Дизайн и синтез коротких пептидов с ноотропной и нейропротективной активностью
На правах рукописи
МОРОЗОВА АННА АНАТОЛЬЕВНА ДИЗАЙН И СИНТЕЗ КОРОТКИХ ПЕПТИДОВ С НООТРОПНОЙ И НЕЙРОПРОТЕКТИВНОЙ АКТИВНОСТЬЮ 02.00.10 – Биоорганическая химия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук
Москва – 2009 2
Работа выполнена в отделе химии Государственного учреждения научно исследовательского Института фармакологии имени В.В.Закусова Российской академии медицинских наук
Научный консультант: доктор биологических наук, профессор Гудашева Татьяна Александровна
Официальные оппоненты: доктор химических наук Филиппова Ирина Юрьевна доктор химических наук, профессор, член-корр. РАН Цетлин Виктор Ионович
Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной генетики РАН
Защита состоится 31 марта 2009 года. В 16 час. 00 мин. На заседании Cовета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском Государственном Университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 199991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 40, МГУ, Лабораторный корпус “А”, аудитория
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова
Автореферат разослан ………………….. 2009 года Учёный секретарь Cовета кандидат химических наук И.Г.Смирнова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы В настоящее время физиологически активные пептиды рассматриваются как “лекарства будущего”. Наряду с богатым спектром фармакологических свойств, этот класс соединений обладает такими важными преимуществами перед непептидными соединениями, как высокая активность, малая токсичность, невыраженность синдрома отмены и, как правило, мягкий модуляторный характер действия. На сегодняшний день имеется всего около 50 пептидных лекарственных препаратов. Использование биологически активных эндогенных пептидов в качестве лекарственных препаратов ограничено их низкой стабильностью в биологических средах и малой способностью проникать через гастро интестинальный и гемато-энцефалический барьеры (ГЭБ). Чтобы избежать этих недостатков, при создании пептидных лекарственных препаратов используют различные приемы. Для увеличения энзиматической стабильности в структуру пептида часто вводят остатки пролина и глицина, D-аминокислоты или неприродные аминокислотные остатки, модифицируют пептидную связь [Н.Ф.Мясоедов и соавт., 2006, 2007;
И.П.Ашмарин и др., 2003, 2005;
М.И.Титов и соавт., 1984, 1987;
Е.И.Чазов и соавт., 1984;
В.И.Дейгин и соавт., 2003]. Наиболее радикальным приемом является создание непептидных пептидомиметиков.
Для увеличения способности проникать через ГЭБ повышают липофильность пептида путем введения гидрофобных заместителей. Почти все эти подходы уменьшают описанные выше преимущества пептидных препаратов.
Принципиально другим подходом является использование коротких, преимущественно ди-тетрапептидов. Они, как правило, способны проникать через биологические барьеры как за счет пассивного, так и активного транспорта. Коротким пептидам присуща повышенная энзиматическая стабильность. Всё это позволяет в ряде случаев создавать на их основе перорально активные лекарственные препараты. В связи с важностью коротких физиологически активных пептидов как основы для создания нового поколения лекарственных веществ развитие новых подходов к их поиску представляется актуальным.
Для поиска коротких биологически активных пептидов широко используется определение биологически активных коротких фрагментов более длинных пептидов. В НИИ фармакологии им. В.В.Закусова РАМН применяется оригинальный подход, состоящий в конструировании коротких пептидов – топологических аналогов непептидных психотропных лекарств [Т.А.Гудашева и др., 1985;
T.A.Gudasheva et al., 1996, 1998;
Т.А.Гудашева и А.П.Сколдинов, 2003;
Р.У.Островская и др., 2000].
В данной работе развиваются такие подходы, как поиск новых дипептидов, генетически родственных известным активным пептидам, создание циклопептидных конформационных аналогов петлеобразных структур белков и N-ацилдипептидных миметиков -поворотных участков полипептидов.
В связи с высоким числом инсультов, сопровождающихся большим процентом смертности, для лечения и профилактики нейродегенеративных заболеваний необходимым является развитие лекарственных препаратов для их лечения, в первую очередь нейропротекторов (для уменьшения очага поражения) и ноотропов (для восстановления нарушенных когнитивных функций). Кроме того, нейропротективные и ноотропные препараты необходимы для лечения других нейродегенеративных заболеваний, таких как болезни Альцгеймера и Паркинсона. Арсенал таких лекарственных средств ограничен.
В качестве одного из прямых регуляторов процессов обучения и памяти рассматривается основной метаболит вазопрессина AVP[4-9]. В НИИ фармакологии им.
В.В.Закусова РАМН было показано, что наименьшим активным фрагментом AVP[4-9] является его N-концевой дипептид амид пироглутамиласпарагина. Получение новых активных аналогов этого дипептида может дать основу для создания новых ноотропных пептидных препаратов.
Важным эндогенным фактором, участвующим в противодействии нейродегенеративным заболеваниям, является фактор роста нервов (NGF), на основе которого ряд зарубежных фирм и университетов пытается создать современные нейропротективные средства [F.M.Longo et al., 1999, 2002, 2003;
H.U.Saragovi et al., 2000, 2002, 2004;
S.J.Pollack and S.J.Harper, 2002].
Поиск коротких пептидов, обладающих ноотропной и нейропротективной активностью, которые в дальнейшем могли бы стать базой для создания принципиально новых пептидных лекарственных препаратов, является актуальным.
Целью работы является дизайн и синтез новых коротких биологически активных пептидов, перспективных для создания лекарственных препаратов с ноотропной и нейропротективной активностью.
В соответствии с поставленной целью задачами исследования являлись:
1. Синтез дипептидов, соответствующих точечным мутантам дипептидного фрагмента AVP(4-5), и изучение взаимосвязи между видом точечной мутации и активностью дипептида;
2. Дизайн и синтез циклических тетра-, пента- и гексапептидов, содержащих трипептидный фрагмент -изгиба 4-й петли нейротрофина NGF;
3. Дизайн и синтез мономерных и димерных N-ацилдипептидных миметиков 4-й и 1-й петель NGF и изучение связи их структуры и активности.
Научная новизна исследования Впервые получены ноотропные дипептиды, соответствующие точечным мутантам амида пироглутамиласпарагина. Впервые синтезированы активные тетра-, пента- и гексапептидные циклические миметики 4-й петли NGF, содержащие трипептидный фрагмент нейротрофина. Показано, что для проявления биологической активности достаточно трех аминокислотных остатков -изгиба 4-й петли NGF в составе тетра гексапептидного циклоаналога. Впервые получена оригинальная группа мономерных и димерных N-ацилдипептидных миметиков NGF, обладающих агонистической и антагонистической активностью. Впервые показано, что миметики 4-й петли обладают селективной нейропротективной активностью, а миметики 1-й петли обладают как нейропротективной, так и дифференцирующей активностью.
Практическая значимость Получены оригинальные дипептиды с ноотропной активностью, которые могут стать основой для создания новых пептидных ноотропных препаратов. Разработан метод синтеза диастереомерно чистых тетра-гексапептидных циклоаналогов NGF, обладающих антагонистической активностью, которые могут быть полезны для создания средств лечения нейротрофин-зависимых новообразований. Получена новая группа низкомолекулярных димерных N-ацилдипептидных миметиков NGF с высокой нейропротективной активностью, на основе которых могут быть созданы препараты для лечения нейродегенеративных заболеваний, таких как болезни Альцгеймера, Паркинсона, инсульты.
