Структурно–функциональные закономерности в металлобелках на примере цитохромов класса с.

На правах рукописи

Дикая Елена Владимировна Структурно–функциональные закономерности в металлобелках на примере цитохромов класса с.

03.00.04 – биохимия 02.00.15 – катализ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва – 2009

Работа выполнена на кафедре химической энзимологии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова и в Университете Болоньи (Италия).

Научный консультант:

Доктор химических наук, профессор А. И. Дикий

Официальные оппоненты:

Доктор химических наук, профессор А. И. Ярополов Доктор биологических наук, профессор А. В. Максименко

Ведущая организация:

Институт физиологически активных веществ РАН

Защита состоится «_» 2009 г. в 16 часов на заседании Совета Д 501.001.59 по защите докторских и кандидатских диссертаций по химическим наукам при МГУ имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, кафедра химической энзимологии, ауд.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета Московского государственного университета имени М.В.

Ломоносова.

Автореферат разослан « » 2009 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук_И.К.Сакодынская

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы.

Установление взаимосвязи между структурой белка и его функциями в организме является важной задачей современной биохимии и биокатализа.

Подобные исследования необходимы как для выяснения функций белков и механизмов метаболизма того или иного организма, так и для создания биоматериалов с заданными свойствами. Для понимания молекулярных основ биокатализа необходимо обладать детальной информацией о трехмерной структуре белка, а также о конкретных структурных характеристиках, определяющих его физико-химические свойства.

Для многих важнейших биологических процессов необходимы металлобелки.

Однако, нельзя приписать какому-либо конкретному металлу только ему одному свойственную функцию в биокатализе. Один и тот же металл может иметь различные функции, в то время как различные металлы участвуют в сходных каталитических реакциях. Стоит отметить разницу между сравнительно небольшим количеством биологически важных металлов и многообразием функций, которые они выполняют.

Окислительно-восстановительные ферменты и металлобелки составляют более 40 % всех классифицированных Международным союзом биохимии и молекулярной биологии белков. Они играют важную роль в сигнальных процессах, отвечающих за регуляцию генов и их экспрессию, в конверсии энергии в процессах фотосинтеза и дыхания.

Изменяя структуру и природу белкового окружения металла в активном центре, живые организмы способны эффективно регулировать физико-химические свойства этих белков. Одной из важнейших функциональных характеристик металлобелков является их окислительно-восстановительный потенциал. На его значение влияют множество факторов, в том числе координационная геометрия активного центра металлобелка, природа лигандов иона металла и доступность активного центра белка для молекул растворителя. В то же время значение потенциала в значительной мере зависит от внешних условий, в том числе, рН среды, ионного состава и диэлектрических характеристик растворителя. Эта зависимость особенно важна с физиологической точки зрения, т.к. позволяет установить, каким образом внешние условия влияют на процессы электронного переноса, протекающих в живых организмах.

Цитохромы являются важным классом металлобелков, участвующих в процессах электронного переноса и окислительно-восстановительного катализа.

Изучение влияния внешних условий на структуру и физико-химические свойства цитохромов позволяет связать структурные особенности этих белков с их функциями, и таким образом, установить их структурно-функциональные особенности.

Цель работы и задачи исследования.

Целью настоящей работы являлось:

получение данных о структуре цитохромов класса с из различных источников;

установление функционально важных структурных элементов в соответствующих классах цитохромов;

изучение влияния внешних условий на структуру цитохромов с и их электро химический потенциал;

соотнесение полученных структурных данных с функциональными свойствами этих белков - переносчиков электронов.

Для этого в работе были поставлены следующие задачи:

1. Выделить низкоспиновые и высокоспиновые цитохромы с из различных источников.

2. С помощью различных физико-химических методов получить данные о структуре выделенных цитохромов;

3. Изучить влияние внешних условий на структурные и функциональные характеристики выделенных в работе цитохромов c.

4. Выявить общие для цитохромов класса с структурно-функциональные закономерности.

Научная новизна и практическая значимость работы.

В работе впервые были получены кристаллы и определены структуры цитохрома с' из Rhodocyclus gelatinosus и цитохрома с6 из Cladophora glomerata.

