблизи реакционного центра.
Особенности механизма инактивации фермента PlyC. Кривые инактивации для фермента PlyC были получены в интервале температур 20 - 50°С, рН 6 – 8, концентраций фермента 0.3 – 160 г/мл. Так как фермент PlyC является олигомером (содержит одну большую субъединицу PlyCA и восемь малых субъединиц PlyCB), то возможно проявление диссоциативного механизма инактивации. И действительно, при анализе кривых термоинактивации фермента PlyC были выявлены следующие закономерности:
-наличие на кривых инактивации точек «излома» в полулогарифмических координатах (т. е. кривые инактивации при определенных условиях описываются суммой двух экспонент, рис. 11 А и Б), -регенерация активности при малых временах термообработки (до «излома»), -изменение положения точки излома в зависимости от концентрации фермента при фиксированной температуре (рис. 11 А, 37°С, 0.3 – 160 г/мл), -изменение положения точки излома в зависимости от температуры при фиксированной концентрации фермента (рис. 11 Б, 8 г/мл, 37 - 45С).
Все эти данные удовлетворяют основным положениям теории диссоциативной инактивации. Диссоциация фермента была изучена методом седиментации. В таблице приведены данные седиментационного анализа для фермента до инактивации и полностью инактивированного при 37°С. Видно, что в случае полностью инактивированного фермента появляется дополнительный белок весом 8 кДа, что соответствует массе малой субъединицы PlyCB. Следовательно, процесс инактивации фермента PlyC можно описать схемой, показанной на рис. 12.
Таблица 1. Данные седиментационного анализа для PlyC (рН 6.3, 160 г/мл).
Остаточная активность Молекулярная масса Коэффициент седиментации 1 110 кДа (100%) 6.9S 0 100 кДа (90%) 6.6S 8 кДа (10%) 1.2S 0.3 г/мл Б A 0.0 37°C ln(A/A0) 0. lnA/A 3 г/мл 39°C 8 г/мл -0. -0. 41.5°C 16 г/мл -1.0 45°C -1. 160 г/мл -1.5 -1. -2. -2. -2. -2. -3. -3. 0 2 4 6 8 10 12 14 0 1 2 3 Время, сут Время, сут Рис. 11. Изображение в полулогарифмических координатах кривых инактивации PlyC. А.
Условия эксперимента: 20 мМ калий-фосфатный буфер, рН 6.3, концентрация фермента 0.3 160 г/мл, 37С. Б. Условия эксперимента: 20 мМ калий-фосфатный буфер, рН 6.3, концентрация фермента 8 г/мл, 37 - 45С.
Рис. 12. Схема инактивации фермента PlyC.
Было показано, что по отдельности большая и малая субъединицы молекулы фермента PlyC активностью не обладают (Nelson et al, 2006). Поэтому величина k2 количественно характеризует процесс необратимой инактивации формы фермента, содержащей одну субъединицу PlyCA и семь субъединиц PlyCB, которая впоследствии в данной работе будет обозначена как «диссоциированная форма фермента». Неинактивированная форма PlyC будет обозначена как «олигомерная форма фермента».
Константы, описывающие диссоциативный процесс (Kdis – константа диссоциации олигомерной формы фермента, k1 – константа скорости диссоциации олигомера, k2 – константа скорости необратимой инактивации диссоциированной формы), рассчитаны по уравнениям, рекомендуемым теорией диссоциативной инактивации (Полторак и др., 1998) и приведены в таблице 2. Данные таблицы 2 подтверждают тот факт, что при повышении температуры величина кинетической константы скорости диссоциации олигомера k растет существенно быстрее, чем кинетическая константа скорости инактивации диссоциированной формы фермента k2. Это означает, что при температурах выше 41.5°С диссоциация олигомера протекает настолько быстро, что скорость лимитирующей стадией становится стадия инактивации диссоциированной формы фермента, которая описывается уравнением первого порядка. При температурах ниже 37°С k1k2. и скорость-лимитирующей стадией становится диссоциация олигомера. В диапазоне температур 37 – 41.5°С константы скорости диссоциации олигомера и инактивации диссоциированной формы фермента сопоставимы и это приводит к появлению двуэкспоненциальной зависимости остаточной активности от времени.
