Количественный анализ структуры частично кристаллических полимеров и композитов на их основе по данным атомно-силовой микроскопии

На правах рукописи

Багров Дмитрий Владимирович КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ СТРУКТУРЫ ЧАСТИЧНО КРИСТАЛЛИЧЕСКИХ ПОЛИМЕРОВ И КОМПОЗИТОВ НА ИХ ОСНОВЕ ПО ДАННЫМ АТОМНО-СИЛОВОЙ МИКРОСКОПИИ 02.00.06 – высокомолекулярные соединения, физико-математические наук

и

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук Москва – 2011

Работа выполнена на кафедре физики полимеров и кристаллов Физического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова Научный доктор физ.-мат. наук, профессор руководитель Яминский Игорь Владимирович Официальные доктор физ.-мат. наук, профессор оппоненты Малкин Александр Яковлевич кандидат физ.-мат. наук Ежов Александр Анатольевич Ведущая организация Институт синтетических полимерных материалов имени Н.С. Ениколопова РАН

Защита состоится 27 апреля 2011 года в 16.30 на заседании диссертационного совета Д 501.002.01 в Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119991 ГСП-1, г. Москва, Ленинские горы, МГУ, физический факультет, аудитория ЮФА.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке физического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова.

Автореферат разослан “ ” 2011 года.

Ученый секретарь диссертационного совета Д.501.002.01, кандидат физико-математических наук Лаптинская Т.В.

Общая характеристика работы

Диссертационная работа посвящена изучению особенностей структуры частично кристаллических полимеров и композиционных материалов на их основе, а именно: изучению механизмов деформации, процессов кристаллизации на подложке из раствора, изменений структуры при смешивании с низкомолекулярными веществами. Основной метод, использованный в работе – атомно-силовая микроскопия (АСМ), причем для обоснования выводов используется не только качественный, но и количественный анализ изображений. В работе предложена установка и методика для визуализации и измерения локальных деформаций полимерных пленок с помощью АСМ, показана эффективность предложенной методики для работы с обычными полимерными пленками, а также с композитными пленками, имеющими жесткое покрытие. Изучены надмолекулярные агрегаты белков паутины: нанофибриллы и поверхностные ламели. Последние формируются при адсорбции молекул на слюду из водного раствора, геометрические характеристики ламелей и особенности процесса их формирования были исследованы с помощью АСМ. В работе также исследованы пленки из поли(3-гидроксибутирата) и композиты с лекарственными веществами на его основе.

Актуальность работы Определение структуры и морфологии частично кристаллических полимеров лежит в основе понимания их механических, оптических, температурных и других функциональных свойств. Многообразие надмолекулярных агрегатов, образуемых частично кристаллическими полимерами, делает их сложными для изучения объектами. Поскольку спектр применений частично кристаллических полимеров непрерывно расширяется, необходимо развитие новых способов их обработки и контроля качества. Это требует развития методов исследований, способных определять особенности их структуры и морфологии с высоким пространственным разрешением. Данная работа посвящена развитию методов количественного анализа структуры кристаллических полимеров и композитов на их основе с помощью атомно силовой микроскопии.

Одним из наиболее широко применяемых на практике частично кристаллических полимеров является полипропилен. В частности, биаксиально ориентированные полипропиленовые пленки широко используются в качестве упаковочных и изолирующих материалов, подвергающихся механическим нагрузкам. Несмотря на их широкое применение, механизмы их деформации недостаточно изучены. Особенно актуально изучение изменений структуры пленок при их вытяжке, а именно изучение механизма пластической деформации и начальных стадий прорастания трещин.

Биосовместимые полимеры, а также композиты на их основе, представляют собой важнейший класс биосовместимых материалов, которые в настоящее время активно используются в медицине. К традиционным применениям биосовместимых полимеров в качестве носителей для доставки лекарств, шовных материалов и материалов для лечения повреждений кожи добавляются такие новые высокотехнологичные применения, как создание искусственных тканей и органов, а также имплантируемых биосенсоров. Для максимально эффективного использования биосовместимых полимеров требуется детальное знание особенностей их структуры и свойств. Среди разнообразных по структуре биосовместимых полимеров особый интерес для изучения представляют частично кристаллические полимеры, поскольку кристаллическая структура, с одной стороны, улучшает механические характеристики (делает материал прочнее), а с другой стороны, обычно замедляет его разложение в организме. В данной работе были исследованы полимеры, для которых либо в клинической практике доказана эффективность применения, либо на уровне лабораторных экспериментов имеются данные о перспективе их использования в медицинских приложениях. Проведенные в данной работе эксперименты направлены на получение новых данных, которые позволили бы лучше понять свойства этих полимеров и особенности их кристаллической структуры.

Актуальными для изучения биосовместимыми кристаллическими полимерами являются белки паутины. Природная паутина сочетает в себе исключительные механические свойства (высокую прочность и способность к рассеиванию энергии) с высокой биосовместимостью, что делает ее важным объектом для изучения как с физической, так и с биологической точки зрения.

В частности, актуальной задачей является выяснение закономерностей агрегации и способов укладки молекул белков паутины, поскольку это позволит лучше понять свойства этого материала и оптимизировать способы его обработки.

Поли(3-гидроксибутират) – это природный биодеградируемый частично кристаллический полимер, который в настоящее время используется как материал для имплантов и покрытий для них. Актуальной задачей является изучение особенностей поверхности пленок из поли(3-гидроксибутирата), а также процессов их деградации.

Цель и задачи работы Целью данной работы было развитие методов анализа структуры кристаллических полимеров на основании количественных данных атомно силовой микроскопии и выявление особенностей микро- и наноструктуры биосовместимых кристаллических полимеров и композитов на их основе.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Описать и определить механизмы изменения структуры поверхности биаксиально-ориентированных пленок на основе полипропилена (БОПП) при растяжении, в том числе:

– Разработать методику наблюдения поверхности полимерных пленок методом АСМ при их растяжении, отработать ее на примере высокоэластичной пленки.

