Разработка подходов для изучения механизма действия и поиска новых ингибиторов интегразы вич-1

На правах рукописи

Королев Сергей Павлович РАЗРАБОТКА ПОДХОДОВ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ МЕХАНИЗМА ДЕЙСТВИЯ И ПОИСКА НОВЫХ ИНГИБИТОРОВ ИНТЕГРАЗЫ ВИЧ-1 02.00.10 - биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Москва 2010

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научный консультант: доктор химических наук, профессор Готтих Марина Борисовна

Официальные оппоненты: доктор химических наук Туницкая Вера Леонидовна доктор биологических наук Глухов Александр Иванович

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита состоится 15 июня 2010 года в 17 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, Институт физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 14 мая 2010 года.

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук /Смирнова И.Г./

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Начавшаяся около 30 лет назад пандемия ВИЧ-инфекции и СПИДа охватила все регионы мира. Согласно оценкам, к концу 2008 года численность ВИЧ-инфицированных составила около 33.4 миллионов. Количество умерших от СПИДа достигло 20 миллионов. Каждый день в мире вирусом СПИДа заражаются 7400 человек.

Одни из самых высоких темпов роста заражения ВИЧ-инфекцией в мире наблюдаются в Украине и России. Именно поэтому задача разработки эффективных лекарственных препаратов для борьбы с вирусом является особенно актуальной для нашей страны. Одной из самых привлекательных мишеней для разработки ингибиторов является вирусный фермент интеграза (ИН), катализирующая интеграцию вирусной ДНК в клеточную.

На настоящий момент протестировано более 250 000 потенциально-возможных ингибиторов интегразы, но только один из них препарат IsentressTM или ралтегравир официально разрешен к применению в качестве одного из компонентов высокоактивной антиретровирусной терапии (ВААРТ). Однако даже комплексная терапия не способна полностью подавить репликацию вируса и с течением времени к ней развивается устойчивость. Так показано, что устойчивость к ралтегравиру развивается у некоторых пациентов в течение 12 недель. На стадии клинических испытаний находятся только близкие к ралтегравиру по механизму действия ингибиторы. Уже показано, что к ним развивается устойчивость, перекрестная с ралтегравиром. В связи с этим разработка новых ингибиторов интеграции, механизм действия которых отличается от действия ралтегравира, является актуальной задачей.

Поиск новых ингибиторов осложняется тем, что зачастую активные in vitro ингибиторы, оказываются неактивными in vivo. Эксперименты на культуре ВИЧ инфицированных клеток достаточно трудоемки и дороги, поэтому, несомненно, актуальным является создание системного подхода к оценке механизма действия ингибиторов, который позволил бы отсеять соединения, неспособные работать in vivo и обладающие механизмом действия, схожим с уже известными ингибиторами, к которым выработались устойчивые штаммы вируса.

Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в создании системы методов, позволяющей охарактеризовать механизм ингибирования ИН различными соединениями и дать рекомендации по дальнейшему применению новых ингибиторов.

В ходе работы необходимо было решить следующие задачи.

1. Сформулировать общую схему характеристики ингибиторов ИН.

2. Оптимизировать методику ингибирования каталитической активности ИН.

3. Разработать методику, позволяющую изучать влияние ингибитора на правильную укладку ДНК в активном центре ИН.

4. Провести апробацию разработанных подходов на ингибиторах ИН с известным механизмом действия.

5. Осуществить поиск новых ингибиторов ИН и исследовать их механизм ингибирования интеграции с использованием разработанной системы подходов.

Научная новизна и практическая значимость. В настоящей работе разработана и апробирована система подходов для характеристики ингибиторов ИН с различными механизмами действия in vitro. В частности, можно сказать какой этап интеграции подавляется, связывается ли ингибитор в каталитическом центре ИН или с С-концевым доменом белка, взаимодействует ли ингибитор с ионом металла в активном центре ИН, способен ли действовать на пресформированный комплекс ИН/ДНК. Разработана методика, позволяющая изучать влияние ингибитора на правильную укладку ДНК в активном центре ИН. Кроме того, изучено влияние клеточного партнера ИН, LEDGF/р75, на каталитическую и ДНК-связывающую активность фермента. С использованием метода кросс-линкинга уточнено расположение вирусной ДНК в ее комплексе с ИН и LEDGF.

Предложено использовать комплекс ИН/LEDGF в качестве более адекватной модели для характеристики действия ингибиторов ИН ВИЧ-1 in vitro. Исследование действия ингибиторов на активность ИН в комплексе с LEDGF позволит дать рекомендации к дальнейшему изучению их действия на культуре ВИЧ-инфицированных клеток.

Совокупность предложенных подходов была использована для поиска и характеристики новых ингибиторов ИН ВИЧ-1. Найден новый класс ингибиторов интегразы: нитробензофуроксаны/ нитробензофуразаны, изучен механизм их действия и показано, что они относятся к ингибиторам 3’-процессинга, связываются в активном центре ИН, препятствуют связыванию в нем ДНК-субстрата и не взаимодействуют с ионом металла-кофактора.

Показано, что димерные бисбензимидазолы (DBBI) способны ингибировать обе стадии интеграции за счет нарушения правильной укладки ДНК-субстрата в активном центре ИН. Эффективность ингибирования зависит от природы линкера, соединяющего пары бензимидазолов, и может различаться в 300 раз. На основании всех полученных результатов сделан вывод о том, что разная ингибирующая активность DBBI обусловлена разным механизмом их действия: DBBI с гептаметиленовым линкером является конкурентным ингибитором интегразы, в то время как для DBBI с триэтиленгликолевым линкером предполагается неконкурентный или более сложный механизм ингибирования.

Публикации и апробация работы. По материалам публикации опубликовано статьи в отечественных и зарубежных реферируемых журналах. Результаты работы были представлены на следующих конференциях: международной конференции молодых учёных по фундаментальным наукам "Ломоносов-2006", секция "Химия. Науки о живом" (Москва, 12-15 апреля 2006 г.), 32nd FEBS Congress – Molecular Machines (Вена, Австрия, 7 12 июля 2007 г.), VI съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 11-15 мая 2008 г.), XVI Российском национальном конгрессе “Человек и лекарство” (Москва, 6-10 апреля 2009 г.), научной конференции «Bionano’09. Химическая биология, фундаментальные проблемы бионанотехнологии», (Новосибирск, 10-14 июня 2009 г.), международной конференции «Nucleic Acids at the Chemistry-Biology Interface» (Манчестер, Великобритания, 7-8 сентября 2009 г.).

Структура и объем диссертационной работы. Диссертационная работа изложена на 151 странице машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты и обсуждение, экспериментальную часть, выводы и список литературы. Материал иллюстрирован 65 рисунками и 17 таблицами. Библиографический указатель включает в себя 134 цитированные работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

На основе анализа данных литературы, была сформулирована следующая схема характеристики ингибиторов ИН (Рис. 1).

Этап I. Изучается ингибирующее действие веществ на каждую из стадий интеграции: 3’-процессинг и перенос цепи. Определяются концентрации ингибиторов, при которых эффективность реакции снижается на 50% (IC50).

Если значение IC50 для реакции переноса цепи оказывается ниже, чем для 3’ процессинга, то такой ингибитор относится к ингибиторам переноса цепи. Известно, что данные ингибиторы связываются в активном центре фермент-субстратного комплекса и препятствуют взаимодействию с клеточной ДНК. Если значение эффективности ингибирования 3’-процессинга и переноса цепи близки, то данный ингибитор является ингибитором 3’-процессинга, который препятствует взаимодействию ИН с вирусной ДНК, или аллостерическим ингибитором ИН.

