Исследование механизма действия липополисахаридов различной структуры на функции нейтрофилов человека 02. 00. 10 - биоорганическая химия aвтофеферат диссертации на соискание учёной степени кандидата х

На правах рукописи

Загряжская Анна Николаевна Исследование механизма действия липополисахаридов различной структуры на функции нейтрофилов человека 02. 00. 10 - биоорганическая химия AВТОФЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Москва 2009

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений Химического факультета Московского Государственного Университета имени М. В. Ломоносова и в отделе биокинетики Института физико-химической биологии имени А. Н. Белозерского Московского Государственного Университета имени М. В. Ломоносова Научные руководители:

доктор химических наук Судьина Галина Федоровна кандидат химических наук Гришина Зоряна Владимировна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Ланкин Вадим Зиновьевич кандидат химических наук Шрам Станислав Иванович

Ведущая организация:

Учреждение Российской Академии Наук Институт биохимии им. А.Н. Баха

Защита состоится 24 ноября 2009 года в 16 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Химическом факультете МГУ по адресу:

119991, г. Москва, Ленинские горы, МГУ, д. 1, НИИ ФХБ им. А. Н. Белозерского, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан 23 октября 2009 года Учёный секретарь совета, кандидат химических наук Смирнова И. Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Бактериальные липополисахариды (lipopolysaccharide, LPS) или эндотоксины, входят в состав клеточной стенки грамотрицательных бактерий, и выделение LPS в свободном состоянии в процессе роста, деления бактерий, при действии антибиотиков и белков плазмы крови in vivo является ключевым звеном в индукции септического шока (Shenep et al., 1988;

Zhang et al., 1998). Эндотоксины взаимодействуют со специфическими рецепторами клеток высшего организма и являются одними из наиболее сильных индукторов иммунного ответа (Rietschel et al., 1996). Учитывая высокую токсичность LPS для высшего организма, подробное изучение механизмов их воздействия на функции клеток, участвующих в иммунном ответе, является актуальной задачей биоорганической химии, молекулярной биологии и медицины.

Показано, что структура эндотоксина играет важную роль в процессах фагоцитоза и разрушения бактерий (Friedberg et al., 1970). В полноразмерной структуре LPS выделяют части: гидрофобный липид А, центральный гетерополисахарид, и полисахарид О-антиген (Kastowsky et al., 1992). Однако роль центрального полисахарида в токсическом действии LPS на клетки иммунной системы не достаточно изучена. Поэтому исследование влияния различных форм LPS на функции нейтрофилов для определения функциональной значимости центрального полисахарида, является актуальным.

Клетки крови нейтрофилы участвуют в неспецифическом иммунном ответе.

Нейтрофилы первые мигрируют к очагу воспаления и осуществляют захват (фагоцитоз) микроорганизмов и чужеродных частиц. Фагоцитоз – комплексный процесс, который сопровождается образованием активных форм кислорода и азота, высвобождением цитокинов, протеолитических ферментов и синтезом липидных медиаторов воспаления, в частности, метаболитов 5-липоксигеназы (5-LO, КФ 1.13.11.34) лейкотриенов. Показано, что мыши (-/-) по 5-LO более чувствительны к бактериальной инфекции по сравнению с мышами дикого типа (Machado et al., 2005). В связи с этим актуальность исследований механизма действия хемотипов LPS на активность 5-LO и роли лейкотриенов в реализации эффектов LPS на процесс фагоцитоза вполне очевидна.

Важными факторами, регулирующими клеточные эффекты LPS, являются липопротеиды и липиды плазмы крови. Несомненный интерес представляет изучение модуляции ответов нейтрофилов на LPS этими липидами.

Цель и задачи исследования.

Целью работы стало комплексное исследование влияния LPS с различной длиной полисахаридной цепи из патогенной грамотрицательной бактерии Salmonella typhimurium на фагоцитоз и ряд функций нейтрофилов человека, связанных с процессом фагоцитоза;

а также изучение роли липидов в реализации действия LPS из патогенной грамотрицательной бактерии Pseudomonas Aeruginosa 10 на нейтрофилы.

Для выполнения работы необходимо было решить следующие задачи:

- исследовать действие хемотипов LPS из Salmonella typhimurium с различной длиной полисахаридной цепи: Re мутанта, (липид А и остатки 2-кето-3-дезокси- D маннооктоновой кислоты);

Ra мутанта (липид А и центральный полисахарид);

и полноразмерной S формы LPS на опсонин-зависимый фагоцитоз и синтез лейкотриенов в нейтрофилах человека;

- установить значимость активации 5-LO и последующего синтеза лейкотриенов для реализации эффектов хемотипов LPS на опсонин-зависимый фагоцитоз;

- определить влияние различных хемотипов LPS на образование химически активных радикалов кислорода и азота в нейтрофилах человека;

- исследовать механизм действия различных хемотипов LPS на активность 5-LO и синтез лейкотриенов в нейтрофилах человека;

- исследовать модуляцию эффекта LPS из Pseudomonas aeruginosa 10 на синтез лейкотриенов в нейтрофилах под действием природных липидов, в частности, холестерина и его производных.

Научная новизна и практическая значимость работы. В диссертационной работе впервые установлено, что LPS различной структуры в разной степени стимулируют фагоцитоз частиц опсонизированного зимозана (OZ) нейтрофилами человека с эффективностью действия хемотипов LPS: Re S Ra. Согласно полученным в работе данным, степень активации фагоцитоза различными формами LPS обусловлена способностью хемотипов LPS повышать синтез лейкотриенов в нейтрофилах.

Эффективность стимулирующего действия различных форм LPS на фагоцитоз OZ коррелировала с их эффектами на адгезию, синтез лейкотриенов и образование супероксид-иона в нейтрофилах человека: Re S Ra. Установлено, что способность разных форм эндотоксинов стимулировать данные функции нейтрофилов имеет противоположную направленность с их способностью увеличивать синтез оксида азота (NO) с эффективностью действия хемотипов LPS: Ra S Re.

Показано, что синтез NO в нейтрофилах, стимулированный LPS и OZ, осуществляется ферментативно под действием NO-синтазы (NOS). Продемонстрировано наличие в клетках изоформ NOSI и NOSII.

Установлено, что NO ингибирует активность 5-LO при непосредственном взаимодействии, а также через активацию растворимой гуанилатциклазы и протеинкиназы G (механизм sGC/cGK). Доказано, что в фагоцитирующих нейтрофилах под действием хемотипов LPS образуется эндогенный NO, который ингибирует активность 5-LO по механизму sGC/cGK.

Предложена модель, описывающая действие различных форм эндотоксинов с возрастающей длиной цепи на опсонин-зависимый фагоцитоз и связанные с этим процессы образования NO и синтеза лейкотриенов в нейтрофилах.

Установлено, что фосфатидилхолин нейтрализует действие LPS на активность 5-LO и что холестерин, присутствующий в мембране клетки, играет важную роль в реализации эффекта LPS на активность фермента.