– Описать закономерности пластической деформации, а также зарождения и прорастания трещин на поверхности пленок БОПП, соотнести их с известными закономерностями, предсказываемыми механикой разрушения.

2. Установить взаимосвязь между способом приготовления и обработки пленок поли(3-гидроксибутирата) и морфологией их поверхности, а также выявить влияние низкомолекулярных веществ на морфологию поверхности.

3. Охарактеризовать надмолекулярные агрегаты белков 1F9 и 2E паутины, в том числе:

– Разработать протоколы приготовления растворов белков паутины 1F9 и 2E12, в которых белки не агрегируют и длительное время находятся в состоянии отдельных молекул, и нанесения этих растворов на подложку.

– Провести количественную обработку изображений белковых агрегатов.

Научная новизна диссертации 1. В данной работе впервые установлены закономерности зарождения и прорастания трещин в металлизированной пленке биаксиально ориентированного полипропилена, проанализированы закономерности изменения шероховатости поверхности поливинилхлорида и полипропилена при их вытяжке.

2. Определена зависимость морфологии ультратонких пленок поли(3 гидроксибутирата) от условий их приготовления. Обнаружено возникновение фазового контраста на кристаллических ламелях, имеющих различную ориентацию относительно подложки.

3. Обнаружено, что при анализе совместимости поли(3 гидроксибутирата) с низкомолекулярными веществами (рифампцином, левофлоксацином и индометацином) метод АСМ дает результаты, хорошо совпадающие с результатами, полученными другими методами – спектрофотометрическим и методом оценки параметров растворимости.

4. Впервые обнаружено формирование ламелей из молекул рекомбинантных белков паутины на слюде, причем ламели могут быть двух типов. На основании измерений размеров ламелей показано, что молекулы, адсорбированные на слюду и на поверхность уже сформированных монослойных ламелей, имеют разную конформацию. Обнаружено сходство между размерами и морфологией ламелей, образованных двумя разными белками паутины 1F9 и 2Е12. Показано, что скорость роста ламелей существенно зависит от аминокислотного состава. Методом АСМ получены изображения отдельных молекул белка 2Е12 – первые микроскопические изображения отдельных молекул белка паутины.

Практическая значимость Установка для деформации пленок, совместимая с АСМ, использованная в данной работе для наблюдения формирования полос сдвига на поверхности полипропилена, представляет собой новый инструмент для изучения механизмов деформации полимеров, который может быть востребован в задачах контроля качества, изучении свойств композитных материалов и механики разрушения.

Результаты, полученные в данной работе при исследовании пленок поли(3-гидроксибутирата), могут быть использованы при разработке имплантов и новых носителей для лекарств.

В данной работе впервые микроскопическим методом наблюдались отдельные молекулы спидроинов – этот результат позволяет оптимизировать процедуры растворения и обработки белков паутины, поскольку показывает, что в растворах, приготовленных по определенным протоколам, они существуют в форме отдельных молекул. Обнаруженные в данной работе закономерности агрегации рекомбинантных спидроинов могут быть использованы для теоретического объяснения свойств паутины и шелка, а также при конструировании новых материалов.

Основные положения, выносимые на защиту 1. При неупругой деформации биаксиально-ориентированных пленок на основе полипропилена в покрытии из аморфного сополимера на поверхности возникают полосы сдвига в виде линейных протяженных углублений и выступов с перепадом рельефа 15-20 нм. При растяжении пленки на основе БОПП с тонким алюминиевым покрытием происходит прорастание трещин покрытия в полимер и фибриллизация полимера в трещинах.

2. Методика для визуализации деформации поверхности полимерных пленок при ступенчатой вытяжке.

3. Рекомбинантные аналоги белков паутины 1F9 и 2Е12 могут существовать в водных растворах в виде нанофибрилл и в виде отдельных молекул. При адсорбции на слюду из разбавленного водного раствора отдельные молекулы белков паутины формируют ламели двух типов.

Молекулы, адсорбированные на слюде и на поверхности уже сформированных ламелей, имеют разные конформации.

4. Поли(3-гидроксибутират) хорошо совместим с индометацином и рифампицином и плохо совместим с левофлоксацином. Последний при приготовлении композитной пленки методом полива не проникает в пленку, а остается на ее поверхности.

Апробация работы Основные результаты диссертационной работы были изложены в докладах на следующих конференциях:

Четвертая Санкт-Петербургская Конференция Молодых Ученых «Современные проблемы науки о полимерах», 15-17 апреля, 2008, Санкт Петербург, Институт высокомолекулярных соединений РАН International Student Research Forum, University of Nebraska Medical Centre, Omaha, Nebraska, USA, 1-3 June The 13th International Conference “Polymeric Materials P2008”, Martin-Luther University, Halle, Germany, 24-26 September Четвертый студенческий симпозиум по биоинженерии, биологический факультет МГУ имени М.В.Ломоносова, Москва, Россия, 25 октября 2008.

Третья международная конференция «Современные достижения бионаноскопии», физический факультет МГУ имени М.В.Ломоносова, Москва, Россия, 16-18 июня 2009.

Пятая Всероссийская Каргинская Конференция «Полимеры — 2010», химический факультет МГУ имени М.В.Ломоносова, Москва, Россия, 21 – 25 июня 2010г.

Четвертая международная конференция «Современные достижения бионаноскопии», физический факультет МГУ имени М.В.Ломоносова, Москва, Россия, 15-18 июня 2010.

Третья Всероссийская конференция «Нанотехнологии в онкологии 2010», Московский научно-исследовательский онкологический институт им. П.А. Герцена, Москва, Россия, 30 октября Публикации По теме диссертации опубликовано 13 работ, из них 5 статей [A1-A5], включая 3 статьи в реферируемых журналах, входящих в список ВАК [A1-A3], и тезисов докладов на конференциях [A6-A13].