Этап II-А. В случае ингибитора переноса цепи необходимо провести сравнение эффективности ингибирования ИН в присутствии ионов Mg2+ и Mn2+. Ионы двухвалентного металла связаны в активном центре ИН и необходимы ей для осуществления процессинга. Если ингибитор взаимодействует с ионом металла, то из-за различной координирующей способности Mg2+ и Mn2+ влияние ингибитора на активность ИН в присутствии разных ионов металлов будет различаться. Соответственно, более высокая ингибирующая способность в присутствии иона Mn2+ будет указывать на то, что ингибитор взаимодействует с ионом металла в активном центре ИН. Одинаковая активность указывает на отсутствие такого взаимодействия.

Этап II-Б. В случае ингибитора 3’-процессинга или аллостерического ингибитора необходимо изучить его влияние на ДНК-связывающую активность ИН. За связывание ДНК в первую очередь ответственен С-концевой домен ИН. Следовательно, ингибитор, который подавляет связывание ДНК в тех же концентрациях, что и 3’-процессинг, взаимодействует с С-концевым доменом. Если ингибитор подавляет связывание менее эффективно, чем процессинг, то очевидно он взаимодействует с каталитическим центром.

Рис. 1.

Этап III-А. Для ингибитора, взаимодействующего с каталитическим доменом, необходимо выяснить, влияет ли он на правильную укладку ДНК в активном центре ИН.

Если такое влияние есть, то значит, ингибитор препятствует взаимодействию ДНК с активным центром ИН, т.е. является классическим ингибитором 3’-процессинга. Если такого влияния нет, то такой ингибитор влияет на каталитическую активность ИН, возможно, за счет частичного изменения структуры активного центра. Для обоих типов ингибиторов необходимо выяснить происходит ли их взаимодействие с ионом металла в активном центре ИН на этапе IV-A.

Этап III-Б. Для ингибитора, взаимодействующего с С-концевым доменом, необходимо сравнить его ингибирующее действие в конкурентных условиях, когда ИН, ДНК и ингибитор смешиваются одновременно, с действием на предварительно сформированный комплекс ИН с вирусной ДНК. Если ингибитор не способен ингибировать активность ИН в пресформированном комплексе, его можно отнести к конкурентным ингибиторам связывания ДНК.

Ингибитор, способный подавлять активность ИН в пресформированном комплексе, является скорее аллостерическим ингибитором, вызывающим разрушение комплекса ИН с ДНК или его инактивацию за счет структурных изменений белка. Это заключение необходимо дополнительно проверить в экспериментах по воздействию ингибитора на целостность пресформированного комплекса ИН с ДНК на этапе IV-Б.

Некоторые методы для реализации предложенной схемы были известны из литературы: методики ингибирования 3’-процессинга и переноса цепи (Этап I), изучения взаимодействия ингибитора с ионом металла в активном центре ИН (Этап II-A), ингибирования ДНК-связывающей активности ИН (Этап II-Б), исследование действия ингибитора на пресформированный комплекс ИН/ДНК (Этап III-Б). Однако для получения достоверных результатов необходимо было оптимизировать известные методики анализа для нашего препарата ИН. Кроме того, на момент начала выполнения работы не существовало метода, позволяющего оценить влияние ингибитора на правильную укладку ДНК в активном центре ИН (Этап III-А), такую методику нам предстояло разработать.

1. Разработка и оптимизация методов, необходимых для характеристики действия ингибиторов.

1.1. Оптимизация условий ингибирования 3’-процессинга и переноса цепи (Этап I) В исследованиях ингибиторов ИН in vitro обычно используются рекомбинантные препараты белка и олигонуклеотидные дуплексы, повторяющие нуклеотидную последовательность конца участка U5 длинного концевого повтора (ДКП) вирусной ДНК.

В ходе 3’-процессинга от 3’-конца процессируемой цепи отщепляется динуклеотид GT, и из радиоактивно меченного исходного 21-звенного дуплекса U5 (Рис. 2А) образуется дуплекс 19/21 (U5-2). В случае реакции переноса цепи в качестве субстрата используется процессированный дуплекс U5-2. Особенностью ИН является тот факт, что в данной реакции она может встраивать процессированный U5-2 субстрат как в неспецифическую ДНК-мишень, так и в другую молекулу субстрата. Интеграция происходит в разные места и приводит к нескольким продуктам. Для изучения анти-интегразной активности потенциальных ингибиторов отдельно исследуют подавление ингибиторами 3’ процессинга и переноса цепи и для каждого препарата определяют значение IC50. Условия интеграции сильно зависят от метода выделения фермента. Нами использовался метод выделения ИН без детергентов в присутствии Mg2+ и Zn2+, и прежде всего было решено детально охарактеризовать каталитическую активность используемого препарата ИН, чтобы выбрать оптимальные условия для проведения катализируемых ею реакций.

Известно, что в клетке ИН действует в комплексе с вирусными и клеточными белками, входящих в состав прединтеграционного комплекса (ПИК), причем основным кофактором ИН, который входит в состав ПИКа, является клеточный белок LEDGF/p (Cherepanov et al., 2003).

Нашим коллегам из Института геномики и молекулярной и клеточной биологии г.

Страсбурга (Франция) удалось разработать методику получения комплекса ИН/LEDGF и показать, что в его состав входят 4 субъединицы ИН и 2 субъединицы LEDGF. Структура комплекса ИН/LEDGF была изучена с помощью крио-электронной микроскопии и имела разрешение порядка 14. Методами компьютерного моделирования с использованием данных о структуре ИН, LEDGF и взаимодействии ИН с вирусной и клеточной ДНК была построена модель ИН/LEDGF/ДНК.

Однако из-за низкого разрешения крио электронной микроскопии, точно определить расположение ДНК в этом комплексе было невозможно. Было решено оценить, возможно ли использовать комплекс ИН с LEDGF в качестве модели для изучения действия Рис. 2. Изучение каталитической активности ИН ингибиторов ИН in vitro.

и комплекса ИН/LEDGF. (А) Структура 21 Необходимо было звенного и 40-звенного U5-субстрата. Графики зависимости выхода продукта 3’-процессинга 21- охарактеризовать каталитическую и 40-звенных субстратов ИН и комплексом активность наших препаратов ИН/LEDGF от времени (Б).

и Табл. 1. Определение параметров V0, Vmax и Km реакции 3’ рембинатной ИН процессинга, осуществляемой ИН и комплексом ИН/LEDGF комплекса ИН/LEDGF, Длина Фермент V0, нМ/мин Vmax, нМ/мин Km, нМ предназначенных для ДНК, н.п.

изучения ингибиторов 21 ИН 0.010 ± 0.001 - ИН. Была исследована 21 ИН/LEDGF 0.010 ± 0.001 - кинетика накопления 40 ИН 0.013 ± 0.001 0.036±0.004 7.5±0. продукта 3’-процессинга 40 ИН/LEDGF 0.027 ± 0.002 0.14±0.04 27± ИН и комплексом ИН/LEDGF, при этом были использованы стандартный 21-звенный субстат и удлиненный 40-звенный субстрат (Рис. 2А). На основании результатов были построены кинетические кривые (Рис. 2Б) и рассчитаны стационарные скорости V0 процессинга (Табл. 1).

