авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Оглы кинетические закономерности формирования коррозионно активных биопленок и подходы к их элиминированию

На правах рукописи

Азизов Руфат Эйваз оглы КИНЕТИЧЕСКИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ ФОРМИРОВАНИЯ КОРРОЗИОННО АКТИВНЫХ БИОПЛЕНОК И ПОДХОДЫ К ИХ ЭЛИМИНИРОВАНИЮ 02.00.15 - катализ 03.00.23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва – 2007

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова Научные руководители:

чл.-корр. РАН, доктор химических наук, профессор Варфоломеев Сергей Дмитриевич ведущий научный сотрудник, кандидат технических наук Ефременко Елена Николаевна

Официальные оппоненты:

профессор, доктор биологических наук Холоденко Василий Петрович (ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии) кандидат химических наук Скляр Владимир Ильич (МГУП Мосводоканал)

Ведущая организация:

Биологический факультет Московского государственного университета им.

М.В.Ломоносова

Защита состоится «27» февраля 2007 года в 1600 час на заседании диссертационного совета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова

Автореферат разослан « » января 2007 года

Ученый секретарь диссертационного совета, к.х.н. Сакодынская И.К.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Биокоррозия металла представляет собой тип коррозии, который развивается под воздействием микроорганизмов, и на сегодняшний день хорошо известно, что около 20-30% всех потерь металла в промышленности происходит за счет биокоррозии.

Нефтяная промышленность относится к тем отраслям, основные фонды которых, в наибольшей степени подвергаются воздействию биокоррозии.

Коррозионно активные клетки микроорганизмов можно обнаруживать в коммуникационных системах с замедленным течением или застаиванием воды, в отстойниках и резервуарах-нефтехранилищах. Процессы биокоррозии в нефтяной промышленности часто приводят к авариям с большими экономическими потерями и экологическим ущербом для окружающей среды.

Известны научные исследования, направленные на изучение процессов биокоррозии, происходящих на внешних поверхностях металлических конструкций. Вопросы, связанные с исследованием процессов биокоррозии внутрикоммуникационных систем при транспортировке промысловых вод, мало изучены, и большинство известных работ посвящены исследованию планктонных клеток, при том, что в этих системах обнаруживаются коррозионно активные биопленки, представляющие собой самоиммобилизующиеся на металлических поверхностях ассоциации клеток преимущественно гетеротрофных (ГБ) и сульфат-восстанавливающих бактерий (СВБ).

Основным методом исследования биопленок является микробиологический, который заключается в механическом удалении биопленок с металлических поверхностей с последующей их дезинтеграцией ультразвуком и высевом разведений полученных суспензий на селективные среды. Поскольку метод является крайне неудобным, так как требует длительного времени культивирования клеток (до 3-х недель) и является крайне не точным, то основные закономерности формирования биопленок остаются мало изученными.

В течение нескольких последних десятилетий большое внимание уделяется вопросам ингибирования и элиминирования биокоррозии.

Поскольку био- и химическая коррозия представляют собой комплексно развивающиеся явления, то скрининг веществ, действие которых одновременно направлено против химического корродирования металла и вызывает гибель микроорганизмов, способствующих протеканию коррозионных процессов, является важной задачей научных исследований, проводимых в данной области.

Возможности биолюминесцентного метода определения концентрации внутриклеточного аденозинтрифосфата (АТФ) являются перспективными с точки зрения его применения для фундаментальных исследований особенностей кинетики роста клеток, входящих в состав коррозионно активных биопленок.

АТФ является универсальным внутриклеточным метаболитом, содержащимся во всех жизнеспособных клетках любых микро- и макроорганизмов, поэтому его можно рассматривать как универсальный индикатор жизнеспособных клеток в анализируемом образце. АТФ можно определять при помощи биолюминесценции с большой точностью даже при ультрамалом содержании вещества в образце – до 10–12–10–14 М. В связи с этим актуальным является разработка новых подходов на основе биолюминесцентного метода определения внутриклеточного АТФ к анализу кинетики роста коррозионно активных клеток в пробах воды и грунта, в том числе объектах, загрязненных нефтью, а также к исследованию влияния различных факторов на кинетику формирования коррозионно активных биопленок.

Разработка новых экологически безопасных подходов к элиминированию процессов биокоррозии является одной из основных задач промышленности. В качестве одного из эффективных средств, позволяющих предотвращать полностью или хотя бы существенно снижать риск развития биокоррозионных процессов, привлекает к себе внимание применение ингибиторов коррозии (ИК) с биоцидной активностью по отношению к планктонным клеткам и биопленкам. Скрининг веществ с биоцидным действием среди активно применяющихся на практике ИК представляется крайне актуальной задачей. Применение нефтяных сорбентов для удаления нефти из сточных вод с целью уменьшения риска развития коррозионно опасных микроорганизмов, участвующих в формировании биопленок также может быть актуальным, с точки зрения, предотвращения развития процессов биокоррозии.



Таким образом, разработка новых подходов к анализу основных факторов, влияющих на кинетику формирования коррозионно активных биопленок, с последующей разработкой экологически безопасных подходов к элиминированию этих факторов является весьма актуальной, и представляет большой научный интерес. Проведение таких исследований и разработок крайне важно с экономической и экологической точек зрения применения их на практике.

Цель и задачи исследования. Основной целью данной работы являлось установление основных кинетических закономерностей формирования коррозионно активных биопленок, анализ основных факторов, влияющих на их формирование, а также разработка подходов к их элиминированию на основе биолюминесцентного метода определения внутриклеточного АТФ.

В ходе работы необходимо было решить следующие основные задачи:

- разработать подходы на основе биолюминесцентного метода определения внутриклеточного АТФ к определению численности клеток коррозионных бактерий, а также сравнить полученные результаты с данными микробиологического анализа;

- разработать подходы на основе биолюминесцентного метода определения АТФ к исследованию кинетики роста коррозионно активных клеток в пробах воды, грунта, в составе биопленок, формирующихся в том числе объектах, загрязненных нефтью;

- исследовать кинетические закономерности формирования биопленок под влиянием различных факторов, в частности, исследовать влияние микробного состава среды, химического состава сплава, используемого для изготовления металлических конструкций, присутствия нефти в среде и сульфида железа, накапливающегося на поверхности металла, а также типа системы (замкнутые или проточные) на кинетику роста коррозионно активных биопленок;

- разработать подход на основе биолюминесцентного метода определения АТФ к оценке биоцидной активности ИК по отношению к коррозионно активным планктонным клеткам и биопленкам, а также оценитьэффективность применения ИК в качестве биоцидов;

- исследовать возможность применения нефтяных сорбентов для удаления компонентов среды, провоцирующих формирование коррозионно опасных биопленок.