Список сокращений АСМ – атомно-силовая микроскопия, атомно-силовой микроскоп ПП – полипропилен БОПП – биаксиально-ориентированный полипропилен ПГБ – поли(3-гидроксибутират) БСА – бычий сывороточный альбумин ПВХ – поли(винилхлорид) ПЭ – полиэтилен Структура и объем диссертационной работы Диссертация состоит из введения, пяти глав, выводов и списка литературы, включающего 141 наименование. Работа изложена на 122 страницах и содержит 71 рисунок и 1 таблицу.

Основное содержание работы

Во введении обоснована актуальность темы диссертационной работы, сформулирована цель работы, обсуждается новизна и практическая значимость полученных результатов.

В главе 2 представлен обзор литературы по теме диссертационной работы. В обзоре описаны некоторые общие свойства частично кристаллических полимеров и особенности их изучения методом АСМ.

Рассмотрены физические и биофизические свойства исследуемых объектов, в том числе белков паутины и их аналогов. В обзоре обсуждаются также особенности растяжения пленок, имеющих жесткие покрытия, и использование АСМ для визуализации деформаций полимерных пленок.

В главе 3 содержится описание исследованных в работе образцов и способы их приготовления к измерениям, описаны использованные методики и способы проведения измерений.

В главе 4 описаны эксперименты по визуализации деформаций полимерных пленок с помощью АСМ. Развитая в работе методика визуализации деформаций основана на использовании устройства для вытяжки пленок (Рисунок 1 а), совместимого с АСМ. Для удерживания пленки (1) используются подвижные зажимы (2). Устройство имеет три опоры (3) в двух из опор сделаны углубления (4), чтобы ножки микроскопа не проскальзывали по гладкой поверхности. Перемещение зажимов осуществляется вращением ручек (6), линия, вдоль которой перемещаются зажимы, задается парой направляющих (7). Сканирующая головка АСМ размещается на устройстве для вытяжки, как показано на рисунке 1 б.

Рисунок 1 – Устройство для деформации пленок (а) и размещение АСМ на нем в процессе измерений (б). 1 – пленка, 2 – подвижные зажимы, 3 – опоры, 4 – углубления, 5 – пружины, 6 – ручки, 7 – направляющие.

Для визуализации деформации пленок измерения проводились следующим образом. Вначале получали изображение поверхности недеформированного образца. Затем кантилевер отводили от поверхности, чтобы не повредить его при растяжении пленки. После этого пленку растягивали так, чтобы сканируемая область не сместилась – для этого зажимы должны иметь одинаковые смещения относительно платформы. Обычно сканирование осуществлялось вблизи дефекта, хорошо заметного в оптический микроскоп, и растяжение каждый раз осуществлялась так, чтобы смещение этого дефекта было минимальным. После этого выжидали 10-15 минут, чтобы произошла релаксация напряжений в пленке, подводили кантилевер к поверхности и сканировали ту же самую область, что и на первом этапе (или же другую область, если особенности конкретной точки не важны). При фиксированном значении деформации снимались один или несколько кадров, затем цикл растяжения и сканирования повторялся.

Для отладки методики визуализации деформаций использовали образец пластифицированного поливинилхлорида (ПВХ). Изображения одной и той же точки поверхности пленки ПВХ при различных деформациях представлены на рисунке 2. Цифрами отмечены четыре хорошо заметных дефекта, вблизи которых проводилось сканирование. Значения деформации, указанные на кадрах, были измерены по расстоянию между зажимами и отражают макроскопическую деформацию. Измеряя расстояния между дефектами, можно вычислить локальную (микроскопическую) деформацию и оценить коэффициент Пуассона материала. Для исследованного образца ПВХ было получено значение ПВХ=0,45±0,05. Указанная погрешность учитывает стандартное отклонение значений деформации, измеренных между несколькими парами дефектов и приборную погрешность. Для высокоэластичного полимера можно ожидать значения коэффициента Пуассона, близкого к 0,5, что и наблюдается в эксперименте.

Рисунок 2 – АСМ-изображения участка поверхности ПВХ при разных деформациях, ось вытяжки горизонтальна. Цифрами отмечены хорошо заметные дефекты. Через дефекты 2 и 3 проведены сечения.

Методика визуализации деформаций, опробованная и отлаженная на примере пленки из пластифицированного ПВХ, была использована для изучения деформации промышленной биаксиально-ориентированной пленки на основе полипропилена. Эта пленка состоит из трех слоев полимера и имеет на одной стороне тонкое металлическое покрытие. Три полимерных слоя формируются при изготовлении пленки: два поверхностных слоя толщиной 0,8 1,2 мкм, состоящих из сополимера ПП с полиэтиленом (ПЭ) или терполимера ПП с полиэтиленом и полибутеном, и центральный кристаллический слой гомополимера ПП. Такая трехслойная пленка подвергается двухступенчатой вытяжке, затем на нее наносится покрытие (на ту сторону, которая покрыта сополимером ПП/ПЭ, а сторона, покрытая терполимером, оказывается открытой).

Рисунок 3 – АСМ-изображения участка поверхности пленки БОПП при разных относительных деформациях, ось вытяжки горизонтальна. Цветовая шкала на каждом кадре оптимизирована для максимальной контрастности. На вставках показаны графики сечений вдоль белых линий на кадрах.

Изображения участка поверхности пленки БОПП, покрытой терполимером, при разных значениях деформации представлены на рисунке 3.

Видно, что по мере деформации поверхность покрывается сеткой из углублений и выступов (перепад рельефа между ними составляет 15-20 нм), направленных под углом 45,3°±0,9° к направлению вытяжки. Они могут быть интерпретированы как полосы сдвига. В изотропном теле, подвергаемом одноосной нагрузке, максимальное сдвиговое напряжение достигается под углом 45° к направлению растягивающей (или сжимающей) силы, поэтому можно сказать, что наблюдаемый угол 45,3°±0,9° хорошо соответствует углу, предсказываемому классической механикой разрушения.