Разработана методика выделения цитохрома с из мутантного штамма метилотрофных дрожжей Hansenula рolymorpha. В работе проведен детальный анализ влияния внешних условий на структурные характеристики изученных белков и на их окислительно-восстановительные свойства. Проведен сравнительный анализ структур изучаемых цитохромов со структурами гомологичных белков.

Выявлены общие для цитохромов класса с структурно-функциональные закономерности.

Полученные данные о структурно-функциональных зависимостях в цитохромах с могут быть применены при целевом моделировании ферментов с заданными каталитическими свойствами. Структурная информация о металлоцентре и функционально значимых участках белка необходима при создании комбинаторных библиотек металлосодержащих лекарств. Кроме того, знания механизмов электронного переноса могут быть применены при создании модуляторов электронного переноса.

Апробация работы.

Основные результаты диссертационной работы были представлены на международных конференциях: "Microbial Physiology and Gene Regulation: Emerging Principles and Applications", Hague, December 10-14, 1995 и "Biocatalysis-2009.

Fundamentals & Applications", Arkhangelsk, June 19-24, 2009.

Публикация.

По теме диссертации опубликовано 5 печатных работ, из них – 3 статьи, тезисов докладов на международных конференциях.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы.

Диссертация изложена на 130 страницах, содержит 43 рисунка, 26 таблиц и диаграммы.

Основное содержание работы

.

Выделение и очистка цитохромов с из различных источников.

В работе были предложены методики выделения и очистки до гомогенности следующих белков: цитохром с из мутантного штамма метилотрофных дрожжей Hansenula рolymorpha с подавленной каталазной активностью, цитохром с6 из зеленых водорослей Cladophora glomerata, а также выделен и очищен цитохром с' из фотосинтетических бактерий Rhodocyclus gelatinosus.

Цитохром с из мутантного штамма метилотрофных дрожжей H. рolymorpha был выделен в три основных этапа:

- разрушение клеток этилацетатом с одновременным частичным осаждением белков сульфатом аммония;

- осаждение белков на специфическом фильтре Целите-545;

- серия ионнообменных хроматографий.

Уровень экспрессии данного белка в мутантном штамме был в 3-4 раза выше, чем в нативном штамме. Общий выход белка из 1,4 кг клеток был равен 20 мг.

Цитохром с6 из зеленых водорослей C. glomerata был выделен в три основных этапа:

- экстракция белков из таллома водорослей;

- осаждение белков сульфатом аммония;

- серия ионнообменных хроматографий.

Цитохром с' из фотосинтетических бактерий Rh. gelatinosus был выделен в два основных этапа:

- разрушение клеток на ультразвуковом дезинтеграторе с последующим осветлением ультрацентрифугированием;

- серия ионнообменных хроматографий.

Чистота полученных белков определялась электрофоретически и по отношению интенсивности максимума пика Соре к интенсивности полосы на 280 нм в спектрах поглощения. Все белки были выделены с чистотой выше 95%.

Альтернативный механизм детоксикации метилотрофных дрожжей H. polymorpha с подавленной каталазной активностью.

Для изучения возможных каталитических механизмов детоксикации метилотрофных дрожжей в работе использовали мутантный штамм метилотрофных дрожжей Hansenula polymorpha (C-105-65) с подавленной каталазной активностью, но с восстановленной способностью к метилотрофному росту и использованию метанола в качестве единственного источника углерода и энергии.

В метилотрофных дрожжах, растущих в среде метанола, последний вступает в реакцию окисления, катализируемую алкогольоксидазой (AOX), в результате которой выделяется токсичный для организма пероксид водорода:

CH3OH + O2 CH2O + H2O AOX Важным последующим шагом является детоксикация организма от пероксида водорода. Реакция детоксикации у нативных дрожжей H. polymorpha протекает в пероксисомах и катализируется каталазой.

В мутантном штамме дрожжей H. polymorpha каталазная активность была подавлена и удаление пероксида водорода каталазой становилось невозможным.

При этом, хотя выход биологической массы уменьшался, по сравнению с биологической массой нативного организма, мутантный штамм был способен расти в среде с единственным источником углерода - метанолом. Таким образом, вывод пероксида водорода из организма происходил по другому механизму. В то же время было известно, что пероксид водорода способен индуцировать в H. polymorpha экспрессию другого фермента – цитохром с пероксидазы, также способного служить катализатором в реакциях детоксификации и выводить пероксид водорода.