Научная новизна работы. Разработаны новые подходы на основе биолюминесцентного метода определения внутриклеточного АТФ к исследованию коррозионно активных клеток бактерий. Впервые были определены удельные концентрации внутриклеточного АТФ для ряда бактерий, провоцирующих развитие коррозии и относящихся к различным таксономическим группам. Показана возможность использования биолюминесцентного метода определения АТФ для исследования кинетики роста коррозионно активных клеток в пробах воды, грунта, в составе биопленок, в том числе загрязненных нефтью.

Разработан способ дифференцированного определения численности коррозионно активных бактерий в смешанных планктонных культурах и в составе биопленок на основе комбинированного подхода, сочетающего в себе микробиологические приемы работы с клетками микроорганизмов, основанные на использовании селективных питательных сред для культивирования клеток, биолюминесцентный метод анализа внутриклеточной концентрации АТФ, а также стандартные математические методы обработки данных по кинетике роста микроорганизмов.

С помощью биолюминесцентного метода установлено влияние состава планктонной культуры на кинетику формирования биопленок. Рассчитаны кинетические параметры формирования биопленок в средах, различающихся по микробному составу, и установлены кинетические закономерности роста биопленок в зависимости от микробного состава среды.

Показано влияние присутствия сульфида железа на поверхности металла на кинетику формирования коррозионно активных биопленок.

Рассчитаны кинетические параметры формирования биопленок на металлических поверхностях, покрытых различными концентрациями сульфида, и установлена взаимосвязь между процессами накопления сульфида железа, коррозии металла и ростом биопленок.

Показано влияние химического состава стали, на которой происходит формирование биопленок, на кинетику этого процесса. Рассчитаны кинетические параметры формирования биопленок на металлических поверхностях, отличающихся по химическому составу.

Показано влияние присутствия нефти в среде на кинетику формирования коррозионно активных биопленок. Рассчитаны кинетические параметры формирования биопленок в средах с различными концентрациями нефти и выявлены закономерности влияния присутствия нефти в среде на рост клеток в составе биопленок.

Показана возможность исследования роста биопленок в проточных системах с помощью биолюминесцентного метода определения внутриклеточного АТФ. Рассчитаны кинетические параметры и установлены закономерности формирования коррозионно активных биопленок в различных по типу системах (проточная и замкнутая).

Разработан подход к оценке биоцидной активности ИК по отношению к различным коррозионно активным планктонным клеткам и биопленкам на основе биолюминесцентного метода анализа. Впервые определены минимальные ингибирующие концентрации ряда широко применяемых на практике ИК для планктонных клеток и биопленок с помощью биолюминесцентного метода. Установлены закономерности влияния биоцидной активности ИК на планктонные клетки и биопленки. Показаны основные преимущества разработанного метода по сравнению с микробиологическим методом определения минимальных ингибирующих концентраций.

Показана возможность использования нефтяного сорбента для антибиокоррозионных целей, и установлена эффективность совместного использования нефтяного сорбента Мегасорб и ИК с биоцидными свойствами. Рассчитаны кинетические параметры формирования биопленок с применением стадии фильтрации среды с помощью Мегасорба, а также при совместном использовании Мегасорба и ИК.

Практическая значимость работы. Основная практическая значимость результатов, полученных в работе, состоит в том, что:

- Разработанные подходы на основе биолюминесцентного метода исследования коррозионно акивных клеток и биопленок перспективны с точки зрения эффективной замены традиционно используемых для этих целей микробиологических методов анализа. Такая замена может позволить проводить более быстрые и точные анализы коррозионной ситуации in situ;

- Разработанный способ дифференцированного определения численности бактерий в смешанных культурах на основе комбинированного подхода, основанного на сочетании биолюминесцентного, микробиологического и кинетического анализа является экспрессным и удобным для анализа экологической ситуации на различных объектах. Метод является универсальным и может быть использован не только коррозии в нефтяной промышленности, а также в других отраслях промышленности;

- Показаны закономерности формирования биопленок под влиянием различных факторов (микробного состава среды, сульфида железа на поверхности, химического состава сплава, присутствия нефти в среде и типа функционирующей системы), которые необходимо учитывать при конструировании оборудования, а также при разработке стратегии управления процессами коррозии на работающих системах. Постоянный контроль этих факторов может существенно продлить время эксплуатации промышленных систем;





- Разработанный подход к определению биоцидной активности ИК на основе биолюминесцентного метода определения АТФ может быть применен при определении необходимости использования тех или иных биоцидов на промышленных объектах, подверженных биокоррозии, что представляет собой большой экологический и экономический интерес;

- Совместное применение сорбента Мегасорб с ИК может снизить цену антибиокоррозионых программ, а также представляет большой интерес как экологически безопасный подход к элиминированию биокоррозии.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на Всероссийских и Международных конференциях:

Междунар. конференции “Biocatalysis-2002: Fundamentals and Applications” (Москва, Россия, 2002);

Междунар. конференции молодых ученых «От фундаментальной науки к новым технологиям. Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок.

Экологически безопасные технологии» (Тверь, Россия, 2002);

8 и 9-ой Пущинских школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, Россия, 2004, 2005);

2-ом и 3-ем Московских Междунар.

конгрессах «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, Россия, 2003, 2005);

конференции молодых ученых, аспирантов и стипендиатов фонда имени И.В. Березина «Инженерная энзимология», посвященной 80-летию И.В. Березина (Москва, Россия, 2003);

Всерос.