Наиболее значительные изменения по сравнению с ИН происходят при 3’ процессинге 40-звенного субстрата комплексом ИН/LEDGF. В этом случае можно наблюдать значительное увеличение эффективности и начальной скорости реакции и полное изменение характера зависимости выхода продукта процессинга от времени (Рис.

2Б). Отсутствие начальной лаг-фазы, которая обусловлена медленным связыванием ИН с ДНК, позволило предположить, что связывание 40-звенного U5-субстрата комплексом ИН/LEDGF происходит мгновенно. Это затем было подтверждено в экспериментах по изменению анизотропии флюоресценции флуоресцентно-меченного субстрата. Далее были изучены и представлены в координатах Лайнуивера-Берка зависимости скоростей 3’ процессинга, осуществляемого ИН или комплексом ИН/LEDGF, от концентрации 40 звенного U5-субстрата. Были рассчитаны значения Vmax и Km (Табл. 1).

По нашему мнению, данные по стимуляции каталитической и ДНК-связывающей активности ИН в присутствии LEDGF указывают на то, что LEDGF обеспечивает правильную структурную организацию ИН. Мы считаем, что структура ИН в комплексе с LEDGF более соответствует нативной структуре ИН, которая обеспечивается за счет взаимодействия с компонентами ПИКа. Соответственно, комплекс ИН с LEDGF является более адекватной моделью для изучения ингибирующей активности соединений, чем свободная ИН.

1.2. Влияние ингибитора на укладку ДНК в активном центре интегразы (Этап III-А) Основной вклад в связывание ДНК вносит не каталитический, а С-концевой домен ИН, поэтому ингибитор, который связывается в каталитическом домене, может препятствовать взаимодействию вирусной ДНК с активным центром фермента, при этом не оказывая значительного влияния на суммарное связывание ДНК белком. В связи с этим, помимо влияния ингибиторов на ДНК-связывающую активность ИН, было предложено изучить влияние ингибитора на правильную укладку ДНК-субстрата в активном центре ИН. Для этого решили 20% 5% 25% использовать метод ковалентного 7 4 U5B 5’ GTGTGGAAAATСTCAGAG 3’ присоединения к ферменту U5A 3’ CACACCTTTTAGAGAGA 5’ аналогов субстрата, содержащих альдегидную группировку, которая 65 способна взаимодействовать с 30% 5% 40% 40% 5' аминогруппой остатков лизина.

5' U C O O O Соответственно остатки цитидина O = = OH в структуре 21-звенного ДНК OH OO OH OO OH 3' 3' субстрата заменяли на 2’-О-(2,3 дигидроксипропил) - цитидин Рис. 3. Положения U5-дуплекса, в которые (), а остатки тимидина – на 2’-О вводилась модификация, а также структурные формулы нуклеозидов, содержащих 2,3- (2,3-дигидроксипропил)-уридин () дигидроксипропильную группу. Сверху и снизу (Рис. 3). Модифицированные дуплекса указаны положения модификаций и нуклеозиды вводили вблизи эффективность присоединения модифицированного субстрата к ИН. Большой стрелкой указано место расщепляемой при 3'-процессинге расщепления ДНК-субстрата при 3’-процессинге.

связи, поскольку именно этот регион взаимодействует с каталитическим доменом ИН и образует наиболее значимые специфические ДНК-белковые контакты.

ДНК-дуплексы были окислены NaIO4 для получения альдегидной группы, затем они инкубировались с ИН при 37°С в течение 1 часа, и проводилось восстановление образовавшегося основания Шиффа NaBH3CN в течение 30 минут. Продукты присоединения анализировали при помощи электрофореза в геле по методу Лэммли.

Эффективность присоединения модифицированной ДНК к ИН сильно зависела от места расположения модификации в структуре дуплексов. Наибольшая эффективность образования конъюгатов с ИН наблюдалась в случае дуплексов, содержащих модификации во 2-ом и 3-ем положениях непроцессируемой цепи (Рис. 3). Известно, что c первыми четыремя положениями непроцессируемой цепи взаимодействуют остатки 139- каталитического домена ИН, которые расположены непосредственно в ее активном центре, а остаток глутаминовой кислоты 152 входит в состав каталитической триады ИН (Heuer and Brown, 1997). Таким образом, использование субстратов с модификацией во 2-ом или 3-ем положениях непроцессируемой цепи позволяет изучать взаимодействие ДНК непосредственно с активным центром ИН. Ингибитор, связывающийся в активном центре ИН и препятствующий взаимодействию активного центра ИН с вирусной ДНК, соответственно должен препятствовать и ковалентному соединению ИН и ДНК.

Кроме того, поскольку использование альдегидной модификации ДНК-субстрата позволяло получать конъюгаты ИН с ДНК с достаточно высокой эффективностью, было решено использовать кросс-линкинг для уточнения расположения ДНК в комплексе ИН/LEDGF/ДНК.

1.3. Уточнение структуры комплекса ИН/LEDGF/ДНК с использованием метода кросс-линкинга Было решено провести присоединение модифицированного ДНК-субстрата к комплексу ИН/LEDGF и определить аминокислотные остатки белка, ковалентно связанные с субстратом. Основываясь на полученных результатах, было высказано предположение, что стимуляция ДНК-связывающей активности ИН в присутствии LEDGF объясняется тем, что LEDGF стабилизирует конформационно-подвижные участки ИН, тем самым, облегчая ее взаимодействие с ДНК-субстратом. ДНК-связывающий С-концевой домен ИН обладает высокой конформационной подвижностью. В то же время каталитический домен, также участвующий в связывании ДНК обладает достаточно жесткой структурой. В связи с этим, было решено, что в присутствии LEDGF наиболее интересно изучить взаимодействие С-концевого домена ИН с ДНК. Известно, что С концевой домен ИН взаимодействует с 4-ым – 9-ым положениями непроцессируемой (U5A) цепи ДНК (Agapkina et al., 2006), поэтому был выбран ДНК-субстрат с модификацией в 6-ом положении непроцессируемой цепи, способный образовывать конъюгат с ИН с достаточно высокой эффективностью. Ввиду отсутствия 40-звенных модифицированных олигонуклеотидов использовался составной субстрат, в котором 21 звенный олигонуклеотид U5A-6, содержащий альдегидную группу в 6 положении и радиоактивную метку на 5’-конце, вместе с олигонуклеотидом 19_U5A составляли комплементарную цепь 40-звенному олигонуклеотиду 40_U5B. Для определения аминокислоты, связанной с 6-ым положением субстрата, ДНК-субстрат инкубировали с комплексом ИН/LEDGF, смесь продуктов разделяли методом гель-электрофореза по Лэммли, из геля вырезали полосу, соответствующую по подвижности комплексу U5А 6/ИН, гидролизовали белок трипсином и полученный конъюгат олигонуклеотида с пептидом очищали от всех примесей последовательно гель-электрофорезом в 20% ПААГ с 7М мочевиной, хроматографией на Fe3+-NTA-агарозе и гель-фильтрацией на колонках Microcon YM-3.

MALDI-TOF масс-спектрометрический анализ был проведен сотрудником Института биоорганической химии РАН им. М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова Р. Х.