Апробация работы Результаты работы докладывались на Всероссийской конференции, посвященной 110-летию Героя Социалистического Труда, лауреата Ленинской и Государственной премий СССР, академика АМН СССР С.В.Аничкова “Психофармакология и биологическая наркология” (Москва, Россия, 2002), на 8-й Региональной конференции Европейской Коллегии Нейропсихофармакологии (Москва, Россия, 2005), на 4-й Международной конференции “Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам” (Москва, Россия, 2006), на III-м Съезде Фармакологов России “Фармакология – практическому здравоохранению” (Санкт-Петербург, Россия, 2007), на 30-м Европейском пептидном симпозиуме (Хельсинки, Финляндия, 2008).
Публикации По результатам работы опубликовано 5 научных статей и 7 тезисов докладов на научных конференциях.
Структура и объём диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы. Работа изложена на 162 страницах машинописного текста, содержит 18 таблиц, 3 схемы и 38 рисунков. Библиографический указатель включает 188 наименований.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Синтез дипептидов, соответствующих точечным мутантам AVP(4-5), и изучение взаимосвязи между видом точечной мутации и активностью дипептида В НИИ фармакологии им. В.В.Закусова РАМН ранее был сконструирован суперактивный дипептидный аналог пирацетама, амид пироглутамиласпарагина [Т.А.Гудашева и др., 1995], который совпал с N-концевым фрагментом основного метаболита вазопрессина AVP(4-9). Этот эндогенный гексапептид в настоящее время рассматривается как один из основных регуляторов процессов обучения и памяти. Он входит в состав вазопрессинового семейства мнемотропных пептидов, включающего также AVP(4-8), AVP(5-9) и AVP(5-8) [D. de Wied, 1980;
G.L.Kovacs and D. de Wied, 1994].
Мы предположили, что, наряду с вазопрессиновым семейством, может существовать генетически родственное ему семейство других нейропептидов, регулирующих обучение и память. Это гипотетическое семейство может отличаться от вазопрессинового заменами в аминокислотной последовательности, вызванными точечными мутациями соответствующего гена. В случае пироглутамилсодержащих дипептидов, родственных N концевому фрагменту AVP(4-9), число вариантов таких мутаций невелико, что допускает прямую экспериментальную проверку. Мы рассматривали только гипотетические мутации по триплету, соответствующему второму аминокислотному остатку, замены по которому (на глицин и небелковые аминокислоты), как было показано [Т.А.Гудашева и А.П.Сколдинов, 2003] при изучении структурно-функциональных отношений в группе аналогов этого дипептида, возможны без потери ноотропной активности.
AVP кодируется следующим участком ДНК:
Cys Tyr Phe Gln Asn Cys Pro Arg Gly TGC TAC TTC CAG AAC TGC CCG AGG GGC Остаток Asn кодируется нуклеотидной последовательностью AAC. Хорошо известно, что при точечных мутациях чаще встречается замена одного пиримидинового основания на другое (С на Т или Т на С), или пуринового основания на другое пуриновое основание (А на G или G на А). Такие замены называются транзицией. Трансверсия, замена пуринового основания на пиримидиновое или пиримидинового на пуриновое, встречается гораздо реже.
Как видно из таблицы 1, для амида пироглутамиласпарагина существует только 2 варианта транзиций по кодону второго аминокислотного остатка и 5 вариантов трансверсий.
Таблица 1. Возможные замены 2-ого аминокислотного остатка в дипептиде pGlu-Asn-NH2, вызванные точечными мутациями Синтезированный Тип мутации Кодон АК.О. Боковой радикал дипептид CH2CONH ААС Asn pGlu-Asn-NH Транзиция CH2COO GAC Asp pGlu-Asp-NH по 1-му основанию (A-G) Транзиция CH2OH AGC Ser pGlu-Ser-NH по 2-му основанию (A-G) CH Трансверсия САС His pGlu-His-NH N NH по 1-му основанию (А-С) Трансверсия ТАС Tyr pGlu-Tyr-NH СН 2 OH по 1-му основанию (A-T) CH2CH Трансверсия CH АТС Ile по 2-му основанию (A-T) CH CH CH Трансверсия АСС Thr по 2-му основанию (A-C) OH Трансверсия по 3-му ААА (CH2)4NH Lys основанию (С-А(G)) ААG Дипептиды, которые при этом получаются, построены не из структурно близких аминокислотных остатков, как при традиционном методе конструирования функционально близких пептидов, а из генетически близких аминокислотных остатков, которые могут значительно отличаться по структуре. Например, аспарагиновая кислота, в отличие от аспарагина, несет отрицательный заряд. Для исследования мы использовали все варианты транзиций и, для сравнения, два варианта трансверсий. Нами были синтезированы дипептиды pGlu-Asp-NH2, pGlu-His-NH2, pGlu-Tyr-NH2 и все диастереомеры pGlu-Ser-NH2.
pGlu-Asp-NH2 был получен конденсацией сукцинимидного эфира пироглутаминовой кислоты и натриевой соли амида аспарагиновой кислоты с общим выходом 40%:
1 ) H -A s p (O N a )-N H 2 /D M F H O -S u, D C C p G lu -A s p -N H p G lu -O S u p G lu -O H диоксан 2 ) 1 0 % H 2S O pGlu-His-NH2, pGlu-Tyr-NH2 и все диастереомеры pGlu-Ser-NH2 были получены методом активированных эфиров, исходя из пентахлорфенилового эфира пироглутаминовой кислоты и метиловых или этиловых эфиров соответствующих аминокислот с последующим аммонолизом. После очистки колоночной хроматографией выходы составили 64-82%.
NH Pcp-OH, DCC Y-AA-OAlk x HCl X-pGlu-Y-AA-OAlk X-pGlu-Y-AA-NH X-pGlu-OPcp TEA(NEM), DMF X-pGlu-OH THF, 0oC CH3OH TEA - триэтиламин, NEM - N-этилморфолин Alk = CH3, C2H AA=Ser, His, Tyr X, Y = L или D Для улучшения транспорта дипептидов через гематоэнцефалический барьер были синтезированы трет-бутиловые эфиры pGlu-Asp(OBut)-OBut и pGlu-Ser(OBut)-OBut из пентахлорфенилового эфира пироглутаминовой кислоты и соответствующих трет бутиловых эфиров аминокислот.
Структура дипептидов была подтверждена данными 1Н-ЯМР-спектроскопии и элементным анализом, все соединения охарактеризованы физико-химическими константами (табл. 2). Диастереомерная чистота дипептидов по данным 1Н-ЯМР была не ниже 95%.
Для изучения влияния соединений на процессы обучения и памяти была использована модель постконвульсионной ретроградной амнезии условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ) с электросудорожным шоком (ЭСШ) в качестве амнезирующего агента на белых беспородных крысах-самцах [R.Ader et al., 1972]. Тест основан на норковом рефлексе животного и позволяет определить ноотропную активность по величине таких показателей, как время пребывания животного в светлой или темной камере.
Из таблицы 2 видно, что дипептиды, полученные путем транзиции, pGlu-Asp-NH2 и pGlu-Ser-NH2, обладают ноотропной активностью в тесте УРПИ, тогда как дипептиды pGlu His-NH2 и pGlu-Tyr-NH2, полученные путем трансверсии, неактивны. Интересно, что активен pGlu-Asp-NH2, несущий отрицательный заряд, в отличие от исходного pGlu-Asn NH2. Введение гидрофобной трет-бутильной группы в боковой радикал аспарагиновой кислоты и в С-концевое положение вместо амидной группы pGlu-Asp-NH2 приводит к увеличению активности этого дипептида. В то же время в случае незаряженного серин содержащего дипептида две трет-бутильные группы почти не оказывали влияния на активность. Данные по ноотропной активности диастереомеров pGlu-Ser-NH2 показывают, что эффект является стереоселективным и зависит от конфигурации первого аминокислотного остатка и не зависит от конфигурации -углеродного атома серина, поскольку ноотропной активностью обладали LL, LD изомеры, в то время как DD, DL изомеры были неактивны.