симпозиуме «Биотехнология микробов» (Москва, Россия, 2004);

4-ой Междунар. конференции «Проблемы загрязнения окружающей среды» (Пермь, Россия, 2005);

3-ем Европейском конференции «Bioremediation» (Crete, Greece, 2005);

7-ом Междунар. конференции «Physical Chemistry» (Belgrade, Serbia and Montenegro, 2004);

6-ом Междунар. Мамедалиевском конференции «Нефтехимия» (Баку, Азербайджан, 2005).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 19 печатных работ, из них: 4 статьи в международных журналах, 4 статьи в международных сборниках статей, 10 тезисов докладов в материалах Международных и Всероссийских конференций, симпозиумов и конгрессов. Получен 1 Патент РФ на изобретение.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 182 ссылок. Работа изложена на 157 страницах, содержит 61 рисунок и 21 таблицу.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Экспериментальная часть Объекты исследования. В работе были использованы следующие бактериальные культуры: Rhodococcus erythropolis AC-1514, Rhodococcus ruber АС-1513, Rhodococcus rhodochrous, Pandorеa sp., Pseudomonas putida В 1091, Desulfovibrio vulgaris B-1388, Desulfovibrio desulfiricans B-1799, Acidithiobacillus ferrooxidans B-458. Также в работе использовалась ассоциация коррозионно активных клеток, которая была выделена из нефтяных месторождений Альметьевска (Татарстан) и характеризовалась высокой (106-107 кл/мл) концентрацией СВБ. В работе использовались ИК (Нитро-1, Нитро-2, Каспий-2, Каспий-4, Хазар, ВФИКС-82), широко применяемые в нефтяной промышленности стран СНГ и разрабатываемые в России (Ингибитор 55).

Методы исследования. Культивирование ГБ проводили в колбах Эрленмейера на термостатируемой качалке IRC-1-U (Швецария) (180 об/мин, 280С). Использовали питательную среду следующего состава: (в г/л):

триптический гидролизат кильки и хлорида натрия (содержание в г/л: 10,05 и 4,95, соответственно), NaCl 5,0;

КH2PO4 3,0;

Na2CO3 - 0,1;

К2HPO4 - 6,0;

NH4Cl - 2,0;

MgSO4 x 7H2O - 0,2;

CaCl2 x 6H2O - 0,01;

MnSO4 x 5H2O - 0,02;

FeSO4 x 7H2O - 0,01, pH 6,7 – 7,2. При необходимости биомассу осаждали на центрифуге Beckman J2-21 (США, 15000 об/мин, 15 мин).

Культивирование СВБ проводили в пробирках Хоттингера. Для роста клеток использовали среду Постгейта следующего состава, (в г/л): лактат 4,0;

дрожжевой экстракт - 1,0;

аскорбиновая кислота - 0,1;

MgSO4 x 7H2O 0,2;

К2HPO4 - 0,01;

Fe(SO4)2(NH4)2 x 6H2O - 0,2;

NaCl - 10,0. Клетки культивировали в термостате при 300С и 370С в анаэробных условиях.

Выращивание биопленок проводилось на поверхности металлических купонов (Стандард-Металл, Россия) в питательных средах в течении 2-х недель.

Концентрацию внутриклеточного АТФ определяли люциферин люциферазным методом с использованием реагента на основе рекомбинантной люциферазы светляков (ООО Люмтек, Россия).

Биолюминесценцию измеряли с помощью люминометра Microluminometr 3560 (New horizons diagnostics Co, США). Для экстракции АТФ из планктонных клеток бактерий в жидких инкубационных средах использовали диметилсульфоксид (ДМСО). Для определения удельной концентрации внутриклеточного АТФ в клетках использовали калибровочные графики логарифмической зависимости концентрации клеток от концентрации внутриклеточного АТФ.

Пробы грунта, загрязненных нефтью, обрабатывали хлороформом. Далее использовали буферные растворы для экстракции АТФ из хлороформных экстрактов.

Для определения АТФ в составе биопленок использовали металлические купоны, покрытые биопленками, отмывали их от планктонных клеток физиологическим раствором и обрабатывали ДМСО. Экстракцию АТФ проводили в течение 15 мин с периодическим перемешиванием на мешалке Vortex (Biosan, Литва). Металлические купоны перед их использованием во всех экспериментах обрабатывались ацетоном, затем выдерживались в растворе 0,1 M HCl, промывались дистиллированной водой и высушивались при комнатной температуре.

Для определения удельной скорости роста (µ) планктонных клеток и биопленок строили кинетические кривые роста в натуральных полулогарифмических координатах. При обработке кинетических данных использовали первые 5-8 точек кинетической кривой, входящих в экспоненциальную фазу роста.

Определение концентрации сульфида проводили спектрофотометрически с использованием н,н-диметил-п-финилендиамина.

При исследовании коррозионных процессов определяли массовый показатель коррозии (К), представляющий собой отношение изменения массы образца металла в результате коррозии (мг), к площади корродируемой поверхности (см2). Металлические купоны после подготовки к эксперименту взвешивались на аналитических весах. В процессе формирования биопленки металл обрабатывали раствором н,н-диметил-п финилендиамина (2 мл/см2) для удаления биопленки с поверхности, промывали дистиллированной водой, подсушивали на воздухе и взвешивали.

Для получения металлических поверхностей с различными концентрациями сульфида железа на поверхности купоны экспонировали в среде с природной ассоциацией коррозионно активных клеток в течение различного времени. Начальная концентрация клеток в среде составляла (3, ± 0,6) х 104 кл/мл. Далее металлические поверхности, покрытые биопленкой, экспонировали в ДМСО в течение 30 мин и промывали дистиллированной водой.

Для определения минимальных ингибирующих концентраций (МИК) готовили ступенчатые разведения растворов ИК в физиологическом растворе, затем туда вносили суспензии клеток так, чтобы концентрации клеток в образцах составляли 106-107 кл/мл (N0). После выдерживания клеток в физиологическом растворе при 280C в течение 7 сут в присутствии ИК определялась их остаточная концентрация (N) с использованием биолюминесцентного метода. Далее проводилась линеаризация полученных данных с расчетом достоверности аппроксимации. Для определения МИК различных ИК по отношению к коррозионно активным биопленкам выдерживали биопленки в физиологическом растворе при 280C в течение сут в присутствии различных концентраций ИК, после чего определяли остаточную концентрацию клеток в составе биопленок.

