Модифицированные полимерные наногели: синтез, свойства и применение
На правах рукописи
НУКОЛОВА НАТАЛИЯ ВЛАДИМИРОВНА МОДИФИЦИРОВАННЫЕ ПОЛИМЕРНЫЕ НАНОГЕЛИ:
СИНТЕЗ, СВОЙСТВА И ПРИМЕНЕНИЕ 02.00.06 – высокомолекулярные соединения, химические наук
и
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук МОСКВА – 2010
Работа выполнена на кафедре высокомолекулярных соединений химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова и в фармацевтическом колледже Медицинского центра университета Небраски в соответствии с соглашением о научном сотрудничестве и обмене между Московским государственным университетом имени М.В.
Ломоносова (Москва, Россия) и Медицинским центром университета Небраски (Омаха, Небраска, США).
Научный консультант: доктор химических наук, профессор Кабанов Александр Викторович
Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор Паписов Иван Михайлович доктор химических наук, профессор Зубов Виталий Павлович
Ведущая организация: Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН
Защита состоится 10 ноября 2010 года в 14 час. на заседании Диссертационного совета Д 501.001.60 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские Горы, д.1, стр.3, МГУ имени М.В. Ломо носова, Химический факультет, Лабораторный корпус “А”, кафедра высокомолекулярных соединений, ауд. 501.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.
Автореферат разослан октября 2010 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, к. х. н. Долгова А.А.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Наногели представляют собой уникальный класс гидрогелей, основанных на гидрофильной или амфифильной полимерной сетке, которая стабилизирована в результате межмолекулярных взаимодействий или химических связей. В настоящее время наногели, благодаря способности обратимо откликаться на небольшие внешние воздействия (температура, ионная сила, рН, электрическое поле и др.), а также включать в свой объем и контролируемо высвобождать различные биологически активные вещества (БАВ), интенсивно исследуются и внедряются во многие области производственной деятельности человека.
В последние годы гидрогели микро- и наноразмеров привлекают все большее внимание в качестве основы для создания систем доставки лекарств (СДЛ) в организме с контролируемым дозированием. Наногели способны абсорбировать большое количество воды (до 95% в/в), тем самым, содействуя включению в свой объем различных молекул (РНК, ДНК, олигонуклеотиды, низкомолекулярные терапевтические и диагностические агенты), которые нестабильны, быстро выводятся из организма или характеризуются высокой системной токсичностью.
Наногели позволяют конструировать СДЛ с контролируемым «спусковым механизмом» высвобождения лекарств из наноконтейнера в ответ на изменения окружающей среды. Кроме того, повышение селективности их действия в организме может быть достигнуто посредством введения различных специфических векторных групп, предающие избирательную направленную доставку БАВ в определенные органы или клетки-мишени.
Наногели – это интенсивно развивающийся, относительно новый класс наноматериалов (первый обзор вышел в 2002). Поэтому многие физико химические свойства наногелей еще практически не изучены, в литературе мало работ по введению направляющих векторных групп в наногели, до сих пор нет успешных попыток использования наногелей для адресной доставки лекарственных препаратов in vivo.
Цель работы заключалась в синтезе новых полимерных наногелей, способных включать биологически активные вещества;
в создании новых подходов для модификации этих сложных полимерных систем различными векторными группами с сохранением их биологической активности;
в изучении физико химических особенностей поведения таких наногелей в водных средах и в установлении возможности практического применения разработанных наноматериалов в медицине.
Научная новизна. Впервые продемонстрировано, что можно контролировать многие физико-химические характеристики наногелей, синтезируемых на основе блок-иономерных комплексов, создавая полимерные наноконтейнеры для молекул с заранее заданными свойствами (емкость загрузки и кинетика высвобождения БАВ, дисперсионная стабильность пустых и нагруженных наногелей, способность «откликаться» на изменения во внешней среде). Разработаны методы химической модификации наногелей низкомолекулярными соединениями (фолиевая кислота) и белками (моноклональные антитела) с сохранением биологической активности этих соединений. Изучены физико-химические характеристики модифициро ванных наногелей (гидродинамический размер, -потенциал, дисперсионная стабильность) в широком диапазоне рН и ионной силы раствора, и оптимизировано число модифицирующих групп с точки зрения их взаимодействия с модельными и клеточными рецепторами. Разработан метод загрузки модифи цированных наногелей БАВ и флуоресцентными метками, и впервые показана принципиальная возможность их доставки с помощью наногелей в опухоль.
Практическая значимость работы. В ходе исследования физико-химических свойств наногелей, их модификации векторными группами, а также введения в их объем различных молекул получены результаты, имеющие принципиальное значение для развития этого нового класса наноматериалов в качестве систем для направленной доставки терапевтических и диагностических молекул в раковые опухоли. В частности, в работе исследована способность наногелей, нагруженных противораковыми лекарствами и модифицированных фолиевой кислотой, селективно убивать раковые клетки, а также уменьшать рост опухолей и увеличивать продолжительность жизни животных.
Апробация работы. Основные результаты работы докладывались и обсуждались на Международном Симпозиуме по наномедицине и доставке лекарственных препаратов NanoDDS’08 (Торонто, Канада, 2008) и NanoDDS’ (Индианаполис, США, 2009), на 40 и 41-ом ежегодном студенческом биомедицинском научном форуме (Небраска, США, 2009 и 2010), на 50-ом ежегодном национальном студенческом научном форуме (Техас, США, 2009), на 1-ой Международной летней школе – Нано2009. «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах» (Московская область, Россия, 2009), на симпозиуме «Biomedical Polymers for Drug Delivery» (Юта, США, 2010), на 42-ой ежегодной фармацевтической научной конференции аспирантов (Огайо, США, 2010), а также Гордоновской научной конференции «Drug Carriers in Medicine and Biology» (США, 2008 и 2010).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 1 статья в журнале, рекомендованном ВАК, и 10 тезисов докладов на российских и международных конференциях.
Объем и структура работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, заключения, выводов, списка цитируемой литературы (161 наименований) и приложения. Работа изложена на 141 странице, содержит 27 рисунков, 4 таблицы.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
В литературном обзоре рассмотрены современное состояние исследований в области микро/наногелей, основные подходы к их получению, особенности их физико-химических характеристик, а также возможность практического применения данных систем для решения задач современной медицины.
В экспериментальной части описан синтез наногелей и методы их модификации векторными группами, способы введения различных лекарственных препаратов, а также использованные в работе методы исследования.