Полученные в данной работе результаты расширяют представление о регулировании ряда функций нейтрофилов человека под действием бактериальных эндотоксинов;

полученные данные также могут быть использованы в разработке новых препаратов для вакцинации против патогенных штаммов Salmonella.

Апробация работы. Основные результаты работы представлены на ASCB & European Cytoskeleton forum "Dynamic Interplay Between Cytoskeletal and Membrane Systems" (2007, Dijon, France), Четвертой крымской конференции "Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии" (2008, Судак, Крым, Украина), Keystone symposium "Complex Lipids in Biology: Signaling, Compartmentalization and Disease" (2009, Olympic Valley, USA).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи: 2 статьи в отечественном сборнике и одна в иностранном журнале.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы ( наименований). Диссертация изложена на 124 страницах, содержит 5 таблиц и 33 рисунка.

Список сокращений.

5-LO – 5-липоксигеназа (5-lipoxygenase);

АА – арахидоновая кислота (arachidonic acid), 5,8,11,14-цис-эйкозатетраеновая кислота;

cGK – cGMP-зависимая протеинкиназа G (cGMP regulated protein kinase);

cGMP - циклический гуанозинмонофосфат (cyclic guanosine monophosphate);

cPLA2 – цитоплазматическая фосфолипазa А2 (cytosolic phospholipase A2);

Chol - холестерин (cholesterol);

CP – фосфат холестерина (cholesterol phosphate);

CS – сульфат холестерина (cholesterol sulfate);

GTP - гуанозинтрифосфат (guanosine triphosphate);

HPLC – высокоэффективная жидкостная хроматография (high perfomance liquid chromatography).

L-NAME - метиловый эфир N-нитро-L-аргинина (N-Nitro-L-arginine methyl ester);

LPS – липополисахариды (lipopolysaccharides), эндотоксины;

LTB4 – лейкотриен В4, 5S,12R-5,12-дигидрокси-6-цис-8,10-транс-14-цис эйкозатетраеновая кислота;

NO – оксид азота;

NOS – синтаза оксида азота (nitric oxide synthase);

OZ – опсонизированный зимозан (opsonized zymosan);

PC - фосфатидилхолин (phosphatidylcholine);

PKC – протеинкиназа С (protein kinase C);

sGC – растворимая гуанилатциклаза (soluble guanylate cyclase);

SOD – супероксид дисмутаза (superoxide dismutase);

Центральный полисахарид GlcNAc Gal Hep KDOp Abe (или HepppEtN) Липид А Man Rha Gal Glc Gal Glc Hepp Hepp KDOp n Re мутант (SL1181) O-антиген Ra мутант (TV119) S (полноразмерная форма) Схематическая структура LPS (S) из Salmonella typhimurium с указанием мутантных хемотипов Re и Ra, использованных в данной работе. Обозначения: Abe (abequose), абеквоза (3, 6-дидезокси-D-галактоза);

Man (D-mannose), D-манноза;

Rha (L-rhamnose), L рамноза (6-дезоксиманноза);

Gal (D-galactose), D-галактоза;

GlcN (D-glucosamine), D глюкозамин;

Hep (L-glycero-D-manno-heptose), L-глицеро-D-манногептоза;

KDO (3-deoxy D-mannooctulosonic acid), 2-кето-3-дезокси- D-маннооктоновая кислота;

EtN (ethanolamine), этаноламин;

Ac (acetyl), ацетил;

p (phosphate), фосфат.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ Часть 1. Исследование механизма действия липополисахаридов различной структуры из Salmonella typhimurium на функции нейтрофилов человека.

Грамотрицательные бактерии экспрессируют как полноразмерную форму LPS, так и мутантные формы эндотоксинов, в структуре которых отсутствуют О-антиген и/или элементы центрального полисахарида (Garcia-Verdugo et al., 2005). LPS, выделившиеся в свободном состоянии из клеточной стенки бактерий, признаны более биологически активными по сравнению с эндотоксинами, связанными с бактериальной мембраной (Leeson et al., 1994). Предполагается, что токсичность LPS как в составе цельной бактерии, так и в свободном состоянии (после гибели и лизиса бактерий), обусловлена, главным образом, липидом А;

структура О-антигена определяет антигенную специфичность бактерий. Роль центрального полисахарида в патогенезе не изучена подробно. Много работ посвящено изучению рецепторного комплекса, обуславливающего многообразные эффекты действия эндотоксинов на клетки высшего организма. Однако биосинтез физиологически активных веществ лейкотриенов и образование активных форм кислорода и азота в ответ на действие LPS различной структуры, которая характеризуется одинаковым липидом А и разной длиной полисахаридной цепи, не изучена. Поэтому исследование эффектов разных хемотипов LPS на ряд клеточных процессов в нейтрофилах представляет несомненный интерес.

В данной работе были cмоделированы условия захвата инородных частиц (зимозана) нейтрофилами человека по опсонин-зависимому механизму в присутствии свободных бактериальных эндотоксинов с различной длиной полисахаридной цепи. Центральным вопросом исследования была роль лейкотриенов в эффектах разных хемотипов LPS на фагоцитоз опсонизированного зимозана (OZ). Было также проведено исследование влияния хемотипов LPS на клеточные процессы, тесно связанные с 5-липоксигеназной активностью: высвобождение АА – субстрата 5-LO, транслокацию 5-LO к ядерной мембране и синтез активных форм кислорода и азота. Изучение описанных ниже эффектов хемотипов LPS на функции нейтрофилов: фагоцитоз OZ, адгезию нейтрофилов, синтез лейкотриенов, а также активных форм кислорода и азота проведено впервые.

1.1. Эффекты различных хемотипов LPS на опсонин-зависимый фагоцитоз и адгезию нейтрофилов к коллагену.

Было исследовано влияние мутантных форм LPS из Salmonella enterica серотипа typhimurium (Ra и Re), а также полноразмерной формы (S) на фагоцитоз частиц OZ нейтрофилами человека. Фагоцитоз – процесс захвата чужеродной частицы клеткой фагоцитом, который начинается с прикрепления частицы-мишени к специфическим клеточным рецепторам и последующим поглощением и разрушением частицы. Широко используемой моделью частицы-мишени для изучения процессов фагоцитоза являются частицы зимозана (высушенные клеточные стенки дрожжей Saccharomyces cerevisiae). В данной работе было проведено исследование опсонин-зависимого фагоцитоза, поэтому в качестве частицы-мишени использовали опсонизированный зимозан. Для получения OZ гомогенную суспензию частиц зимозана инкубировали 30 мин с аутологической сывороткой крови и тщательно промывали физиологическим буферным раствором. В результате опсонизации частица зимозана покрывается иммуноглобулинами и белками комплемента, которые распознаются, соответственно, FcR (Fc-gamma receptors) и CR (complement receptors) рецепторами на поверхности нейтрофилов, направляя процесс фагоцитоза по опсонин-зависимому механизму. Для исследования эффектов различных хемотипов LPS на опсонин-зависимый фагоцитоз нейтрофилы человека преинкубировали (праймировали) 30 мин с LPS, затем добавляли OZ на 3 мин, фиксировали клетки и определяли индекс фагоцитоза. Из рис. 1А видно, что все тестируемые хемотипы LPS стимулируют фагоцитоз, при этом форма Ra, в составе которой липид А и центральный полисахарид, вызывает максимальное увеличение индекса фагоцитоза OZ, а полноразмерная форма S и форма Re, образуемая липидом А с остатками KDO, менее эффективны.