В работе использовались пробы нефтей из Бакинских месторождений – Балаханы и Сураханы (ИНХП, Азербайджан), а также нефтесорбент Мегасорб (ООО «Инкомцентр», Россия), разработанный для сбора нефти и нефтепродуктов с поверхности воды. Мегасорб представляет собой нетканый, волокнистый материал, изготовленный из полимерных волокон.

При обработке всех экспериментальных данных рассчитывали средние значения и значения стандартного отклонения. Все эксперименты проводились не менее чем в трех повторностях.

Результаты и обсуждение 1. Применение биолюминесцентного метода определения АТФ для исследования кинетики роста микроорганизмов, участвующих в процессах биокоррозии Поскольку именно планктонные клетки, присутствующие в сточных водах, участвуют в формировании биопленок, первоначально основное внимание в исследовании было уделено именно им. Были установлены биолюминесцентным методом значения удельных концентраций внутриклеточного АТФ, характерные именно для тех клеток, которые являются основными известными участниками биокоррозионных процессов (Табл. 1). Исследования СВБ и ГБ проводились в средах, которые далее использовались в работе при культивировании биопленок.

Таблица 1. Удельная концентрация внутриклеточного АТФ в клетках микроорганизмов, участвующих в процессах биокоррозии.

Микроорганизм Удельная конц. АТФ, моль/кл (5,2±0,3)х10- D.vulgaris (4,0±0,2)х10- D.desulfiricans (8,7±0,4)х10- D.denitrificance (2,7±0,4)х10- Ас.ferrooxidans (1,0±0,1)х10- Ps.putida (2,1±0,3) x 10- Rh. erythropolis (2,4±0,2) x 10- Rh. rubber (3,1±0,6) x 10- Rh. rhodochrous Полученные данные применялись для исследования кинетики роста этих клеток (Рис. 1). Было установлено, что скорость роста железоокисляющих бактерий оказалась существенно ниже, чем у СВБ и ГБ, поэтому именно этим двум типам клеток далее уделялось основное внимание при изучении биокоррозионных процессов.

D. vulgaris Ps. putida Ac. ferrooxidans Микроорганизм Удельная скорость lg[конц. клеток, кл/мл] роста (µ), ч- Ps.putida 0, D.vulgaris 0, Ас.ferrooxidans 0, Рис. 1. Кинетические кривые и удельные скорости роста 0 50 100 клеток.

время, ч В нефтяной промышленности в транспортных коммуникациях часто грунт присутствует в смеси с нефтью и микробными клетками. Определение их численности в таких системах составляет отдельную задачу. Применение биолюминесцентного метода определения АТФ для ее решения позволило установить возможность определения численности клеток в присутствии различных концентраций нефти (до 60% масс.). Следует отметить новизну и практическую значимость этих результатов, так как они могут быть использованы не только при исследовании процессов биокоррозии, но и для оценки численности клеток-нефтедеструкторов, которые, в свою очередь, часто используются для биоремедиации почв и воды. Точность определения численности клеток составила 80-90%. Исследование кинетики роста планктонных клеток в средах с нефтью показало, что их удельная скорость роста зависит от концентрации нефти в исследуемой системе (Рис. 2).

0. 0. 0. - µ, сут 0. 0. 0. 0 2 4 Н еф ть в гр ун те, % Рис. 2. Удельные скорости роста клеток ГБ в грунте. Клетки: Ps. putida (), Rh. ruber (), смесь Ps. putida и Rh. rubber ().

Также было установлено, что удельная скорость роста планктонных клеток ГБ увеличивается в смешанных культурах, что проводит к ускорению накопления в среде метаболитов, необходимых в качестве субстратов для развития СВБ.

В начале работы с коррозионно активными биопленками были оптимизированы условия применения биолюминесцентного метода для их исследования. Был проведен выбор экстрагирующего реагента, определено оптимальное соотношение объема реагента и обрабатываемой площади поверхности биопленки, а также минимальное время, достаточное для обеспечения максимальной экстракции АТФ. Было, установлено, что ДМСО является самым эффективным экстрагентом, позволяющим в течении 15 мин провести полную экстракцию АТФ из биопленки при ее обработке 0,5 мл ДМСО на 1 см2 поверхности. Последующий анализ роста биопленок показал, возможность применения биолюминесцентного метода для исследования кинетики роста биопленок. Удельная скорость роста клеток в составе биопленки на основе индивидуальной культуры СВБ составила 0,082 ч-1.

Известно, что клетки, участвующие в процессах биокоррозии, чаще всего присутствует на объектах, подверженных коррозии, в составе смешанных культур. Для выяснения роли представителей отдельных типов клеток, в частности, ГБ и СВБ был разработан способ дифференцированного определения численности бактерий в смешанных культурах на основе комбинированного подхода, сочетающего в себе микробиологические приемы работы с клетками микроорганизмов, предполагающие использование селективных питательных сред для культивирования клеток, биолюминесцентный метод анализа концентрации внутриклеточного АТФ, а также стандартные математические методы обработки кинетических данных роста микроорганизмов. Результаты предложенного дифференцированного определения были подтверждены микробиологическим методом (Табл. 2).

Таблица 2. Сравнение результатов дифференцированного анализа различных клеток, проведенного микробиологическим методом и согласно предлагаемому комбинированному подходу.

Анализируемые образцы Концентрация клеток в смеси Микробиологический Используемый метод метод Модельная система, (кл/мл) (4,3±0,5)х106 (5,5±0,4)x Pseudomonas putida 105 (4,2±0,1)x Desulfovibrio vulgaris 103 (6,3±0,3)x Асidithiobacillus ferrooxidans Биопленка, (кл/см2) (6,9±0,5)х103 (7,5±0,3)x Pseudomonas putida 107 (2,2±0,2)x Desulfovibrio vulgaris При этом предложенный подход на основе биолюминесцентного определения АТФ потребовал существенно меньшего времени для проведения анализа и обеспечил его более точный результат. Новизна предложенного дифференцированного метода анализа смешанных культур в составе биопленок была подтверждена Патентом РФ на изобретение (№2263148, 2005).

2. Исследование закономерностей формирования коррозионно активных биопленок и факторов, влияющих на них Были проведены исследования кинетических закономерностей формирования биопленок при варьировании ряда факторов, в частности:

микробного состава планктонных культур в среде, химического состава корродируемого металла, присутствия и концентрации нефти в среде, присутствия сульфида железа на поверхности металла и типа функционирующей системы, подверженной биокоррозии.