В работе изучены наногели, полученные на основе блок-иономерных комплексов (БИК) с использованием полиэтиленгликоль-б-полиметакриловой кислоты (ПЭГ-б-ПМАК) и двухвалентных ионов металла (Са2+, Ва2+). В работе использовали блок-сополимеры ПЭГ(170)-б-ПМАК(180) и ПЭГ(114)-б-ПМАК(81) с концевыми метокси-группами, а также ПЭГ(125)-б-ПМАК(180) с концевой гидроксильной группой.
Синтез полимерного наногеля, состоящего из ковалентно сшитых блок сополимерных цепей ПЭГ-б-ПМАК, представляет собой двухстадийный процесс (Схема 1). Первая стадия заключается в самоорганизации блок-сополимера в БИК в присутствии ионов металла. Блок-иономерные комплексы ПЭГ-б-ПМАК и Меn+ были приготовлены из водных растворов блок-сополимера и МеCl2 при рН 8.0.
Вторая стадия - это формирование сшивок в ядре БИК между карбоксильными группами полиметакриловой кислоты и аминогруппами 1,2-этилендиамина в присутствии водорастворимого карбодиимида (КДИ). После введения сшивок в БИК ионы металла удаляли хелатированием с ЭДТА и последующим диализом.
Формирование наноразмерных БИК и наногелей подтверждали методами динамического рассеяния света (ДРС) и атомно-силовой микроскопии (АСМ).
Поведение водных дисперсий наногелей с различной плотностью сшивки (степень набухания, морфология, стабильность и др.) было подробно изучено.
Различные по природе векторные группы (фолиевая кислота (ФК), моноклональные антитела (mAb) или их фрагменты (Fab)) были ковалентно связаны с наногелями через короткие связки или длинные гибкие ПЭГ мостики.
Модифицированные наногели были охарактеризованы методами ДРС, АСМ, протонного ядерного магнитного резонанса (1Н-ЯМР), УФ-спектрофотометрии, электрофореза в полиакриламидном геле (SDS-PAGE). Кроме того, метод поверхностного плазмонного резонанса (ППР) был использован для демонстрации специфического связывания модифицированных наногелей с их мишенями и определения равновесных констант ассоциации и диссоциации.
В качестве противоопухолевых препаратов были выбраны доксорубицин (DOX) и цисплатин (CDDP), которые вводились в наногели простым смешением водных растворов компонентов при рН 7.0 и рН 9.0, соответственно.
Контролируемое высвобождение данных веществ из наногелей изучали методом диализа в буферных растворах при рН 7.4 и 5.5 и температуре 37oC. Исследованы параметры (плотность сшивки, степень модификации), влияющие на введение и скорость высвобождения этих препаратов из наногелей.
Также в работе использовали наногели и их производные, содержащие флуоресцентные группы (флуоресцеин изотиоцианат или коммерчески доступные красители Alexa Fluor® 488 или 680), ковалентно связанные с полиметакриловыми сегментами. Данные материалы использовали для анализа эффективности связывания и эндоцитоза ФК-наногелей и нагруженных лекарствами наногелей в различных раковых клетках (А2780, А549 и NIH3T3).
Практическая значимость работы продемонстрирована с использованием модели аденокарциномы яичника А2780 человека, привитой к иммунодефицитным мышам, на которой, в частности, проведены исследования по биораспределению цисплатины с использованием масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой (ИСП-МС).
ПЭГ-б-ПМАК Фолиевая кислота (ФК) Цисплатин (CDDP) Доксорубицин (DOX) CH R CH2CH2O CH2 y x COOH R = CH3O-, OH x = 170, 125, y = 180, РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Синтез и физико-химические свойства полимерных наногелей.
1.1. Синтез полимерных наногелей на основе блок-иономерных комплексов.
Синтез полимерных наногелей на основе блок-сополимера ПЭГ-б-ПМАК был впервые осуществлен в нашей научной группе с использованием БИК ПЭГ-б ПМАК/Са2+ качестве матрицы (Схема 1).
ПМАК-сшитое ядро ПЭГ-корона - -- самосборка - - - - сшивка - - - - 1) ЭДТА 1) CH3CH2N=C=N(CH2)3N(CH3)2•HCl Ca2+ 2) диализ - 2) NH2CH2CH2NH - - - - полимерная сшитая матрица с ПЭГ-б-ПМАК наногель матрица (БИК) ионами металла Схема 1. Схема синтеза наногеля на основе блок-сополимеров ПЭГ-б-ПМАК.
За формированием БИК ПЭГ-б-ПМАК/Ме2+ следили по изменению мутности получаемых растворов (рис. 1) при варьировании состава реакционной смеси, Z.
(Z = n[Men+]/[COO-], где n – валентность ионов металла, [Men+] – их концентрация и [COO-] – концентрация карбоксильных групп при данном рН.) Из рис. 1 видно, что образование БИК ПЭГ-б-ПМАК/Ме2+ происходит в узком диапазоне конденсирующих противоионов и зависит от природы этих противоионов, длины ионного блока и относительной весовой фракции гидрофильного ПЭГ блока (ЭГ) в блок-сополимере. Так, при одинаковых значениях Z мутность растворов комплексов, сформированных из ПЭГ(125)-б-ПМАК(180) (ЭГ 0.26), была значительно выше, чем комплексов, состоящих из ПЭГ(170)-б-ПМАК(180) блок сополимеров, где гидрофильный блок гораздо длиннее (ЭГ 0.33). Во всем диапазоне изученных концентраций более «гидрофильные» ПЭГ(114)-б-ПМАК(81) блок-сополимеры (ЭГ 0.42) не образовывали БИК с ионами Са2+, однако Рисунок 1. Зависимости мутности растворов различных ПЭГ-б-ПМАК/Ме2+ комплексов при варьировании состава реакционной смеси, Z:
/ ( ) ПЭГ(170)-б-ПМАК(180)/Са2+, ( ) ПЭГ(170)-б-ПМАК(180)/Ва2+, ( ) ПЭГ(125)-б-ПМАК(180)/Са2+, ( ) ПЭГ(125)-б-ПМАК(180)/Ва2+, ( ) ПЭГ(114)-б-ПМАК(81)/Са2+, Z ( ) ПЭГ(114)-б-ПМАК(81)/Ва2+.
наблюдалось формирование БИК при высоких концентрациях ионов Ва2+ (Z 3) (рис. 1). Кроме того, во всех случаях комплексы с ионами Ва2+ начинали образовываться при более низких значениях Z по сравнению с ионами Са2+, возможно благодаря более сильному связыванию Ва2+ с анионным сегментом блок-сополимера. На основании экспериментальных данных можно предположить, что самосборка ПЭГ-б-ПМАК/Ме2+ зависит от кооперативного связывания противоионов с ионным цепями ПМАК и инициируемой амфифильности получаемых комплексов.