Известно, что в процессах фагоцитоза и адгезии нейтрофилов задействованы, по крайней мере, частично, одни и те же рецепторы и сигнальные каскады (Ross et al., 1993).

Поэтому было исследовано влияние 30 мин инкубации клеток с Re, Ra и S формами LPS на прикрепление (адгезию) нейтрофилов к поверхности, покрытой коллагеном. Из рисунка 1В видно, что все тестируемые хемотипы LPS стимулируют адгезию, при этом Ra форма LPS приводит к наибольшему прикреплению клеток (~ в 8 раз выше, чем в контроле), S и Re формы LPS, соответственно, менее эффективны. Таким образом, хемотипы LPS из Salmonella typhimurium в различной степени стимулируют опсонин зависимый фагоцитоз и адгезию нейтрофилов человека с эффективностью: Re S Ra.

Индекс фагоцитоза (частиц/клетку) A Рис. 1. Влияние Re, Ra и S хемотипов LPS на фагоцитоз частиц OZ нейтрофилами (А) и адгезию нейтрофилов к поверхности, покрытой коллагеном (В). А. Нейтрофилы инкубировали 30 мин c 1 мкг/мл хемотипов LPS, затем добавляли OZ ( частиц/клетку) на 3 мин и определяли индекс фагоцитоза методом фазово контрастной микроскопии. В.

Контроль Re Ra S Нейтрофилы инкубировали 30 мин с хемотипами LPS и определяли % клеток, В прикрепившихся к поверхности. * P 0.05, ** P 0.01 к контролю.

Адгезия (%) 1.2. Роль 5-LO в эффектах хемотипов LPS на фагоцитоз частиц OZ нейтрофилами.

При активации нейтрофилы синтезируют ряд липидных Ra S Контроль Re медиаторов, участвующих в регулировании процесса воспаления. Один из наиболее физиологически значимых медиаторов - LTB4 является сильнейшим хемоаттрактантом и играет роль в привлечении дополнительного пула лейкоцитов к очагу воспаления. Ключевым ферментом в синтезе лейкотриенов является 5-LO, которая в интактных клетках локализована в цитоплазме, при увеличении внутриклеточной концентрации Ca2+ (Ca2+i) транслоцируется к ядру, связывается с ядерной мембраной и включается в белковый комплекс с FLAP (5 lipoxygenase activating protein) и цитозольной фосфолипазой А2 (cPLA2) (Peters-Golden et al., 2005). cPLA2 катализирует высвобождение из фосфолипидов мембран АА – субстрата 5-LO, а FLAP связывает и "презентирует" АА для 5-LO (Abramovitz et al., 1993). C целью выяснения связи эффектов Re, Ra и S форм LPS на фагоцитоз OZ нейтрофилами с 5 липоксигеназной активностью нейтрофилов, клетки инкубировали в присутствии хемотипов LPS и ингибитора синтеза 5-LO метаболитов МК886, затем добавляли OZ и определяли индекс фагоцитоза. Известно, что МК886 блокирует FLAP в каталитическом комплексе синтеза 5-LO продуктов (Werz, 2002). Из рис. 2 видно, что МК886 приводит к снижению индекса фагоцитоза и значительному нивелированию эффектов эндотоксинов на фагоцитоз. Эти данные позволяют сделать вывод, что способность разных форм LPS активировать фагоцитоз OZ зависит от стимуляции ими синтеза лейкотриенов в клетках.

Рис. 2. Эффект МК886 на фагоцитоз OZ нейтрофилами. Нейтрофилы Индекс фагоцитоза (частиц/клетку) инкубировали 30 мин с 1 мкг/мл Re, OZ Ra и S форм LPS в присутствии или в 100 нM MK886 + OZ отсутствие 100 нМ МК886, затем добавляли OZ на 3 мин и определяли индекс фагоцитоза методом фазово контрастной микроскопии. * P 0. по сравнению с соответствующим контролем.

S Ra Контроль Re 1.3. Исследование синтеза 5-LO метаболитов в нейтрофилах, стимулированных OZ.

Учитывая взаимосвязь между процессами образования лейкотриенов и эффектами разных форм LPS на фагоцитоз, было исследовано влияние хемотипов LPS на синтез лейкотриенов, стимулированный OZ. Предварительные эксперименты показали, что соотношение эффектов хемотипов LPS на синтез лейкотриенов сохраняется при действии 0.5-5 мкг/мл LPS, а в интервале концентраций LPS 2-5 мкг/мл синтез не зависит от концентрации LPS, поэтому дальнейшие эксперименты проводили при концентрации эндотоксинов 5 мкг/мл. Как видно из рис. 3, в нейтрофилах, инкубированных только с LPS, не происходит активация 5-LO. Добавление OZ, вызывающее повышение Ca2+i, приводит к активации 5-LO, и исследуемые формы LPS в 5-LO метаболитов (нг/107 PMNLs) различной степени стимулируют образование 5-LO метаболитов с эффективностью, аналогичной - OZ + OZ действию хемотипов LPS на фагоцитоз OZ и адгезию нейтрофилов: Re S Ra.

Рис. 3. Влияние хемотипов LPS на S Ra Контроль Re образование 5-липоксигенгазных метаболитов в нейтрофилах. Нейтрофилы инкубировали 30 мин с 5 мкг/мл различных форм LPS, затем добавляли 2 мг/мл OZ (где указано) на 30 мин, количество продуктов определяли методом HPLC. * P 0.05, ** P 0.01 к соответствующему контролю.

1.4. Действие хемотипов LPS на высвобождение АА и транслокацию 5-LO к ядру в нейтрофилах.