При исследовании влияния микробного состава среды на кинетические закономерности формирования биопленок, суспензии клеток были приготовлены с разными концентрациями СВБ и ГБ, при этом тех или иных клеток в суспензиях было больше или они были в среде в одинаковых концентрациях (Рис. 3). Было показано, что на разных стадиях роста биопленка имела гетерогенный состав, и независимо от исходного микробного состава планктонных клеток скорость роста СВБ в составе биопленок была больше, чем ГБ. Именно удельная скорость роста биопленки в среде с исходно высокой концентрацией СВБ оказалась максимальной (Рис.

3). Полученные данные подтвердили определяющую роль СВБ в формировании коррозионно активных биопленок.

Удельные скорости роста биопленки (µ), 1/сут lg[конц. АТФ, моль/см ] - 0, -1 0, -1 0, -1 -1 -1 -1 2 4 6 8 10 в р е мя, с ут Рис. 3. Кинетические кривые роста биопленок в средах с различными составами планктонных культур: () СВБ ГБ, () СВБ = ГБ, () СВБГБ.

В качестве другого фактора, который мог бы влиять на формирование коррозионно активных биопленок, было рассмотрено присутствие сульфида железа на поверхности металла. Были подготовлены металлические купоны с исходно разными концентрациями сульфида на поверхности. Последующие исследования показали, что процесс формирования биопленок ускоряется на поверхности металла, покрытой сульфидом (Рис. 4), при этом его наличие на поверхности в основном влияет на экспоненциальную фазу роста биопленок.

Удельная скорость роста биопленки возрастает с увеличением исходной концентрации сульфида на поверхности металла (Рис. 5). Вероятно, это связано с тем, что присутствие сульфида на поверхности обеспечивает её гетерогенность и улучшение условий для развития химической коррозии.

Удельная скорость 7 биопленке, кл/см ] lg[конц. клеток в роста, сут- 3 0 1 2 0 1 2 3 4 5 6 7 время, сут 2- [S ], мкг/см Рис. 4. Кинетика роста биопленок Рис. 5. Удельные скорости на металлических поверхностях, роста биопленок от покрытых сульфидом железа присутствия различных (мкг/ см ): - контроль;

- 0,45;

концентраций сульфида – 0,92;

– 1,41;

- 2,20. железа на металле.

Параллельное исследование массового показателя коррозии и кинетики накопления сульфида в составе биопленок показало, что оба явления ускоряются в конце логарифмической фазы роста биопленок (Рис. 6).

Данный факт свидетельствует о чёткой взаимосвязи между формированием биопленки и химической коррозией металла. Эти результаты имеют большую практическую значимость, так как подтверждают высокую опасность развития биопленок и необходимость их элиминирования с целью снижения риска коррозионных потерь металла (Рис. 6).

В нефтяной промышленности используются металлы с различным химическим составом. В частности, из низкоуглеродистой стали состоят части конструкций, используемых в неагрессивных условиях и в отсутствии воды, из углеродистой стали состоят старые трубопроводы, насосы и резервуары, а из нержавеющей стали изготавливаются трубопроводы при добыче нефти со дна морей. В связи с этим в работе исследовались кинетические закономерности формирования биопленок на поверхности мягкой, углеродистой и нержавеющей сталей (Рис. 7).

2-lg[конц.клеток в биопленке, кл/см ] 3-конц. сульфида на поверхности 1-массовый показатель металла, х10, мкг/см коррозии, мг/см -1 0 1 2 3 4 в р е мя, с у т Рис. 6. Кинетические кривые роста биопленки, накопления сульфида и химической коррозии на поверхности металла, изначально покрытой сульфидной пленкой с концентрацией сульфида 2,2 мкг/см2.

Самая высокая удельная скорость роста биопленок наблюдалась на поверхности мягкой стали. Формирование биопленок сопровождалось накоплением сульфида и химической коррозией мягкой и углеродистой стали, и практически отсутствовали потери металла в случае нержавеющей стали за весь период проведения эксперимента. При этом на поверхности нержавеющей стали рост биопленки был также незначительным. Таким образом, было установлено, что формирование биопленок на металлической поверхности существенно зависит от химического состава стали, и выбор стали крайне важен с практической точки зрения.

с та л ь -6 с та л ь -2 0 12Х18Н10Т lg[конц. клеток, кл/см ] 2 5 7 11 13 в р ем я, сут Рис. 7. Кинетика роста биопленок на поверхности различных металлов.

Еще одним исследованным фактором, который влиял на развитие биопленок, было присутствие нефти в среде. Следует отметить, что в промысловых водах нефтяной промышленности практически всегда присутствует нефть, и даже после первичной очистки ее концентрация в водах составляет 1-5%. Анализ удельных скоростей роста биопленок при различных концентрациях нефти в среде показал, что при низких концентрациях нефти (1-3%) наблюдается увеличение удельной скорости роста (Рис. 8). Дифференцированный анализ численности клеток в составе биопленок показал, что наличие нефти в среде способствует увеличению численности не только клеток ГБ, но также и СВБ.

Удельная скорость 3. 2. роста, 1/сут 2. 1. 1. 0. 0. 0 2 4 н е ф ть, % Рис. 8. Удельная скорость роста биопленки в среде с разной концентрацией нефтьи.

Необходимо отметить, что до сих пор исследовались процессы формирования биопленок в статичной системе, тогда как в нефтяной промышленности в большинстве случаев функционируют проточные системы. В связи с этим далее особое внимание было уделено исследованию закономерностей формирования биопленок в зависимости от типа проточной системы. Следует подчеркнуть, что изучение влияния протока на скорость роста биопленок в подобных системах ранее никем не проводилось. На практике у нефтяников существует умозрительное представление о том, что при достаточно высоких скоростях протока формирование биопленок вообще не происходит. На самом деле при исследовании открытой проточной системы, оказалось, что идет активное формирование биопленок, правда оно имеет различный характер при относительно высоких и низких скоростях протока (Рис. 9). Результаты этих исследований являются весьма значимыми с практической точки зрения, так как на их основе могут быть рекомендованы строго определенные скорости протока сточных вод для применения на практике, а именно не менее 0,1 м/с.