Формирование БИК с гидродинамическим диаметром 90-110 нм было подтверждено методом ДРС. Важно отметить, что растворы комплексов ПЭГ-б ПМАК/Меn+ были устойчивы даже при высоких концентрациях ионов металла в системе (Z = 2.5). Напротив, в тех же условиях комплексы ПМАК/Меn+ претерпевали фазовое разделение. Это указывает на стабилизацию образующихся полиэлектролит/металл комплексов за счет наличия гидрофильных ПЭГ блоков во внешнем слое ПЭГ-б-ПМАК/Меn+. Комплексы ПЭГ-б-ПМАК/Меn+, по всей вероятности, представляют собой наночастицы с морфологией «ядро-корона».
Полученные ПЭГ-б-ПМАК/Са2+ комплексы далее были использованы в качестве матриц для синтеза наногелей с различной плотностью сшивок (Схема 1).
Основываясь на данных 1Н-ЯМР, найдено, что выход реакции был значительно ниже теоретического (не менее 3-5% введенных поперечных сшивок для теоретически возможного 20%). Это возможно благодаря формированию «петель» и/или прохождению реакции конденсации только по одной концевой группе 1,2 этилендиамина, а также гидролизу КДИ-активированных карбоксильных групп.
Несмотря на то, что экспериментально определенное количество сшивок носит оценочный характер, отметим, что в результате синтеза было введено достаточное количество сшивок для создания полимерной сетки, которая оставалась стабильной даже при 200-кратном разбавлении. В то время как несшитые БИК диссоциировали при удалении противоионов. Как и ожидалось, размеры набухших наногелей были значительно больше, чем их первоначальных БИК матриц (150 170 нм по сравнению с 90-110 нм). Мы предполагаем, что наногели частично сохраняют структуру исходных БИК и содержат формообразующее ядро сшитых полианионных цепей и внешнюю гидрофильную ПЭГ корону. Наногели имели отрицательный -потенциал, что свидетельствует о наличии некоторой доли ПМАК цепей в их короне. Полученные полимерные наногели не агрегировали и оставались стабильными в широком диапазоне рН (4.5-11.0) и концентраций (до 5 % в/в). Для практического использования данных наногелей важно, что они могут быть лиофилизированы и редиспергированы в водных средах практически без изменения их первоначальных параметров.
1.2. Физико-химические характеристики наногелей.
Наногели представляют собой сверхмягкие наноматериалы сферической формы (рис. 2). Размеры, заряд, степень набухания и дисперсионная стабильность материалов играют принципиальную роль для их применения в качестве СДЛ.
Найдено, что размеры дегидратированных частиц (метод АСМ) значительно отличаются от размеров набухших наногелей в разбавленных растворах (метод ДРС). Так, средняя высота и диаметр дегидратированных ПЭГ(170)-б-ПМАК(180) наногелей составили 3.45 ± 0.1 нм и 111.43 ± 0.4 нм, соответственно. Установлено, что увеличение числа сшивок в наногеле приводит к увеличению высоты дегидратированных частиц, что указывает на увеличение жесткости материала.
Рисунок 2. Двух- и трехмерные АСМ изображения ПЭГ(170)-б-ПМАК(180) наногеля в прерывисто-контактном режиме на воздухе.
Ширина изображения - 2 мкм.
Набухание наногелей, как правило, зависит от многих параметров, например, природы полимера, качества растворителя, плотности сшивки, температуры, ионной силы раствора. Этот обратимый процесс происходит в результате комбинации эффектов ионизации ПМАК цепей, увеличения подвижности сегментов, уменьшения их межмолекулярных взаимодействий, а также проникновения противоионов в объем наногеля и повышения осмотического давления. Так, при увеличении рН среды в отсутствии добавленной соли наблюдалось увеличение размеров наногеля, а в присутствии соли (0.15 М NaCl) размеры наногеля практически не изменялись (рис. 3). Степень набухания наногелей при постоянном рН также зависела от ионной силы раствора. Так, при увеличении концентрации низкомолекулярного электролита в системе при рН 7. наблюдалось постепенное уменьшение размеров наногелей. В противоположность этому при рН 5.5, когда ПМАК сегменты были частично ионизированы, увеличение ионной силы раствора приводило к увеличению размеров. Возможно, что при низком рН увеличение ионной силы раствора приводит как к увеличению ионизации, так и к увеличению осмотического давления за счет проникновения противоионов. В то же время при высоком рН цепи ПМАК практически полностью ионизированы и добавление противоионов приводит к снижению электростатического отталкивания цепей за счет экранирования заряда.
Влияние рН и ионной силы раствора на изменения -потенциала наногелей, возможно, еще более сложно. Согласно теории Штерна частицы с хорошо выраженной поверхностью (мицеллы, липосомы) образуют двойной электрический слой на поверхности, состоящий из адсорбционного слоя (слой Гельмгольца), который непосредственно примыкает к межфазной поверхности, и диффузного слоя (слой Гуи), в котором находятся противоионы. Однако в отличие от данных частиц, изучаемые мягкие материалы, возможно, могут образовывать слой Гельмгольца, распространяющийся внутрь объема наногеля. Таким образом, размеры (возможно форма) наногеля и емкость его адсорбционного слоя в двойном электрическом слое могут изменяться в зависимости от степени набухания. Более того, в результате ионизации, несмотря на предполагаемую для изучаемых наногелей структуру «ядро-корона», несшитые цепи ПМАК, находящиеся в ядре наногеля, могут перемещаться во внешние слои благодаря своей гибкости и способствовать понижению -потенциала системы. Любопытно, что -потенциал повышался и переставал зависеть от рН при высокой ионной силе раствора (0.15 М NaCl). Насколько нам известно, теория -потенциала в наногелях пока недостаточно развита. Тем не менее, исходя из наших результатов, можно предположить, что проникновение противоионов в объем данных частиц может сильно влиять на их размеры (набухание) и -потенциал. Для полного понимания свойств наногелей необходимы дальнейший феноменологический анализ и теоретическое обоснование набухания и электрокинетических характеристик данного наноматериала.
5% 600 pH 10% 500 20% 5 6 7 8 40% - -потенциал, мВ Д эфф, нм 60% 80% 300 - - 5% 10% -40 20% 0 40% 5 6 7 8 9 60% pH -50 80% Рисунок 3. Влияние степени сшивки наногелей на их гидродинамический диаметр (Дэфф) и -потенциал. Результаты выражены, как среднее значение ± SD (n = 3).