Следует отметить, что в интервале исследованных рН величины констант, характеризующих процесс диссоциативной инактивации, являются рН независимыми.
Таблица 2. Кинетические параметры диссоциативной термоинактивации PlyC.
Kdis107, M k1106, c-1 k2106, c- рН t, °С 6.3 37 3.2 10.0 2. 39 4.4 100.0 9. 41.5 10 200 7 37 3.1 1.0 2. 39 4.5 98 9. 41.5 9 195 8 37 3 0.9 2. 39 4.6 99 9. 41.5 9 190 Таблица 3. Причины инактивации ферментов LysK и PlyC в зависимости от условий.
Фермент Условия Причина инактивации рН t, °C Концентрация фермента LysK 6–9 20 – 40 0.05 – 0.5 мг/мл Необратимая агрегация за счет нековалентных взаимодействий 6–9 40 – 50 0.05 – 0.5 мг/мл Не определена 6, 9 40 – 50 0.05 – 0.5 мг/мл Денатурация PlyC 6–8 37 – 41.5 0.3 – 160 г/мл Диссоциация 6–8 41.5 0.3 – 160 г/мл Мономолекулярный механизм 37 инактивации 6, 8 20 – 50 0.3 – 160 г/мл Денатурация В таблице 3 приведены суммарные результаты исследования инактивации бактериолитических ферментов LysK и PlyC. Из приведенных данных можно сделать вывод, что при 22°C фермент LysK инактивируется за счет агрегации за счет гидрофобных взаимодействий, а PlyC – по мономолекулярному механизму.
3. Стабилизация ферментов. Следует отметить, что испытания стабилизированных ферментных препаратов проводили при двух температурах: 22°С и 37°С (ускоренная инактивация).
Стабилизация LysK. Исходя из того, что фермент LysK инактивируется по агрегационному механизму, логично предположить, что путем увеличения вязкости растворов можно уменьшить частоту столкновений между молекулами фермента и подавить инактивацию. И действительно, глицерин, сорбитол, сахароза и трегалоза оказывают стабилизирующее влияние в высоких (40 - 60%) концентрациях. В качестве примера влияние 50% концентраций глицерина, сорбитола, сахарозы и трегалозы на стабильность LysK при 37°С показано на рис. 13. Из рисунка видно, что время полуинактивации фермента возрастает в 200 раз, а значения констант инактивации второго порядка во столько же раз уменьшаются.
Остаточная активность LysK Остаточна яактивность LysK Без добавок 1. 1.0 Без добавок 50% глицерин 2+ 1 мM Ca 0. 50% сорбитол 0.8 2+ 5 мM Ca 50% сахароза 0. 0.6 50% трегалоза 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0 5 10 15 20 0 20 40 60 Время, сутки Время, сутки Рис. 13. Влияние 50% содержания Рис. 14. Влияние катиона кальция на глицерина, сорбитола, сахарозы, трегалозы стабильность фермента LysK. Условия на стабильность фермента LysK. Условия эксперимента: 37°С, рН 7.5, 0.5 мг/мл LysK.
эксперимента: 37°С, рН 7.5, 0.5 мг/мл LysK.
Так как добавление ЭДТА в небольших концентрациях (0.1 – 0.5 мМ) дестабилизировало фермент, было сделано предположение о возможном наличии в молекуле фермента катиона металла и исследовано влияние катионов различной природы на активность и стабильность LysK. Из катионов металлов стабилизирующее влияние на фермент оказывает катион кальция в концентрации 1 - 5 мМ. Время полуинактивации LysK при 37°С увеличивается в 56 раз (рис. 14). Так как катион кальция не влияет на начальную активность фермента, логично предположить, что он играет структурную роль, но не отвечает за катализ.