Действительно, в исследуемом в работе мутантном штамме экспрессия данного фермента была увеличена. Кроме того, было замечено увеличение экспрессии другого неизвестного белка.

В данной работе был выделен белок, экспрессия которого повышена в вышеупомянутом мутанте в 3-4 раза. На основании спектров поглощения, ЯМР и ЭПР данных, молекулярной массы и яркой, характерной для цитохромов окраски, белок был отнесен к классу низкоспиновых цитохромов с из митохондрий. Данный белок является субстратом цитохром с пероксидазы в реакции восстановления перекиси водорода до воды. Таким образом, было подтверждена возможность существования альтернативного механизма удаления пероксида водорода окислением цитохрома с в митохондриях, катализируемого цитохром с пероксидазой (СсР) по следующей реакции:

2 cyt c (Fe2+) + H2O2 +2H+ 2 cyt c (Fe3+) + 2H2O CcP УФ- видимые спектры поглощения цитохромов c Для всех изученных в работе цитохромов были записаны и проанализированы спектры поглощения. Проведенные спектральные исследования позволили определить спиновое состояние изученных белков. Спектры цитохрома с из H.

рolymorpha и цитохрома с6 из C. glomerata, представленные на рисунке 1, являются типичными для низкоспиновых цитохромов, в то время как цитохром с' из Rh.

gelatinosus (рисунок 2) имеет спектр, характерный для высокоспиновых систем.

Цитохром с из H. рolymorpha итохром с6 из C. glomerata.

Рисунок 1. Спектры поглощения низкоспиновых цитохромов с в окисленной и восстановленной формах.

Рисунок 2. Спектр поглощения высококоспинового цитохрома с' из Rh. gelatinosus в окисленной форме.

Анализ полученных спектров поглощения позволил охарактеризовать координационную сферу иона железа в активном центре изученных цитохромов.

Спектры поглощения низкоспиновых цитохромов с и с6 в восстановленной форме имеют -полосы при ~550 нм, -полосы ~ 523 нм и полосы Соре ~ 415 нм. В спектрах окисленной формы этих белков полосы Соре сдвигаются в коротковолновую область ~ 410 нм, а - и -полосы сливаются в одну широкую полосу на ~530 нм, с небольшим плечом на 560 нм. У обоих белков в окисленном состоянии можно обнаружить типичную слабоинтенсивную полосу на 695 нм, характеризующую взаимодействие серы аксиального метионина с железом гема. Эта полоса может пропадать при частичной денатурации белка, при его восстановлении или при связывании железа гема с другими лигандами. Для обоих белков в окисленном состоянии при изменениях значения рН до щелочного данная полоса пропадает, указывая на происходящие конформационные перегруппировки в белке.

Спектр поглощения цитохрома с' отличается от спектров низкоспиновых цитохромов. Действительно, цитохром с' – это пятикоординационный, самоокисляющийся высокоспиновый белок. В его спектре не наблюдается полосы на 695 нм, но присутствует полоса на 638 нм, которая служит маркером высокоспинового состояния и появляется благодаря взаимодействию высокоспинового иона железа с порфирином.

Кислотно-основные равновесия цитохромов с.

Анализ спектров поглощения, ЯМР, ЭПР и результатов электрохимического титрования при различных значениях рН среды позволил количественно охарактеризовать устанавливающиеся кислотно-основные равновесия для изученных цитохромов. Для всех выделенных цитохромов были определены два наиболее ярко выраженных равновесия (Рисунок 3). Первое устанавливается в кислой среде (значение рКа ~ 4,5) и обусловлено изменением в степени ионизации карбоксильной группы пропионата 7 гема как у низкоспиновых, так и у высокоспинового цитохромов. Данное равновесие не сопровождается какими-либо существенными структурными изменениями в координационной сфере иона железа.

Так как пропионатные группы не входят в сопряженную систему электронной плотности порфиринового кольца и иона железа, то изменения в значениях потенциалов белков при изменении степени ионизации этих групп являются незначительными.