Из рис. 3 видно, что на степень набухания наногелей влияет и плотность сшивок: например, водные растворы наногелей на основе ПЭГ(125)-б-ПМАК(180) с низкой плотностью сшивок (теор.10%) набухали гораздо сильнее при повышении рН, чем наногели с большим числом сшивок (теор. от 40% до 80%), а при теоретической степени сшивки 5% невозможно синтезировать наногели с диаметром частиц менее 200 нм. С увеличением плотности сшивки уменьшался потенциал наногелей (рис. 3) благодаря 1) уменьшению подвижности сегментов ПМАК в результате введения дополнительных сшивок и 2) уменьшению числа свободных карбоксильных групп, способных к ионизации. Важно отметить, что сильно сшитые наногели (теор.80%) были неустойчивы и агрегировали в растворах, содержащих физиологическую концентрацию солей.
Гидрофильные наногели, синтезированные на основе БИК матрицы, представляют собой важный класс новых наноматериалов. Исчерпывающий анализ физико-химических характеристик наногелей необходим для создания новых эффективных СДЛ на их основе. Так, изменение только одного параметра, например, степени сшивки, приводит к изменению размера и заряда наногелей, их стабильности и способности к набуханию. Таким образом, разработанный нами метод синтеза наногелей позволяет контролировать многие физико-химические свойства этих систем (набухание, размер, заряд), влиять на их стабильность и способность «откликаться» на изменения внешней среды.
2. Фолат-модифицированные наногели и их загрузка БАВ.
Одна из задач современной медицины состоит в создании СДЛ направленного действия. Выбор фолиевой кислоты, в качестве векторной группы, был обусловлен её стабильностью и высокой аффинностью (Кd ~ 10-910-10 M ) к фолатному рецептору, который имеет высокий уровень экспрессии в раковых клетках.
2.1. Синтез ФК-наногелей.
Синтез ФК-наногелей включал три стадии (Схема 2): 1) синтез наногелей со свободными поверхностными гидроксильными группами, 2) синтез стабильных промежуточных продуктов (интермедиатов) с концевыми аминогруппами (NH2 наногель), 3) конъюгация интермедиата с активированной фолиевой кислотой (ФК-наногель). На каждой стадии образовывалось стабильное соединение, которое можно изолировать и хранить в течение нескольких месяцев.
Водные дисперсии наногелей, синтезированные на основе ОН-ПЭГ(125)-б ПМАК(180), служили исходным материалом для синтеза конъюгатов с ФК.
Гидроксильные группы наногеля реагировали с дивинилсульфоном (ДВС) по cl-PMA-b-PEO-OH OH O наногель N N COOH N H N O H N N H2N S RT, 30 min O Фолиевая кислота (ФК) COOH O S cl-PMA-b-PEO O O NH+ Cl N N ДВС-наногель КДИ, Н2О NH2 RT, 3 h ФК H 2N O O H O N O + S cl-PMA-b-PEO NH2 + N N N O стабильный интермедиат, NH2-наногель активный интермедиат ФК OH O N COOH N N H N H N N H2N O ФК-наногель N наногель H Схема 2. Схема синтеза ФК-модифицированного наногеля.
реакции Михаэля с образованием стабильного интермедиата, ДВС-наногель.
Учитывая гидролиз ДВС в водных растворах, а также возможность образования межмолекулярных сшивок, использовали его избыток. Далее ДВС-наногель смешивали с избытком 1,2-этилендиамина для получения стабильного производного (NH2-наногель), характеристики которого были практически такими же, как и исходного наногеля (табл. 1). Конечный продукт, ФК-наногель, очищали методом гель-фильтрационной хроматографии. Количество связанной ФК, определяемое методом спектрофотометрии, варьировалось от 0.01 до 2.5 мкмоль ФК/мг полимера в зависимости от молярного соотношения ФК в реакционной смеси. Важно отметить, что в результате реакции фолиевой кислоты с наногелем возможно образование биологически неактивного - и активного -изомеров, хотя выход -изомера может быть выше в силу более высокой реакционной способности карбоксильной группы ФК в - по сравнению с -положением. Так как в результате синтеза несколько ФК присоединялись к одной молекуле наногеля, то их изомеры не могли быть разделены. Тем не менее, ФК-наногель содержал достаточное количество активного -изомера, что подтверждено дальнейшими экспериментами по связыванию ФК-наногеля с его мишенью.
2.2. Морфология и набухание ФК-наногелей.
Методом АСМ показано, что морфология наногелей не изменяется после их модификации векторными группами. Так, средние высоты и диаметры дегитратированных частиц составили 48.55 ± 2.9 нм и 103.18 ± 9.8 нм, соответственно, для наногелей, и 45.37 ± 2.2 нм и 111.16 ± 3.5 нм, соответственно, для ФК-наногелей. Средние объемы составили 2.70 105 нм3 и 2.90 105 нм3, соответственно. Полученные наногели значительно набухали в водной среде (табл.
1). Степень их набухания и значения -потенциала зависели от рН среды, а также наличия низкомолекулярных электролитов в растворе (табл.1).
Таблица 1. Физико-химические характеристики а пустых и нагруженных лекарством наногелей (А) в отсутствии низкомолекулярных электролитов в воде при рН 5.5 и 7.4, а также (Б) в фосфатном буфере (pH 7.4, 0.15 M NaCl) и ацетатно-солевом буфере (pH 5.5, 0.15 M NaCl). Результаты выражены, как среднее значение ± SD (n = 5). ФК-наногели содержали 0.2 мкмоль ФК/мг полимера.