Сравнение кинетики роста биопленок в системах различного типа показало, что самая высокая удельная скорость роста характерна именно для открытой проточной системы (Рис. 10).

0. удельная скорость роста 0. биопленок, 1/ч 0. 0. 0. 0. 0. 0 0.02 0.04 0.06 0.08 0. скорость протока, м/с Рис. 9. Влияние скорости протока на удельную скорость роста биопленок в открытой системе.

./см] еток, кл lg[конц.кл 3 статическая система 2 замкнутая проточная система 1 открытая проточная система 0 50 100 150 время, ч Рис. 10. Кинетические кривые роста биопленок в различных системах.

В целом следует отметить, что совокупность данных, полученных при исследовании факторов, влияющих на кинетику формирования биопленок, категоричным образом свидетельствуют о необходимости изменения действующих на практике противокоррозионных программ, поскольку требуется другая, отличная от планктонных культур, стратегия борьбы с биопленками.

3. Разработка подходов к элиминированию процессов биокоррозии 3.1. Исследование возможности применения ингибиторов коррозии для предотвращения биокоррозии На практике единственным средством предотвращения коррозии являются ИК, и, очевидно, что, с точки зрения элиминирования биокоррозии, большой интерес могут представлять ИК, имеющие биоцидную активность.

Следует отметить, что на практике используются вещества, обладающие биоцидной активностью, для которых определяют МИК по отношению к планктонным клеткам, но не биопленкам.

Исследовалась возможность применения биолюминесцентного метода для оценки биоцидной активности ИК, уже широко используемых в нефтяной промышленности стран СНГ и вновь разрабатываемых. Было установлено, что ряд ИК ингибируют люциферазу, а отдельные виды ИК, содержащие в своем составе ПАВ, оказывают слабый активирующий эффект (Табл. 3 и 4). Вместе с этим анализ констант ингибирования, активации и констант Михаэлиса реакций взаимодействия люциферазы с АТФ в присутствии различных концентраций ИК показал (Табл. 5), что концентрации веществ, которые оказывают какое-либо влияние, существенно выше (в 100-300 раз) тех, которые реально применяются на практике.

Таблица 3. Константы ингибирования Таблица 4. Константы активации люциферазы различными ИК. люциферазы некоторыми ИК.

Ингибиторы Константа Ингибиторы Константа коррозии ингибирования, коррозии активации, Ki, г/л Kа, г/л 0,81 ± 0, Катон Нитро-1 0, Ингибитор-55 3,20 ± 0,34 Каспий-2 0, Хазар 9,05 ± 0,92 ВФИКС-82 0, Нитро-2 10,52 ± 1, Каспий-4 8,16 ± 0, Таблица 5. Константы Михаэлиса для реакции люциферазы с АТФ в присутствии различных ИК.

Конц. ИК, Км, мМ г/л Ингибитор-55 Хазар Нитро-2 Каспий- 0,1 0,35 0,38 0,36 0, 0,4 0,49 0,43 0,45 0, 1,0 0,54 0,55 0,49 0, 3,0 0,57 0,62 0,54 0, В связи с этим стало очевидно, что биолюминесцентный метод может быть использован для определения МИК для различных ИК. Значения МИК в отношении планктонных клеток, полученные биолюминесцентным методом, были выше по сравнению с данными микробиологического анализа (Табл. 6). Предположительно, такие результаты были следствием того, что микробиологическим методом определялись только все растущие клетки, а биолюминесцентным методом все жизнеспособные клетки, в том числе и не делящиеся.

Таблица 6. МИК разных ИК, определенные микробиологическим и биолюминесцентным методами, по отношению к разным бактериальными культурами.

МИК, мг/л ВФИКС Нитро- Каспий- Каспий Микроорганизм Катон Хазар 82 1 2 Микробиологический метод 30 75 30 30 75 P. рutida 50 75 50 50 75 А. ferrooxidans 100 100 75 75 50 D. vulgaris Биолюминесцентный метод 117 165 55 57 172 P. рutida 120 162 133 111 164 А. ferrooxidans 229 332 174 169 327 D. vulgaris Понятно, что на практике состав промысловых вод может быть разным, поэтому далее, чтобы определить влияние химического состава вод на действие биоцидного вещества, были взяты различные варианты сред, в частности, питательная среда, физиологический раствор, промысловая вода из нефтяного месторождения и артезианская вода, которую закачивают в скважину (Табл. 7). Результаты показали, что действие биоцида, внесенного в образцы воды в концентрации МИК, было не однозначным, согласно данным, полученным микробиологическим и биолюминесцентным методами. Очевидно, что с помощью биолюминесцентного метода были определены не только растущие, но и некультивируемые формы бактерий, а также было очевидно, что отдельные образцы исследованной воды, например, Артезианской, вообще не требовали введения биоцида, так как сами вызывали гибель клеток, в частности, из-за высокой концентрации солей (329 г/л).

Определение МИК в отношении биопленок позволило установить, что биопленки, формирующиеся на основе смешанных культур, более устойчивы к действию биоцидов, поэтому их применение в отношении таких биопленок с целью полного подавления их роста должно быть в больших концентрациях, чем для биопленок, сформировавшихся на основе монокультур и, безусловно больше, чем для планктонных клеток (Табл. 8).

Таблица 7. Исследование микробиологическим и биолюминесцентным методами биоцидной активности Катона, введенного в МИК в разные инкубационные среды по отношению к клеткам P. рutida.

Исходная Конечная концентрация клеток, Среда для инкубации клеток концентрация кл/мл клеток, Биолюминес- Микробиологи кл./мл центный метод ческий метод Питательная среда (5,3±0,3) х 107 (2,1±0,2) х 109 (1,6±0,1) х - без Катона (5,6±0,2) х 106 (3,8±0,4) х 106 (2,8±0,8) х - с Катоном Физиологический раствор (8,2±0,5) х 106 (7,7±0,7) х 106 (3,1±0,2) х - без Катона (7,5±0,6) х 106 (7,5±0,6) х - с Катоном Нет клеток КНС 1417 (промысловая вода Сиреньковского нефтяного месторождения «Ямашнефть») (5,0±0,7) х 106 (1,7±0,1) х - без Катона Нет клеток (6,9±0,5) х 106 (5,0±0,3) х - с Катоном Нет клеток Артезианская вода Ромашкинского нефтяного месторождения («Альметьевскнефть», Девон) (5,0±0,3) х - без Катона Нет клеток Нет клеток (5,4±0,3) х - с Катоном Нет клеток Нет клеток Таблица 8. МИК разных ИК для планктонных клеток и биопленок.