В щелочных средах для всех изученных в работе цитохромов с устанавливается другое кислотно-основное равновесие (рКа~9,0). С ним связаны более значительные изменения в структуре низкоспиновых цитохромов с. При этих значениях рН понижается электрохимический потенциал белков. В спектрах поглощения пропадает полоса на 695 нм, характеризующая взаимодействие серы аксиального метионина с железом гема. В ЯМР спектрах пропадают сигналы метилового и метиленового пиков аксиального метионина. Все эти данные позволяют сделать вывод о разрыве аксиальной связи железо-сера метионина. При этом общий вид спектров остается характерным для низкоспинового шестикоординационного железа гема.

Принимая во внимания полученные данные, был сделан вывод о замещении аксиального метионина на другой лиганд. В качестве альтернативного аксиального лиганда был предложен лизин, находящийся в удобной для такой замены позиции.

рКа процесса замещения метионина хорошо согласуется со значениями рН, при которых происходит депротонация NH3+-концевой группы лизина, которая в этом случае становится нейтральной и способной координировать Fe (III). Кроме того, уменьшение электрохимического потенциала (Рисунок 4) позволяет предположить стабилизацию окисленного состояния железа гема, происходящую при замене серы метионина на более сильный донор электронов, каким является азот лизина.

В ЯМР спектрах цитохрома с' при щелочных значениях рН (рКа~9,0) также происходят значительные изменения, которые можно объяснить депротонацией аксиального гистидина, что приводит к увеличению силы поля этого лиганда и, как следствие, изменению общего спина системы.

Рисунок 3. Определение значений рКа на примере цитохрома с6 из C. glomerata. А – ЯМР спектры: изменения в химическом сдвиге сигнала С, отнесенного к сигналам пропионата порфирина;

B – спектры поглощения Рисунок 4. Зависимость электрохимического потенциала от рН для цитохрома с из H.

рolymorpha.

Кристаллизация цитохрома с6 из C. glomerata и цитохрома с' из Rh.

gelatinosus.

В работе были получены кристаллы цитохрома с6 из C. glomerata и цитохрома с' из Rh. gelatinosus методом паровой диффузии (табл. 1).

Таблица 1. Условия кристаллизации цитохромов с6 и с' методом висящей капли.

Буфер для Температура Раствор для Время роста Белок Осадитель белка роста кристаллов роста 0,2 M Na ацетат, Цитохром с6 20 мМ Tris*Cl 30%PEG 22°C 1-2 недели 0,1M Na 5 мг/мл pH 7,6 какодилат, pH 6, 50 mM 55% (NH4)2HPO4, 1M 50 mM (NH4)2SO Цитохром с' NaCl, pH6.0 4°C 2-3 недели (NH4)2HPO4, 10 мг/мл 200 мМ pH6.0 100 мМ какодилат (NH4)2SO4, рН 6, 30% PEG 4K Полученные кристаллы исследовались методом рентгеноструктурного анализа для расчета структуры этих белков.

Анализ структуры цитохрома с6 из C. glomerata и цитохрома с' из Rh.

gelatinosus Цитохром с С помощью рентгеноструктурного анализа в работе были получены данные о трехмерной структуре цитохрома с6. Обработка данных проводилась методом молекулярного замещения. Трехмерная структура цитохрома с6, определенная с разрешением 1,3, представлена на рисунке 5. Молекула белка (молекулярный вес 10,5 кДа) находится в ассиметричной элементарной ячейке, содержание растворителя около 50%. Координаты атомов белка депонированы в белковой базе данных www.rcsb.org с кодом 1LS9.

Рисунок 5. Структура цитохрома с6 из C. glomerata.

Цитохром с6 из C. glomerata является мономером и его структура в нейтральной среде характеризуется четырьмя альфа спиралями, одной короткой спиралью и антипараллельным -слоем ( - - - - ).

Большая часть гема расположена в гидрофобном окружении. Он связан с белком через Cys17 и Cys20 (тиоэфирные связи), а также через His21 и Met (аксиальноые лиганды). Таким образом, железо в геме координировано шестью лигандами – четыре азота порфиринового кольца и два аксиальных лиганда. Гем почти полностью укрыт от растворителя. Наиболее доступными группами гема являются 3-СН3 и 4-СН3, вместе с атомами кислорода пропионатов 6 и 7.