Зиганшиным. В полученном масс-спектре присутствовал наиболее интенсивный пик с массой 7745 Да. Масса пептида была рассчитана по формуле: М(пептида)=М(пика) – М(олигонуклеотида) – М(Н+) и оказалась равна 1350 Да. Среди пептидов, образующихся при триптическом гидролизе ИН, присутствует пептид 263-273, имеющий массу 1348 Да, в структуре которого присутствуют два остатка лизина: Lys264 и Lys266. Конъюгат обработали HF для деградации олигонуклеотидной части и провели секвенирование полученного пептида методом тандемной масс-спектрометрии. Анализ полностью подтвердил результаты MALDI-TOF анализа:

полученная аминокислотная последовательность RKAKIIRDYGK соответствовала пептиду 263-273 из С-концевого домена интегразы ВИЧ-1. Согласно модели комплекса ИН/LEDGF/ДНК, построенной д ром Марком Руффом из Института геномики и молекулярной и клеточной биологии г. Страсбурга с учетом полученных нами данных, 6-положение непроцессируемой цепи U5-субстрата сближено с Рис. 4. Модель взаимодействия комплекса ИН/LEDGF с ДНК.

остатком Lys264 ИН, а не Lys266 (Рис. 4).

2. Апробация системы подходов на ингибиторах интегразы с известными механизмами действия Необходимо было выяснить, позволяет ли разработанная система подходов делать достоверные выводы о механизме действия ингибиторов ИН. Для этого было решено проверить сформулированные подходы на ингибиторах с известными механизмами действия. Были выбраны 3 известных ингибитора: пурпурогаллин, L-708,906 и 11-D-E (Рис. 5).

Пурпурогаллин Пурпурогаллин относится к классу 2-гидрокситрополонов – семичленных небензоидных ароматических гидроксикетонов. Некоторые представители этого класса были изучены в качестве ингибиторов ИН и было показано, что они связываются в ее активном центре, взаимодействуют с ионами двухвалентого металла и препятствует взаимодействию ИН с вирусной ДНК.

На этапе I была оценена способность соединений ингибировать обе реакции, катализируемые интегразой ВИЧ-1 (Табл. 2). Пурпурогаллин с одинаковой эффективностью ингибировал обе A Б стадии интеграции, что O O OH характерно для ингибитора 3’ HO OH процессинга. На этапе II-Б COOH O показано, что пурпурогаллин OH O O Br O В значительно хуже ингибирует COOH Br связывание ИН с ДНК, чем 3’ O GGTTTTTGTGTp NH NH O O O процессинг. На этапе III-А OH Br выяснилось, что пурпурогаллин Br OH влияет на ковалентное связывание Рис. 5. Структуры известных ингибиторов интегразы: ДНК-субстрата в активном центре (А) пурпурогаллина;

(Б) L-708,906;

(В) 11-D-E.

ИН с эффективностью близкой к Табл. 2. Ингибирование пурпурогаллином, L-708,906 и 11-D-E каталитической активности ИН ВИЧ-1 в реакциях 3’-процессинга и переноса цепи и ингибирование взаимодействия ИН с ДНК-субстратом.

IC50*, мкМ Связывание Название 3’-процессинг Перенос Связывание ДНК в ИН ИН/LEDGF ИН цепи ИН с ДНК активном Mg2+ Mn2+ центре ИН Пурпурогаллин 0.7±0.1 1.5±0.2 0.2±0.1 0.6±0.1 50±20 1.0±0. L-708,906 4.2±1.6 4.0±1.2 1.0±0.2 0.5±0.2 500 100± 11-D-E 0.05±0.01 0.005±0.001 0.06±0.02 0.06±0.01 0.05±0.01 0.03±0. * все значения являются усредненными результатами не менее чем 3-х экспериментов эффективности ингибирования 3’-процессинга (Табл. 2). В соответствии с предложенной схемой эти данные указывают на взаимодействие ингибитора с активным центром ИН.

На Этапе IV-А была изучена ингибирующая активность пурпурогаллина в реакции 3’ процессинга в присутствии иона Mn2+ (Табл. 2). Оказалось, что пурпурогаллин более чем в 3 раза активнее по отношению к ИН с кофактором-марганцем, чем с кофактором-магнием.

Этот результат указывает на взаимодействие ингибитора с ионом металла.

Таким образом, совокупность предложенных подходов позволила достоверно определить механизм ингибитора ИН пурпурогаллина, который полностью согласуется с литературными данными. Помимо этого, было определено значение IC50 пурпурогаллина для реакции 3’-процессинга, катализируемой комплексом ИН с LEDGF (Табл. 2).

Оказалось, что в присутствии LEDGF ингибирующая активность пурпурогаллина снижается примерно в два раза. Этот факт, по нашему мнению, указывает на то, что данный ингибитор не будет эффективно ингибировать репродукцию ВИЧ-1 в клеточной культуре. Хотя подобные исследования для пурпурогаллина не проводились, из литературы известно, что большая часть изученных 2-гидрокситрополонов оказалась не способна защитить МТ-2 клетки от цитопатического эффекта, вызванного ВИЧ- (Semenova et al., 2006), они также слабо ингибировали репродукцию ВИЧ-1 в зараженных лимфобластоидных CEM-SS и MT-4 клетках (Didierjean et al., 2005).

L-708, L-708,906 – ингибитор переноса цепи, содержащий мотив дикетокислоты (2,4 диоксобутановой кислоты), который имеется во всех наиболее активных ингибиторах переноса цепи, в том числе и в ралтегравире. Данный ингибитор связывается в активном центре ИН, уже связанной с вирусной ДНК, взаимодействует с ионом металла и мешает связыванию клеточной ДНК. Ингибиторы данного класса не влияют на связывание ИН с вирусной ДНК.

Проведенные эксперименты показали, что L-708,906 действительно практически на порядок лучше ингибирует перенос цепи, чем 3’-процессинг и при этом взаимодействует с металлом-кофактором (Табл. 2). Для проверки схемы было изучено влияние L-708,906 на ДНК-связывающую активность ИН и правильную укладку ДНК в активном центре (Табл.

2). В соответствии со своим механизмом действия, L-708,906 не влиял на связывание ДНК с ИН, а на укладку ДНК в активном центре действовал примерно в 20 раз хуже, чем на 3’ процессинг. Определенное значение IC50 для 3’-процессинга, катализируемого комплексом ИН/LEDGF, практически совпало с определенным для ИН, таким образом, полученные данные указывают на то, что ингибитор является потенциально активным на клетках. В литературе показана высокая противовирусная активность L-708,906 на МТ-2 клетках, зараженных ВИЧ-1 (Pluymers et al., 2002). Таким образом, в соответствии с разработанной схемой был подтвержден известный из литературы механизм действия L-708,906.

11-D-Е 11-D-Е – разработанный в нашей лаборатории неконкурентный ингибитор ИН. Он представляет собой конъюгат одноцепочечного олигодезоксирибонуклеотида и флуоресцентного красителя эозина. 11-D-E является аллостерическим ингибитором ИН: он связывается с С-концевым доменом и вызывает разрушение комплекса ИН с ДНК.

Изучение ингибирующей активности 11-D-E в реакциях 3’-процессинга и переноса цепи (Этап I), показало, что данный ингибитор подавляет обе реакции с одинаковой эффективностью (Табл. 2), что согласуется с его механизмом действия. На этапе II-Б было показано, что 11-D-E способен подавлять связывание ДНК с той же эффективностью, что и 3’-процессинг (Табл. 2), что указывало на то, что он взаимодействует с С-концевым доменом ИН. Изучение действия 11-D-E на 3’-процессинг, осуществляемый пресформированным комплексом ИН/ДНК (Этап III-Б), и влияния ингибитора на целостность пресформированного комплекса ИН/ДНК (Этап IV-Б) показало, что 11-D-E действительно является аллостерическим ингибитором ИН: ингибитор разрушал комплекс ИН/ДНК с IC50 порядка 0.06±0.02 мкМ, что соответствовало его IC50 при ингибировании каталитической активности ИН.

