Механизм ферментативных реакций гидролиза гуанозинтрифосфата по результатам молекулярного моделирования
На правах рукописи
ШАДРИНА Мария Сергеевна МЕХАНИЗМ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ ГИДРОЛИЗА ГУАНОЗИНТРИФОСФАТА ПО РЕЗУЛЬТАТАМ МОЛЕКУЛЯРНОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ 02.00.17 — математическая и квантовая химия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени кандидата физико-математических наук
Москва 2008
Работа выполнена в лаборатории химической кибернетики кафедры физической химии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова Научный руководитель доктор физико-математических наук Григоренко Белла Людвиговна Официальные оппоненты доктор физико-математических наук Ефремов Роман Гербертович доктор физико-математических наук Венер Михаил Владимирович Ведущая организация Институт биохимической физики им. Н.М.Эмануэля РАН
Защита состоится «23» октября 2008 года в 16:30 в 337 аудитории Химического факультета МГУ на заседании диссертационного совета Д 501.001.50 при МГУ имени М В. Ломоносова (119991, Москва, ГСП–2 Ленинские горы, д. 1, стр. 3, МГУ имени М. В. Ломоносова, Химический факультет).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.
Автореферат разослан «» _ 2008 года.
Учёный секретарь диссертационного совета Д 501.001.50, кандидат химических наук Матушкина Н. Н.
Общая характеристика работы
Актуальность темы Исследование механизмов реакций ферментативного катализа, включая стадии элементарных химических превращений в активных центрах белков, необходимо для получения знаний о функционировании клеток живых организмов, для решения практических задач фармацевтики и биотехнологии. Результаты экспериментальных методов, применяемых для изучения ферментативных реакций, включая традиционные кинетические исследования, часто в сочетании с приемами генной инженерии, а также исследования методами рентгеноструктурного анализа (РСА) и ядерно-магнитного резонанса (ЯМР) комплексов ферментов с аналогами субстратов или ингибиторами, предоставляют важнейшую информацию о механизмах сложных превращений в белках.
Результаты компьютерных расчетов на основе современных методов молекулярного моделирования, а именно, молекулярной механики (ММ), молекулярной динамики (МД), квантовой химии и комбинированных подходов квантовой механики – молекулярной механики (КМ/ММ), позволяют существенно дополнить экспериментальные исследования, добавить новую информацию и обеспечить визуализацию процессов ферментативного катализа с атомным разрешением.
Диссертация посвящена изучению методами молекулярного моделирования одной из важнейших биохимических реакций - ферментативного гидролиза гуанозинтрифосфата (ГТФ) в различных гуанозиннуклеотид связывающих белках (G белках). Несмотря на большой объем накопленной экспериментальной информации по кинетическим и структурным данным для реакции GTP + H2O GDP + Pi где GTP и GDP обозначают гуанозинтрифосфат и гуанозиндифосфат, Pi – неорганический фосфат, и на неоднократные попытки ее теоретического осмысления, заключение о механизме этой реакции в различных средах остаётся предметом дискуссий в научной литературе.
Цель работы Цель работы заключалась в систематическом изучении элементарных стадий реакции гидролиза гуанозинтрифосфата в различных G-белках с использованием методов КМ/ММ, молекулярной механики и молекулярной динамики и установлении общего механизма химических превращений в активных центрах ферментов.
В работе решались следующие задачи:
1. Выделить типы активных центров G-белков и аминокислотные остатки, участвующие в связывании и гидролизе ГТФ, на основании экспериментальных структурных данных и результатов молекулярного моделирования.
2. Провести детальные расчеты полных профилей энергии вдоль реакционного пути реакции гидролиза GTP + H2O GDP + Pi от фермент-субстратных комплексов до продуктов для выделенных репрезентативных ферментативных систем.
3. Построить структуры фермент-субстратных комплексов для различных представителей G-белков и сформулировать прогнозы о механизме гидролиза ГТФ в этих системах.
Научная новизна результатов 1. Молекулярное моделирование позволило получить детальную картину химических превращений в реакциях гидролиза ГТФ в различных G-белках. С помощью метода КМ/ММ были локализованы стационарные точки на поверхностях потенциальной энергии, определены энергетические характеристики отдельных стадий реакций, что в конечном итоге позволило предложить единый механизм химической реакции ферментативного гидролиза ГТФ.