Водородные связи, образуемые водой могут определять координационные свойства иона железа и, следовательно, играют функциональную роль в электронном переносе. И хотя многие эукариотические цитохромы с имеют молекулу воды около аксиальных лигандов гема, в случае цитохрома с6 из C. glomerata молекул воды в этой области не было обнаружено.

Для определения функционально важных структурных элементов белка был проведен сравнительный анализ структуры цитохрома с6 из C. glomerata с известными структурами других цитохромов с6. Сравнение значений среднеквадратичного отклонения позволяет судить о структурной консервативности тех или иных участков структур. Было найдено, что данное значение ниже для спиралей I, III, IV и -петли, в то время как спираль II и петля, соединяющая ее c третьей спиралью, имели высокое значения среднеквадратичного отклонения.

Проведенный анализ хорошо согласуется с гомологичностью последовательности аминокислот на этих же участках.

Из трех структурных элементов, окружающих гем, только -петля и петля, соединяющая спирали III и IV хорошо сохраняются внутри класса цитохромов с6.

Обе петли расположенны около доступных растворителю 3-СН3 и 4-СН3 атомов пиррольного кольца. Короткий участок антипараллельного -слоя, следующего за спиралью III, находится между Lys60 и Met63 и стабилизирован водородной связью, образуемой амидным протоном Lys60 и карбонильным атомом Met63. Этот участок имеет стабильную аминокислотную последовательность и сходные структурные характеристики у всех цитохромов с6. Как аксиальный лиганд гема Met63, так и выдвинутый в качестве альтернативного аксиального лиганда при щелочных значениях рН Lys60 расположены на этом структурно-консервативном -слое.

Данный анализ позволяет предположить, что эти консервативные структурные элементы участвуют во взаимодействии цитохрома с6 с его функциональными партнерами, и впоследствии, в переносе электрона. Полученные данные позволяют заключить, что спираль II, характеризующаяся низкой гомологичностью аминокислотной последовательности и высоким значением среднеквадратичного отклонения, не имеет определяющего функционального значения.

Для дальнейшего изучения свойств цитохрома с6 был проведен анализ поверхностного потенциала этого белка и других белков того же класса.

Сравнение показывает (Рисунок 6) схожее распределение поверхностных зарядов в данном классе белков. Во всех случаях гем находится в окружении гидрофобных групп, а большинство отрицательных зарядов расположено с противоположной гему стороны. Положительно заряженные группы, в основном лизина, сгруппированы около доступного растворителю пиррольного кольца гема.

Необходимо отметить, что именно поверхность белка вокруг канала, ведущего к гему играет важную роль при молекулярном распознавании в реакциях электронного переноса. Из рисунка 6 видно, что доступность гема растворителю сходна для всех анализируемых цитохромов.

Рисунок 6. Распределение зарядов на поверхности цитохромов с6. Показаны две ориентации белков, под углом 180° вокруг вертикальной оси. Гем указан стрелками. 1LS9 цитохром с6 из C.glomerata, 1C6R - цитохром с6 из S.obliquus, 1CTJ - цитохром с6 из M.braunii, 1CYJ - цитохром с6 из Ch. reinhardti, 1F1F - цитохром с6 из A.maxima, 1GDV - цитохром с6 из P. yezoensis.

Как было определено в работе, значение окислительно-восстановительного потенциала для цитохрома с6 из C. glomerata при стандартных условиях (водородный электрод, рН 7, 298 К, 0,1 М NaCl) было равно 0,352 V. Найденное значение близко к значениям потенциалов для других цитохромов с6.

Таблица 2. Окислительно-восстановительные потенциалы и доступность гема различных цитохромов с6 с известной структурой.