pH 5.5 pH 7. (A) вода -потенциал, -потенциал, Дэфф, PDI Дэфф, PDI мВ мВ нм нм 94 ± 8 0.06 ± 0.02 -15 ± 4 177 ± 6 0.05 ± 0.01 -29 ± наногель 103 ± 7 0.06 ± 0.02 -16 ± 1 175 ± 5 0.07 ± 0.01 -29 ± NH2-наногель 107 ± 2 0.09 ± 0.01 -13 ± 1 136 ± 8 0.05 ± 0.01 -21 ± ФК-наногель 119 ± 6 0.09 ± 0.04 -11 ± 3 148 ± 9 0.09 ± 0.04 -26 ± наногель/DOX ФК-наногель/DOX 113 ± 3 0.09 ± 0.02 -8 ± 3 120 ± 1 0.08 ± 0.02 -22 ± 109 ± 5 0.04 ± 0.01 -5 ± 1 137 ± 5 0.04 ± 0.02 -20 ± наногель/CDDP ФК-наногель/CDDP 104 ± 1 0.09 ± 0.04 -9 ± 2 126 ± 7 0.03 ± 0.02 -18 ± (Б) солевой буфер pH 5.5 (ABS) pH 7.4 (PBS) 143 ± 7 0.06 ± 0.01 -6 ± 1 152 ± 8 0.05 ± 0.01 -9 ± наногель 142 ± 6 0.07 ± 0.02 -6 ± 1 158 ± 8 0.09 ± 0.02 -8 ± NH2-наногель 113 ± 3 0.07 ± 0.01 -5 ± 1 127 ± 7 0.07 ± 0.01 -9 ± ФК-наногель 132 ± 2 0.08 ± 0.03 -2 ± 1 140 ± 6 0.09 ± 0.03 -5 ± наногель/DOX ФК-наногель/DOX 117 ± 5 0.08 ± 0.02 -2 ± 1 121 ± 4 0.08 ± 0.01 -4 ± 122 ± 9 0.07 ± 0.04 -3 ± 1 127 ± 7 0.05 ± 0.02 -4 ± наногель/CDDP ФК-наногель/CDDP 118 ± 9 0.06 ± 0.02 -5 ± 2 118 ± 5 0.09 ± 0.02 -6 ± а Эффективный диаметр (Дэфф), относительная ширина распределения частиц по размерам (PDI) и -потенциал наногелей были получены методом динамического рассеяния света (ДРС).
Следует отметить, что модификация наногелей ФК-векторами приводила к некоторому уменьшению в размерах и увеличению -потенциала даже в отсутствии низкомолекулярных электролитов в системе (табл. 1). При увеличении количества пришитых ФК-векторов степень набухания наногелей понижалась.
Например, ФК-наногели с умеренной степенью модификации (0.05-0.1 мкмоль ФК/мг полимера) набухали подобно немодифицированным наногелям. Напротив, сильно модифицированные ФК-наногели набухали гораздо меньше (1.0 мкмоль ФК/мг полимера) или совсем теряли способность к набуханию (2 мкмоль ФК/мг полимера). Такое поведение ФК-наногелей можно объяснить 1) введением дополнительных сшивок в наногеле в результате побочной реакции между аминогруппами NH2-наногеля и карбоксильными группами бис-активированной ФК, а также 2) ассоциацией ФК-векторов в мультимерные комплексы, благодаря образованию водородных связей по типу хугстиновского взаимодействия.
2.3. Специфичность связывания ФК-наногелей с их мишенью.
Взаимодействие ФК-наногелей с фолат-связывающим белком (ФСБ), иммобилизованным на поверхность биосенсора, изучали методом спектроскопии поверхностного плазмонного резонанса (ППР), который позволяет следить за протеканием реакций в реальном временном диапазоне. Изменение угла ППР в общем случае пропорционально количеству адсорбировавшегося/ десорбировавшегося с поверхности вещества (при известном фиксированном показателе преломления среды). ППР-отклик от немодифицированного наногеля оставался на уровне фонового сигнала в растворе, что говорит об отсутствии взаимодействий или минимальной адсорбции наногеля на субстрате (рис.4).
Напротив, ФК-наногель вызывал сильный ППР-отклик, который понижался при добавлении свободной ФК (до или одновременно с ФК-наногелем), что свидетельствует о специфичном связывании ФК-наногеля с его мишенью. Хотя даже значительный избыток свободной фолиевой кислоты не блокировал полностью ППР-отклик (200 мкМ свободной ФК по сравнению с 0.12 мкМ ФК в наногеле). Такое сильное связывание ФК-наногеля с субстратом частично можно объяснить его многоточечным взаимодействием с иммобилизованным ФСБ.
ФК-наногель Резонансные единицы (RU) Рисунок 4. Специфическое взаимодействие наногелей, ФК-наногель + свободная ФК ФК-наногелей и смеси ФК наногелей со свободной ФК с ФСБ, иммобилизованным на поверхности биосенсора.
20 наногель - -100 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 Время, сек 2.4. Введение БАВ в наногели.
Противораковые препараты (CDDP и DOX) были введены в наногели при различных молярных соотношениях лекарства и карбоксильных групп наногеля, [лекарство]/[COOH]. CDDP эффективно связывался с ПМАК блоками наногеля посредством образования координационного комплекса с Pt (II). В случае DOX загрузка наногелей происходила за счет электростатических, а также гидрофобных взаимодействий. В обоих случаях размер нагруженных наногелей уменьшался, и потенциал увеличивался, что свидетельствует о нейтрализации карбоксильных групп наногеля и включении лекарства в наногели (табл. 1, рис 5). Степень набухания нагруженных лекарством наногелей сильно зависела от молярного соотношения [лекарство]/[COOH]. Размеры наногеля практически не менялись при повышении рН, если соотношение [CDDP]/[COOH] было выше, чем 0.5 (рис 5).
pH -потенциал, мВ 5 6 7 8 9 Д эфф,нм 200 - - - 10 - 5 6 7 8 pH Рисунок 5. Влияние введения лекарств на гидродинамический диаметр и -потенциал наногелей. Пустые наногели ( ) и наногели, нагруженные при разных молярных соотношениях CDDP и карбоксильных групп ПМАК, [CDDP]/[COOH]: ( ) 0.25, ( ) 0.5, ( ) 0.75, ( ) 0.1 и ( ) 1.5. Результаты выражены, как среднее значение ± SD (n = 3).
Интересно отметить, что ёмкость наногелей (отношение массы введенного лекарства к массе нагруженного наногеля) уменьшалась на 10-15% при введении ФК-групп (рис.6). Более того, для сильно модифицированных ФК-наногелей, например 1.0 мкмоль ФК/мг полимера, ёмкость понижалась почти на 45% по сравнению с немодифицированными наногелями. Это может быть обусловлено стерическими препятствиями для проникновения и связывания лекарства с наногелями в результате сжатия ФК-наногеля, а также уменьшением числа свободных карбоксильных групп в наногеле вследствие побочных реакций при конъюгации ФК. Варьирование молярных соотношений [лекарство]/[COOH] от 0.25 до 1.5 не привело к резкому изменению ёмкости наногелей, но значительно влияло на дисперсионную стабильность нагруженных наногелей. Так, при молярном соотношении больше чем 0.75, системы лекарство/наногель дестабилизировались и выпадали в осадок в течение нескольких дней (рис. 6).