Последовательность Gln-Asp встречается в 10 нейропептидах, в том числе в динорфине В. Последовательность Gln-Ser встречается в 13 нейропептидах, в том числе в бета-эндорфине, кортистатине-29 и пептиде, родственном тахикинину I (Uru-TK I) [http://erop.inbi.ras.ru]. При процессинге некоторые из них могут образовывать соответствующие пироглутамилсодержащие дипептиды.
Таким образом, нам удалось расширить группу ноотропных дипептидов на основе пироглутаминовой кислоты.
Таблица 2. Физико-химические свойства и ноотропная активность пироглутамилсодержащих дипептидов ТСХ, Rf б) Ноотропная []20D, град Т. пл., °С № Дипептид * в) # Ж активность, % Е 215 a) 1 L-pGlu-L-Asn-NH2 –16,1 (с 1,0;
вода) 0,28 0,34 +57* 2 L-pGlu-L-Asp-NH2 187 –21,4 (с 0,5;
вода-метанол, 1:1) 0,30 0,39 +19* 3 L-pGlu-L-Ser-NH2 176-178 –7,9 (с 0,5;
метанол) 0,52 0,26 +20* 4 L-pGlu-D-Ser-NH2 165-167 +5,0 (с 0,5;
метанол) 0,52 0,26 +31* 5 D-pGlu-L-Ser-NH2 162-165 –5,4 (с 0,5;
метанол) 0,52 0,26 - 6 D-pGlu-D-Ser-NH2 176-177 +7,4 (с 0,5;
метанол) 0,52 0,26 a) 7 L-pGlu-L-His-NH2 213 +2,6 (с 0,5;
этанол) 0,22 0,17 + 8 L-pGlu-L-Tyr-NH2 207-210 +2,0 (с 1,0;
метанол) 0,67 0,52 0,50 0, t t 9 L-pGlu-L-Asp(OBu )-OBu масло –11,2 (с 1,0;
этанол) +46* 0,31 0, t t 10 L-pGlu-L-Ser(OBu )-OBu 103 –1,7 (с 1,0;
этанол) +22* Примечания: а) с разложением;
б) система Е – диоксан-вода, 10:1, система Ж – бутанол-уксусная кислота вода, 4:1:1;
в) активность рассчитывалась по формуле: А=(ТЭСШ+вещество – ТЭСШ+NaCl)/(ТNaCl – ТЭСШ+NaCl)100%, где ТЭСШ+NaCl - среднее время пребывания в светлой камере животных, получивших 0,9% раствор NaCl и подвергнутых ЭСШ 24 часа назад, ТЭСШ+вещество - среднее время пребывания в светлой камере животных, получивших вещество и ЭСШ, ТNaCl - среднее время пребывания в светлой камере животных, получивших 0,9% раствор NaCl и ложный ЭСШ. Доза 0,1 мг/кг внутрибрюшинно, * р 0,05 статистическая достоверность отличия от контроля по Манн-Уитни (Mann-Whitney U-тест).
2. Дизайн и синтез биологически активных циклических тетра-, пента- и гексапептидов, содержащих трипептидный фрагмент -изгиба 4-й петли NGF 2.1. Дизайн Нашей задачей являлось синтезировать циклопептидные аналоги фактора роста нервов (NGF) (рис. 1), содержащие только 3 аминокислотных остатка из последовательности 4-й петли для выяснения его наиболее короткого активного фрагмента. NGF относится к семейству нейротрофинов, взаимодействует с рецепторами TrkA и р75, участвует в дифференцировке нейронов, усиливает рост дендритов и увеличивает выживаемость определенных видов нейронов в центральной и в периферической нервных системах.
В качестве объекта моделирования был выбран -изгиб 4-й петли NGF, образованный остатками 93–96:
-Asp-Glu-Lys-Gln-. Этот участок наиболее экспонирован наружу, что делает его предположительно более доступным для взаимодействия с рецептором. Молекулярное моделирование с использованием программы HyperChem показало, что конформация -изгиба 4-й петли подобна конформации 4-членного модельного циклопептида cyclo(-Asp-Glu-Lys-Gly-) (рис. 2).
_ # Эксперименты in vivo были проведены в лаб. психофармакологии (зав. лаб. проф.
Т.А.Воронина) д. б. н., вед. н. с. С.С.Трофимовым.
2 петля 43- 4 петля 91- 1 петля 28- 3 петля 59- Рис. 1. Структура NGF по данным РСА Рис. 2. Совмещение тетрапептидного участка (файл 1btg из Брукхавенской базы данных 93–95 4-й петли NGF (из данных РСА) и http://www.rcsb.org/pdb) теоретической модели cyclo(-Asp-Glu-Lys-Gly-) (красный цвет) В его состав были включены аминокислотные остатки, относящиеся к центральному дипептидному фрагменту -изгиба, и предшествующий ему остаток аспарагиновой кислоты – для того, чтобы выяснить их роль в активности NGF. В качестве четвертого остатка вместо Gln96 (для исключения влияния его бокового радикала, поскольку значение этого остатка для активности NGF известно [K.Kallander et al., 1997]) мы взяли глицин.
Циклопептиды более устойчивы к протеолизу, чем линейные пептиды, так как не распознаются экзопептидазами. Отсутствие заряженных концевых групп облегчает их транспорт через клеточные мембраны и приводит к лучшему биоаккумулированию. Эти свойства дают значительные преимущества циклопептидам с точки зрения терапевтического применения по сравнению с соответствующими линейными аналогами.
Для более детального изучения влияния конформации пептида на активность мы синтезировали еще два циклопептида-гомолога, содержащие ту же самую последовательность Asp-Glu-Lys и, соответственно, два и три остатка Gly.
2.2. Синтез Были синтезированы следующие циклические пептиды – миметики 4-й петли NGF:
cyclo(-Gly-Asp-Glu-Lys-) (VIII), cyclo(-Gly-Gly-Asp-Glu-Lys-) (IX) и cyclo(-Gly-Gly-Gly-Asp Glu-Lys-) (X).
Защищенные по боковым группам линейные предшественники H-Gly-Asp(OBut) Glu(OBut)-Lys(Boc)-OH (I), H-Gly-Gly-Asp(OBut)-Glu(OBut)-Lys(Boc)-OH (II), H-Gly-Gly Gly-Asp(OBut)-Glu(OBut)-Lys(Boc)-OH (III) были получены твердофазным методом.
R -ClTrt = Сl Resin Cl Схема 1. Блок-схема твердофазного пептидного синтеза линейных пептидов (I)–(III) В качестве твердофазного носителя использовали смолу, содержащую 2 хлортритильную якорную группу [K.Barlos et al., 1989], модифицированную Вос-лизином.
Высококислотолабильные 2-хлортритиловые эфиры могут быть селективно расщеплены 0,5% TFA/CH2Cl2, что должно было позволить нам получить защищенные по боковым цепям линейные пептиды, пригодные для последующей циклизации. Ступенчатое наращивание полипептидной цепи проводили, начиная от С-концевого остатка. Пептидный синтез выполняли в стеклянном реакционном сосуде Меррифилда в ручном варианте. Для синтеза была применена стандартная Fmoc/But-стратегия с использованием коммерчески доступных Fmoc-АА(But/Вос)-ОН (схема 1).
N-концевая Fmoc-защитная группа легко отщеплялась 20% раствором пиперидина в DMF. Конденсацию проводили в растворе DMF с применением BOP реагента в случае синтеза гексапептида и PyBОР - в случае одновременного синтеза пента- и тетрапептидов.