Рисунок 4 – Изменение параметров шероховатости поверхности по мере вытяжки для БОПП (А) и для ПВХ (Б).

Рисунок 5 – АСМ-изображения поверхности пленки БОПП, покрытой Al, деформированной на 15%. А – изображение микрорельефа поверхности, Б – фазовое изображение участка, выделенного рамкой на кадре А. В и Г – графики сечений вдоль линий 1 и 2 на кадре А.

Было показано, что если вынуть пленку из зажимов, то угол между направлением этих углублений и направлением вытяжки за счет контракции пленки увеличивается от 45,3°±0,9° до 52°±1°. Таким образом, в данном эксперименте корректное измерение угла возможно только с использованием деформационного устройства, совместимого с АСМ.

Для пленки БОПП было получено значение ПП=0,34±0,13, которое хорошо соответствует типичным значениям коэффициента Пуассона для полимеров (от 0,3 до 0,5).

Были проанализированы закономерности изменения шероховатости поверхности пленок ПВХ и БОПП при вытяжке (Рисунок 4). Для этого при разных деформациях вычислялись значения средней (Ra) и среднеквадратичной (Rq) шероховатости выбранного участка, а потом они нормировались на их начальные значения (при нулевой деформации). Как видно из рисунка 4, для обеих исследованных пленок (ПВХ и БОПП) при больших деформациях наблюдается рост шероховатости. На поверхности БОПП рост шероховатости объясняется возникновением и ростом полос сдвига, а на ПВХ – образованием микротрещин на дефектах.

Методом АСМ была изучена фрагментация и образование регулярного микрорельефа на поверхности пленки на основе БОПП, имеющей алюминиевое покрытие (Рисунок 5). Трещины покрытия прорастают в полимер на глубину, большую, чем толщина покрытия (она составляет 30 нм, а глубина трещин зависит от деформации и составляет от 70-100 нм при ~8% и до 400-600 нм при ~70%). Внутри трещины наблюдается фибриллизация полимера – он образует нити диаметром 80-100 нм. Они хорошо заметны на фазовом изображении и сравнительно плохо видны на изображении микрорельефа.

Можно выделить как минимум два механизма, которые приводят к прорастанию трещин в полимер. Первый из них [1] состоит в том, что если трещина зарождается в покрытии, то чем больше ее глубина, тем больше оказывается напряжение в ее вершине, и когда трещина достигает границы покрытие-полимер, напряжение в вершине оказывается достаточным для разрыва полимера. Второй механизм прорастания трещин связан с явлением боковой контракции образца при его вытяжке. Области полимера, покрытые металлом, являются более прочными, чем области трещин, где поверхность полимера открыта, поэтому величина локальной деформации в трещинах оказывается больше. При вытяжке полимер сжимается в перпендикулярном направлении (в том числе в направлении, перпендикулярном плоскости пленки), и величина сжатия оказывается больше там, где больше локальная деформация, т.е. в трещинах.

Образование регулярного микрорельефа на покрытой алюминием поверхности БОПП происходит локально, по механизму пластического шарнира [2]. Поскольку складки рельефа наблюдаются только на покрытии и не наблюдаются на открытом полимере (в трещине), то наблюдается локальное отслаивание покрытия. Перепады высоты микрорельефа составляют до 250 нм (Рисунок 5 В).

Итак, в главе 4 предложена методика для визуализации деформаций полимерных пленок при их растяжении, показана эффективность этой методики для измерения локальных деформаций пленки, визуализации процессов зарождения и прорастания трещин, анализа механизмов деформации.

В главе 5 описаны эксперименты по изучению морфологии поверхности пленок поли(3-гидроксибутирата) (ПГБ) и композитов на его основе методом атомно-силовой микроскопии. Была исследована поверхность пленок ПГБ, приготовленных методами полива (макроскопические пленки толщиной 42±7 мкм) и нанесения на вращающуюся подложку (ультратонкие пленки толщиной менее 30 нм). Первые из них могут использоваться в качестве имплантов для изучения биологических свойств ПГБ, вторые являются удобной моделью для изучения его кристаллической структуры.

Морфология пленок, приготовленных методом нанесения на вращающуюся подложку (спин-коатинга), существенно зависит от типа использованной подложки (в данной работе использовались слюда и графит) и частоты ее вращения. Варьируя эти параметры, удалось наблюдать полиморфизм кристаллических структур ПГБ: ламели, расположенные преимущественно параллельно подложке (flat-on) и перпендикулярно ей (edge on), аксиалиты, пальцеобразные структуры, «двумерные сферолиты», компактные дендриты – некоторые из этих структур представлены на рисунке 6.

Рисунок 6 – Пленки ПГБ, приготовленные методом спин-коатинга на слюде. А – пальцеобразные структуры, Б – «двумерные сферолиты», В – увеличенный фрагмент кадра Б, выделенный черной рамкой. Представлен график сечения вдоль горизонтальной белой линии на кадре В.

Наиболее существенные результаты, полученные при исследовании пленок, приготовленных методом нанесения на вращающуюся подложку, состоят в следующем. На слюде при увеличении частоты вращения подложки доминирующая на подложке морфология изменяется: при низкой частоте вращения наблюдаются «пальцеобразные структуры» (Рисунок 6 А, толщина ламели от 3,2 до 3,7 нм), при ее увеличении начинают возникать «двумерные сферолиты» (Рисунок 6 Б). Такой переход, по-видимому, объясняется тем, что при увеличении растет пересыщение раствора, из которого происходит кристаллизация, и это приводит к возникновению более компактных структур.

Между двумерными сферолитами наблюдаются области, в которых удается различить стопки ламелей со средней шириной L=5,5±0,9 нм (Рисунок 6 В) – контур такой области выделен белой линией на рисунке 6 Б. На графите наблюдались ламели, имеющие различную форму и взаимную ориентацию, для которых толщина составляла 4,0±0,3 нм. По-видимому, малая толщина ламелей на обеих подложках объясняется быстрой кристаллизацией.