Тем не менее, мы получили стабильные нагруженные лекарством ФК-наногели с концентрацией ФК-вектора от 0.1 до 0.5 мкмоль ФК/мг полимера при массовом отношении лекарство/полимер равным, как минимум, 1:2. Данные наногели могут быть высушены и редиспергированы в водных средах практически без изменения первоначальных характеристик (Дэфф = 152 ± 8 нм, PDI 0.05 ± 0.01 против Дэфф = 165 ± 10 нм, PDI 0.10 ± 0.05 для исходных и редиспергированных наногелей, соответственно). Важно, что полученные наногели обладают исключительно высокой несущей способностью и остаются стабильными в физиологических условиях (ионная сила, рН) в течение нескольких недель.
1 2 2 1 2 40 60 Б Ёмкость наногелей, в/в% A Ёмкость наногелей, в/в% 0.25 0.5 0.75 1 1. 0.25 0.5 0.75 1 1. [DOX]/[COOH] [CDDP]/[COOH] Рисунок 6. Ёмкость наногелей (черные столбцы) и ФК-наногелей (белые столбцы) при различных молярных соотношениях (А) CDDP или (Б) DOX и карбоксильных групп ПМАК при 37°C. Стрелками отмечены молярные соотношения [лекарство]/[COOH] при которых (1) ФК-наногели или (2) обе системы нестабильны и выпадают в осадок в течение нескольких дней. Степень модификации ФК-наногелей составила 0.2 ФК/мг полимера. Результаты выражены, как среднее значение ± SD (n = 3).
2.5. Высвобождение БАВ из наногелей.
Кинетику высвобождения лекарственных препаратов из наногелей изучали методом диализа в фосфатном (рН 7.4) и ацетатном (рН 5.5) буферных растворах.
Из кинетических кривых высвобождения (зависимость количества высвободившегося лекарства от времени) CDDP и DOX из наногелей видно, что процесс высвобождения зависел от рН среды. Так, при рН 5.5 около 60% DOX выделялось из наногелей в первые 6 ч., в то время как при рН 7.4 то же самое количество лекарства выделялось за 24 ч. (рис. 7Б). Ускоренное высвобождение DOX из наногелей при кислых рН может быть объяснено протонированием карбоксильных групп ПМАК цепей, что приводит к ослаблению электростатических взаимодействий между лекарством и наногелем. Стоит отметить, что высвобождение CDDP характеризуется более пролонгированным действием (рис.7А). Кроме того, для двух типов лекарств наблюдалось замедление их скорости высвобождения из наногелей. Это может быть связано с различной подвижностью молекул лекарства во внутренних и внешних слоях наногеля, что влияет на скорость диффузии во внешнюю среду. Кроме того, по мере выделения лекарства отрицательный заряд наногеля увеличивается, и удерживание лекарств за счет образования новых связей усиливается. Отметим, что кинетические кривые высвобождения лекарств из наногеля и ФК-наногеля практически совпадали для всех изученных значений рН среды (рис.7), хотя для ФК-наногелей с высокой степенью модификации наблюдалось ускоренное выделение включенных лекарств, возможно, благодаря периферийной локализации лекарства. Эти данные наглядно демонстрируют, что природа взаимодействия лекарство/наногель и рН среды оказывают значительное влияние на кинетику высвобождения противораковых препаратов. Резюмируя, можно сказать, что нагруженные наногель и ФК-наногель могут выступать как модели лекарственных форм пролонгированного действия.
A Б % высвобождения CDDP % высвобождения DOX 0 8 16 24 32 40 0 50 100 Время, ч Время, ч Рисунок 7. Кинетические кривые высвобождения (A) CDDP и (Б) DOX из наногелей и ФК-наногелей (0.2 мкмоль ФК/мг полимера) в солевом буфере (PBS, pH 7.4 или ABS, pH 5.4) при 37оС: () наногель, pH 5.5, ( ) ФК-наногель, pH 5.5, ( )наногель, pH 7.4, и ( ) ФК-наногель, pH 7.4. Результаты выражены, как среднее значение ± SD (n = 3).
3. Наногели, модифицированные белками (моноклональные антитела).
Наша задача заключалась в том, чтобы разработать такой метод модификации наногелей, который бы позволял вводить любые векторные группы без потери их биологической активности, что актуально по отношению к специфическим моноклональные антителам (mAb) или их фрагментам (Fab). В работе были использованы специфические антитела СС49 (или их фрагменты), имеющие высокую аффинность к опухолеспецифическому антигену гликопротеину TAG-72.
Антитела СС49 уже используются в клинических исследованиях для диагностики и лечения различных онкологических заболеваний, благодаря высокому уровню экспрессии TAG-72 во многих аденокарциномах человека. В качестве диагностического агента мы использовали флуоресцентный зонд Alexa Fluor 680, который был ковалентно связан с наногелями.
3.1. Модификация наногелей антителами или их фрагментами.
Специфические направляющие вектора были присоединены к наногелям ПЭГ(170)-б-ПМАК(180) через гибкие ПЭГ связки в три стадии. На первой стадии антитела (или их фрагменты) тиолировали по общепринятой методике, используя реагент Траута. Вторая стадия заключалась в получении ПЭГилированных mAb (mAb-ПЭГ-NH2) в результате реакции между тиольными группами антител и малеимидными группами ПЭГ связок. На заключительной стадии проводили ковалентное связывание карбоксильных групп наногеля, активированных N гидроксисукцинимидом (NHS), с mAb-ПЭГ-NH2. Использование гибких ПЭГ связок, содержащих 170 мономерных звеньев, было обусловлено задачей сохранения доступности пришитых к наногелю антител для связывания с их специфическим антигеном.
3.2. Анализ mAb-наногелей и их физико-химические свойства.
mAb-наногели анализировали методом электрофореза в полиакриламидном геле (SDS-PAGE) в присутствии и отсутствии восстанавливающего агента.
Сравнение локализации свободных mAb и mAb-ПЭГ-NH2 в полиакриламидном геле подтверждает успешное ПЭГилирование как легких, так и тяжелых цепей антитела. Кроме того, данные электрофореза свидетельствуют об успешном синтезе mAb-наногелей, а также тщательной очистке конечного продукта методом гель-фильтрационной хроматографии. Количество антител, ковалентно связанных с наногелем, составило от 50 до 150 мкг белка/мг наногеля в зависимости от степени модификации.
Методом АСМ показано, что mAb-наногели сохраняли сферическую форму.
Гидродинамический диаметр наногелей немного уменьшался после их модификации (160-170 нм против 140-150 нм, рН 7.4). Однако -потенциал mAb наногеля значительно увеличивался от -32.1 ± 2.1 мВ до -17.0 ± 3.2 мВ.