Кроме того, для проверки схемы было изучено действие 11-D-E на 3’-процессинг в присутствии иона марганца и правильную укладку ДНК в активном центре (Табл. 2). Как и следовало ожидать, 11-D-E, который в соответствии со своим механизмом действия не взаимодействует с активным центром ИН и не координирует ион металла, ингибировал 3’ процессинг в присутствии ионов любого из этих металлов с одинаковой эффективностью.

Также 11-D-E оказался способным подавлять специфическое связывание ДНК в активном центре фермента с той же эффективностью, что и 3’-процессинг, что неудивительно, учитывая его способность вызывать диссоциацию комплекса ИН с ДНК.

Полученные данные полностью подтверждали аллостерический характер ингибирования 11-D-E. Для того чтобы более подробно изучить изменения, происходящие в структуре ИН при взаимодействии с ингибитором, было решено провести дополнительные исследования с использованием метода флуоресцентной спектроскопии.

В структуре ИН находятся семь остатков триптофана, причем два из них, Trp235 и Trp243, расположены в С-концевом домене ИН вблизи Lys236, с которым, как было ранее показано, взаимодействует этот ингибитор.

Было изучено влияние на собственную флуоресценцию ИН ингибитора 11-D-E и соответствующего олигонуклеотида 11-D без эозина, который ингибирует ИН при гораздо более высоких концентрациях, IC50 = 6.0 ± 0. мкМ. Оказалось, что связывание 11-D-E с ИН изменениям Рис. 6. Влияние 11-D-E на собственную приводит к значительным флуоресценцию остатков триптофана собственной флуоресценции остатков ИН. (А) Тушение флуоресценции триптофана ИН (Рис. 6А). Олигонуклеотид без остатков триптофанов ИН при связывании с 11-D-E и 11-D. (Б) эозина, 11-D, тушил флуоресценцию ИН Кинетика изменения флуоресценции значительно менее эффективно (Рис. 6А). нМ ИН при инкубации при 37С, в Кроме того, скорость тушения флуоресценции присутствии 50 нМ U5-субстрата или нМ ингибитора 11-D-E.

ИН ингибитором 11-D-E была значительно выше, чем U5-субстратом (Рис. 6Б). Эти данные хорошо коррелируют с ранее опубликованными данными по связыванию ингибитора данного класса и ДНК-субстрата с ИН (Pinskaya et al., 2004). Кроме того, они являются подтверждением того, что субстрат и ингибитор связываются в разных сайтах ИН.

Нами также впервые было обнаружено, что в присутствии LEDGF активность соединения 11-D-E существенно возрастает. Это указывает на его потенциальную активность как ингибитора репликации ВИЧ, которая подтверждается предварительными испытаниями, проведенными д-ром Мириам Витвру из Каталического университета г.

Левена (Бельгия) на лимфобластоидных клетках MT-4, зараженных ВИЧ-1.

Проведенные исследования показали, что c использованием разработанной системы подходов можно проводить достоверную характеристику ингибиторов ИН с совершенно различными механизмами действия. Совокупность предложенных подходов была использована для поиска и характеристики новых ингибиторов ИН ВИЧ-1.

3. Поиск и характеристика низкомолекулярных ингибиторов интегразы В рамках выполнения проекта МНТЦ, в Институте биомедицинской химии им. В.Н.

Ореховича РАМН с использованием программы PASS была проведена выборка из баз данных органических соединений веществ, потенциально активных в качестве ингибиторов ИН ВИЧ-1. Нашей задачей являлась проверка анти-интегразной активности синтезированных соединений, их структурно-функциональный анализ и изучение механизма действия веществ, проявивших наибольшую активность. На начальном этапе исследований было протестировано более 100 потенциально активных ингибиторов ИН.

Некоторая анти-интегразная активность была обнаружена для синтезированных в Институте органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН производных N-оксидов 2,1,3 бензоксадиазолов (бензофуроксанов) (Рис. 7). С целью поиска наиболее активных ингибиторов ИН было проведено структурно-функциональное исследование ингибиторов данного структурного класса, а также их аналогов – бензофуразанов (2,1,3 бензоксадиазолы) (Рис. 7).

3.1. Структурно-функциональный анализ производных бензофуроксанов и бензофуразанов 3.1.1. Бензофуроксаны и бензофуразаны В первую очередь было решено изучить влияние заместителей на способность соединений данного класса ингибировать реакцию переноса цепи (ПЦ). Был синтезирован незамещенный бензофуроксан (соединение 75), а также бензофуроксаны, имеющие различные заместители в 4, 5, 6 и 7 положениях. Оказалось, что соединения, не содержащие нитрогрупп, практически не подавляли каталитическую активность ИН. В связи с этим, мы сосредоточились на исследовании нитробензофуроксанов (НБФС) и нитробензофуразанов (НБФЗ).

3.1.2. 4-нитробензофуроксаны и -фуразаны В первую очередь была изучена анти-интегразная активность незамещенных 4 НБФС (76) и 4-НБФЗ (84). 4-НБФС 76 в отличие от бензофуроксана 75 оказался способен ингибировать перенос цепи с IC50 порядка 80 мкМ.

4-нитробензофуразан 84 также оказался активен и n=0 : Бензофуразаны N 5 n=1 : Бензофуроксаны проявил ингибирующую активность порядка 30- O 6 8 N мкМ.

(O)n Была изучена ингибирующая активность ряда Рис. 7. Структуры бензофуразана и производных 4-НБФС и 4-НБФЗ. Оказалось, что все бензофуроксана.

они являются ингибиторами ИН, причем были выявлены следующие закономерности:

- 4-НБФС и 4-НБФЗ с аналогичными заместителями, как правило, ингибируют ИН с близкой эффективностью, независимо от положения заместителя;

- наиболее активными являются соединения, содержащие метильную группу в 5-м и/или 7 м положениях, соединение 74 (7-метил-4-нитробензофуроксан) подавляло ИН с IC50(ПЦ)=0.4 мкМ;

- электороноакцепторные заместители, как правило, увеличивают ингибирующую активность 4-НБФС и 4-НБФЗ, а электоронодонорные – нет, исключением являются метильные группы.

3.1.3. 6-нитробензофуроксаны и 5-нитробензофуразаны Была изучена анти-интегразная активность некоторых 6-НБФС и 5-НБФЗ.

Оказалось, что незамещенные 6-НБФС (92, IC50(ПЦ)=5 мкМ) и 5-НБФЗ (109, IC50(ПЦ)= мкМ) значительно лучше ингибируют интегразу, чем незамещенные 4-НБФС и 4-НБФЗ (сравн. 76 и 92, 84 и 109). Однако в отличие от 4-НБФС, введение заместителей в 6-НБФС не только не улучшало его ингибирующую активность, а даже ухудшало ее.

3.1.4. 4,6-динитробензофуроксаны Незамещенный диНБФС (77, IC50(ПЦ)=500 мкМ) оказался менее активен, чем соответствующий 4-НБФС (76). Этот факт согласуется с данными литературы по ингибированию биосинтеза нуклеиновых кислот в культуре клеток. Наличие заместителей в структуре диНБФС значительно увеличивало их ингибирующую активность. Соединение 118, содержащее бром-метильный заместитель в 7-м положении, и соединение 132, содержащее метильный заместитель, были практически на 2 порядка активнее незамещенного диНБФС. Таким образом, по структурно-функциональным закономерностям диНБФС близки к 4-НБФС, но менее активны.