Следующим этапом данной работы было исследование механизма действия Re, Ra и S форм LPS на активность 5-LO. Анализ работ, посвященных регуляции активности 5-LO, позволяет выделить следующие основные факторы: доступность свободного субстрата – АА, Ca2+-зависимая транслокация фермента к ядру и связывание с ядерной мембраной, внутриклеточный уровень гидропероксидов и химически активных радикалов. В интактных клетках 5-LO не активна и локализована в цитоплазме, а ее субстрат АА находится в составе фосфолипидов мембран. При повышении внутриклеточной концентрации ионов Ca2+ происходит активация и транслокация ферментов 5-LO и cPLA к ядерной мембране, где они объединяются в белковый комплекс с FLAP. cPLA катализирует высвобождение АА. В ходе реакции диоксигенирования АА акцептором электронов является негемовый ион железа 5-LO, который взаимодействует с гидропероксидами и химически активными радикалами, регулирующими активность фермента. В свою очередь OZ стимулирует 5-липоксигеназную активность, повышая Ca2+i (Werz, 2002). Как LPS может воздействовать на активность 5-LO? Эндотоксины взаимодействуют с клеточными рецепторами, вызывая активацию сигнальных каскадов в клетке, что приводит к фосфорилированию cPLA2, увеличению ее активности и высвобождению АА (Doerfler et al., 1994). Возможно, отличия в эффектах разных форм LPS на синтез лейкотриенов обусловлены их потенцией высвобождать АА. Чтобы проверить это предположение, нейтрофилы инкубировали с радиоактивно меченой [14C] АА для включения в состав мембран ([14C]AA-нейтрофилы) и, после добавления хемотипов LPS и OZ, детектировали суммарную метку совокупности свободной АА и метаболитов 5-LO. Из рис. 4А видно, что все тестируемые формы LPS стимулировали высвобождение АА, однако в данном случае эффективность разных эндотоксинов не сопоставима с их эффективностью по повышению синтеза лейкотриенов. Таким образом, действие хемотипов LPS именно на высвобождение АА не вносит значимый вклад в их эффекты на синтез лейкотриенов в нейтрофилах.

При активации лейкоцитов 5-LO Ca2+-зависимо транслоцируется к ядру (Peters Golden et al., 2000). Для выяснения, обусловлены ли различия в эффектах хемотипов LPS их воздействием на связывание 5-LO с мембраной, нейтрофилы инкубировали с эндотоксинами и OZ, затем разрушали клетки, выделяли отдельно мембранную и цитоплазматическую фракции и определяли внутриклеточную локализацию фермента. На рис. 4 (В, С) представлен типичный результат иммуноблоттинга 5-LO. Из рис. 4 видно, что в интактных клетках (контроль) этот белок локализован в цитоплазме. Под действием кальциевого ионофора А23187, обычно используемого для гарантированной стимуляции синтеза лейкотриенов, фермент практически полностью локализован в ядерной фракции.

При действии только хемотипов LPS 5-LO была детектирована в цитоплазматической фракции, как и в интактных клетках. Как видно из рис. 4С, добавление к клеткам OZ приводит к частичной транслокации 5-LO к ядерной мембране, однако эндотоксины не оказывают значительного влияния (сопоставимого с действием форм LPS на синтез лейкотриенов) на перераспределение фермента между цитозольной и мембранной фракцией. Полученные результаты свидетельствуют о том, что способность хемотипов LPS стимулировать синтез лейкотриенов не связана с их влиянием на доступность субстрата и связывание 5-LO с ядерной мембраной.

А Выход реакции (% от Контроля) 5-LO метаболитов Рис. 4. Влияние хемотипов LPS на [14C]AA 5-LO метаболиты высвобождение арахидоновой кислоты + [14C]AA (А) и внутриклеточную локализацию 5 LO (В, С) в нейтрофилах. А. [14C]AA нейтрофилы инкубировали 30 мин с мкг/мл хемотипов LPS, затем добавляли 2 мг/мл OZ;

анализировали методом HPLC. * P 0.05, ** P 0.01 по сравнению с соответствующим Контроль контролем. В, С. Детекция 5-LO в Re S Ra цитоплазматическая фракция цитоплазматической (В) и мембранной 97,6 kДa B (ядерной) (С) фракции нейтрофилов.

маркер Контроль Ra + OZ Концентрации агентов: 5 мкг/мл LPS;

Re + OZ А S + OZ OZ Ra Re S мг/мл OZ;

3 мкМ ионофора A23187.

97,6 kДa C маркер мембранная (ядерная) фракция 1.5. Образование активных форм кислорода и азота в нейтрофилах под действием различных форм LPS.

Активность 5-LO чувствительна к внутриклеточному уровню гидропероксидов и свободных радикалов, который во многом определяется образованием химически активных форм кислорода. Продукция активных форм кислорода в клетке начинается с образования супероксид-радикала под действием NADPH-оксидазы. Было проведено исследование влияния хемотипов LPS на образование супероксид-иона (радикала) O2-·в нейтрофилах человека. Измерение количества восстановленного цитохрома С является селективным методом детекции образования O2-·среди всех активных форм кислорода.

LPS способны вызвать активацию NADPH-оксидазы, и из рис. 5А видно, что тестируемые хемотипы LPS стимулируют продукцию супероксид-иона как в интактных клетках, так и при активации клеток OZ с эффективностью Re S Ra. Из рис. 5А видно, что восстановление цитохрома С было полностью блокировано в присутствии супероксид дисмутазы (SOD), вызывающей дисмутацию O2-, что свидетельсьвует о супероксид зависимом восстановлении цитохрома С в данных условиях.

Помимо активации NADPH-оксидазы, LPS способны стимулировать образование NO в клетке. В отличие от NADPH-оксидазной системы, синтез NO в нейтрофилах человека не изучен подробно. В данной работе образование NO в нейтрофилах определяли по накоплению метаболитов NO нитрита NO2- и нитрата NO3- в среде инкубации. В отличие от эффектов LPS на образование супероксида, основные эффекты хемотипов LPS на синтез NO в нейтрофилах были обнаружены в присутствии OZ (рис. 5В). Примечательно, что Re форма LPS, которая оказывает минимальное воздействие на фагоцитоз, адгезию, образование LTs и O2-, наиболее эффективна в стимуляции синтеза NO в фагоцитирующих нейтрофилах, и напротив, Ra форма LPS наименее эффективна, т.е. в данном случае Ra S Rе.

Биосинтез NO в клетке осуществляется под действием NO синтазы;

было также показано неферментативное образование NO в нейтрофилах человека в патологических условиях (Tse et al., 2001). В данной работе было обнаружено значительное снижение накопления метаболитов NO в присутствии ингибитора NOS - метилового эфира N нитро-L-аргинина (L-NAME), что позволяет сделать вывод о ферментативном синтезе NO с участием NOS в нейтрофилах человека под влиянием LPS.

0, A Рис. 5. Влияние хемотипов LPS на - OZ Поглощение цитохрома C продукцию супероксид-иона (А) и + OZ 0, + SOD (535/550 нм), опт. ед.

синтез NO (В) в нейтрофилах. А.

Нейтрофилы инкубировали 30 мин с 0, мкг/мл Re, Ra и S форм LPS в присутствии или в отсутствие ед/мл SOD, затем добавляли OZ 0, (указано) на 30 мин;

исследовали поглощение (550/535) нм. В.

0, Ra S Контроль Re Нейтрофилы инкубировали 30 мин с мкг/мл хемотипов LPS в присутствии - OZ или в отсутствие 100 мкМ L-NAME, B [NO2- + NO3- ], нM/107 PMNLs 60 L-NAME (- OZ) затем добавляли OZ (указано) на + OZ мин;

исследовали с использованием L-NAME за 30 мин до добавления OZ тест-набора Nitrate/Nitrite fluorometric assay kit (Cayman Chemical, США). * P 0.05, ** P 0.01 по сравнению с соответствующим контролем.