Известно, что агрегацию белковых молекул можно подавить не только увеличением вязкости растворов, но и добавлением полиэлектролитов. Так как в присутствии полианионов наблюдается быстрая инактивация фермента, то были взяты поликатионы, такие как полибрен, полилизины, полиэтиленимины различных молекулярных масс. Было установлено, что поликатионы не влияют на стабильность фермента при рН ниже изоэлектрической точки (значение pI, равное 8.6, было определено методом изоэлектрического фокусирования), когда молекулы фермента и полиэлектролита одинаково заряжены. Все без исключения поликатионы проявляют стабилизационный эффект при рН (выше pI), который наиболее ярко проявляется при использовании полибрена.
Включение LysK в комплексы с полибреном (5 – 10 кДа) приводило к увеличению стабильности фермента. На рис. 15 показана зависимость константы инактивации второго порядка от содержания полибрена (ПБ). Из рисунка видно, что константа инактивации второго порядка уменьшается при увеличении молярного соотношения ПБ/фермент до значения, равного 15 и далее остается постоянной.
Для увеличения отрицательного заряда молекулы LysK (при этом увеличивается число электростатических контактов молекул фермента и поликатиона и сдвиг значения изоэлектрической точки в сторону более низких значений) проводили модификацию аминогрупп фермента янтарным ангидридом.
Количество отрицательных зарядов на поверхности молекулы фермента варьировали, получая производные с различной степенью модификации. На рис. 16 приведены кривые инактивации фермента без добавок, фермента в присутствии полибрена с различными степенями модификации: 0, 30, 50 и 70%. Видно, что чем выше степень модификации, тем выше число электростатических контактов, тем выше стабильность.
Суммарные результаты по стабилизации модифицированного и немодифицированного фермента при рН 9 и температурах 22 и 37°С приведены в таблице 4. Из таблицы 4 видно, что, варьируя степень модификации молекулы LysK янтарным ангидридом и молярное соотношение ПБ/фермент, можно добиться уменьшения констант инактивации второго порядка на 2 порядка и увеличения времен полуинактивации на 3 порядка по сравнению с LysK без добавок.
Остаточная активность LysK 3. logkин, (M c ) 1. -1 - Без добавок 2.5 ПБ/LysK 15, 0% 0. ПБ/LysK 15, 70% 2. ПБ/LysK 15, 50% 0. 1.5 ПБ/LysK 15, 30% 0. 1. 0. 0. 0.0 0. 0 20 40 60 80 100 120 140 0 5 10 15 20 25 30 Время,ч ПБ/LysK, моль/моль Рис. 16. Стабилизация полибреном LysK, Рис. 15. Влияние содержания полибрена модифицированного янтарным ангидридом.
на константу инактивации второго Условия эксперимента: рН 9 (20 мМ трис), порядка при рН 9 (20 мМ трис), 37°С, концентрация LysK 0.5 мг/мл, концентрации фермента 0.5 мг/мл, соотношение полибрен/фермент равно температурах 37°С ( ) и 22°С ( ).
моль/моль, степени модификации молекулы LysK эквивалентны 0, 30, 50, 70%.
Таблица 4. Стабилизация LysK полибреном при рН 9.
t, °С Cтепень модификации аминогрупп ПБ/LysK, kинLysK/kин t1/2эксп, ч LysK янтарным ангидридом, % моль/моль 37 0 0 1 0. 1 10 2. 15 26 30 1 20 15 24 50 1 75 15 116 70 1 175 15 268 22 0 0 1 1. 1 11 15 21 50 1 27.5 15 46 70 1 69 15 82 Так как, модификация аминогрупп LysK янтарным ангидридом приводит не только к увеличению числа электростатических контактов между ним и поликатионом, но и к сдвигу значения pI в сторону меньших значений рН, то в данной работе было показано, что при 37°С, рН 7.5, степенях модификации аминогрупп молекулы LysK 50 и 70% и соотношениях ПБ/фермент 1 – 15 моль/моль время полуинактивации LysK увеличивается в 150 – 200 раз.