Рисунок 7 – Изображения поверхности пленки ПГБ массой 950±25 кДа. (A) – шероховатая сторона контрольной пленки ПГБ, (Б) – гладкая сторона контрольной пленки ПГБ. (В) – фазовое изображение участка, выделенного рамкой на кадре (Б). Представлен график сечения вдоль линии между двумя звездочками на кадре (В).

При приготовлении пленок методом полива одна сторона контактирует с подложкой («нижняя»), а другая с воздухом («верхняя») – в результате эти стороны оказываются разными по своей шероховатости. «Верхняя» сторона оказывается сравнительно шероховатой (Рисунок 7 А, Ra=130±10 нм, Rq=165±10 нм), а «нижняя» сравнительно гладкой (Рисунок 7 Б, Ra=15±3 нм, Rq=20±3 нм). На поверхности удалось получить изображения ламелей (в основном, в режиме фазового контраста) в виде стопок параллельных полос с расстоянием 7-40 нм между ними (Рисунок 7 В). Значения этого диапазона существенно больше толщины ламелей, которые наблюдались в пленках, приготовленных методом нанесения на вращающуюся подложку. Это объясняется, во-первых, расположением плоскостей ламелей под различными углами к поверхности, и, во-вторых, различием в скорости кристаллизации пленок.

Было исследовано влияние низкомолекулярных веществ (индометацина, левофлоксацина, рифампицина) на морфологию поверхности пленок. Было обнаружено, что поверхность пленок из ПГБ с рифампицином и индометацином аналогична по своей морфологии поверхности пленки чистого ПГБ. Однако левофлоксацин, в отличие от рифампицина и индометацина, из-за низкой термодинамической совместимости с ПГБ не проникает в полимерную пленку, а располагается на ее поверхности в виде кристаллов, которые легко удаляются отмывкой (Рисунок 8). На композитных пленках удалось получить изображения ламелей, аналогичные тем, которые получились на контрольном образце ПГБ.

Рисунок 8 – Пленка ПГБ/левофлоксацин до (А) и после (Б) отмывки водой. На кадре (А) видны кристаллы левофлоксацина.

Для объяснения различной совместимости лекарственных веществ с ПГБ был использован метод оценки параметров растворимости [3]. В качестве меры совместимости лекарства с полимером использовалась величина = ( p1 p 2 ) 2 + ( d 1 d 2 ) 2 + ( h1 h 2 ) 2, где параметры растворимости с индексом относятся к лекарству, а с индексом 2 – к полимеру. Частные параметры растворимости p, d, h отвечают соответственно за диполь-дипольные взаимодействия, дисперсионные взаимодействия и водородные связи.

Выяснилось, что для пары ПГБ/левофлоксацин значение =35,1 МПа больше, чем для пар ПГБ/индометацин (=25,8 МПа) и ПГБ/рифампицин (=29,8 МПа), что и является объяснением их различной совместимости.

В заключительном параграфе главы 5 описаны эксперименты по изучению поверхности пленок ПГБ, которые подвергались ферментативному разложению. Показано, что при разложении пленки ПГБ происходит увеличение шероховатости ее поверхности, однако это может не проявляться при высокой начальной шероховатости пленок. Обнаружено, что разложение пленки в организме животного происходит неоднородно на масштабе 0,5 2,5 мкм.

Глава 6 посвящена изучению надмолекулярных агрегатов белков паутины. Она начинается с анализа методических особенностей изучения белков и их агрегатов при помощи АСМ. На примере бычьего сывороточного альбумина (БСА) были получены изображения отдельных молекул, был отработан протокол приготовления образцов и подобраны параметры сканирования, которые затем использовались для получения изображений белков паутины.

В работе сопоставляются два типа надмолекулярных агрегатов:

нанофибриллы и поверхностные ламели. Они принципиально отличаются тем, что первые существуют в растворе, а вторые формируются из отдельных молекул при их адсорбции на подложку. Хотя нанофибриллы белка паутины были описаны ранее [4], однако способ укладки молекул в них до настоящего времени не ясен. В данной работе для нанофибрилл получена оценка агрегационного числа: оно составляет =8-10 молекул на 100 нм длины.

Рисунок 9 – Нанофибриллы 1F9 (А) и 2Е12 (Б) на слюде. Белки были растворены в дистиллированной воде. Стрелками показаны пересечения нанофибрилл.

Изображение нанофибрилл приведено на рисунке 9. Важно, что наблюдаемые нанофибриллы формируются в растворе, а не собираются из более мелких структурных единиц при адсорбции на подложку. Для обоснования этого утверждения приводятся следующие аргументы. Во-первых, нанофибриллы имеют закрутку вокруг собственной оси, в то время как закрутка растущего на поверхности агрегата потребовала бы его частичной десорбции, что крайне маловероятно. Во-вторых, были получены изображения нанофибрилл на различных подложках: на слюде и на аморфном углероде, гидрофилизованном в тлеющем разряде. Хотя шероховатость подложки из аморфного углерода мешает точному измерению размеров нанофибрилл, можно утверждать, что наблюдаемые на разных подложках нанофибриллы морфологически сходны. Таким образом, возможность наблюдения нанофибрилл при помощи АСМ не зависит от использования конкретной подложки – это косвенно подтверждает существование нанофибрилл в растворе. В-третьих, нанофибриллы образуют пересечения и самопересечения (они указаны стрелками на рисунке 9 А), что также указывает на существование нанофибрилл в растворе.

Рисунок 10 – АСМ-изображения белка 1F9, нанесенного на слюду из раствора с концентрацией ~20 мкг/мл в течение t=1,5 мин. Внизу показаны графики сечений вдоль линий 1 и 2 на изображении А.