Уменьшение отрицательного заряда наногеля можно объяснить его частичным экранированием благодаря антителам, ковалентно связанных с поверхностью наногеля, а также уменьшением подвижности ПМАК сегментов. Степень набухания mAb-наногелей была практически такой же, как для немодифи цированных наногелей. Дисперсия mAb-наногелей оставалась стабильной и не агрегировала в физиологическом растворе (0.15 М NaCl, рН 7.4) в течение, как минимум, 10 дней. В заключение стоит сказать, что разработанный нами метод позволяет эффективно модифицировать наногели различными антителами или их фрагментами без изменения морфологии и физико-химических свойств наногеля.
3.3. Специфичность связывания mAb-наногелей с их мишенью.
Специфическое взаимодействие между mAb-модифицированными наногелями и антигеном (бычий подчелюстной муцин, БПМ) было изучено методом ППР.
Найдено, что наногели, модифицированные специфическим антителами СС49, имели высокую аффинность к антигену, в то время как наногели с неспецифическими векторами (IgG) или немодифицированные наногели не обладали связывающей активностью по отношению к гликопротеину БПМ (рис.8).
Кроме того, добавление свободного СС49 (100-300 нМ) приводило к понижению ППР-отклика СС49-наногеля, что свидетельствует о специфичном связывании с БПМ-мишенью. Константы ассоциации (KA) были определены в режиме реального времени с помощью программного обеспечения BIAevaluation 3.0.2 и составили 1.21 108 M-1 для СС49 и 1.01 108 M-1 для СС49-наногель. Равновесные константы диссоциации (KD;
1/KA) составили 8.3 нМ и 9.9 нМ, соответственно.
Это свидетельствует о том, что СС49-наногели обладают практически такой же аффинностью к антигену, что и свободные антитела. Таким образом, разработанный нами метод позволяет векторизовать наногели различными антителами без нарушения их активности.
Рисунок 8. Специфическое СС49-наногель взаимодействие Резонансные единицы (RU) СС49-наногелей, смеси СС49 наногелей со свободным СС49, а также IgG-наногелей с СС49-наногель + свободный СС иммобилизованным БПМ.
p IgG-наногель - 50 0 500 1000 Время, сек Ti 4. Практическое применение разработанных наногелей в медицине.
В настоящей главе представлены данные о практическом применении полимерных наногелей, которые свидетельствуют о широких возможностях этих систем в медицинской практике. Была исследована способность ФК-наногелей, нагруженных противораковыми лекарствами, селективно убивать раковые клетки, а также уменьшать рост опухолей и увеличивать продолжительность жизни животных. Кроме того, продемонстрирована возможность визуализации раковых опухолей животных с помощью mAb-наногелей.
4.1. Применение ФК-наногелей, нагруженных противораковыми лекарствами.
4.1.1. Исследования на клеточных культурах (in vitro эксперименты).
Уровень накопления ФК-наногелей в раковых клетках человека А2780, экспрессирующих фолатные рецепторы (ФР), был значительно выше, чем немодифицированных наногелей, и уменьшался в присутствии свободной фолиевой кислоты, что свидетельствует о специфическом взаимодействии с ФР.
Найдено оптимальное количество ФК-векторов, связанных с наногелем (0.1-0. мкмоль ФК/мг полимера), выше которого захват ФК-наногелей клетками постепенно уменьшался. Такое поведение может быть объяснено 1) межмоле кулярными взаимодействиями ФК-векторов, приводящими к их дезактивации, а также 2) пониженным поглощением клеткой сильно модифицированных ФК наногелей через рецептор-опосредованный эндоцитоз. Последнее предположение было подтверждено детальным анализом транспорта наногелей в А2780 клетках методом проточной цитометрии. Методом конфокальной микроскопии показано, что ФК-векторы не влияют на конечную локализацию наногелей в клетках.
Установлено, что порядок загрузки и модификации в системе ФК наногель/CDDP сильно влияет на способность ФК-вектора связываться с ФР, хотя в случае ФК-наногель/DOX такой зависимости не наблюдалось. В частности, если вначале модифицировать наногели ФК-группами, а потом загружать лекарством, то транспорт таких систем в А2780 клетки будет практически на уровне наногель/CDDP, возможно, благодаря дезактивации -карбоксильных групп фолата во время загрузки. Найдено, что система ФК-наногель/лекарство селективно захватывается ФР-положительной популяцией клеток даже в смеси различных клеточных линий. Введение ФК-векторов приводило к значительному усилению цитотоксического действия препаратов по сравнению с системой ФК наногель/лекарство.
4.1.2. Исследования противоопухолевой активности нагруженных лекарством ФК-наногелей на мышах (in vivo эксперименты). Для подтверждения концепции адресной доставки лекарства in vivo с помощью ФК наногелей использовали CDDP-загруженные наногели. Всех животных с привитыми раковыми опухолями содержали на диете с недостатком фолата, что позволяло снизить концентрацию эндогенного фолата, а также влияло на количество ФР в раковой опухоли. Предварительные результаты по биораспределению лекарственных форм CDDP в мышах показали эффективность адресной доставки лекарства в опухоль. Так, концентрация Pt в опухолях мышей, получивших инъекции ФК-наногель/CDDP, была в 7 раз выше, чем для свободного лекарства. Противоопухолевую активность препаратов оценивали по изменению объема опухоли, потере массы и средней продолжительности жизни животных (рис. 9). Все лекарственные формы CDDP ингибировали рост опухоли по сравнению с контролем. Торможение роста опухоли и увеличение средней продолжительности жизни животных были более выражены в группе ФК наногель/CDDP (рис. 9Б). Однако при его совместном введении со свободной фолиевой кислотой эти показатели ухудшались, что может быть объяснено насыщением ФР. Введение свободного лекарства не оказало такого выраженного тормозящего влияния на скорость роста опухоли, наблюдалась тенденция потери веса и сокращение средней продолжительности жизни животных (рис. 9А), что свидетельствует о токсичности препарата.
A Б * Объём опухоли, мм декстроза dextrose наногель nanogel CDDP % потери веса NS nanogel/CDDP наногель/CDDP ** FA-nanogel/CDDP ФК-наногель/CDDP FA + FA-nanogel/CDDP ФК+ФК-наногель/CDDP 5 * - -15 - 0 5 10 15 0 5 10 15 20 D Время, дни D Время, дни Рисунок 9. (А) Потеря в весе животных и (Б) рост опухоли после введения лекарственных форм CDDP в модели раковых клеток яичника А2780. Результаты выражены, как среднее ± SEM (n = 7-8), *p0.05, **p 0.01, NS-статистически незначимая величина.