Положительное влияние на стабильность LysK оказывает не только образование нековалентных комплексов, но и химическая иммобилизация фермента за счет пришивания его молекул к поверхности полимерных носителей: полиальдегида (получали периодатным окислением декстрана) и полилизина («ножка» - глутаровый альдегид). Процессы сшивания контролировали при помощи метода SDS электрофореза. Иммобилизованный таким образом фермент LysK (сохранивший после иммобилизации 40 – 60% остаточной активности) сохраняет 100% активности через месяц инкубации при 22°С.
На рис. 17 суммированы результаты по стабилизации фермента LysK при помощи перечисленных выше реагентов и методов при 22°С. Из рисунка видно, что в присутствии 50% глицерина, сорбитола, сахарозы, трегалозы, 1 – 5 мМ кальция, а также у сукцинилиованного фермента в присутствии полибрена сохраняется от 80 до 100% активности через 4 месяца хранения при 22°С.
Рис. 17. Влияние различных добавок на остаточную активность LysK при 22°С, рН 7.5, концентрации фермента 0.5 мг/мл через 1 месяц (белый) и 4 месяца (черный). 0 – остаточная активность фермента без добавок после месяца инкубации при 22°С.
№ Агент № Агент № Агент 2+ 1 50% глицерин 5 1 мМ Са 9 50% suc*, ПБ/LysK 6 5 мМ Са2+ 2 50% сорбитол 10 50% suc*, ПБ/LysK 3 50% сахароза 7 Полиальдегид 11 70% suc*, ПБ/LysK 4 50% трегалоза 8 Полилизин/глутаровый альдегид 12 70% suc*, ПБ/LysK suc – LysK, модифицированный янтарным ангидридом Стабилизация PlyC. Исходя из обнаруженного диссоциативного механизма инактивации PlyC, мы предположили, что наиболее эффективным способом стабилизации будет наложение внутримолекулярных химических сшивок на его молекулу. Наиболее эффективным оказалось использование активных по отношению к аминогруппам глутарового альдегида и бис-сульфосукцинимидилсуберата натрия (BS3). Процесс сшивания контролировали при помощи электрофореза в денатурирующих условиях.
На рис. 18 А показан пример электрофореграммы. На первой дорожке, куда был нанесен образец несшитого фермента, отчетливо видно наличие двух полос, одной в области ниже 13 кДа, другой – чуть выше 46 кДа. На третьей и четвертой дорожках отсутствуют полосы, соответствующие массам 50 и 8 кДа и видны полосы, лежащие в области ниже кДа и выше 66 кДа. Из полученных данных можно заключить, что при взаимодействии PlyC с BS3 происходит наложение внутримолекулярных сшивок на молекулу фермента.
Аналогичным образом было показано наличие наложения внутримолекулярных сшивок при взаимодействии PlyC и глутарового альдегида.
Влияние наложения внутримолекулярных сшивок на стабильность PlyC при температуре 37°С показано на рис. 18 Б. Из рисунка видно, что стабилизирующий эффект зависит от вида сшивающего агента: наложение сшивок при помощи BS3 является более эффективным. Кроме того, показано, что при наложении сшивок исчезает концентрационная зависимость и появляется мономолекулярный механизм при инактивации PlyC. Показано, что при 22°С сшитый BS3 или глутаровым альдегидом фермент сохраняет 100% активности через 2 месяца хранения, в то время как несшитый полностью инактивируется в течение месяца.
А Б Ln(A/A0) 0. -0. -1. -1. -2. -2. -3. 0 10 20 30 40 50 60 70 Время,сут Рис. 18. Стабилизация PlyC наложением внутримолекулярных химических сшивок. А.