Если растворить белок паутины в денатурирующем растворителе (использовались два растворителя – 6М GdmSCN и 10% раствор NaCl в 90% HCOOH), а затем нанести на слюду, то наблюдаются нитевидные структуры, которые радикально отличаются от нанофибрилл. Эти структуры были интерпретированы как ламели двух типов (монослойные и двухслойные): они представлены на рисунках 10 для белка 1F9 и 11 для белка 2Е12. Морфология и размеры наблюдаемых структур не зависят от конкретного использованного растворителя.

Ламели первого типа (монослойные) имеют высоту над подложкой 0,55±0,15 нм для 1F9, 0,70±0,15 нм для 2Е12 – это близко к толщине -листа, уложенного на слюду (0,6 нм [5], 0,6±0,2 нм [6]). Они показаны на рисунках 10 А и 11 А звездочкой (*). На них формируются более высокие ламели второго типа: они показаны на рисунках 10 А и 11 А двумя звездочками (**) и имеют высоту в 3-4 раза больше высоты монослойных ламелей.

Количество осажденного на подложку вещества можно варьировать, меняя концентрацию раствора и время экспозиции капли на слюде. При концентрации белка в растворе 5-10 мкг/мл (50-100 нМ) и экспозиции на подложке 1-2 минуты выявляются ламели только первого типа. При повышении концентрации до ~20 мкг/мл (~200 нМ) или увеличении экспозиции капли на подложке с 2 до 4-5 минут, поверх ламелей начинает формироваться второй адсорбированный слой в виде ламелей второго типа (рисунки 10,11).

Ламели второго типа ориентированы по монослойным (рисунки 10 Б, 11 Б): на АСМ-изображениях видно, что продолжением каждой ламели второго типа является более тонкая монослойная ламель.

Рисунок 11 – АСМ-изображения белка 2Е12, нанесенного на слюду из раствора с концентрацией ~20 мкг/мл в течение t=1,5 мин. Внизу показаны графики сечений вдоль линий на кадрах А и Б. На кадре Б для улучшения контрастности выбрана инвертированная цветовая шкала, отличающаяся от традиционной.

Для интерпретации полученных данных была предложена схема растворения и агрегации белков паутины, которая представлена на рисунке 12.

В основе этой схемы лежит утверждение о том, что белки паутины могут существовать в водных растворах в виде нанофибрилл и в виде отдельных молекул. Если растворить сухой белок в дистиллированной воде, то мы получаем раствор, в котором белок преимущественно находится в состоянии нанофибрилл. Если же обработать сухой белок растворителями и потом перевести в воду (разбавлением или гель-фильтрацией), то мы получаем раствор, в котором белок преимущественно находится в состоянии отдельных молекул (по-видимому, они имеют конформацию клубков). При длительном хранении или интенсивном механическом перемешивании он переходит в состояние нанофибрилл.

Рисунок 12 – Схема растворения и адсорбции белков паутины. Размеры АСМ изображений, приведенных внизу: слева 3х3 мкм, справа 800х800 нм.

Обсудим конформацию молекул, входящих в состав ламелей. Поскольку ламели имеют постоянную ширину (для ламелей 2Е12 она составляет 8±1 нм, для 1F9 она имеет близкое значение, однако определить его не удалось) и малую высоту, для описания конформации молекул в них можно использовать модель плоского зигзага. В этой модели предполагается, что молекула распластана по подложке и стабилизирована водородными связями, как в антипараллельном -листе [5].

Когда молекула белка приходит в контакт со слюдой, она либо становится зародышем новой ламели, либо продолжает рост уже существующей, т.е. ламели формируются путем последовательного присоединения молекул из раствора. Если же молекула адсорбируется на поверхность уже сформированной ламели, то она не распластывается до монослоя, а сворачивается в «трехмерную» структуру – об этом говорит различие высот ламелей первого и второго типа. Это подтверждается также тем, что ламели второго типа имеют сегментированную структуру. Как видно из сечений, проведенных вдоль ламелей второго типа на рисунках 10 и 11, вдоль гребня двухслойной ламели наблюдаются выступы и впадины с периодом l1F9=14±5 нм и l2E12=21±6 нм, т.е. ламели второго типа являются сегментированными. Объем отдельного сегмента хорошо соответствует объему одной или двух близко расположенных молекул белка.

Отметим ряд фактов, которые подтверждают схему, предложенную на рисунке 12. Во-первых, возможность формирования ламелей зависит от подложки – они возникают на слюде и не возникают на графите. При нанесении на графит белок 1F9 не образует ламелей, а адсорбируется в виде неструктурированных комков, в контрольном эксперименте (без белка, только растворитель) графитовая подложка оказывается чистой. Во-вторых, у ламелей, в отличие от нанофибрилл, отсутствуют пересечения и самопересечения с удвоением высоты. В-третьих, методом флуоресцентной корреляционной спектроскопии было показано, что белок 1F9 после растворения в 6M GdmSCN оказывается в воде в виде отдельных молекул [7]. Это было показано в эксперименте с белком 1F9, меченым родамином, путем измерения коэффициента диффузии метки. Четвертый аргумент основан на данных кругового дихроизма [4,7]. Для нанофибрилл белков паутины характерно высокое содержание -листов. Белки 1F9 и 2Е12 после обработки в денатурирующих растворителях преимущественно имеют вторичную структуру спирали полипролин-II (PP-II), типичную для денатурированных белков [8]. Данные кругового дихроизма хорошо согласуются с тезисом о том, что после денатурации 1F9 или 2Е12 и уменьшения концентрации хаотропного агента существенная доля белка не сразу агрегирует в нанофибриллы, а остается в состоянии отдельных молекул. В-пятых, для 2Е12 удалось получить микроскопические изображения отдельных молекул.

Рисунок 13 – АСМ-изображения ламелей белков 1F9 (А) и 2Е12 (Б) на слюде.

Образцы приготовлены в идентичных условиях из растворов с концентрацией с=5 мкг/мл.