Были применены 3-х кратные избытки карбоксильной компоненты в расчете на одну свободную аминогруппу. Полноту ацилирования на каждом шаге проверяли по нингидриновому тесту Кайзера, дополнительно проводили мониторинг хода синтеза, измеряя спектрофотометрически количество аддукта дибензофульвена с пиперидином в фильтрате после отщепления Fmoc-защиты.
Пептиды были отщеплены обработкой пептидилполимера 0,5% TFA/CH2Cl2 (2 мин). В этих мягких условиях были получены тетра-, пента- и гексапептиды (I)–(III) (схемa 2), аминокислотный состав которых соответствовал ожидаемому. Однако ТСХ и аналитическая ВЭЖХ показали, что в каждом случае продукт синтеза содержал примеси.
Очистку осуществляли с помощью ВЭЖХ на колонке Диасорб С16 9 мкм (рис. 3).
Lys(Boc)-OClt-Resin Твердофазный пептидный синтез Glyn-Asp(OBut)-Glu(OBut)-Lys(Boc)-OClt-Resin Отщепление от подложки Glyn-Asp(OBut)-Glu(OBut)-Lys(Boc) Glyn-Asp(OBut)-Glu(OBut)-Lys(Boc) Glyn-Asp(OBut)-Glu(OBut)-Lys Glyn-Asp(OBut)-Glu(OBut)-Lys Диастереомер 1 Диастереомер 2 Диастереомер 1 Диастереомер (III), (IIIг): n=3, (II): n=2, (I): n=1 (IIIa): n=3 (IIIб): n=3, (IIб): n=2 (IIIв): n= Циклизация Glyn-Asp(OBut)-Glu(OBut)-Lys(Boc) Glyn-Asp(OBut)-Glu(OBut)-Lys(Boc) Lys(Boc)-Glu(OBut)-Asp(OBut)-Glyn (VI): n=3, (V): n=2, (IV): n=1 (VII): n= Деблокирование 1М HCl в диоксане Glyn-Asp-Glu-Lys (X): n=3, (IX): n=2, (VIII): n= Схема 2. Общая схема синтеза циклических миметиков 4-й петли NGF (VIII)–(X) (IIIб), (IIIв) (IIIa), (III) a) 0 10 20 30 40 50 60 Time (min) б) (II) (IIб) 0 10 20 30 40 50 60 Time (min) (I) в) 10 Time (min) Рис. 3. ВЭЖХ-хроматограммы выделения линейных пептидов из смеси после отщепления от подложки обработкой 0,5% TFA/CH2Cl2 (2 30 мин): (III) – (а), (II) – (б) и (I) – (в) Н-ЯМР-анализ показал, что в спектрах примесных соединений отсутствует характерный триплетный сигнал протона NH-группы остатка Lys, а интенсивность сигналов в области 1,37–1,38 м.д. соответствует только двум But-группам. Это позволило сделать вывод, что побочные соединения (IIIб), (IIIв), (IIб), составляющие около 30% сырых продуктов синтеза 5- и 6-членных пептидов, образуются при отщеплении Вос защитных групп от остатка лизина. Причиной этого, вероятно, явилась большая продолжительность обработки 0,5% TFA/CH2Cl2 для полного удаления целевого пептида от смолы. В случае 4-членного пептида такой побочный продукт из-за малого содержания выделить не удалось. После очистки с помощью препаративной ВЭЖХ выход 6-, 5- и 4 членных линейных защищенных пептидов составлял 52, 56 и 87% соответственно.
Строение соединений (I)–(III), (IIIa)–(IIIв), (IIб) было подтверждено методом 1Н ЯМР-спектроскопии. В данных условиях гексапептид получался в виде двух форм в соотношении 3:2. Эти формы были идентифицированы как диастереомеры (III) и (IIIa), так как они имели одинаковые наборы сигналов в спектрах 1Н-ЯМР, соответствующие целевой структуре. Диастереомеры были легко различимы. Отличались не только химические сдвиги почти всех протонов, но и константы спин-спинового взаимодействия. А также диастереомеры имели близкие времена удерживания при ВЭЖХ (рис. 3). Очевидно, что возникновение второго изомера связано с неожиданно высокой степенью эпимеризации в ходе присоединения одного из аминокислотных остатков, предположительно аспарагиновой кислоты. Это явление может быть связано с использованием ВОР-реагента, поскольку в случае 4- и 5-членных пептидов для активации тех же аминокислот применялся PyBОР реагент и эпимеризации не наблюдалось.
Для получения диастереомерно чистого гексапептида был проведен синтез с использованием PyBОР в качестве конденсирующего реагента. Кроме того, была сделана попытка повысить выход целевого пептида за счет уменьшения количества соединений с частично снятой Вос-группой. Для решения этой задачи пептид отщепляли от полимерной подложки обработкой пептидилполимера смесью ледяной уксусной кислоты, 2,2,2 трифторэтанола в CH2Cl2 (2:2:6) в течение 30 мин. После очистки методом препаративной ВЭЖХ (рис. 4) выход гексапептида (IIIг) составил 88%. Совпадение данных ПМР спектров пептидов (IIIг) и (III), а также одинаковые физико-химические показатели (Rf, т. пл., []D25) указывают на их идентичность. На основании этого можно заключить, что пептид (III) целиком состоит из L-аминокислотных остатков.
5 10 15 Time (min) Рис. 4. ВЭЖХ-хроматограмма выделения линейного гексапептида (IIIг), полученного после обработки смесью ледяной уксусной кислоты, трифторэтанола в CH2Cl2 (2:2:6) 30 мин Таким образом, применение PyBОР-реагента исключило возможность эпимеризации и позволило получить диастереомерно чистый гексапептид (IIIг), который был использован для последующей циклизации, а применение уксусной кислоты для отщепления пептида от смолы привело к отсутствию образования побочного соединения, представляющего собой гексапептид со снятой Вос-группой с остатка лизина, и к большему выходу целевого продукта (88%).
Все выделенные в условиях ВЭЖХ индивидуальные соединения были охарактеризованы температурой плавления, удельным углом вращения, значениями хроматографической подвижности в различных системах растворителей (табл. 3).
Хорошо известно, что циклизация пептидов существенно облегчается, если линейный предшественник образует в растворе псевдоциклическую конформацию, стабилизированную внутримолекулярными водородными связями. Из температурной зависимости химических сдвигов протонов NH-групп пептидных связей в DMSO-d6 (табл.
Таблица 3. Физико-химические свойства линейных пептидов (I)–(III), (IIб), (IIIа-г) ТСХ, Rf * []20D, град Т. пл., °С Вещество Выход, % А Б I 87 182 –23,0 (c 0,1;
вода-этанол, 2:1) 0,90 0, II 56 178 –26,9 (с 0,16;
вода) 0,82 0, IIб 33 97-98 –30,0 (с 0,2;
вода) 0,62 0, III 32 184 –30,0 (с 0,1;
вода) 0,73 0, IIIa 20 185 –27,0 (с 0,1;
вода) 0,73 0, IIIб 16 101-102 –22,3 (с 0,2;
вода) 0,59 0, IIIв 14 100-101 –22,0 (с 0,2;
вода) 0,59 0, IIIг 88 184 –29,8 (с 0,1;
вода) 0,73 0, * система А – хлороформ-метанол-уксусная кислота-вода, 15:10:2:3;
система Б – н-бутанол-пиридин-уксусная кислота-вода, 15:10:3: Таблица 4. Разность химических сдвигов протонов NH-групп аминокислотных остатков линейных пептидов (I), (II), (IIIг) при температурах 18 и 60С (18° – 60°) в DMSO-d Пептиды Asp Glu Lys Gly1 Gly2 Gly Тетрапептид (I) 0,39 0,37 0,00 а) Пентапептид (II) 0,24 0,28 0,00 0,28 а) Гексапептид (IIIг) 0,19 0,11 0,00 0,16 0,20 а) Примечание: а) сигналы обмениваются с HDО.