Доступность растворителю, Потенциал, Идентичность, Источник PDB код %a Е (mV) Порфириновое Весь гем кольцо Arthrospira maxima 1F1F 314 53,3 62,3 17, Phormidium 2V08 325 58,2 57,7 14, laminosum Cladofora glomerata 1LS9 352 100 60,9 11, Monoraphidium 1CTJ 358 61,5 60,7 7, braunii Chlamydomonas 1CYJ 370 58,1 70,0 9, reinhardtii a - идентичность аминокислотной последовательности с аминокислотной последовательностью цитохрома с6 из Cladophora glomerata Различная доступность активного центра растворителю может быть одной из причин различий в значениях окислительно-восстановительного потенциала у цитохромов. В таблице приведены окислительно-восстановительные потенциалы цитохромов с6 и данные о доступности их активного центра, расчитанные для двух различных участков гема. Общая доступность активного центра определяется доступностью растворителю групп пропионатов. Однако, они не входят в сопряженную систему электронной плотности порфиринового кольца, и, в основном, они лишь электростатически стабилизируют положительный заряд на геме. Поэтому невозможно провести прямую корреляцию между доступностью пропионатных групп растворителю и окислительно-восстановительным потенциалом. Более определенную зависимость между этими значениями можно обнаружить, анализируя доступность системы, включающей в себя железо, порфириновое кольцо и атомы, расположенные на расстоянии одной сигма связи от него. Из таблицы видно, что с увеличением доступности этой части гема, значение окислительно-восстановительного потенциала уменьшается. Проведенный анализ позволяет предположить схожесть механизмов редокс реакций, в которые вовлечены цитохромы с6.

Цитохром с' С помощью метода рентгеноструктурного анализа в работе были получены данные о трехмерной структуре цитохрома с' из Rh. gelatinosus. Обработка экспериментальных данных проводилась методом молекулярного замещения.

Расчитанная в работе структура цитохрома с', определенная с разрешением 2,5, представлена на рисунке 7. Как видно из рисунка цитохром с' из Rh. gelatinosus в нейтральной среде является ассимметричным димером. Кристалл цитохрома с' состоит из ассимметричных элементарных ячеек с одной молекулой димера на ячейку. Содержание растворителя около 60 %. Координаты атомов белка депонированы в белковой базе данных www.rcsb.org с кодом 1JAF.

Каждый из мономеров состоит из четырех антипараллельных альфа спиралей. Вместе они образуют вытянутый левоскрученный узел. Гем расположен около С-конца молекулы.

Рисунок 7. Структура цитохрома с' из Rh. Gelatinosus Сравнение аминокислотных последовательностей.

Попарное сравнение аминокислотной последовательности цитохрома с' из Rh.

gelatinosus с аминокислотными последовательностями других цитохромов с' из различных источников [RGCP (Rhodocyclus gelatinosus), AXCP (Achromobacter xyloseoxidans);

CVCP (Chromatium vinosum);

RMCP (Rhodospirillum molischianum);

RRCP (Rhodospirillum rubrum) и RCCP (Rhodobacter capsulatus)] проводилось с помощью программы CLUSTAL W и показало 48, 28, 27, 33 и 27% идентичности, соответственно. Среди всех проанализированных трехмерных структур цитохромов с' выявлено только 9 идентичных и восемь гомологичных аминокислотных остатков.

Необходимо отметить, что наибольшая гомологичность с цитохромом с' из Rh.

gelatinosus обнаружена для цитохрома с' (AXCP) из Achromobacter xyloseoxidans, который выделен из организмов, принадлежащих к другому семейству.

Наблюдаемое структурное сходство между цитохромами с', выделенных из организмов, принадлежащим к различным семействам, является уникальным и не применимо к другим высокоспиновым белкам из тех же источников (например, высокопотенциальный железосерный белок, HiPIP). Возможным объяснением этого аномального феномена может послужить гипотеза о происшедшем в ходе эволюции межвидовом переносе генов.

Окружение гема Гем цитохрома с' из Rh. gelatinosus имеет несимметричное окружение (Рисунок 8).

Рисунок 8. Гем и его окружение в цитохроме с' из Rh. gelatinosus. На рисунке изображены две молекулы воды, пунктирные линии показывают образование водородных связей.

Одна его сторона обращена внутрь белка, а другая частично открыта растворителю. Гем ковалентно связан с белковой матрицей посредством двух тиоэфирных мостиков Cys119 и Cys122. His123 занимает пятое координационное место, в то время как шестое координационное место свободно. Аксиальный гистидин доступен растворителю и образует водородную связь N1 атомом с молекулой воды. Молекула воды найдена также между пропионатыми группами гема в обоих субъединицах цитохрома с' из Rh. gelatinosus. Подобная включенная молекула воды найдена во всех цитохромах с', с уже известной структурой. Arg12, характерный для всех цитохромов с', важен для стабилизации структуры, так как образует шесть структурно важных водородных связей (на рисунке 8 представлены лишь две из них).