1.6. Детекция NO синтазы в нейтрофилах человека.

Re Ra S Контроль Известно три изоформы NO синтазы, конститутивные NOSI и NOSIII, а также индуцибельная изоформа NOSII (Alderton et al., 2001). Анализ литературных данных позволяет говорить о низком уровне экспрессии NOS в нейтрофилах человека, однако данные об экспрессии изоформ NOS противоречивы (Cedergren et al., 2003;

de et al., 2001;

Wallerath et al., 1997;

Molero et al., 2002). В связи с этим мы определили наличие изоформ NOSI и NOSII в нейтрофилах человека. На рис. 6 представлены типичные результаты иммуноблоттинга (А, В) и флуоресцентного окрашивания (C, D) NOSI и NOSII, соответственно. В данной работе показано присутствие нейрональной конститутивной изоформы NOSI в интактных клетках (рис. 6А) и индуцибельной изоформы NOSII (рис. 6В) в интактных клетках, а также в клетках, инкубированных с LPS и OZ. Специфичность антител была подтверждена с использованием лизатов клеточных линий, содержащих NOSI (А-673), и NOSII (RAW264.7 + LPS/IFN-). На рис. 6С1 и 6D1 представлено окрашивание NOSI и NOSII в нейтрофилах при помощи флуоресцентных антител, 6С2 и 6D2 – окрашивание ядер красителем Хёхста (Hoechst), 6С3 и 6D3 – фазово-контрастные изображения клеток.

Сравнительный анализ рис. 6С1 и 6С2, а также рис. 6D1 и 6D2, позволил установить, что белки NOSI и NOSII локализованы преимущественно в цитоплазме.

C С1 D D D С C D С 10 m 10 m маркер маркер A B 170 kДa 170 kДa 155 kДa 130 kДa 130 kДa 130 kДa NOS I NOS I I Контроль Re Re+OZ RAW264. A-673 PMNLs +LPS/IFN PMNLs Рис. 9. Детекция NOSI (А, С) и NOSII (B, D) в нейтрофилах человека. А. Детекция NOSI методом Western blotting в нейтрофилах (PMNLs) и в лизате клеток А-673 (Santa Cruz Biotechnology, Inc;

Германия). В. Нейтрофилы инкубировали 30 мин с Re формой LPS, добавляли 2 мг/мл OZ (указано) на 30 мин, лизировали клетки и детектировали NOSII методом Western blotting. Для контроля использовали лизат макрофагов RAW264.7, стимулированных LPS/IFN- (Santa Cruz Biotechnology, Inc;

Германия). С1, D1 – результаты обнаружения NOSI и NOSII, соответственно, методом флуоресцентного окрашивания клеток. С2, D2 – визуализация клеточных ядер под действием красителя Хёхста. С3, D3 - фазово-контрастные изображения клеток.

1.7. Роль NO синтазы в функциях нейтрофилов человека, праймированных различными хемотипами LPS.

В данной работе были изучено влияние хемотипов LPS на ферментативное образование NO и присутствие NOS в нейтрофилах человека и показано, что разные формы LPS различаются по способности активировать NOS нейтрофилов. Роль NOS в эффективности действия хемотипов LPS на фагоцитоз и связанные с процессом фагоцитоза функции нейтрофилов была исследована с использованием L-NAME, конкурентного ингибитора NOS. Как видно из таблицы 1, действие различных форм LPS на фагоцитоз OZ, образование супероксид-иона и лейкотриенов заметно нивелируется в присутствии 100 мкМ и 500 мкМ L-NAME. Таким образом, можно заключить, что действие хемотипов LPS на функции нейтрофилов обусловлено их влиянием на активность цитоплазматической NOS.

Таблица 1. Влияние L-NAME на ряд функций нейтрофилов, праймированных хемотипами LPS.

Клетки инкубировали 30 мин с 5 мкг/мл LPS в присутствии или в отсутствие L-NAME и определяли % прикрепившихся клеток (адгезия);

либо добавляли OZ на 3 мин и определяли индекс фагоцитоза;

либо добавляли OZ на 30 мин и исследовали образование метаболитов 5-LO и супероксид-иона.

Добавление Эффект различных хемотипов LPS (в Тестированные L-NAME % от соответствующего контроля) функции PMNL Re Ra S 164 ± 9 265 ± 15 207 ± Фагоцитоз OZ + 100 мкM L-NAME 193 ± 11 226 ± 14 195 ± + 500 мкM L-NAME 197 ± 11 212 ± 12 187 ± 128 ± 8 912 ± 51 202 ± Адгезия + 100 мкM L-NAME 157 ± 12 786 ± 47 191 ± + 500 мкM L-NAME 159 ± 12 708 ± 42 178 ± 116 ± 8 273 ± 18 209 ± Синтез метаболитов 5-LO, + 100 мкM L-NAME 189 ± 10 255 ± 15 207 ± стимулированный + 500 мкM L-NAME 191 ± 11 243 ± 15 217 ± OZ 114 ± 7 169 ± 10 141 ± Образование супероксид-иона, + 100 мкM L-NAME 142 ± 9 160 ± 10 147 ± стимулированное + 500 мкM L-NAME 145 ± 9 156 ± 9 144 ± OZ 1.8. Прямое действие NO на активность 5-LO в бесклеточной системе.

При рассмотрении эффекта Re формы LPS видно, что увеличение образования NO приводит к подавлению синтеза лейкотриенов и фагоцитоза OZ нейтрофилами человека (таблица 1). Учитывая связь процессов фагоцитоза и синтеза лейкотриенов, был исследован эффект действия NO на активность 5-LO. Для того, чтобы определить непосредственное влияние NO на активность 5-липоксигеназы, нейтрофилы человека разрушали под действием ультразвуковых импульсов. Полученный клеточный лизат инкубировали с донором NO диэтиламино-NONOатом (diethylamine NONOate, diEtNONOate), который при физиологических рН разлагается с выделением NO. В качестве контроля использовали его неактивный аналог сульфо-NONOат (sulpho NONOate, S-NONOate). Реакцию образования метаболитов 5-LO инициировали добавлением АА. Из рис. 7 видно, что преинкубация лизата клеток в течение 30 мин с донором NO приводит к значительному концентрационно-зависимому ингибированию активности 5-LO. При добавлении diEtNONOate одновременно с АА ингибирование донора NO на активность 5-LO сохранялось, но уменьшалась величина эффекта. Это можно объяснить существованием определенного промежутка времени, необходимого для распада diEtNONOate и накопления достаточного количества NO. В то же время, S NONOate не оказывает влияния на синтез лейкотриенов (рис. 7). Следовательно, подавление активности 5-LO обусловлено выделением NO при распаде diEtNONOate.