4) видно, что сигналы протонов NH-группы остатка Lys практически не смещаются в сильное поле при повышении температуры, в отличие от сигналов NH-протонов остатков Asp, Glu и Gly. Это свидетельствует в пользу того, что в указанном растворителе в молекулах линейных пептидов (I)–(III) имеется внутримолекулярная водородная связь с участием NH-группы остатка Lys, что предполагает существование пептидных цепей в компактной псевдоциклической конформации.
Циклизацию линейных предшественников (I)–(III) для подавления межмолекулярных побочных реакций проводили согласно принципу разбавления Циглера при концентрациях пептида 10-3М в DMF. В качестве конденсирующих реагентов были выбраны ВОР, HBTU и DPPA (схема 2). Исходные соединения добавляли к раствору реагента и диизопропилэтиламина капельно в течение нескольких часов.
Ход реакций контролировался с помощью аналитической ВЭЖХ с использованием колонок Reprosil C18 3 мкм и Диасорб С16 7 мкм. Все циклические пептиды были выделены с помощью препаративной ВЭЖХ на колонке Диасорб С16 9 мкм. Продукты каждой реакции циклизации были проанализированы и охарактеризованы данными ТСХ в различных системах растворителей, удельным углом вращения и температурой плавления (табл. 5). Структура и диастереомерная чистота были подтверждены данными 1Н-ЯМР спектроскопии. Молекулярные массы защищенных циклопептидов были подтверждены методом масс-спектрометрии.
В ходе этой части работы были сделаны следующие наблюдения. С ВОР-реагентом конверсия исходных в циклические продукты (табл. 6) составляла от 70 до 90% для всех пептидов. С таким же выходом проходила циклизация 6-членного пептида с использованием HBTU. Выходы в присутствии более мягкого активирующего реагента DPPA составили 40–60%.
Таблица 6. Выходы защищенных циклопептидов (IV)–(VI), полученных в разных условиях Содержание Аналитическая ВЭЖХ (214 нм) Данные ЕSI-MS ТСХ, Rf * мономера по Метод Выход, % данным Соотношение Пептиды циклизации LD, LЕ, Найдено, ВЭЖХ и высот пиков [M + H]+ Вычислено, М В Г Д (мономер-димер) (мономер-димер) ЕSI-MS, % (мономер-димер) BOP 1: 92 12,00 и 12,20 11,25 и 11,27 756 и Циклогекса 1: 12,08 и 12,15 11,26 и 11,27 756 и 1511 755 0,55 0,36 0, пептид HBTU 74 (VI) 12,38 11,57 DPPA;
10–3М Циклопента- BOP 72 13,56 и 13,68 12,00 и 12,10 1:3 699 и 1397 698 0,62 0,52 0, пептид – (V) DPPA;
10 М 48 14,00 12,27 699 BOP 81 17,02 14,93 1283 Циклотетра DPPA;
10–3М 641 0,90 0,93 0, пептид 40 17,32 и 17,40 15,00 и 15,10 3:1 642 и 1283 (IV) DPPA;
10–4М 10 17,48 15,35 642 * система В - хлороформ-метанол-вода, 80:10:1;
система Г - хлороформ-этанол-уксусная кислота, 85:10:5;
система Д - хлористый метилен метанол, 10: Таблица 5. Физико-химические свойства защищенных мономерных циклопептидов []25D (с 0,1;
вода-этанол, 1:1), град Т. пл., °С Вещество Циклогексапептид (VI) 188 –30, Циклопентапептид (V) 213-214 –32, Циклотетрапептид (IV) а) а) Примечание: а) показатели не определяли ввиду получения малого количества вещества.
Продукт циклизации пептидов при использовании ВОР- и HBTU-реагентов, а в случае 4-членного пептида и DPPA, содержал, кроме мономерного, димерный циклопептид.
Димеры только незначительно отличались от мономеров по времени удерживания в условиях аналитической обращенно-фазовой ВЭЖХ и элюировались при препаративной ВЭЖХ одновременно с ними. Для идентификации мономеров и димеров использовался метод масс-спектрометрии. Их относительное количество в смеси определяли по данным аналитической ВЭЖХ (табл. 6). Степень димеризации зависела от природы активирующего реагента и размера цикла. Наибольшее количество димера давали ВОР- и HBTU-реагенты.
В случае ВОР-реагента димер был единственным продуктом реакции 4-членного пептида, тогда как 5- и 6-членные пептиды образовывали около 25% димера. DPPA, в отличие от этих реагентов, при той же концентрации пептидов приводил к чистым 5- и 6-членным мономерным циклопептидам, а в случае 4-членного пептида была получена смесь с содержанием мономерного циклопептида около 25%. При разбавлении до 10-4М с применением DPPA был получен 4-членный циклопептид без примеси димера. Выход при этом составил 10% (табл. 6). Попытка повысить выход реакции путем увеличения времени реакции до 50 суток при тех же условиях не привела к желаемому результату и выход реакции составил также 10%.
В спектрах 1Н-ЯМР защищенных циклических пептидов протоны всех аминокислотных остатков дают индивидуальные сигналы, параметры которых соответствуют литературным данным, причем отсутствие лишних сигналов в спектрах этих пептидов указывает на отсутствие диастереомерных примесей, а совпадение КССВ сигналов однотипных протонов и удельных углов вращения предполагает идентичность диастереомерного состава образцов циклопептида, синтезированных разными методами.
Деблокирование циклопептидов проводили в условиях одновременного удаления Вос t и Bu -групп путем обработки 4M HCl в диоксане. Структура полученных незащищенных циклопептидов была подтверждена данными 1Н-ЯМР-спектроскопии. Во всех спектрах отсутствовали сигналы, характерные для трет-бутильной группы. Молекулярные массы соединений подтверждены масс-спектрометрически. Соединения охарактеризованы физико-химическими константами (табл. 7).
Таблица 7. Физико-химические свойства целевых мономерных циклических пептидов Т. пл., Данные ЕSI-MS ТСХ (А), Вещество Найдено, [M + H]+ Вычислено, [M + H]+ °С Rf cyclo(-Gly-Asp-Glu-Lys-) (VIII) 196-198 0,06 430 cyclo(-Gly-Gly-Asp-Glu-Lys-) (IX) 184-186 0,08 487 cyclo(-Gly-Gly-Gly-Asp-Glu-Lys-) (X) 170-172 0,12 544 Таким образом, в настоящей работе получены новые низкомолекулярные миметики NGF, имитирующие -изгиб его 4-й петли и содержащие всего 3 аминокислотных остатка этой петли, в том числе два центральных остатка -изгиба и предшествующий им остаток Asp93, роль которых в проявлении нейропротективных свойств NGF до сих пор была мало изучена.
2.3. Биологическая активность циклических миметиков 4-й петли NGF Циклопептидные миметики 4-й петли NGF были исследованы на нейропротективную активность в концентрациях 10-5–10-8М на культуре иммортализованных клеток гиппокампа мыши линии НТ22#. Тетрапептид снижал жизнеспособность нейронов в концентрации 10- М, пентапептид и гексапептид – в концентрации 10-5М (данные МТТ-теста). Эти результаты свидетельствуют в пользу того, что для проявления нейропротективной активности миметиков, по-видимому, необходима димерная форма, как это известно для самого NGF.
Таким образом, показано, что для проявления биологической активности достаточно 3 х аминокислотных остатков -изгиба 4-й петли NGF в составе тетра-гексациклопептидного миметика.