При идентичных условиях нанесения на подложку длина монослойных ламелей белка 1F9 существенно больше, чем длина ламелей белка 2Е (Рисунок 13). В частности, на примере белка 2Е12 удалось получить изображения мономолекулярных ламелей, т.е. отдельных молекул, уложенных на подложке в конформации плоского зигзага. Наблюдаемая разница в длине ламелей может быть объяснена, исходя из данных о кинетике формирования вторичных структур в белках [9]. Когда молекула белка паутины, находящаяся в водном растворе, приходит в контакт со слюдой, она под действием поверхностных сил сворачивается в плоский зигзаг. Этот процесс оказывается энергетически выгодным, по-видимому, не только из-за взаимодействия с подложкой, но и из-за образования водородных связей между соседними фрагментами цепи, как в -листе. Скорость роста -листов ограничена скоростью их зарождения, которая, в свою очередь, зависит от вероятности образования петли. Поскольку в белке 2Е12 присутствуют остатки пролина, то они снижают энергетический порог образования петли и зародыша ламели, поэтому зародышеобразование ламелей белка 2Е12 происходит быстрее, чем зародышеобразование ламелей белка 1F9. Это, в свою очередь, приводит к тому, что ламели 1F9 оказываются длиннее ламелей белка 2Е12.

В заключительной части главы описаны эксперименты по нанесению на подложку глобулярного белка, обработанного денатурирующим растворителем.

Показано, что белок БСА после растворения в 10% растворе NaCl в 90% HCOOH, последующего разведения водой и нанесения на слюду не формирует ламелей (в отличие от 1F9 и 2Е12), а адсорбируется в форме глобул. Для объяснения этого сопоставим процессы растворения и адсорбции разных (белков БСА и спидроинов) с точки зрения изменения их конформаций. При растворении в LiCl/HCOOH каждый из белков денатурирует и теряет свою структуру. При разбавлении водой молекулы спидроинов принимают конформацию клубков, причем при адсорбции на слюду они формируют ламели. БСА, в отличие от спидроинов, после снижения концентрации хаотропного агента LiCl/HCOOH быстро принимает глобулярную конформацию – нативную или близкую к нативной. После этого при адсорбции на слюду молекулы сохраняют глобулярную конформацию и не проявляют тенденции к кристаллизации или агрегации.

В приложении 1 приведены формулы аминокислот, входящих в состав белков.

Выводы 1. Разработан способ визуализации деформаций полимерных пленок с помощью атомно-силового микроскопа, который позволяет регистрировать локальные деформации пленки, зарождение и прорастание трещин, выяснять механизмы деформации.

2. Впервые с помощью устройства для растяжения пленок, совместимого с АСМ, визуализированы изменения структуры многослойных металлизированных пленок на основе полипропилена в процессе ступенчатой деформации. Было обнаружено:

Возникновение полос сдвига в покрытии из терполимера в виде углублений на 15-20 нм, направленных под углом 45° к направлению вытяжки, предсказываемое классической механикой разрушения.

Прорастание трещин покрытия в объем полимера и фибриллизация полимера в трещинах при растяжении пленки с тонким алюминиевым покрытием.

3. Определена морфология поверхности композитных пленок из поли(3 гидроксибутирата), приготовленных методами полива и нанесения на вращающуюся подложку, проанализирован полиморфизм кристаллических структур. Показано, что на шероховатой поверхности пленок поли(3 гидроксибутирата) и композитов на его основе возможно получение изображений ламелей с помощью АСМ.

4. Методом АСМ получено изображение отдельных молекул белка 2Е12 – первое микроскопическое изображение отдельных молекул белка паутины.

Показано, что рекомбинантные аналоги белков паутины 1F9 и 2Е12 могут существовать в водных растворах в виде нанофибрилл и в виде отдельных молекул.

5. Показано, что при адсорбции на слюду из разбавленного водного раствора отдельные молекулы белков паутины формируют ламели двух типов.

Ламели первого типа монослойные: они имеют высоту над подложкой менее нм и постоянную ширину. Для описания конформации молекул в них использована модель плоского зигзага. Молекулы белков паутины, адсорбированные на поверхности монослойных ламелей, организованы в протяженные сегментированные ламели второго типа, причем их высота в 3- раза больше высоты монослойных ламелей. Из различий высот следует, что макромолекулы, адсорбированные на слюде и на поверхности уже сформированных монослойных ламелей, имеют разные конформации. При идентичных условиях нанесения на подложку длина ламелей белка 1F существенно выше, чем длина ламелей белка 2Е12 – это, предположительно, объясняется тем, что присутствие остатков пролина в цепи 2Е12 снижает энергию образования зародышей ламелей.

Список публикаций по теме диссертации:

[A1] Д. В. Багров, В. В. Прохоров, Д. В. Клинов, И. И. Агапов, И. В.

Яминский, В. Г. Богуш «Изучение ламелей рекомбинантного белка паутины методом атомно-силовой микроскопии» // Биофизика.– т. 56.– 1. – с. 7-12. – 2011.

[A2] Босхомджиев А.П., Бонарцев А.П., Иванов Е.А., Махина Т.К., Мышкина В.Л., Багров Д.В., Филатова Е.В., Бонарцева Г.А., Иорданский А.Л. «Гидролитическая деструкция биополимерных систем на основе поли 3-оксибутирата. Кинетический и структурный аспекты» // Пластические массы.– 8.– c. 13-18.– 2009.

[A3] Босхомджиев А.П., Бонарцев А.П., Махина Т.К., Мышкина В.Л., Иванов Е.А., Багров Д.В., Филатова Е.В., Иорданский А.Л., Бонарцева Г.А.

«Сравнительное изучение кинетики биодеградации биополимерных систем на основе поли-3-оксибутирата» // Биомедицинская химия.– т. 55.– 6.– c. 625-635.– 2009.

[A4] Д.Багров, И.Яминский «Атомно-силовая микроскопия деформаций полимерных материалов» // Наноиндустрия.– 5.– с. 32-36.– 2008.