Изображение геля 10% SDS-PAGE. Слева-направо: первая дорожка - фермент, вторая маркеры (160, 66, 46, 23 и 13 кДа), третья и четвертая - фермент, сшитый 50 и 100 кратным избытком BS3 при рН 7.5. Б. Стабильность при 37°С и рН 6.3 сшитого и не сшитого фермента: PlyC в концентрации 3 г/мл ( );
PlyC в концентрации 16 г/мл ( );
PlyC, сшитый 200 кратным избытком глутарового альдегида, 3 г/мл ( );
PlyC, сшитый кратным избытком глутарового альдегида, 16 г/мл ();
PlyC, сшитый 50 кратным избытком BS3, 3 г/мл ( );
PlyC, сшитый 100 кратным избытком BS3, 16 г/мл ( ).
В настоящей работе было исследовано влияние на активность и стабильность PlyC большого количества соединений различной природы. Установлено, что полиакриловая кислота массой 30 кДа, глицерин, НПАВ Brij 30 и Pluronic F127 положительно влияют на стабильность PlyC. В таблице 5 показано, во сколько раз увеличивается время полуинактивации фермента при 22 и 37°С в присутствии различных концентраций этих добавок. На основе всех указанных выше соединений была создана мицеллярно полиэлектролитная композиция М16. В композиции М16 фермент сохраняет 100% активности в течение 2 месяцев инкубации при 37 и 22°С.
Таблица 5. Влияние различных добавок на стабильность PlyC (0.4 г/мл, рН 6.3).
Состав композиции 1/2/1/2PlyC, 37°С 1/2/1/2PlyC, 22°С Полиакриловая кислота, 30 кДа, 10х избыток 4.7 20% глицерин 5 0.1% Brij 30 5 Pluronic F127, 25х избыток 124 20% глицерин, Pluronic F127, 10х избыток 92 4. Испытание стабильных препаратов фермента PlyC на живых клетках.
Эффективность действия PlyC на культуру стрептококка при длительном выдерживании при 22°С оценивали для препаратов фермента в композиции М16. Фермент инкубировали в композиции М16, через определенные промежутки времени наносили пробу на газон растущей культуры.
Рис. 19. Влияние фермента PlyC на культуру клеток стрептококков (а) и количество колоний в культуре, отобранной из зоны лизиса (б). Зона просветления (лизиса) на газоне через минут после добавления фермента (а) и количество колоний в пробе, отобранной из зоны лизиса, пересеянной и инкубированной при 37°С в течение 24 ч (б). 1 свежеприготовленный фермент с М16, 2 - 2 суток, 3 - 2 недели, 4 - 2 месяца инкубации при 22°С. 5 – 8 - контроли (фермент без М16, 6 – 2 суток, 7 - 2 недели, 8 - 2 месяца инкубации при 22°С).
На рис. 19 представлены данные по оценке эффективности работы фермента. Условия проведения эксперимента также приведены в подписи к этому рисунку. Как видно, активность фермента в буфере существенно падала уже через двое суток, а количество колоний росло. В отличие от контроля фермент, инкубируемый в мицеллярно полиэлектролитной композиции, продолжал эффективно лизировать бактериальные клетки даже через 2 месяца хранения. Следует отметить, что практическая неизменность зоны лизиса и отсутствие новых бактерий в пробе, взятой из зоны лизиса через 30 минут, свидетельствовали о том, что эффективность действия фермента не снижалась ни в процессе хранения в композиции, ни в процессе функционирования.
ВЫВОДЫ:
1. Впервые были определены температурные и рН оптимумы функционирования ферментов LysK и PlyC. Показано, что в молекуле LysK может содержаться остаток гистидина, ответственный за катализ, и катион металла, играющий структурную роль.
2. Впервые идентифицированы механизмы инактивации ферментов LysK и PlyC.
Показано, что в условиях испытаний ферментных препаратов (22 и 37°С) LysK инактивируется вследствие агрегации за счет нековалентных взаимодействий, а PlyC вследствие диссоциации олигомерной молекулы с последующей инактивацией диссоциированной формы (37°С) и по мономолекулярному механизму (22°С).