Основываясь на наших in vitro и in vivo экспериментах, можно заключить, что разработанный нами ФК-наногель/CDDP представляет собой перспективную лекарственную форму, который в будущем, возможно, позволит понизить системную токсичность лекарства, улучшить противоопухолевый эффект и продлить жизнь пациента.
ВЫВОДЫ 1. Впервые синтезированы и всесторонне изучены полимерные наногели на основе ковалентно сшитых блок-сополимеров ПЭГ-б-ПМАК, содержащих полианионные и неионные водорастворимые блоки, способные нести различные векторные группы, а также дополнительно включать молекулы БАВ. Показано влияние природы комплексообразующих ионов металла и относительного соотношения анионного и неионогенного блоков на формирование блок иономерных комплексов, которые являются исходными материалами для синтеза таких наногелей.
2. Показана принципиальная возможность контроля дисперсионной стабильности, размера и -потенциалa наногелей и их производных посредством изменения плотности сшивки, степени модификации векторными группами и количества введенного лекарства. Установлено влияние изменения рН и ионной силы раствора на набухание таких наногелей и их производных.
3. Разработаны химические методы, позволяющие контролировать модификацию наногелей различными химическими группами (фолиевая кислота (ФК), антитела) с сохранением способности этих векторных групп к специфическому связыванию с их мишенями (фолатный рецептор, антиген).
4. Впервые осуществлен синтез фолат-модифицированных наногелей с введенными молекулами БАВ (цисплатин, доксорубицин). Установлено, что количество ФК-векторов влияет на способность наногелей эффективно связывать и удерживать БАВ в своем объеме. Проведена оптимизация числа групп ФК (0. мкмоль ФК/мг полимера) с целью увеличения введенных БАВ в наногели и достижения их стабильности в физиологических средах.
5. Впервые показана возможность одновременного использования цисплатина и ФК-векторов в одной системе для адресной доставки лекарства в опухоли.
Установлено, что ФК-наногели, разработанные в настоящей работе, улучшают активность и снижают токсичность цисплатина, что что подтверждено экспериментами in vitro и in vivo.
Основные результаты диссертационной работы изложены в следующих публикациях:
1. Jong Oh Kim, Nataliya V. Nukolova, Hardeep Oberoi, Alexander V. Kabanov, and Tatiana K. Bronich;
Block ionomer complex micelles with cross-linked cores for drug delivery.//Высокомолек. Соед. А. 2009. Т. 51. № 6. с. 1-11.
2. Нуколова Н.В., Кабанов А.В., Бронич Т.K. Адресная доставка полимерных наногелей. //Тезисы докладов 1-ой Международной летней школы – Нано2009.
«Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах», Россия. 2009. с. 388.
3. Nataliya V. Nukolova, Hardeep S. Oberoi, Alexander B. Zezin, Tatiana K. Bronich and Alexander V. Kabanov. Cisplatin-loaded folate-conjugated nanogels for targeted cancer therapy.
// The 42nd Annual Pharmaceutics Graduate Student Research Meeting. Columbus.USA. 2010.
Book of abstracts. p. 65.
4. Nataliya V. Nukolova, Hardeep S. Oberoi, Alexander V. Kabanov and Tatiana K.
Bronich. Folate-conjugated nanogels as a nanocarrier for targeted delivery for cancer treatment.//The 41st Annual Midwest Student Biomedical Research Forum. Omaha. USA. 2010.
Book of abstracts. p. 5. Nataliya V. Nukolova, Hardeep S. Oberoi, Alexander V. Kabanov and Tatiana K.
Bronich. Folate-Conjugated Cross-Linked Polymer Nanogels as a Nanocarrier for Targeted Delivery.// The 7th International Nanomedicine and Drug Delivery Symposium (NanoDDS’09).
Indianapolis. USA. 2009. Book of abstracts. p. 6. Nataliya V. Nukolova, Surinder Batra, Alexander V. Kabanov, Tatiana K. Bronich.
Preparation of Antibody-Bound Cross-Linked Micelles for Targeted Drug Delivery.// The 7th International Nanomedicine and Drug Delivery Symposium (NanoDDS’09). Indianapolis. USA.
2009. Book of abstracts. p. 7. Jong Oh Kim, Nataliya V. Nukolova, Zigang Yang, Alexander V. Kabanov, and Tatiana K. Bronich. Surface Functionalized Nanogels with Cross-Linked Ionic Core for Specific Tumor Targeting.// The 7th International Nanomedicine and Drug Delivery Symposium (NanoDDS’09).
Indianapolis. USA. 2009. Book of abstracts. p. 8. Hardeep S. Oberoi, Fredric C. Laquer, Nataliya V. Nukolova, Jiangeng Huang, Yazen Alnouti and Tatiana K. Bronich. Biodistribution and comparative pharmacokinetics of cisplatin loaded core cross-linked micelles in mice.// The 7th International Nanomedicine and Drug Delivery Symposium (NanoDDS’09), Indianapolis. USA. 2009. Book of abstracts. p. 9. Nataliya V. Nukolova, Alexander V. Kabanov, Tatiana K. Bronich. Design of folic acid-conjugated cross-linked polymer micelles for delivery of magnetic resonance imaging agents // The 50th annual National Student Research Forum. Galveston. Texas. USA. 2009.
Book of abstracts. p. 10. Nataliya V. Nukolova, Alexander V. Kabanov, Tatiana K. Bronich. Polymer Micelles for Delivery of Imaging Agents.// The 40th Annual Midwest Student Biomedical Research Forum. Omaha. Nebraska. USA. 2009. Book of abstracts. p. 11. Nataliya V. Nukolova, Michael D. Boska, Alexander V. Kabanov, Tatiana K. Bronich.
Polymer Micelles with Cross-linked Core for Delivery of Imaging Agents.// The 6th International Nanomedicine and Drug Delivery Symposium (NanoDDS’08), Toronto. Canada.
2008. Book of abstracts. p. Список сокращений:
АСМ атомно-силовая микроскопия БАВ биологически активные вещества БИК блок-иономерные комплексы ДРС динамическое рассеяние света КДИ карбодиимид ППР поверхностно плазмонный резонанс ПЭГ-б-ПМАК блок-сополимер этиленгликоля и метакриловой кислоты СДЛ система доставки лекарств ФК фолиевая кислота Н-ЯМР протонный ядерный магнитный резонанс CDDP цисплатин DOX доксорубицин mAb или Fab моноклональные антитела или их фрагменты NHS N-гидроксисукцинимид PDI относительная ширина распределения частиц по размерам SD среднеквадратичное отклонение