МИК, мг/л Микроорганизмы Катон SXT-1003 Хазар Нитро-1 Инг.№55 ВФИКС- Планктонные клетки СВБ 200 200 150 150 300 Биопленка на основе СВБ 750 1000 1000 800 800 Биопленка на основе природной 800 1000 1100 900 900 ассоциации клеток При этом было установлено, что введение вещества с биоцидной активностью в среду с планктонными клетками в начале формирования биопленок приводит к более эффективному снижению их удельной скорости роста, чем при внесении биоцида в среду в экспоненциальной фазе роста биопленок (Табл. 9).

Таблица 9. Удельные скорости роста биопленок при внесении Катона на разных стадиях роста.

µ, ч-1 µ, ч- Конц. Снижение Снижение ингибитора (при внесении удельной (при внесении ИК в удельной коррозии, ИК до начала скорости экспоненциальной скорости мг/л формирования роста, % фазе роста роста, % биопленок) биопленок) 0 0,086 контроль 0,070 контроль 50 0,060 30 0,061 100 0,045 48 0,049 150 0,031 65 0,038 3.2. Использование нефтяного волокнисто-пористого сорбента для снижения скорости биокоррозионных процессов При анализе факторов, влияющих на формирование биопленок, в частности, присутствия планктонных клеток, нефти и сульфида железа, возникла идея снижения скорости развития биокоррозионных процессов за счет элиминирования этих факторов. В качестве средства такого элиминирования был использован нефтяной сорбент Мегасорб, обладающий колоссальной нефтеемкостью (40 кг нефти/кг сорбента) и уникальной скоростью сорбции (4 кг нефти/кг сорбента/мин). Известно, что Мегасорб может быть использован в 100 рабочих циклах после полной загрузки нефтью и ее удаления отжимом. Следует отметить, что нефтяные сорбенты, предназначенные для ликвидации последствий аварий с разливом нефти, ранее никем не применялись для решения проблем, связанных с предотвращением коррозии металла.

При прокачивании среды, имитирующей по своему составу промысловые воды, через колонку, заполненную Мегасорбом, было установлено, что в ходе одного фильтрационного цикла из среды удаляется весь сульфид железа (Рис. 11). При этом емкость сорбента по сульфиду составляет 1 мг/г сорбента.

В отношении планктонных клеток, присутствовавших в той же среде, в концентрациях 106 кл/мл, было установлено, что они могут быть удалены на 90% после однократной фильтрации среды через Мегасорб (Рис. 12).

[S2-], мг/л Рис. 11. Зависимость остаточной концентрации сульфида в среде после ее фильтрации (1л) через сорбент.

1 2 3 4 5 масса сорбента, г Рис. 12. Эффективность 0 5 10 15 удаления клеток -0. Мегасорбом из среды -0. ln(N/N0) объемом 1 л, где N0 и N концентрации клеток в -1. потоке до и после -1. фильтрации.

-2. масса сорбента, г Обработка сточных вод фильтрацией через Мегасорб позволила снизить скорость формирования биопленки в 4 раза. Проверка эффективности применения Мегасорба с одновременным введением в систему ИК с биоцидным действием показала, что количество вещества, необходимого для полного удаления биопленок, может быть снижено на 30%.

ВЫВОДЫ 1. Определены удельные концентрации внутриклеточного АТФ для ряда клеток бактерий, относящихся к различным таксономическим группам и участвующих в процессах биокоррозии. Показана возможность использования биолюминесцентного метода определения АТФ для исследования кинетики роста клеток, участвующих в развитии процессов биокоррозии. Оптимизированы условия применения биолюминесцентного анализа для исследования кинетики роста ГБ в пробах, загрязненных нефтью (до 60% масс.).

2. Оптимизированы условия применения биолюминесцентного метода для исследования кинетики роста коррозионно активных биопленок. Разработан способ дифференцированного определения численности бактерий в смешанных культурах, позволяющий исследовать микробный состав коррозионно активных биопленок.

3. Выявлены закономерности формирования коррозионно активных биопленок под влиянием различных факторов. Установлено, что основную роль в формировании коррозионно активных биопленок играют СВБ, на всех стадиях роста состав коррозионно опасных биопленок является гетерогенным, присутствие ГБ увеличивает скорость формирования биопленок. Показано, что присутствие сульфида железа на металлических поверхностях ускоряет рост на них биопленок. Установлено, что химический состав стали, используемой для изготовления металлических конструкций, определяет скорость развития на них коррозионно опасных биопленок.

Выявлено, что присутствие 1-3 % нефти в среде ускоряет процесс формирования биопленок. Показано, что зависимость формирования биопленок от скорости протока имеет различный характер при относительно высоких и низких скоростях протока. Установлено различие в удельных скоростях роста биопленок в стационарной, открытой и замкнутой проточной системах.

4. Показано, что ИК могут влиять на люциферазную реакцию. Вместе с этим анализ кинетических параметров люциферазной реакции в присутствии ИК подтвердил возможность применения биолюминесцентного метода для исследования биоцидной активности этих веществ. Разработан подход на основе биолюминесцентного метода к определению биоцидной активности ИК по отношению к различным планктонным культурам и биопленкам.

Установлено, что значения МИК исследованных ИК по отношению к биопленкам в 3-8 раз больше по сравнению с планктонными культурами.

Установлено, что именно в начальной стадии формирования биопленок необходимо вводить в функционирующие системы нефтяной промышленности ИК с биоцидным действием.

5. Показана возможность использования нефтяного сорбента в антибиокоррозионных целях. Применение Мегасорба позволяет снизить МИК разных ИК с биоцидным действием в отношении биопленок на основе СВБ на 30%.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Efremenko E., Azizov R., Makhlis T., Krupianko P., Varfolomeyev S. (2002) Bioluminescent method based on luciferase application for enumeration of oil degrading microorganisms. // Proc. Petrochem. Oil Refining, V.1 (4), p.92-104.