Полученные данные говорят о том, что NO может быть прямым эндогенным ингибитором 5-липоксигеназной активности в нейтрофилах человека.

5-LO метаболитов (нг/107 PMNLs) Рис. 7. Эффекты доноров оксида азота (NONOate) на активность 5-LO в бесклеточной системе. Лизат нейтрофилов инкубировали с исследуемыми агентами 30 мин.

Синтез лейкотриенов инициировали добавлением 20 мкМ арахидоновой S-NONOate diEtNONOate (за 30 мин до кмслоты (АА) на следующие 30 мин.

добавления 20 мкM AA) Количество продуктов определяли diEtNONOate + 20 мкM AA методом HPLC.

0 50 100 200 500 NONOate, мкM 1.9. Роль гуанилатциклазы и протеин киназы G в эффектах хемотипов LPS на активность 5-LO в нейтрофилах.

Для реализации ингибирующего эффекта NO на активность 5-LO необходимы высокие (мкМ) концентрации NO (рис. 7). Поэтому было выдвинуто предположение о существовании более чувствительного механизма действия NO на активность этого фермента в нейтрофилах человека. Известно, что NO уже в наномолярных концентрациях стимулирует активность растворимой гуанилатциклазы (sGC), которая осуществляет конверсию гуанозинтрифосфата (GTP) в циклический гуанозинмонофосфат (cGMP), что приводит к активации cGMP-зависимой протеинкиназы G (cGK). Было показано, что активация sGC и cGK в альвеолярных макрофагах крыс приводит к ингибированию активности 5-LO (Coffey et al., 2008). Известно 2 формы гуанилатциклазы:

мембранносвязанная и растворимая. NO не взаимодействует с мембранносвязанной гуанилатциклазой (membrane-bound GC, mGC), активация mGC происходит под действием ряда гормональных пептидов, одним из которых является ANF (atrial natriuretic peptide (factor)). Помимо NO, стимулирующего активность растворимой гуанилатциклазы (sGC), синтетический эффектор YC-1 является преимущественно аллостерическим, NO независимым активатором sGC. В данной работе было исследовано действие NO независимых активаторов гуанилатциклазы на активность 5-LO в нейтрофилах в присутствии OZ. Как видно из таблицы 2, YC-1 вызывает подавление активности 5-LO;

в то же время, в присутствии ANF не наблюдается изменений активности фермента.

Вероятно, нейтрофилы человека не экспрессируют mGC. Полученные данные свидетельствуют о том, что система растворимой гуанилатциклазы функционирует в нейтрофилах человека и приводит к подавлению активности 5-LO.

Таблица 2. Влияние активаторов PMNLs + 5-LO метаболитов, (нг/107 PMNLs) гуанилатциклазы YC-1 и ANF на синтез 2 мг/мл OZ 24,3 ± 1,7 метаболитов 5-LO, стимулированный OZ, в 1 мкM YC-1 + OZ 7,2 ± 0,3** нейтрофилах. Клетки инкубировали в течение 3 мкM YC-1 + OZ 3,3 ± 0,2** мин с 2 мг/мл OZ в присутствии или в отсутствие 10 нM ANF + OZ 24,6 ± 1,4 агентов (указано). Продукты исследовали 30 нM ANF + OZ 24,9 ± 1,4 методом HPLC. ** P 0.01 к контролю.

Было проведено исследование роли растворимой гуанилатциклазы (sGC) в эффектах хемотипов LPS на синтез лейкотриенов в нейтрофилах, при использовании специфичных ингибиторов. Из рис. 8А видно, что ингибитор sGC (LY83583) вызывает увеличение образования лейкотриенов и, в значительной степени, нивелирует различия в эффектах хемотипов LPS на активность 5-LO. Так же, ингибитор cGK (KT5823) приводит к увеличению активности 5-LO и некоторому "сглаживанию" эффективности разных эндотоксинов (рис. 8В). Из сравнения рис. 8 и таблицы 1 видно, что действие ингибиторов sGC и cGK на синтез лейкотриенов, стимулированный OZ, в праймированных LPS нейтрофилах, аналогично действию L-NAME, ингибитора NOS. Поэтому можно предположить, что эндогенный NO, который в процессе фагоцитоза OZ образуется в нейтрофилах, праймированных LPS, ингибирует активность 5-LO, главным образом, посредством активации sGC и cGK.

Рис. 8. Действие ингибитора sGC LY83583 (А) и ингибитора cGK 5-LO метаболитов (нг/107 PMNLs) A + OZ + 1 мкM LY83583 (за 30 мин KT5823 (В) на синтез метаболитов 5 до добавления OZ) LO, стимулированный OZ в нейтрофилах, праймированных Re, Ra и S формами LPS. Нейтрофилы инкубировали 30 мин с 5 мкг/мл хемотипов LPS в присутствии или в отсутствие 1 мкМ LY83583 (А) или мкМ KT5823 (В), затем добавляли OZ Контроль S Re Ra на 30 мин;

количество продуктов 5-LO метаболитов (нг/107 PMNLs) B + OZ определяли методом HPLC. * P 0.05, + 2 мкM KT5823 (30 мин до добавления OZ) ** P 0.01 по сравнению с соответствующим контролем.

Контроль S Re Ra 1.10. Роль цитоплазматической фосфолипазы А2 и протеин киназы С в эффектах различных хемотипов LPS на образование оксида азота в нейтрофилах.

В данном исследовании было показано, что различия в эффектах разных форм LPS на ряд функций нейтрофилов главным образом связаны с различной степенью активации NOS под действием тестируемых хемотипов LPS. Регуляция активности NOS в нейтрофилах человека практически не изучена. Известно, что АА является мощным ингибитором NOSI в нервных клетках (Palomba et al., 2004). В данной работе было обнаружено ингибирование NOS в нейтрофилах при добавлении экзогенной АА, а также при блокировании фосфолипазы А2 (cPLA2), высвобождающей АА в клетке, с помощью ингибитора cPLA2. В присутствии ингибитора cPLA2 наблюдалось сглаживание эффективности хемотипов LPS (данные не приведены).

Известно, что LPS активируют протеинкиназу С (protein kinase C, PKC) в макрофагах и нейтрофилах (Paul et al., 1995;

Tepperman et al., 2000). Мы исследовали роль протеинкиназы С в эффектах хемотипов LPS. Обнаружено, что стауроспорин – мощный ингибитор РКС, приводит к выравниванию величины эффектов различных форм LPS на синтез NO (данные не приведены). Полученные результаты позволяют предположить участие цитоплазматической фосфолипазы А2 и протеинкиназы С в действии различных форм LPS на образование NO в нейтрофилах человека.

1.11. Предлагаемый механизм действия липополисахаридов различной структуры на фагоцитоз частиц OZ и синтез лейкотриенов в нейтрофилах человека.