[A5] Багров Д.В., Яминский И.В., Ярышева Л.М., Волынский А.Л.

«Применение атомно-силовой микроскопии для описания деформаций полимерных пленок» – "Физико-химия полимеров. Синтез, свойства и применение". Сборник научных трудов. Выпуск 14.– Тверь 2008.– с. 47-52.

[A6] Д.В.Багров, В.В.Мусатова, В.В.Прохоров, Д.В.Клинов, И.И.Агапов, В.Г.Богуш, И.В.Яминский «Ламели из рекомбинантных аналогов белков паутины» // Россия, Москва, Четвертая международная конференция «Современные достижения бионаноскопии», 15-18 июня 2010, Сборник тезисов, с. 15.

[A7] В.В.Мусатова, Д.В.Багров, И.И.Агапов, И.В.Яминский, В.Г.Богуш, К.В.Шайтан «Изучение нанофибрилл рекомбинантного белка паутины 1F методом атомно-силовой микроскопии» // Россия, Москва, Современные достижения бионаноскопии, Третья международная конференция, 16- июня 2009, Сборник тезисов, с. 38-39.

[A8] В.В.Мусатова, Д.В.Багров, И.И.Агапов, И.В.Яминский, В.Г.Богуш, К.В.Шайтан, В.В.Прохоров, Д.В.Клинов «Ламели из рекомбинантного белка паутины» // Россия, Москва, Четвертый студенческий симпозиум по биоинженерии, 30 октября 2009, Тезисы докладов, с. 31-33.

[A9] Bagrov D.V., Yaminsky I.V., Yarisheva L.M., Volinsky A.L.

«Visualization of polymer film surfaces under tension by atomic-force microscopy» // Germany, Halle, "Polymeric materials P2008", 24-26 September 2008, Book of abstracts, PI-02.

[A10] Bagrov D.V., Yaminsky I.V., Yarisheva L.M., Volinsky A.L. «Fraction analysis of polymer films» // USA, Nebraska, Omaha, International Student Research Forum, 1-3 June 2008, Book of abstracts, p. 15.

[A11] Bagrov D.V., Yaminsky I.V., Yarisheva L.M., Volinsky A.L. «Application of atomic-force microscopy for visualisation of polymer film surfaces under tension» // Russia, Saint-Petersburg, 4th Saint-Petersburg Young Scientists Conference "Modern problems of polymer science", 15-17 April 2008, Book of abstracts, p. 75.

[A12] Д.В.Багров, В.В.Мусатова, В.В.Прохоров, Д.В.Клинов, И.И.Агапов, В.Г.Богуш, И.В.Яминский «Изучение агрегации рекомбинантных белков паутины» // Россия, Москва, Пятая Всероссийская Каргинская конференция "Полимеры-2010", 21 – 25 июня 2010, С2-2.

[A13] Багров Д.В., Бонарцев А.П., Босхомджиев А.П., Махина Т.К., Мышкина В.Л., Филатова Е.В., Яковлев С.Г., Воинова В.В., Бонарцева Г.А., Шайтан К.В. «Исследование структуры и процесса разложения пленок из поли-3-гидроксибутирата и его композитов с лекарственными веществами» // Россия, Москва, Третья Всероссийская конференция «Нанотехнологии в онкологии 2010», 30 октября 2010, Cборник тезисов, с. 15-18.

Список цитированной литературы:

1. George M., Colin J., Coupeau C., Grilhe J. Damaging of a soft substrate by cracks propagation through its hard coating: AFM observations and finite element simulation // Eur.Phys.J.Appl.Phys.– 2003.– Vol. 22.– p. 15-19.

2. Волынский А.Л., Бакеев Н.Ф. Структурная самоорганизация аморфных полимеров – М.: Физматлит, 2005, 230 c.

3. van Krevelen D.W., Nijenhuis K.Te. Properties of polymers – Elsevier Science Ltd.: 2009, 1004 pages.

4. Bogush V.G., Sokolova O.S., Davydova L.I., Klinov D.V., Sidoruk K.V., Esipova N.G., Neretina T.V., Orchanskyi I.A., Makeev V.Y., Tumanyan V.G., Shaitan K.V., Debabov V.G., Kirpichnikov M.P. A novel model system for design of biomaterials based on recombinant analogs of spider silk proteins // J.Neuroimmune.Pharmacol.– 2009.– Vol. 4.– 1.– p. 17-27.

5. Lashuel H.A., LaBrenz S.R., Woo L., Serpell L.C., Kelly J.W.

Protofilaments, Filaments, Ribbons, and Fibrils from Peptidomimetic Self-Assembly:

Implications for Amyloid Fibril Formation and Materials Science // J.Am.Chem.Soc.– 2000.– Vol. 122.– p. 5262-5277.

6. Topilina N.I., Higashiya S., Rana N., Ermolenkov V.V., Kossow C., Carlsen A., Ngo S.C., Wells C.C., Eisenbraun E.T., Dunn K.A., Lednev I.K., Geer R.E., Kaloyeros A.E., Welch J.T. Bilayer fibril formation by genetically engineered polypeptides: preparation and characterization // Biomacromolecules.– 2006.– Vol. 7.– 4.– p. 1104-1111.

7. Antonenko Y.N., Perevoshchikova I.V., Davydova L.I., Agapov I.A., Bogush V.G. Interaction of recombinant analogs of spider silk proteins 1F9 and 2E12 with phospholipid membranes // Biochim.Biophys.Acta.– 2010.– Vol. 1798.– 6.– p. 1172-1178.

8. Mezei M., Fleming P.J., Srinivasan R., Rose G.D. Polyproline II helix is the preferred conformation for unfolded polyalanine in water // Proteins.– 2004.– Vol. 55.– 3.– p. 502-507.

9. Финкельштейн А.В., Птицын О.Б. Физика белка: курс лекций – Книжный Дом "Университет", 2002. 376 с.