2. Получены структуры фермент-субстратных комплексов для ряда G-белков, отражающие основные типы активных центров, и проведен их сравнительный анализ. Выделены основные аминокислотные остатки, участвующие в связывании и гидролизе ГТФ для разных типов активных центров.
3. Для сигнального белка p21Ras построен энергетический профиль реакции гидролиза GTP + H2O GDP + Pi.
4. Для фактора роста EF-Tu построен энергетический профиль реакции гидролиза GTP + H2O GDP + Pi для двух случаев: в присутствии и отсутствии рибосомы.
Объяснена роль аминокислотного остатка гистидина 85 в этих реакциях.
5. С использованием данных о структурах реагентов и переходных состояний, полученных методом КМ/ММ, рассчитаны и сопоставлены с экспериментальными результатами кинетические изотопные эффекты 18О/16О для реакций гидролиза ГТФ в системах p21Ras, p21Ras*RasGAP, EF-Tu.
6. Показано, что реакция гидролиза ГТФ для различных G-белков протекает по единообразному диссоциативному механизму: на первой стадии отщепляется гамма-фосфатная группа ГТФ, затем происходит нуклеофильная атака реакционной молекулы воды по атому фосфора отщепляющейся фосфатной группы с последующим переносом протонов и образованием неорганического фосфата и ГДФ.
Практическая значимость данной работы заключается в том, что результаты исследования позволяют детализировать механизм химической реакции на молекулярном уровне и, следовательно, дают принципиальную возможность управлять ферментативными реакциями. Результаты исследования могут быть использованы в разработке новых биологически активных соединений и лекарственных препаратов.
Апробация работы и публикации Материалы диссертации были представлены на V международной молодежной конференции (Институт биохимической физики РАН им. М.Н. Эмануэля, Москва, 2005), 3-й Всероссийской школе-симпозиуме «Динамика и структура в химии и биологии» (Москва, 2005), III международной конференции по водородным связям и молекулярному взаимодействию (Киев, 2006), 5-й Всероссийской конференции "Молекулярное моделирование" (Москва, 2007), 4-м международном симпозиуме «Компьютерные методы в токсикологии и фармакологии, включающие Интернет ресурсы» (Москва, 2007), 2-й международной конференции «Biocatalysis 2008» (Москва, 2008).
Результаты работы опубликованы в 10 печатных работах, в том числе в статьях в рецензируемых научных журналах.
Структура и объем работы Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы из 112 наименований. Работа включает 92 рисунка и таблицу.
Содержание работы Первая глава посвящена описанию методов моделирования (КМ/ММ, молекулярной динамики, молекулярной механики) и литературным данным по объектам моделирования – G-белкам.
Общая идея комбинированного метода квантовой и молекулярной механики (КМ/ММ) сводится к разделению рассматриваемой системы на две части.
В квантовую подсистему (КМ-часть) включаются наиболее важные для реакции атомы, при этом энергии и силы, действующие на атомы, рассчитываются методами квантовой химии. В молекулярно-механическую подсистему (ММ-часть) входят оставшиеся аминокислотные остатки и молекулы воды;
при этом энергии и силы вычисляются с использованием эмпирических силовых полей. В данной реализации метода КМ/ММ взаимодействие между КМ- и ММ-подсистемами описывается с помощью теории потенциалов эффективных фрагментов [Grigorenko B.L. и др., 2002].
В качестве эффективного фрагмента рассматривается часть молекулы, внутренние координаты которой можно считать фиксированными. В этом подходе аминокислотные остатки разбиваются на фрагменты, типичные для полипептидных систем;
молекулы воды представляют собой отдельные фрагменты. Влияние окружения (ММ-части) на квантово-механическую часть описывается электростатическими и обменно-отталкивательными вкладами в одноэлектронную матрицу квантового гамильтониана.
Компьютерная реализация данного варинта метода КМ/ММ основана на использовании двух пакетов компьютерных программ: PC GAMESS [Грановский A.A.] и TINKER [Ponder J.W.]. Геометрическая оптимизация и расчеты энергии в КМ части выполнены методом Хартри-Фока с использованием базиса LANL2DZ(d,p)_ECP. Взаимодействие между атомами, входящими в эффективные фрагменты ММ-части, рассчитано методом молекулярной механики с силовым полем AMBER.