Поскольку нам удалось открыть ранее неописанный структурный класс ингибиторов ИН, мы решили детально изучить механизм действия найденных ингибиторов. В качестве объектов исследования были отобраны 8 соединений (Рис. 8). Были выбраны наиболее активные ингибиторы 74 (7-метил-4-нитробензофуроксан) и 109 (5-нитробензофуразан).

Для изучения влияния заместителя на механизм действия ингибиторов были выбраны соединения 49 (метил[(4-нитробензофуроксан-7-ил)амино]ацетат), 130 (4-нитро-7 (фенилтио)-бензофуразан) и 118 (7-(бромометил)-4,6-динитрофуроксан). Также были отобраны проявившие анти-интегразную активность нитросодержащие соединения, не относящиеся к классам бензофуроксанов и бензофуразанов, 103 (4-азидо-3-хлор-2-(4 хлорфенил-)-6-нитро-1-бензотиофен), 107 (3,7,8-тринитропиразол-[5,1-с][1,2,4]триазин-4 амин) и 112 (2-амино-5,7-динитрохинолин-3-карбонитрил 1-оксид).

3. 2. Определение механизма действия выбранных ингибиторов 3.2.1. Ингибирование 3’-процессинга и переноса цепи, катализируемых ИН и комплексом ИН/LEDGF В соответствии с предложенной схемой исследования, на этапе I была детально оценена способность веществ ингибировать каталитическую активность ИН в реакциях 3’ концевого процессинга и переноса цепи. Были определены значения IC50 веществ для обеих реакций, из которых следовало, что большинство соединений ингибирует 3’ процессинг с той же эффективностью, что и перенос цепи (Табл. 3, Колонки 1 и 4). Таким образом, выбранные соединения относятся к ингибиторам 3’-процессинга или к аллостерическим ингибиторам ИН. Также было установлено, что в присутствие LEDGF/p75 ингибирующее действие веществ, как правило, несколько улучшается (Табл. 3, Колонки 2 и 5). Некоторое улучшение ингибирующей активности веществ по отношению к комплексу ИН/LEDGF указывает на то, что данные соединения могут проявлять активность по отношению к прединтеграционному комплексу.

3.2.2. Влияние ингибиторов на ДНК-связывающую активность ИН В соответствии с разработанной схемой, далее было решено перейти к этапу II-Б.

Действие ингибиторов на связывание ДНК было изучено с использованием метода торможения в геле. Оказалось, что практически все исследуемые соединения в гораздо меньшей степени влияют на суммарное связывание ДНК интегразой, чем на 3’-процессинг (Табл. 3, Колонка 7). Этот факт позволил предположить, что ингибиторы взаимодействуют с каталитическим доменом ИН N O 2N O 2N NO N N N N O2N Cl O O N N N N N NO O 2N O O O H2N H3C H3C S O 49 74 103 NO O2N NO N N O 2N CN N O O O N N O 2N N O2N N NH SO O O Br O 109 112 118 Рис. 8. Структуры ингибиторов интегразы из классов нитробензофуроксанов, нитробензофуразанов и других нитросодержащих соединений, выбранных для характеристики их механизма действия.

Табл. 3. Ингибирование НБФС, НБФЗ и другими нитросоединениями каталитической активности ИН ВИЧ-1 в реакциях 3’-процессинга и переноса цепи, влияние ингибиторов на ДНК-связывающую активность ИН и связывание ДНК в активном центре ИН.

IC50*, мкМ 3’-процессинг Перенос цепи Связ. ДНК № Связ.

в акт.

ИН ИН/LEDGF ИН ИН ИН/LEDGF ИН ИН с ДНК соед.

центре ИН Mg2+ Mn2+ Mg2+ Mn2+ 1 2 3 4 5 6 7 50±10 20±5 35±10 80±30 40±15 70±20 500±100 90± 0.5±0.2 0.4±0.1 0.5±0.1 0.4±0.2 0.5±0.1 10±2 0.6±0. 74 0.5±0. 30±5 10±3 20±5 35±5 10±1 30±5 500±100 40± 50±10 20±5 40±10 50±20 40±10 45±15 300±50 65± 0.5±0.1 3±1 1.0±0.2 5±2 3±1 4±1 45±10 1.0±0. 4±1 3±0.5 3±1 4±1 5±1 4±1 25±5 6± 6±2 3.0±0.5 5±2 2.0±0.5 4.0±0.5 5±2 25±8 6± 20±5 15±5 20±5 15±5 20±5 25±5 40±10 20± * все значения являются усредненными результатами не менее чем 3-х экспериментов 3.2.3. Влияние ингибиторов на правильную укладку ДНК в активном центре ИН Далее было исследовано влияние веществ на специфическое связывание ДНК в активном центре ИН (Этап III-А). Значения IC50 для этих веществ при подавлении ковалентного связывания ДНК в активном центре фермента совпадали с полученными для катализа (Табл. 3, Колонка 8). Этот результат указывает на то, что ингибиторы взаимодействуют с активным центром ИН и препятствуют правильной укладке в нем ДНК-субстрата. При этом связывание ингибиторов не приводит к таким изменениям структуры ИН, которые могли бы полностью блокировать ее ДНК-связывающую активность.

3.2.4. Взаимодействие ингибиторов с ионом металла в активном центре ИН Основываясь на предположении, что ингибиторы связываются в активном центре фермента, было решено выяснить, взаимодействуют ли данные вещества с ионами металла-кофактора, которые связаны в активном центре ИН и необходимы ей для осуществления процессинга (Этап IV-А). Оказалось, что ингибиторы не взаимодействуют с ионом металла, поскольку тип металла не оказывает влияния на эффективность ингибирования (Табл. 3, Колонки 1 и 3, 4 и 6).

3.2.5. Действие ингибиторов на каталитическую активность ИН в условиях пресформированного комплекса Дополнительно было решено выяснить, способны ли ингибиторы влиять на каталитическую активность ИН, уже связавшую субстрат. Необходимость этого эксперимента обусловлена тем, что при осуществлении интеграции ИН постоянно остается связанной с вирусной ДНК. Для этого эксперимента было выбрано соединение 74, как одно из наиболее активных. Ингибитор оказался столь же активным по отношению к ИН, предварительно связанной с ДНК-субстратом, как и в условиях, когда ингибитор, ИН и ДНК инкубировались совместно (IC50 = 0.5±0.2 мкМ). Таким образом, ингибитор оказался способен действовать на ИН, связавшую субстрат, поэтому целесообразно было изучить его влияние на клетки, зараженные ВИЧ-1.

В рамках проекта МНТЦ нашими коллегами из Национального института рака г.

Фредерик (США) было изучено действие некоторых веществ на МТ-4 клетки, зараженные ВИЧ. К сожалению, наиболее активные in vitro соединения 74 и 109 подавляли репликацию ВИЧ-1 при тех же концентрациях, при которых проявлялась их цитотоксичность для клеток. Только для соединений 49 и 118 ингибирующее действие проявилось при более низких концентрациях, чем цитотоксичность. Однако индекс селективности (отношение цитотоксичности к величине терапевтического эффекта), показанный этими соединениями, оказался не слишком высок.