В данной работе установлено, что стимулирующее действие LPS различной структуры на процесс фагоцитоза в нейтрофилах обусловлено их действием на синтез 5 липоксигеназных метаболитов (рис. 2). На основе экспериментальных данных предложена модель, описывающая регуляцию активности 5-LO под действием LPS с увеличением длины полисахаридной цепи в нейтрофилах, фагоцитирующих частицы OZ (рис. 9).

Рис. 9. Схема модулирования активности 5-LO под действием O2 LPS с увеличивающейся длиной OONO- NO полисахаридной цепи в нейтрофилах, фагоцитирующих Липид А частицы OZ. В клетках OZ вызывает транслокацию 5-LO к ядро OZ NOS ядерной мембране, активацию 5 sGC LO и синтез лейкотриенов.

5-LO cGK А. Липид А (на примере исследования Re формы LPS) A запускает сигнальный каскад, LTs приводящий к увеличению активности цитоплазматической O2 NOS нейтрофилов, что вызывает повышение уровня эндогенного OONO NO и подавление синтеза 5 NO LPS липоксигеназных метаболитов, преимущественно посредством OZ активации sGC и cGK.

ядро sGC NOS В. Центральный олигосахарид cGK 5-LO LPS (на примере исследования Rа LPS) формы способен B стимулировать дополнительный сигнал, приводящий к LTs подавлению активности NOS, что ведет к уменьшению синтеза NO, увеличению активности 5-LO и образования лейкотриенов. Указано, что запуск сигнала на подавление активности NOS в клетках сопровождается увеличением образования супероксид иона O2-, которое было максимальным при действии Ra и S форм LPS. При взаимодействии O2-· и NO образуется пероксинитрит OONO-, обладающий нитрующими и окислительными свойствами.

Часть 2. Регуляция биосинтеза лейкотриенов под действием LPS из Pseudomonas aeruginosa холестерином и другими липидами.

Важными факторами, регулирующими клеточные ответы на действие LPS, являются липопротеиды и липиды плазмы крови человека. Сравнение действия LPS из двух источников: Salmonella typhimurium и Pseudomonas Aeruginosa, показало, что эффекты LPS из P. Aeruginosa более чувствительны к добавлению липидов (данные не приведены).

Нейтрофилы играют ключевую роль в выведении из легких патогенных бактерий P.

Aeruginosa, вызывающих пневмонию (Seeger and Lasch, 1987). В данной работе было показано стимулирующее действие LPS из Pseudomonas Aeruginosa 10 на фагоцитоз OZ нейтрофилами человека (данные не приведены). Учитывая роль лейкотриенов в процессе фагоцитоза, было исследовано влияние LPS и ряда липидов на активность 5-LO в нейтрофилах. Для изучения совместного действия липидов и LPS на активность 5-LO использовали более мощный (по сравнению с OZ) стимул для активации 5-LO кальциевый ионофор A23187, что позволяло снизить количество клеток в инкубации. мин прединкубации нейтрофилов с LPS из Pseudomonas aeruginosa 10 приводили к увеличению продукции 5-LO метаболитов на ~ 30% при активации клеток А23187 (рис.

10).

Роль липидов в регуляции клеточных ответов изучена значительно меньше, чем генная и белковая регуляция. Основная сложность, но вместе с тем и преимущество, липидного воздействия состоит в том, что липиды оказывают глобальный эффект на регулировку всей клеточной машины. В экспериментах с липидными везикулами в бесклеточной системе недавно было показано, что флюидизация мембран является одним из ключевых факторов, способствующих связыванию 5-LO с мембраной и последующей активации фермента. Одним из самых распространенных фосфолипидов клеточных мембран является 1,2-диацил-sn-глицеро-3-фосфохолин или фосфатидилхолин (PC).

Известно, что PC способствует связыванию 5-LO с мембраной. В физиологических условиях содержание РС в околоядерных мембранах выше, чем в плазматической мембране. В экспериментах с использованием везикул различного состава было показано, что наличие в них катионных липидов (1,2-димиристоил-глицеро-3-этилфосфохолин) увеличивает, а анионных (1-пальмитоил-2-олеил-глицеро-глицерин-3-фосфат) – снижает активность 5-LO (Pande et al., 2004). Ранее в нашей группе было обнаружено, что анионные производные галактоцереброзидов – сульфатиды, также подавляют активность этого фермента (Sud'ina et al., 2001).

Уникальное положение среди прочих липидов занимает холестерин (Chol), который является важным структурообразующим компонентом клеточных мембран и воздействует на процессы флюидизации мембран. Отношение РС/Chol в клетках организма зависит от типа клеток и колеблется около 30 % Chol (РС/Chol = 70:30) в плазматической мембране.

Также холестерин присутствует в плазме крови, где происходит его этерификация.

Известно, что сульфат холестерина, аналогично холестерину, взаимодействует с фосфолипидами и участвует в организации липидного бислоя мембраны (Kitson et al., 1992).

Недавно было обнаружено, что 5-LO вовлечена в развитие атеросклероза (Mehrabian et al., 2003). В последнее время широко обсуждается инфекционная природа атеросклероза (Cullen et al., 2005), поэтому изучение регуляции эффекта бактериальных эндотоксинов на активность 5-LO под действием липидов плазмы крови представляет большой интерес. В данной работе проведено исследование совместного воздействия LPS из Pseudomonas aeruginosa 10 и следующих липидов: холестерина (Chol), его сульфата (cholesterol sulfate, CS) и фосфата (cholesterol phosphate, CP). На рис. 10 (слева) видно, что холестерин и его производные вызывают подавление синтеза лейкотриенов с эффективностью ингибирования CP CS Chol. Ранее в нашей лаборатории был исследован механизм подавления активности 5-LO под действием холестерина и его эфиров (Aleksandrov et al., 2006). Из рис. 10 (слева) видно, что Chol снижает уровень синтеза лейкотриенов как в интактных клетках, так и в праймированных LPS даже на фоне увеличения активности 5 LO под действием LPS. Добавление клеткам сульфата холестерина (CS) или фосфата холестерина (РС) также приводит к снижению синтеза лейкотриенов, кроме того, LPS в присутствии этих липидов не вызывает дополнительную активацию 5-LO по сравнению с интактными клетками.

Рис. 10. Влияние LPS из * 5-LO метаболитов (нг/107 PMNLs) Pseudomonas Aeruginosa на синтез 5-LO метаболитов и - LPS модулирование эффекта LPS + LPS * под действием липидов.

Нейтрофилы инкубировали * 30 мин с 5 мкг/мл LPS и мкМ липидов (слева) или с мкг/мл LPS и 250 мкМ липидов (справа), затем добавляли 2 мкМ ионофора Контроль Chol, CS, CP, PC PC/Chol PC/CS PC/CP А23187 на 10 мин.

175:75 175:75 мкМ (- липиды) 75 75 75 250 175: 100% 70:30 70:30 70: Отношение липидов указано в мольных %. Количество продуктов определяли методом HPLC. * P 0.05 к с соответствующему контролю.