3. Дизайн и синтез биологически активных N-ацилдипептидных миметиков 4-й и 1-й петель нейротрофина NGF 3.1. Дизайн N-ацилдипептидных миметиков 4-й и 1-й петель NGF Циклические миметики 4-й петли NGF показали антагонистическую активность и, косвенно, способность связываться с нейротрофиновыми рецепторами. Однако их синтез трудоемок, выходы невелики. С целью создания более технологичных пептидных миметиков NGF были сконструированы замещенные линейные дипептидные миметики петель NGF. Наиболее доступными для взаимодействия с нейротрофиновыми рецепторами являются петлеобразные участки, называемые 4-й (остатки 91-98) и 1-й (остатки 28-36) петлями. При конструировании выбирались остатки петель наиболее открытые для возможного взаимодействия с рецептором, то есть наиболее экспонированные в растворитель (рис. 5).
В случае 4-й петли был взят центральный дипептидный фрагмент -изгиба, -Glu94 Lys95-. Прилегающий аминокислотный остаток для упрощения молекулы и увеличения биологической стабильности заменялся на его биоизостер. Так, остаток Asp93 заменялся на сукцинильный радикал. Заряд на C-конце сконструированного миметика удалялся путем перевода в амид. Так был сконструирован миметик 4-й петли Suc-Glu-Lys-NH2.
В случае 1-й петли -изгиб (-Asp30-Ile31-Lys32-Gly33-) расположен относительно молекулы NGF так, что в растворитель более экспонированы боковые радикалы прилегающих к нему остатков (рис. 5). Взаимодействие же центральных остатков -изгиба с рецептором, особенно остатка Lys32, судя по данным рентгеноструктурного анализа, должно быть затруднено. Вследствие этого мы имитировали остатки 1-й петли, экспонированные в растворитель и близкие к -изгибу. Были сконструированы дипептидные миметики 1-й петли Ac-Lys-Glu-NH2 и Acа-Gly-Lys-NH2. В этих случаях остаток Gly33 был заменен на _ # Эксперименты in vitro были проведены в лаб. нейропротекции (зав. лаб. к. б. н.
Т.А.Антипова) Рис. 5. Расположение петель 1 и 4 в молекуле NGF по данным РСА (файл 1btg из Брукхавенской базы данных http://www.rcsb.org/pdb) биоизостер - ацетильный остаток, а остаток Lys32 – на остаток -аминокапроновой кислоты.
Заряд на C-конце удалялся также путем перевода в амид.
Поскольку есть данные, что нейротрофины взаимодействуют со своими рецепторами в гомодимерной форме, причем это взаимодействие необходимо для сближения двух рецепторов и их взаимного фосфорилирования, были сконструированы соответствующие димерные дипептидные миметики NGF, в которых мономерные участки были соединены спейсером по С-концу. В качестве спейсера, соединяющего дипептиды, брали гексаметилендиамин, его гомологи или его производные.
Были сконструированы и синтезированы следующие соединения:
94 Миметики 4-й петли (-Thr91-Thr92-Asp93-Glu -Lys -Gln96-Ala97-Ala98-) Мономерный Димерные ГК 1 Suc-Glu-Lys-NH2 ГК 2, ГК 2б-д (Suc-Glu-Lys-NH-)2(CH2)n, n = 2- ГК 2а (Suc-Glu-Lys-NН-(CH2)5-CO-NH-)2(CH2) 31 Миметики 1-й петли (-Ala28-Thr29-Asp30-Ile -Lys -Gly33-Lys34-Glu35-Val36-) Мономерные Димерные ГК 3 Ac-Lys-Glu-NH2 ГК 4 (Ac-Lys-Glu-NН-)2(СН2) ГК 5 Acа-Gly-Lys-NH2 ГК 6 (Аса-Gly-Lys-NH-)2(CH2) Примечания. Ас - ацетил, Suc - монозамещенный остаток янтарной кислоты, Аса - остаток -аминокапроновой кислоты. Жирным шрифтом выделен центральный участок -изгиба.
Подчеркиванием выделены аминокислотные остатки, вошедшие в дипептидные фрагменты миметиков NGF.
3.2. Синтез N-ацилдипептидных миметиков 4-й и 1-й петель нейротрофина NGF Дипептидные миметики NGF были синтезированы классическими методами пептидного синтеза в растворе. Конденсация осуществлялась методом активированных эфиров.
Для синтеза миметиков 4-й петли (рис. 6) использовали N-гидроксисукцинимидные производные. В случае мономера ГК1 проводили аммонолиз Z-Lys(Boc)-OSu и получали амид, а в случае димера ГК2 присоединяли гексаметилендиаминовый спейсер. После удаления Z-группы гидрогенолизом присоединяли Z-Glu(ОBut)-OSu. Полученные Z защищенные дипептиды снова подвергали гидрогенолизу и ацилировали янтарным ангидридом в DMF при комнатной температуре. Вос, But защитные группы снимали обработкой 4М HCl в диоксане. Для изучения влияния длины цепи спейсера на эффект были синтезированы гомологи ГК2б-д и соединение с более длинным спейсером ГК2а, для синтеза которых также был использован метод активированных сукцинимидных эфиров.
NH3 / DMF Z -Lys(B o c)-N H 1) H 2, 10% P d/C 2) Z -G lu(O B u t )-O S u Z -Lys(B o c)-O S u DMF C H 3O H H 2 N -(C H 2 ) 6 -N H 2 Z -Lys(B oc)-N H (C H 2 ) DMF Z -Lys(B o c)-N H Z -G lu(O B u t)-Lys(B o c)-N H 2 H O O C -C H 2 -C H 2 -C O -G lu (O B u t)-L ys(B oc)-N H 2) 1) H 2, 10% P d/C O O Z -G lu (O B u t)-L ys(B oc)-N H H O O C -C H 2 -C H 2 -C O -G lu(O B u t)-Lys(B o c)-N H O C H 3O H DMF (C H 2 ) 6 (C H 2 ) Z -G lu (O B u t )-L ys(B oc)-N H H O O C -C H 2 -C H 2 -C O -G lu(O B u t)-Lys(B o c)-N H H O O C -C H 2 -C H 2 -C O -G lu-Lys-N H 2 ГК 4 M H C l / диоксан H O O C -C H 2 -C H 2 -C O -G lu -Lys-N H ГК (C H 2 ) H O O C -C H 2 -C H 2 -C O -G lu -Lys-N H Рис. Для получения ГК3 (рис. 7) использовали п-нитрофениловые эфиры защищенных аминокислот. Аммонолиз Boc-Glu(OBzl)-ONр проводили выдерживанием соединения в растворе водного аммиака в среде DMF. После освобождения -аминогруппы действием TFA присоединяли Boc-Lys(Z)-ONp. Далее был введен остаток уксусной кислоты в виде п нитрофенилового эфира. Защитные Bzl, Z группы боковых функций удаляли гидрогенолизом в присутствии палладиевого катализатора. ГК4 получали аналогично ГК3, предварительно присоединив гексаметилендиаминовый спейсер (рис. 7).