Таким образом, был обнаружен новый класс ингибиторов ИН – нитробензофуроксаны и нитробензофуразаны. С использованием разработанного подхода был охарактеризован их механизм действия: они оказались ингибиторами 3’-процессинга, которые взаимодействуют с каталитическим центром ИН и препятствуют связыванию в нем U5-субстрата, но при этом они не взаимодействуют с ионом металла-кофактора. В дальнейшем планируется провести дополнительный синтез производных нитробензофуроксанов и –фуразанов, а также структурно-функциональное исследование новых веществ для улучшения их ингибирующей активности и снижения цитотоксичности.

4. Ингибирование интегразы димерными бисбензимидазолами Одной из возможных стратегий ингибирования интеграции является разработка соединений, которые специфично связываются с вирусной ДНК и препятствуют ее расщеплению ИН. В рамках этой стратегии, нашими коллегами из Института молекулярной биологии имени В.А. Энгельгардта РАН методами компьютерного моделирования были сконструированы лиганды малой бороздки ДНК, специфично взаимодействующие с А/Т-последовательностями, - димерные бисбензимидазолы (DBBI), которые отличались между собой длиной и структурой линкера, соединяющего пары 2,6 замещенных бензимидазольных фрагментов. Линкеры были созданы на основе олигометиленовой и триэтиленгликолевой цепочек (Рис. 9). Было установлено, что наиболее активно ингибирует ИН соединение, имеющее гептаметиленовый линкер, DBBI(7). Соединение с более коротким пентаметиленовым линкером подавляло 3’ процессинг в 3 раза хуже. Наименьшую активность в серии проявляли соединения с наиболее длинным, но гидрофильным триэтиленгликолевым линкером, DBBI(8). Было решено провести детальное исследование механизма действия DBBI(7) и DBBI(8) для того, чтобы выявить факторы, определяющие столь сильные различия их ингибирующей активности.

4.1. Изучение механизма действия DBBI 4.1.1. Влияние DBBI на 3’-процессинг и перенос цепи, катализируемые ИН и комплексом ИН/LEDGF В первую очередь была детально оценена способность димерных бисбензимидазолов DBBI(7) и DBBI(8) подавлять каталитическую активность ИН (Табл.

4). Оказалось, что ингибирующая активность DBBI(7) в обеих реакциях, по крайней мере, на два порядка превышает активность DBBI(8). Также оба соединения ингибировали перенос цепи несколько хуже, чем 3’-процессинг. Этот факт плохо соответствовал предполагаемому механизму ингибирования за счет экранирования ДНК от связывания с ИН. Кроме того, было установлено, что в присутствии LEDGF ингибирующее действие обоих DBВI несколько ухудшается, причем влияние LEDGF более выражено в случае DBBI(7) (Табл. 4).

4.1.2. Ингибирование DBBI ДНК-связывающей активности ИН В соответствии со схемой характеристики механизма действия ингибиторов ИН, была предпринята попытка изучить влияние DBBI на ДНК-связывающую активность ИН (Этап II-Б), используя метод торможения в геле. К сожалению, оценить влияние DBBI на ДНК-связывающую активность ИН не удалось, так как положительно заряженные молекулы DBBI препятствовали вхождению ДНК в гель. Поэтому при увеличении концентрации DBBI формально наблюдалась стабилизация комплекса ИН/ДНК, хотя этот Рис. 9. Структуры димерных бисбезимидазолов (DBBI).

Табл. 4. Ингибирование димерными бисбензимидазолами каталитической активности ИН ВИЧ-1 в реакциях 3’-процессинга и переноса цепи и влияние ингибиторов на связывание ДНК в активном центре ИН.

IC50*, мкМ Связывание Ингибирование 3’-процессинг Перенос цепи ДНК в 3’-процессинга в Ингибитор ИН/LEDG активном пресформ. компл.

ИН ИН/LEDGF ИН F центре ИН ИН/ДНК DBBI(7) 0.14±0.04 0.044±0.017 0.09±0.03 0.052±0.016 0.39±0. 0.033±0. DBBI(8) 10±2 14±3 16±6 23±8 26±6 * все значения являются усредненными результатами не менее чем 3-х экспериментов процесс маловероятен. Тем не менее, было решено продолжить изучение механизма действия ингибиторов по разработанной схеме и параллельно изучить влияние DBBI на правильную укладку ДНК в активном центре ИН (Этап III-А), и на активность пресформированного комплекс ИН/ДНК (Этап III-Б).

4.1.3. Влияние DBBI на правильную укладку ДНК в активном центре ИН Было установлено, что DBBI(7) препятствует связыванию ДНК-субстрата в активном центре фермента при концентрациях, сравнимых с теми при которых ингибируется интеграция, а DBBI(8) - при несколько более высоких концентрациях (Табл.

4). Таким образом, ингибирующее действие веществ, и в первую очередь DBBI(7), можно объяснить тем, что они препятствуют правильной укладке ДНК-субстрата в активном центре ИН. Это может быть следствием взаимодействия DBBI как с ДНК, так и с ИН.

4.1.4. Действие DBBI на каталитическую активность ИН в условиях пресформированного комплекса Была измерена ингибирующая активность DBBI в условиях, когда перед добавлением ингибитора осуществляли преинкубацию ИН с субстратом U5B/U5A.

Оказалось, что эффективность ингибирования снижалась, по крайней мере, на порядок по сравнению с условиями, когда DBBI, ИН и ДНК инкубировались совместно (Табл. 4). Это означало, что DBBI не способны ни вытеснять ДНК из уже сформированного комплекса ИН/ДНК, ни инактивировать ИН за счет изменения ее конформации.

4.1.5. Взаимодействие ингибиторов с ДНК-субстратом Известно, что димерные бисбензимидазолы обладают высоким сродством к А/Т последовательностям двухцепочечной ДНК. Соответственно, в рамках изучения механизма действия этих ингибиторов необходимо было оценить константы взаимодействия DBBI с дуплексом U5B/U5A в условиях проведения каталитической реакции.

Для характеристики этого взаимодействия использовался метод флуоресценции, т.к. интенсивность собственной флуоресценции DBBI увеличивается при связывании с ДНК. На основании данных по увеличению интенсивности флуоресценции DBBI (Рис. 10А и Б) в присутствии возрастающих концентраций ДНК были построены изотермы связывания и определены константы диссоциации комплексов DBBI с ДНК.

Значения Kd для комплексов субстрата U5B/U5A с DBBI(7) и с DBBI(8) были равны 270 ± 20 нМ и 140 ± 11 нМ, соответственно.

Значение константы диссоциации комплекса DBBI(7) с ДНК оказалось значительно выше, чем значение IC50 этого ингибитора для 3’-процессинга, а в случае DBBI(8), наоборот, константа диссоциации была намного ниже, чем IC50 (Табл. 4).

Рис. 10. Увеличение интенсивности флуоресценции 50 нМ DBBI(7) (А) и 50 Очевидно, что ингибирование интеграции ни нМ DBBI(8) (Б) в присутствии U5- одним из исследуемых соединений нельзя субстрата (концентрации ДНК в мкМ объяснить конкуренцией ингибитора и ИН за связывание с ДНК. В случае DBBI(7) ингибирование интеграции происходит при концентрациях, когда ингибитор еще не связан с ДНК-субстратом. DBBI(8) может связаться с ДНК, но либо это не препятствует связыванию ИН со своим ДНК-субстратом и его процессингу, либо ИН вытесняет ингибитор из его комплекса с ДНК и осуществляет процессинг субстрата.