Следующая серия экспериментов по изучению эффекта LPS на активность 5-LO была проведена в присутствии характерных для клеточных мембран комбинаций PC с Chol или его эфирами (РС/Chol, РС/CS, РС/СР в соотношении 70:30). Как видно из рис. 10 (справа), активность 5-LO выше в присутствии PC, а ингибирующие эффекты холестерина и его эфиров сохраняются независимо от присутствия РС в липидных везикулах. Однако, стимулирующий эффект LPS на активность 5-LO не наблюдается в присутствии 100% РС.

Примечательно, что введение Chol в состав везикул (РС:Chol = 70:30) восстанавливает и усиливает стимулирующее влияние LPS на активность 5-LO (рис. 10, справа), несмотря на ингибирующий эффект самого липида.

Экзогенно добавленные липиды могут влиять как на структуру агрегатов LPS, так и на состав клеточных мембран. Известно, что РС способен извлекать Chol из мембраны клетки (Borodin et al., 1985). Нейтрализация активности LPS под действием ряда катионных пептидов и липидов основана на их взаимодействии с отрицательно заряженными фосфатными группами в составе LPS. Изменения в составе плазматической мембраны и положительно заряженные группы холина в составе РС могут ингибировать активность LPS. Везикулы PC, содержащие 30 % Chol, что соответствует среднему соотношению РС и Chol в клеточных мембранах, не способны экстрагировать Chol.

Данные об увеличении активности 5-LO под действием LPS в присутствии везикул РС/Chol позволяют сделать вывод, что присутствие Chol в мембране клетки необходимо для поддержания биологической активности LPS. Однако замена Chol в составе везикул на CS или CP приводит к элиминированию стимулирующего влияния LPS на активность 5-LO, аналогично эффекту эфиров Chol в отсутствие РС.

Принимая во внимание гипотезу об инфекционной природе атеросклероза (Cullen et al., 2005), полученные данные позволяют предположить, что Chol поддерживает эффекты LPS и может служить медиатором развития воспалительного процесса. Но сульфат холестерина элиминирует активность Chol и нейтрализует активность LPS.

Присоединение сульфо-группы к липидам является физиологически значимой модификацией липидов, таких как, Chol (Roberts and Lieberman, 1970) и галактоцереброзиды (Honke et al., 2004). Предположительно, сульфатированные липиды являются специфическими эндогенными регуляторами синтеза лейкотриенов в нейтрофилах человека. Таким образом, в данной работе было выявлено двоякое действие Chol на активность 5-LO (рис. 11).

Рис. 11. Схема, иллюстрирующая разнонаправленные эффекты холестерина на синтез лейкотриенов нейтрофилами в ядро присутствии LPS. Холестерин ингибирует 5 холестерин липоксигеназную активность, но поддерживает стимулирующий эффект LPS на синтез LTs.

цитоплазма ВЫВОДЫ 1) Выявлен стимулирующий эффект различных форм эндотоксинов из Salmonella typhimurium на фагоцитоз частиц опсонизированного зимозана нейтрофилами человека с эффективностью действия хемотипов LPS: Re S Ra.

2) Показано, что действие хемотипов LPS на фагоцитоз OZ нейтрофилами в значительной степени обусловлено их воздействием на синтез продуктов 5-липоксигеназного окисления арахидоновой кислоты – лейкотриенов.

3) Показано, что эффективность стимулирующего действия различных форм LPS на фагоцитоз OZ коррелирует с их эффектами на адгезию, синтез LTs и образование супероксид-иона в нейтрофилах человека.

4) Установлено, что способность хемотипов LPS с различной эффективностью стимулировать фагоцитоз OZ, образование супероксид-иона и синтез LTs обусловлена различиями по эффективности активации синтеза оксида азота (Ra S Re).

5) Показано, что синтез NO в нейтрофилах, стимулированный LPS и OZ, осуществляется ферментативно под действием NO-синтазы. Продемонстрировано присутствие в клетках изоформ NOSI и NOSII.

6) Установлено, что эндогенный оксид азота ингибирует активность 5-липоксигеназы непосредственно, а также через активацию растворимой гуанилатциклазы и протеинкиназы G (sGC/cGK).

7) На основе анализа всей совокупности экспериментальных и литературных данных предложена модель, описывающая действие различных форм эндотоксинов с возрастающей длиной цепи на опсонин-зависимый фагоцитоз и связанные с этим процессом функции нейтрофилов человека. Предполагается, что центральный полисахарид инициирует сигнальный каскад, приводящий к подавлению стимулирующего эффект липида А на активность NOS, вызывая увеличение активности 5-LO.

8) Установлено, что фосфатидилхолин нейтрализует действие LPS на активность 5-LO и что холестерин, присутствующий в мембране клетки, играет важную роль в реализации эффекта LPS на активность фермента.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Pushkareva M.A., Zagryagskaya A.N., Aleksandrov D.A., Sud’ina G.F. Cholesterol Sulfate Inhibits 5-lipoxygenase Activation in Human Polymorphonuclear Leukocytes and Abolishes Effect of Pseudomonas aeruginosa Lipopolysaccharides on Leukotriene Synthesis. // Abstracts of the ASCB & European Cytoskeleton forum “Dynamic Interplay Between Cytoskeletal and Membrane Systems”. 2007. P.26-27.

2. Загряжская А.Н., Гришина З.В., Галкина С.И., Судьина Г.Ф. Действие липополисахаридов из Pseudomonas aeruginosa на фагоцитоз и синтез лейкотриенов в полиморфноядерных лейкоцитах человека. // Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии. 2007. C.431-433.

3. Судьина Г.Ф., Александров Д.А., Гришина З.В., Пушкарева М.А., Загряжская А.Н., Галкина С.И. Синтез лейкотриена В4 и его роль как сигнальной молекулы. Регуляция биосинтеза лейкотриенов под действием холестерина и других липидов. // Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии. 2007.

C.387-390.

4. Загряжская А.Н., Галкина С.И., Пушкарева М.А., Гришина З.В., Судьина Г.Ф.

Фагоцитоз и синтез лейкотриенов полиморфноядерными лейкоцитами человека. // Тезисы Четвертой крымской конференции “Окислительный стресс и свободнорадикальные патологии”. 2008. C.49.

5. Zagryagskaya A.N., Aleksandrov D.A., Pushkareva M.A., Galkina S.I., Grishina Z.V., Sud’ina G.F. Biosynthesis of Leukotriene B4 in Human Polymorphonuclear Leukocytes:

Regulation by Cholesterol and Other Lipids. // Journal of Immunotoxicology. 2008. V.5. N.04.

P.347-352.

6. Zagryagskaya A.N., Golenkina E.A., Galkina S.I., Grishina Z.V., Sud’ina G.F. Effect of Pseudomonas aeruginosa Lipopolysaccharides on Leukotriene Synthesis in Human Polymorphonuclear Leukocytes: Regulation by Cholesterol and Other Lipids. // Abstracts of the Keystone symposium “Complex Lipids in Biology: Signaling, Compartmentalization and Disease”. 2009. P.135.