Атом железа довольно значительно приподнят над плоскостью порфиринового кольца (~0,25 ) по направлению к аксиальному гистидину.

Подобный эффект можно объяснить большим эффективным радиусом высокоспинового иона железа, из-за чего ион не входит полностью во внутреннее пространство порфиринового кольца. Кроме того, отсутствие шестого лиганда с дистальной стороны, не накладывает жестких стереохимических ограничений и позволяет железу занять более удобное, приподнятое положение.

У цитохрома с' из Rh. gelatinosus пропионатные группы гема лишь частично прикрыты белком и направлены в сторону второго мономера, в виде клещей.

Найденные между двумя мономерами молекулы воды стабилизируют димер солевыми и водородными связями. С тыльной стороны шестое координационное место иона железа стерически блокировано Phe16, принадлежащим спирали А.

Фенильное кольцо расположено параллельно плоскости гема и лежит на расстоянии ~3,6. Это пространство весьма гидрофобно и вблизи гема не было найдено ни одной молекулы воды. У цитохромов с' из CVCP и RCCP ароматические остатки также блокируют доступ к шестому координационному месту иона железа (Рисунок 9). У других цитохромов (RMCP, RRCP, AXCP) на соответствующих позициях гидрофобных групп не было найдено. Подобные структурные особенности позволяют разделить цитохромы с' на две группы.

Первая группа включает CVCP, RCCP и RGCP, в то время как вторая группа состоит из RMCP и AXCP. Члены первой группы имеют глубокий проход между спиралью В и С. Прямой доступ к аксиальной позиции железа гема блокирован ароматическим остатком. У второй группы цитохромов с' подобный канал отсутствует.

Имеющиеся данные не позволяют провести однозначную корреляцию между доступностью гема для растворителя среди цитохромов этого класса и значением их окислительно-восстановительного потенциала, которые варьируются от E0 = -5 mV до E0 = +110 mV.

Рисунок 9. Трехмерная структура цитохромов с' из различных источников. Гем указан стрелкой. RGCP- Rhodocyclus gelatinosus), CVCP - Chromatium vinosum;

RCCP - Rhodobacter capsulatus;

AXCP - Achromobacter xyloseoxidans;

RMCP - Rhodospirillum molischianum.

Соединение димеров Два мономера цитохрома с' из Rh. gelatinosus образуют димер. Он имеет характерную для цитохромов с' Х-форму и обе субъединицы расположены почти под прямым углом друг к другу. В изученном белке было найдено несколько межмономерных связей, обеспечивающих стабилизацию димера. Обнаружено шесть водородных связей между боковыми цепями спиралей А и А' двух мономеров.

Другие стабилизирующие димер водородные связи образуются молекулами воды, находящимися между двумя субъединицами. Кроме того, существуют гидрофобные контакты между спиралями В и В' и А и А'.

Сравнение структуры цитохрома с' из Rh. gelatinosus со структурами других белков.

Характерная структура цитохромов с', состоящая из четырех -спиралей, встречается и среди белков других классов. Поиск сходных структур с помощью программы DALI позволил обнаружить 40 белков, для которых значение Z (степень структурной схожести) было больше 2, что говорит о значительном сходстве структур этих белков со структурой мономера цитохрома с' из Rh. gelatinosus.

Цитохром b562 из E. coli имеет значение Z равное 10,6, при этом аминокислотные последовательности этих двух белков идентичны на 13%. Миогемеритрин из сипункулоидных червей имеет значение Z равное 7,0.

Миогемеритрин – негемный белок, состоящий из 118 аминокислот и имеющий биядерный центр, содержащий ионы железа. Интересно, что положение биядерного центра почти полностью совпадает с положением активного центра цитохрома с'.

Миогемеритрин в живых организмах связывает кислород. Этот белок имеет разные олигомерные формы: мономер, димер, тетрамер и октамер.

Цитохром b562 – мономер, состоящий из 106 аминокислот, в котором гем, расположенный около С-конца, связан с белковой матрицей аксиальными метионином и гистидином. Как цитохром b562, так и цитохром с' имеют гем в качестве простетической группы. Сходство общей структуры цитохрома с' и цитохрома b562, одинаковое расположение гемов, их химическое окружение и доступность растворителю позволило выдвинуть предположение о наличии общего эволюционного предка для этих классов цитохромов.