3. Впервые подобраны стабилизирующие агенты для LysK, увеличивающие время его полуинактивации на 2 порядка при 37°С и позволяющие сохранить более 80% активности фермента в течение 4 месяцев инкубации при 22°С.
4. Впервые найдены способы стабилизации PlyC, такие как включение в мицеллярно полиэлектролитные композиции и наложение внутримолекулярных химических сшивок.
Показано, что при использовании таких способов стабилизации время полуинактивации фермента при 37°С увеличивается на 1 – 2 порядка, а при 22°С PlyC сохраняет 100% активности в течение 2 месяцев.
5. Показана высокая эффективность работы стабилизированных препаратов фермента PlyC на живых клетках.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Клячко Н.Л., Дмитриева Н.Ф., Ещина А.С., Игнатенко О.В., Филатова Л.Ю., Райнина Е.И., Казаров А.К., Левашов А.В. Ферменты бактериофагов для профилактики и лечения бактериальных инфекций: стабильность и стабилизация фермента, лизирующего клетки Streptococcus pyogenes // Биоорганическая химия. 2008. Т. 34. № 3. С. 416 - 421.
2. Филатова Л.Ю., Беккер С.С., Донован Д.М., Гладилин А.К., Клячко Н.Л. Cтабилизация поликатионом LysK – фермента, лизирующего клетки Staphylococcus aureus // Вестн. Моск.
ун-та. Сер. 2. Химия. 2009. Т.50. №. 6. С. 472 - 474.
3. Filatova L.Yu., Levashov A.V., Dmitrieva N.F., Eshchina A.S., Klyachko N.L. Encapsulation of enzyme lysing group A streptococci to improve its stability // Proceedings of XVIth International Conference on Bioencapsulation, Dublin, Ireland, Sept. 4-8, 2008. P. 34.
4. Filatova L.Yu., Dmitrieva N.F., Eschina A.S., Levashov A.V., Klyachko N.L. Modification of bacteriophage lytic enzyme active towards Streptococuus pyogenes to improve its stability.
Abstracts of International student’s forum, Omaha, Nebraska, USA, June 1 – 3, 2008. P. 30 – 31.
5. Филатова Л.Ю., Левашов А.В., Клячко Н.Л. Стабилизация фермента, лизирующего клетки стрептококков группы А, для использования в фармакологических препаратах // Материалы международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов 2008». Секция «Химия». Москва, Россия, 12-14 апреля 2008. С. 309.
6. Филатова Л.Ю., Беккер С.С., Донован Д.М., Клячко Н.Л. LysK – фермент бактериофага в качестве потенциального антимикробного агента: кинетические характеристики и стабильность // Материалы международного форума по нанотехнологиям. Москва. 2008. С.
391 – 393.
7. Филатова Л.Ю., Беккер С.С., Донован Д.М., Клячко Н.Л. Кинетические характеристики и стабилизация LysK – фермента, лизирующего клетки Staphylococcus aureus // Материалы 5-го международного конгресса «Биотехнология – состояние и перспективы развития». Москва.
2009. Часть 2. С. 281.
8. Филатова Л.Ю., Клячко Н.Л. Получение стабильных медицинских препаратов путем включения в наноматрицы ферментов бактериофагов, лизирующих клетки стрептококка и стафилококка // Материалы I Международной летней научной школы «Нано 2009.
Наноматериалы и нанотехнологии в биологии и медицине». Москва. 2009. С. 185.
9. Filatova L.Yu., Donovan D.M., Becker S.C., Klyachko N.L. Stabilization of the enzyme, lysing Staphylococus aureus cells // Abstracts of International conference «Biocatalysis 2009:
Fundamentals and Applications». Arkhangelsk. 2009. P. 66.
10. Филатова Л.Ю., Клячко Н.Л. Разработка подходов к стабилизации ферментов бактериофагов как потенциальных антибактериальных агентов для лечения болезней микробной (стрептококка и стафилококка) этиологии в медицине и ветеринарии // Материалы третьей международной конференции «Современные достижения бионаноскопии». Москва. 2009. С. 77.