Таким образом, используя разработанную систему подходов, удалось показать, что ингибирование интеграции DBBI осуществляется за счет взаимодействия этих ингибиторов с ИН, а не с ДНК. Ингибиторы препятствовали правильной укладке ДНК в активном центре ИН. Однако использованные методы не позволили определить, чем объясняется разница в эффективности ингибирования каталитической активности ИН DBBI(7) и DBBI(8). Было решено построить кинетические модели взаимодействия DBBI с ИН и определить тип ингибирования для этих соединений.

4.1.6. Построение кинетической модели взаимодействия ИН с ингибитором на основе зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата и ингибитора для определения KI Для определения типа ингибирования DBBI(7) были найдены зависимости начальной скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата при различных концентрациях ингибитора (Рис. 11А). На основании полученных данных предложена модель полного конкурентного ингибирования ферментативной активности. В соответствии с моделью были получены значения константы Михаэлиса Km = 9.5±2.9 нМ и константы ингибирования KI = 30±5 нМ.

Таким образом, DBBI(7) является конкурентным ингибитором ИН, причем ингибирующее действие DBBI(7) обусловлено именно взаимодействием с ИН, а не с ДНК.

Этот вывод хорошо согласуется с результатами изучения влияния ингибитора на правильную укладку ДНК в активном центре ИН. В условиях ферментативной реакции DBBI(7) конкурирует с U5 субстратом за связывание в активном центре ИН и именно поэтому эффективно подавляет ковалентное присоединение субстрата к ИН. Конкурентный механизм хорошо согласуется и с фактом 4-х кратного повышения IC50(DBBI(7)) для 3’ процессинга в присутствии LEDGF. Дело в том, что LEDGF также взаимодействует с каталитическим доменом ИН и, следовательно, он может препятствовать связыванию с ним DBBI(7).

Совсем другой вид приобретают эти зависимости, когда в качестве ингибитора используется DBBI(8) (Рис. 11Б). Вид кривых свидетельствует в пользу схемы неконкурентного ингибирования ИН, тем не менее, учитывая, что величина эффективной константы Михаэлиса не постоянна, можно предположить более сложной механизм ингибирования ферментативной активности. Очевидно, однако, что связывание Рис. 11. Зависимость начальной DBBI(8) вне активного центра ИН тем не менее скорости ферментативной реакции от концентрации субстрата при препятствует правильной укладке ДНК-субстрата в различных концентрациях DBBI(7) активном центре ИН. С учетом найденных ранее (А) и DBBI(8) (Б) в координатах величин была достоверно определена величина Лайнуивера-Берка. Концентрации ингибиторов (в мкМ) указаны на константы ингибирования KI = 4.7±0.6 мкМ. графике.

ВЫВОДЫ 1. Разработан набор подходов, позволяющий охарактеризовать механизм действия ингибиторов интегразы ВИЧ-1 in vitro.

2. Охарактеризован комплекс интегразы с ее клеточным кофактором LEDGF/p75;

установлено, что в присутствии LEDGF ускоряется связывание, увеличивается начальная скорость и эффективность 3’-процессинга 40-звенного ДНК-субстрата;

определено, что шестое положение непроцессируемой цепи субстрата сближено с остатком лизина интегразы.

3. Найден новый класс ингибиторов интегразы - нитробензофуроксаны/ нитробензофуразаны;

с использованием разработанных подходов изучен механизм их действия и показано, что они относятся к ингибиторам 3’-процессинга, связываются в активном центре фермента и препятствуют связыванию в нем ДНК- субстрата.

4. Показано, что димерные бисбензимидазолы, DBBI, способны ингибировать обе стадии интеграции, при этом эффективность ингибирования существенно зависит от природы линкера, соединяющего остатки бисбензимидазола. Установлено, что DBBI взаимодействуют с интегразой и препятствуют правильной укладке ДНК в ее активном центре;

на основании всех полученных результатов сделан вывод о том, что разная ингибирующая активность DBBI(7) и DBBI(8) обусловлена разным механизмом их действия: DBBI(7) является конкурентным ингибитором интегразы, в то время как для DBBI(8) предполагается скорее неконкурентный механизм ингибирования.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Smolov M., Gottikh M., Tashlitskii V., Korolev S., Demidyuk I., Brochon J.C., Mouscadet J.F., Deprez E. Kinetic study of the HIV-1 DNA 3'-end processing. Single-turnover property of integrase. // FEBS J., 2006, 273, 1137-1151.

2. Zhuse A.L., Gromyko A.V., Ivanov A.A., Salynov V.I., Popov K.V., Korolev S.P., Gottikh M.B., Oleynikov V.A., Streltsov S.A. New highly fluorescing bis-Hoechsts: physicochemical, biochemical and cytological studies. // J. Biomol. Struct. Dyn., 2007, 24(6), 666-668.

3. Громыко А.В., Салянов В.И., Стрельцов С.А., Олейников В.А., Королев С.П., Готтих М.Б., Жузе А.Л. Лиганды, специфичные к определенным последовательностям пар оснований ДНК. XIII. Новые димерные молекулы Хёхста 33258. Синтез, взаимодействие с ДНК, ингибирование интегразы ВИЧ-1. // Биоорган. Химия., 2007, 33(6), 613-623.

4. Michel F., Crucifix C., Granger F., Eiler S., Mouscadet J-F., Korolev S., Agapkina J., Ziganshin R., Gottikh M., Nazabal A., Emiliani S., Benarous R., Moras D., Schultz P., and Ruff M. (2009) Structural basis for HIV-1 DNA integration in the human genome, role of the LEDGF/р75 cofactor. // EMBO J., 2009, 28(7), 980-991.

5. Королев С.П. Изучение структуры комплекса интегразы ВИЧ-1 с ДНК методом аффинной модификации // Материалы Международной конференции молодых ученых по фундаментальным наукам "Ломоносов-2006", секция "Химия. Науки о живом", г.

Москва, 12-15 апреля 2006 года, том 2, стр. 26.

6. Agapkina Y., Korolev S., Aleksandrov D., Romanova E., Shevelev S., Poroikov V., Gottikh M. Study of the new HIV-1 integrase inhibitors mechanism of action using modified substrates // Abstracts of 32nd FEBS Congress – Molecular Machines, Vienna, Austria, 7-12 July, 2007, FEBS Journal 274 (s1), p. 239.

7. Прокофьев О.Н., Королев С.П., Агапкина Ю.Ю., Смолов М.А., Готтих М.Б. Изучение функциональной активности комплекса интегразы ВИЧ-1 с фактором транскрипции LEDGF/p75 // VI съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск, 11-15 мая 2008 года, стр. 85.

8. Королев С.П., Агапкина Ю.Ю., Готтих М.Б. Разработка подхода для изучения механизма действия ингибиторов интегразы вируса иммунодефицита человека // XVI Российский национальный конгресс “Человек и лекарство”, Москва, 6-10 апреля 2009 г., стр. 540.

9. Готтих М.Б., Королев С.П., Приказчикова Т.А., Агапкина Ю.Ю., Смолов М.А.

Нанокомплексы модифицированных олигонуклеотидов с транспортными пептидами – ингибиторы интеграции и репликации ВИЧ-1 // Научная конференция «Bionano’09.

Химическая биология, фундаментальные проблемы бионанотехнологии», Новосибирск, 10-14 июня 2009 г., стр. 19.

10. Sergei Korolev, Tatiana Prikazchikova, Julia Agapkina, Maksim Smolov, Marina Gottikh.

Short modified oligonucleotides as efficient allosteric inhibitors of HIV-1 integrase // Nucleic Acids at the Chemistry-Biology Interface, Manchester, UK, 7-8 September, 2009, p. 10.