NH3 / DMF В о с -G lu (O B z l)-N H 1) TFA 2 ) B o c -L y s (Z )-O N p B o c -G lu (O B z l)-O N p В о с -G lu (O B z l)-N H H 2 N -(C H 2 ) 6 -N H 2 TEA / DMF (C H 2 ) DMF В о с -G lu (O B z l)-N H В о с -L y s (Z )-G lu (O B z l)-N H 2 H 3 C -C O -L y s (Z )-G lu (O B z l)-N H 1) TFA 2 ) H 3 C -C O -O N p TEA / DMF В о с -L y s (Z )-G lu (O B z l)-N H H 3 C -C O -L y s (Z )-G lu (O B z l)-N H (C H 2 ) 6 (C H 2 ) В о с -L y s (Z )-G lu (O B z l)-N H H 3 C -C O -L y s (Z )-G lu (O B z l)-N H H 3 C -C O -L y s -G lu -N H 2 ГК H 2, 1 0 % P d /C H 3 C -C O -L y s -G lu -N H C H 3O H ГК (C H 2 ) H 3 C -C O -L y s -G lu -N H Рис. На первоначальном этапе синтеза ГК5 (рис. 8) Z-Lys(Boc)-OSu переводили в амид путем взаимодействия с аммиаком в среде DMF. Деблокирование -аминогруппы проводили гидрогенолизом в присутствии палладиевого катализатора и затем присоединяли Z-Gly-ONp. Полученный амид защищенного дипептида вновь подвергали гидрогенолизу и конденсировали с сукцинимидным эфиром Вос--аминокапроновой кислоты. Вос-защитные группы удаляли, растворяя полученное соединение в TFA. В случае ГК6 Z-Lys(Boc)-OSu конденсировали с 1,6-диаминогексаном и далее синтез осуществляли аналогичным путем.
NH3 / DMF Z -L ys(B oc)-N H 2 1) H 2, 10% P d/C 2) Z -G ly-O N p Z -L ys(B o c)-O S u DM F C H 3O H Z -L ys(B oc)-N H H 2 N -(C H 2 ) 6 -N H (C H 2 ) DMF Z -Lys(B o c)-N H Z -G ly-L ys(B oc)-N H 2 1) H 2, 10% P d/C 2) B oc-N H -(C H 2 ) 5 -C O O S u C H 3O H Z -G ly-L ys(B o c)-N H (C H 2 ) Z -G ly-L ys(B oc)-N H B o c-N H -(C H 2 ) 5 -C O -G ly-L ys(B oc)-N H 2 H 2 N -(C H 2 ) 5 -C O -G ly-L ys-N H 2 ГК TFA H 2 N -(C H 2 ) 5 -C O -G ly-L ys-N H B o c-N H -(C H 2 ) 5 -C O -G ly-L ys-N H ГК (C H 2 ) (C H 2 ) H 2 N -(C H 2 ) 5 -C O -G ly-L ys-N H B o c-N H -(C H 2 ) 5 -C O -G ly-L ys-N H Рис. Строение целевых соединений было подтверждено методом 1Н-ЯМР-спектроскопии и элементным анализом, вещества охарактеризованы значениями хроматографической подвижности и физико-химическими константами (табл. 8).
Таблица 8. Физико-химические свойства дипептидных миметиков NGF ТСХ, Rf []25D, град Т. пл., °С Вещество Выход, % А Б ГК 1 216 (с разложением) –37,0 (с 0,1;
вода) 0,50 0, 47,0 (с 0,1;
вода) ГК 2 0,41 0, 36 120- 30,0 (с 1,0;
вода) ГК 2а 118-121 0,41 0, 35,2 (с 0,5;
вода-метанол, 1:1) ГК 2б 0,41 0, 40 гигроскопичные кристаллы 33,3 (с 1,0;
вода) ГК 2в 0,41 0, 42 гигроскопичные кристаллы 35,2 (с 0,5;
вода-метанол, 1:1) ГК 2г 0,41 0, 41 гигроскопичные кристаллы 31,6 (с 0,5;
вода-метанол, 1:1) ГК 2д 0,41 0, 43 гигроскопичные кристаллы ГК 3 40 198-199 –32,3 (с 1,0;
вода) 0,43 0, ГК 4 63 205-206 –39,3 (с 1,0;
вода) 0,15 0, 7,8 (с 0,17;
вода) ГК 5 50-52 0,65 0, 129,6 (с 0,17;
вода) ГК 6 масло 0,50 0, 3.3. Изучение связи структуры и активности мономерных и димерных N ацилдипептидных миметиков 4-й и 1-й петель NGF 3.3.1. Изучение нейропротективных свойств пептидов in vitro Нейропротективные свойства синтезированных соединений определяли in vitro в условиях оксидативного стресса, вызванного перекисью водорода, на культуре иммортализованных клеток гиппокампа мыши линии НТ22 [Т.А.Зенина и др., 2007].
Вещества добавляли к культуре клеток за 24 часа до перекиси водорода. Жизнеспособность клеток определяли по тесту с МТТ красителем (окрашивание живых клеток бромидом 3 [4,5-диметилтиазол-2-ил]-2,5-дифенилтетразолия) [P.Maher and J.B.Davis, 1996]. Результаты определения нейропротективной активности N-ацилдипептидных аналогов NGF представлены в таблице 9 (в таблице приведен активный нижний порог исследованных концентраций).
Таблица 9. Нейропротективная активность N-ацилдипептидных миметиков NGF в условиях оксидативного стресса на культуре клеток НТ Активность*, % # Вещество Концентрация, М - ГК 1 –61* Примечания. Активность рассчитывалась по формуле:
- 94* А = (Dэксп – Dн2о2) / (Dконтр – Dн2о2) 100%, - ГК 2 196* где Dэксп - оптическая плотность раствора в опыте, - 36* Dн2о2 - оптическая плотность раствора активного - ГК 2а 52* контроля (Н2О2), - 103* 10 Dконтр - оптическая плотность раствора контроля - ГК 2б 112* 10 (без Н2О2), - 51* 10 *р 0,05 по t-тесту Стьюдента, - ГК 2г 43* 10 светопоглощение измеряли при =600 нм, - ГК 2д 33* [С] н2о2 конечная = 1,5 ммоль.
- ГК 5 24* - 54* - _ ГК 6 57* -8 # Эксперименты in vitro были проведены в лаб.
41* нейропротекции (зав. лаб. к. б. н. Т.А.Антипова) - NGF 37* Мономерный миметик 4-й петли ГК1, внесенный в концентрации 10-5М, снижал жизнеспособность нейронов. В то же время димер ГК2, внесенный в тех же условиях в концентрациях до 10-9М, увеличивал жизнеспособность клеток НТ22. Это подтверждает важность димерной структуры для проявления агонистической активности миметиков NGF.
Как удлинение (ГК2а), так и уменьшение длины спейсера (ГК2б-д) приводило к снижению активности. Так, удлинение спейсера в соединении ГК2а по сравнению со спейсером соединения ГК2 привело к уменьшению активной концентрации в 10000 раз. В ряду миметиков 1-й петли достоверной нейропротективной активностью обладал как мономерный дипептид ГК5, так и димер ГК6. Их дипептидный фрагмент включает аминокислотные остатки, приближенные к центру -изгиба, в отличие от соединений ГК3 и ГК4, которые оказались неактивными. Наиболее активный миметик NGF, ГК2, моделирующий центральный участок -изгиба 4-й петли, по действующей концентрации (в молях) и выраженности нейропротективного эффекта не уступает самому природному нейротрофину. Полученные результаты подтверждают важность -изгибов полипептидной цепи в белок-белковом взаимодействии.
3.3.2. Влияние миметиков NGF на дифференцировку клеток феохромоцитомы коры надпочечников крысы линии РС- Для оценки дифференцирующего эффекта были выбраны клетки феохромоцитомы коры надпочечников крысы линии РС-12. Клетки РС-12 при добавлении фактора роста нервов способны дифференцироваться по нейрональному типу, в связи с чем они применяются как объект исследования для выяснения дифференцирующей способности различных препаратов.
В среду культивирования добавлялись препараты ГК1–ГК5 в конечных концентрациях 10-5–10-8М. В качестве положительного контроля использовался NGF в конечной концентрации 100 нг/мл (10-9М). Результаты были получены путем подсчета количества дифференцированных и недифференцированных клеток.
Было показано, что соединения ГК1–ГК4 не вызывали дифференцировку клеток линии РС-12 ни в одной из исследованных концентраций. Однако ГК1 в концентрации 10-5М снижал дифференцирующий эффект NGF на 50%. ГК5 обладал дифференцирующим действием в конечных концентрациях 10-5М и 10-6М.