Рисунок 10. Сравнение структуры цитохрома с' (показана серым цветом) со структурами:

а) - цитохрома b562 (показана черным цветом) и в) миогемеритрина (показана черным цветом).

Выводы Комплексный анализ полученных в ходе работы физико-химических и структурных данных позволил детально охарактеризовать цитохром с из H.

рolymorpha, цитохром с6 из C. glomerata, цитохром с' из Rh. gelatinosus и сделать общие для цитохромов класса с выводы о структурно-функциональных закономерностях..

1. В работе были выделены цитохром с из мутантного штамма C-105- метилотрофных дрожжей H. рolymorpha, цитохром с6 из зеленых водорослей C. glomerata и цитохром с' из фотосинтетических бактерий Rh. gelatinosus.

2. Впервые были получены кристаллы цитохрома с6 из C. glomerata и цитохрома с' из Rh. gelatinosus и определены их трехмерные структуры методом рентгеноструктурного анализа с разрешением 1,3 и 2,5, соответственно. Координаты атомов белков депонированы в белковой базе данных www.rcsb.org. Анализ спектров поглощения, ЯМР и ЭПР данных позволил детально изучить активные центры выделенных цитохромов и отнести цитохром с из H. рolymorpha и цитохром с6 из C.

glomerata к низкоспиновым, а цитохром с' из Rh. gelatinosus к высокоспиновым цитохромам.

3. Показано, что при изменении рН среды до щелочного значения (рКа~9) у низкоспиновых цитохромов с и с6 происходит структурная перегруппировка, в ходе которой аксиальный метионин обратимо замещается на лизин. Обе группы расположены на структурно консервативных участках с высокой аминокислотной гомологией для всех белков соответствующих классов, что позволяет сделать вывод о важности рН-зависимого замещения метионина на лизин в процессах электронного переноса, в которых участвуют цитохромы с. Замещение аксиального метионина на лизин приводит к понижению окислительно восстановительного потенциала.

4. Проведенные исследования позволили выявить корреляцию между доступностью растворителю порфиринового кольца активного центра цитохромов с6 и значениями их окислительно-восстановительного потенциала: при увеличении доступности активного центра значение потенциала уменьшалось. Кроме того, на основании сходства общей структуры цитохрома с' и цитохрома b562, одинакового расположения гемов, их химического окружения и доступности растворителю, было выдвинуто предположение о наличии общего эволюционного предка для этих классов белков.

Список публикаций по теме диссертации 1. Arcer M., Banci L., Dikaya E., Romao M.J. Crystal structure of cytochrome c' from Rhodocyclus gelatinosus and comparison with other cytochromes c'./ J.Biol. Inorg. Chem.

– 1997 – vol. 2 – pp.611-622.

2. Borsari M., Dikaya E., Dikiy A., Gonchar M.V., Maidan M.M., Pierattelli R., Sibirny A.A.

Isolation and Physico-Chemical Characterization of the Cytochrome c from Methylotrophic Yeast Hansenula polymorpha./ Biochem. Biophys. Acta – 2000 – vol.1543 – pp.174-188.

3. Dikiy A., Carpentier W., Vandenberghe I., Borsari M., Safarov N., Dikaya E., Van Beeumen J., Ciurli S. Structural Basis for the Molecular Properties of Cytochrome c6 from the Green Alga Cladophora glomerata./ Biochemistry – 2002 – vol. 41 – pp.14689-14699.

4. Gonchar M.V., Kostryk L.B., Maidan M.M, Dikaya E.V., Luchinat C., Sibirny A.A..

Derepression of cytochrome c peroxidase restores methylotrophic growth of catalase deficient mutant of Hanselula polymorpha // Beijerinck Centennial "Microbial Physiology and Gene Regulation: Emerging Principles and Applications" (December 10-14, 1995). – Hague (The Netherlands). – 1995 - рр.424-425.

5. Dikaya E., Ciurli S., Banci L., Dikiy A. “Comparative analysis of heme’s availability in Cytochtomes c6 and c’”. Abstracts of International Conference "Biocatalysis-2009.

Fundamentals & Applications", Arkhangelsk, June 19-24, 2009, p.124 (poster).