2. Efremenko E.N., Azizov R.E., Makhlis T.A., Varfolomeyev S.D., Abbasov V.M. (2003) Estimation of biocide activity of corrosion inhibitors by bioluminescent method. // Proc. Petrochem. Oil Refining, V. 4 (15), p.70-75.

3. Ефременко Е.Н., Азизов Р.Э., Махлис Т.А., Аббасов В.М., Варфоломеев С.Д. (2005) Определение биолюминесцентным методом минимальных ингибирующих концентраций веществ по отношению к бактериям, участвующим в биокоррозии. // Прикл. биохимия и микробиол., T. 41 (4), с.

429-434.

4. Efremenko E.N., Azizov R.E., Raeva A.A., Abbasov V.M., Varfolomeyev S.D.

(2005) An approach to the rapid control of oil spill bioremediation by bioluminescent method of intracellular ATP determination. // Intern. Biodeterior.

Biodegr., V.56, p.94-100.

5. Efremenko E.N., Azizov R.E., Abbasov V.M., Varfolomeyev S.D. (2006) Analysis of bacteria self-immobilized into corrosive biofilms.// In: Biocatalysis and Biocatalytic Technologies (Ed. Zaikov G.E.), Nova Science Publishers Inc., N.-Y., p. 39-58.

6. Азизов Р. Э., Махлис Т. А., Ефременко Е. Н. (2002) Определение бактерий, деградирующих углеводороды нефти биолюминесцентным методом. // Межд.конференция «От фундаментальной науки – к новым технологиям. Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок. Экологически безопасные технологии», Тверь, Россия, 15 ноября, с.118-120.

7. Efremenko E.N., Azizov R.E., Makhlis T.A., Varfolomeyev S.D., Abbasov V.M. (2004) Kinetic parameters of biluminescent reaction for screening of new biocides among corrosion inhibitors. // Intern. Conference on Physical Chemystry, 21-23 September, Belgrade, Serbia and Montenegro, p. 273-275.

8. Efremenko E.N., Azizov R.E., Abbasov V.M. (2005) Enzymatic method used to control the efficacy of oil decontamination, during the bioremediation processes.

// III Eur. Bioremed. Conference, Chania, Crete, Greece, July 4-7, p. 142-146.

9. Ефременко Е.Н., Азизов Р.Э., Махлис Т.А., Варфоломеев С.Д. (2005) Способ дифференцированного определения численности бактерий в смешанных культурах.// Патент РФ № 2263148, Бюл.№30, приоритет от 18.02.2004.

10. Azizov R.E., Krupyanko P.V., Kalistratova E.A., Makhlis T.A., Efremenko E.N. Estimation of microbial oil-degradation activity by ATP-bioluminescent method. // Intern. Conference BIOCATALYSIS-2002: Fundamentals &Applications, June, 22-27, Moscow, Russia, 2002, p. 68.

11. Efremenko E.N., Azizov R.E., Makhlis T.A., Varfolomeyev S.D.. Analysis of environmental situation in the oil fields by the bioluminescent method of ATP detection.//The 2nd Moscow Intern. Congress on Biotechnology, November 10-14, Moscow, Russia, 2003, p.227-228.

12. Aзизов Р.Э., Ефременко Е.Н., Аббасов В.М. Влияние различных ингибиторов коррозии на кинетические параметры люциферазной реакции. // Конф. молодых ученых, аспирантов и стипендиатов фонда им. И.В.Березина «Инженерная энзимология» посвящ. 80-летию И.В. Березина, Москва, 2003, с. 6-7.

13. Азизов Р.Э., Ефременко Е.Н., Варфоломеев С.Д., Аббасов В.М.

Исследование процессов биокоррозии в нефтяной промышленности биолюминесцентным методом. // 8-я Межд. Конф. “Биология – Наука XXI века”, 17-21 мая, Пущино, Россия, 2004, c. 250.

14. Efremenko E.N., Azizov R.E., Varfolomeyev S.D., Abbasov V.M..

Determination of oil-degrading and biocorrosive microorganisms by biochemical method of ATP detection. // XVIII National Chemistry Congress, July 5-9, Kars, Turkey, 2004, p.467.

15. Азизов Р.Э., Ефременко Е.Н., Махлис Т.А., Аббасов В.М., Варфоломеев С.Д. Исследование формирования коррозионных биопленок биолюминесцентным методом. // Всерос. Симп. «Биотехнология Микробов», Москва, Россия, 19-22 октября, 2004, с. 8.

16. Azizov R.E., Efremenko E.N., Makhlis T.A., Varfolomeyev S.D.. Analysis of biocatalytic systems based on cells, self-immobilizing throughout the biocorrosion processes. // The 3-rd Moscow Intern. Cong. on Biotechnology, Moscow, Russia, March 14-18, 2005, p. 175 - 176.

17. Азизов Р.Э., Ефременко Е.Н., Варфоломеев С.Д., Аббасов В.М. Новые подходы на основе биолюминесцентного метода к анализу основных факторов, влияющих на формирование коррозионных биопленок. // 9-я Межд. Конф. Биология – Наука XXI века, Пущино, Россия, 18-22 апреля, 2005, c. 338.

18. Азизов Р.Э., Ефременко Е.Н., Варфоломеев С.Д., Аббасов В.М. Влияние различных факторов внешней среды на формирование коррозионных биопленок. // VI Межд. Конф. «Проблемы загрязнения окружающей среды» ICEP – 2005, Пермь, Россия, 20-25 сентября, с. 52.

19. Азизов Р.Э., Ефременко Е.Н., Варфоломеев С.Д., Аббасов В.М.

Исследование антибиокоррозионной эффективности пористых сорбентов в нефтяной промышленности. // 6-я Бакинская Межд. Мамедалиевская Конф.

Нефтехим., Баку, Азербайджан, 27-30 сентября, 2005, с. 8.

БЛАГОДАРНОСТЬ Я выражаю искреннюю благодарность чл.-корр. НАН Азерб., проф., д.х.н.

Вагифу Магеррам оглы Аббасову за неоценимую помощь и всестороннюю поддержку при выполнении моей работы.



 

Похожие работы:





 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.