Таким образом, димерные N-ацилдипептидные миметики 4-й петли обладают выраженной нейропротективной активностью, а миметики 1-й петли при наличии слабых нейропротективных свойств могут обладать также дифференцирующей активностью. Это свидетельствует в пользу того, что разные петли NGF ответственны за разные функции этого белка.
ВЫВОДЫ 1. С помощью оригинального метода конструирования биологически активных пептидов, заключающегося в замене аминокислотных остатков на остатки, соответствующие точечным мутациям, получены новые пироглутамилсодержащие дипептиды, родственные N-концевому дипептидному фрагменту эндогенного регулятора памяти AVP(4-9). При этом дипептиды pGlu-Asp-NH2 и pGlu-Ser-NH2, полученные в результате транзиции, обладают ноотропной активностью, тогда как дипептиды pGlu-His NH2 и pGlu-Tyr-NH2, полученные в результате трансверсии, неактивны.
2. Впервые получены биологически активные циклические тетра-, пента- и гексапептидные миметики -изгиба 4-й петли NGF, содержащие только 3 его аминокислотных остатка: cyclo(-Gly-Asp-Glu-Lys-), cyclo(-Gly-Gly-Asp-Glu-Lys-), cyclo( Gly-Gly-Gly-Asp-Glu-Lys-). Показано, что наиболее активным является циклотетрапептидный миметик, конформационно подобный -изгибу 4-й петли, -Asp93-Glu94-Lys95-Glu96-.
образованному остатками Циклотетрапептид снижал жизнеспособность нейронов на культуре иммортализованных клеток гиппокампа мыши линии НТ22 в интервале концентраций 10-5–10-8М.
3. Изучено влияние природы конденсирующего реагента (ВОР, HBTU и DPPA) и степени разбавления на циклизацию. Показано, что использование DPPA позволяет полностью подавить образование циклодимеров в синтезе пяти и шестичленного циклопептида, однако для достижения такого эффекта в случае четырехчленного пептида потребовалось дополнительное десятикратное разбавление реакционной смеси.
4. Получена новая группа биологически активных низкомолекулярных миметиков NGF, мономерных и димерных N-ацилдипептидов, соответствующих наиболее экспонированным наружу участкам 1-й и 4-й петель нейротрофина NGF. При этом N ацильный радикал имитирует соседний третий аминокислотный остаток.
5. Миметики 4-й петли NGF обладают большей нейропротективной активностью, чем аналоги 1-й петли. Активность миметиков 4-й петли на культуре нейронов проявлялась в концентрациях 10-5–10-9М. Показано, что димерные N-ацилдипептидные аналоги 4-й петли NGF увеличивают жизнеспособность нейронов.
6. Впервые показано, что миметики 4-й петли обладают селективной нейропротективной активностью, а миметики 1-й петли обладают как нейропротективной, так и дифференцирующей активностью.
Автор выражает глубокую благодарность д. х. н., вед. н. с. Г.А.Коршуновой (НИИ физико-химической биологии имени А.Н.Белозерского МГУ имени М.В.Ломоносова) и к. х. н., с.
н. с. Н.В.Сумбатян (химфак МГУ имени М.В.Ломоносова, кафедра химии природных соединений) за научно-техническую и консультативную помощь при выполнении работы.
Автор глубоко признателен сотрудникам ГУ НИИ фармакологии имени В.В.Закусова РАМН к.
х. н., с. н. с. В.П.Лезиной за помощь в анализе данных, полученных методом 1Н-ЯМР спектроскопии, д. б. н., вед. н. с. лаборатории психофармакологии С.С.Трофимову и к. б. н., заведующей лабораторией нейропротекции Т.А.Антиповой за выполнение исследований в области изучения биологической активности соединений.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Морозова А.А., Сумбатян Н.В., Лезина В.П., Акпаров В.Х., Коршунова Г.А., Гудашева Т.А. Синтез циклических аналогов 4-й петли фактора роста нервов. // Биоорганическая Химия, 2008, 34 (5), c. 617-629.
2. Gudasheva T.A., Morozova A.A., Trofimov S.S., Ostrovskaya R.U. The stereoselectivity of cognition-activating effect exerted by pGlu-Asn-NH2 as an N-end dipeptide fragment of the major vasopressine metabolite. // Peptides 2004 / Eds. M. Flegel et al. Geneva 1, Switzerland.
2004. P 854-855.
3. Гудашева Т.А., Трофимов С.С., Морозова А.А., Никитин С.В., Островская Р.У., Воронина Т.А., Середенин С.Б. Дизайн ноотропных дипептидов с использованием эволюционно-генетического подхода. // Химико-фармацевтический журнал, 2006, 40 (1), с.
18-22.
4. Карапыш А.А. (Морозова А.А.), Трофимов С.С., Гудашева Т.А., Островская Р.У.
Стереоселективность ноотропного эффекта N-концевого дипептидного фрагмента основного метаболита вазопрессина pGlu-Asn-NH2. // Материалы Всероссийской конференции, посвященной 110-летию Героя Социалистического Труда, лауреата Ленинской и Государственной премий СССР, академика АМН СССР С.В.Аничкова “Психофармакология и биологическая наркология”, Москва, 2002, № 3-4, с. 401.
5. Чепкова А.H., Kaпай Н.А., Дорели Н.В., Карапыш А.А. (Морозова А.А.), Гудашева T.A., Скребицкий В.Г. Эффект пироглутамиласпарагинамида на пластические характеристики синаптической трансмиссии в гиппокампе. // Бюллетень Экспериментальной Биологии и Медицины, 2003, 136 (1), с. 59-61.
6. Капай Н.А., Чепкова А.Н., Гудашева Т.А., Морозова А.А., Скребицкий В.Г. Амид пироглутамиласпарагина нормализует развитие длительной потенциации в срезах гиппокампа крыс. // Бюллетень Экспериментальной Биологии и Медицины, 2004, 138 (2), c.
154-157.
7. Gudasheva T.A., Morozova A.A., Trofimov S.S., Ostrovskaya R.U. The stereoselectivity of cognition-activating effect exerted by pGlu-Asn-NH2 as an N-end dipeptide fragment of the major vasopressine metabolite. // Journal of Peptide Science, 2004, p 483.
8. Morozova A.A., Trofimov S.S., Nikitin S.V. Design of nootropic dipeptides using the evolutional-genetic approach. // European Neuropsychopharmacology, Москва, 2005, 15 (2), p 235.
9. Морозова А.А., Букреев Я.С., Соколенко Н.И., Лезина В.П., Гудашева Т.А. Синтез циклических аналогов 4-й петли фактора роста нервов. // Материалы 4-й Международной конференции “Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам”, Москва, 2006, с. 53.
10. Дорофеев А.М., Трофимов С.С., Морозова А.А., Никитин С.В., Гудашева Т.А. Новые ноотропные дипептиды, сконструированные с использованием эволюционно-генетического подхода. // Материалы 4-й Международной конференции “Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам”, Москва, 2006, с. 27.
11. Морозова А.А., Зенина Т.А., Никитин С.В., Гудашева Т.А. Дизайн и синтез циклических аналогов -поворота 4-й петли фактора роста нервов. // Психофармакология и Биологическая Наркология (Материалы III съезда фармакологов России), Санкт-Петербург, 2007, т. 7, спецвыпуск ч. 2, с. 1860.
12. Gudasheva T., Morozova A., Antipova T., Akparov V. Synthesis of biological active cyclopeptides corresponding to 4th loop of nerve growth factor. // Journal of Peptide Science, 2008, 14 (8), pp 52-53.