Метод молекулярной динамики преимущественно использовался для предварительной оптимизации геометрических конфигураций фермент-субстратных комплексов и для уточнения положений молекул воды и каталитических аминокислотных остатков в активных центрах ферментов. Начальные координаты тяжелых атомов были взяты из структур, содержащихся в банке данных белковых структур (PDB). Расчеты проводились с использованием программных пакетов HyperChem 7 и NAMD 2.6 с применением силовых полей AMBER и Charmm 27.
C помощью метода молекулярного докинга изучалось положение молекулы гуанозинтрифосфата в активных сайтах некоторых G-белков. Расчеты выполнялись с помощью программы Autodock 3.0, позволяющей изучать связывание лиганда с белком, оценивать комплементарность белка и лиганда, находить энергию связывания лиганда в комплексе с белком.
В данной работе были рассмотрены три класса G-белков: мономерные, гетеротримерные G-белки и белковые факторы. Известно, что для всех G-белков характерен цикл гидролиза, в котором белок и молекула ГТФ, проходя через ряд изменений, возвращаются в исходное состояние. При этом белок бывает в двух состояниях: активном, в котором он связан с ГТФ и может передавать сигнал на эффектор, и неактивном, когда связан с ГДФ и передавать сигнал не может. Переход из активного состояния в неактивное проходит при помощи белка-активатора.
Обратный переход осуществляется при помощи обменного фактора.
Из литературных данных известно, что гидролиз ГТФ может проходить в чистом G-белке или в присутствии белка-активатора. Обычно в качестве белка активатора выступают белки GAP или RGS белки. Поэтому большинство выбранных систем рассматривалось в присутствии и в отсутствии белка-активатора.
Для выбранных трех классов G-белков известно большое число экспериментальных исследований, включая данные кристаллографического анализа, кинетических и мутационных исследований.
Вторая глава содержит результаты исследований механизма реакции гидролиза гуанозинтрифосфата в белковых комплексах p21Ras и p21Ras*RasGAP, которые участвуют в передаче сигнала роста в клетке. Из экспериментальных данных известно, что гидролиз гуанозинтрифсофата может проходить в чистом белке p21Ras (в лабораторных условиях) или в белковом комплексе p21Ras*RasGAP (в живых организмах). Присутствие субъединицы RasGAP ускоряет гидролиз ГТФ в 105 раз. Из кинетических данных известно, что наиболее критичные мутации в этих белках – мутации по аминокислотным остаткам Gln61 белка p21Ras и Arg789 белка RasGAP.
Были рассмотрены кристаллические структуры белковых комплексов p21Ras*GTP(N), где GTP(N) – аналог ГТФ, в котором мостиковый,-кислород заменен атомом азота (код PDB:5P21), и p21Ras*RasGAP*GDP*AlF3 (код PDB:1WQ1). При моделировании в этих структурах молекулы аналогов, GTP(N) или GDP*AlF3, заменялись молекулой ГТФ. Сравнение кристаллических структур белка p21Ras из структур 5P21 и 1WQ1 показало, что основные отличия наблюдаются в цепи, состоящей из аминокислотных остатков 59-71. Из литературных данных известно, что петля L4 (аминокислотные остатки 61-67) обладает большой конформационной гибкостью, и изменение ее конформации может влиять на ГТФазную активность белка p21Ras.
С помощью метода молекулярного докинга было проведено исследование комплекса p21Ras*GTP с разными конформациями цепи аминокислотных остатков 59-70 в белке p21Ras. Сравнительными критериями, определяющими однозначность найденного положения, служили вероятность связывания и стандартное отклонение.
Найдено, что вероятности связывания для конформации с исходным положением цепи 59-70 и конформации с «развернутым» (аналогично структуре p21Ras*RasGAP) положением цепи 59-70 равны 99 и 97%, соответственно. При этом стандартное отклонение от данных РСА в обоих случаях равно 0,36. Таким образом, мы показали, что связывание молекулы ГТФ в активном центре белка p21Ras не зависит от конформаций цепи аминокислотных остатков 59-70, в том числе, и от положения Gln61.
Для расчетов методом КМ/ММ была взята часть структуры белка p21Ras. В КМ-часть были включены 33 атома, в ММ-часть - 1464 атома, объединенных в эффективных фрагмента. На Рис.1 приведена оптимизированная структура активного центра фермент-субстратного комплекса p21Ras*GTP.
Результаты расчетов методом КМ/ММ энергетических профилей показывают, что реакции гидролиза ГТФ в белке p21Ras проходит по диссоциативному механизму:
• На первой стадии происходит отщепление -фосфатной группы ГТФ под действием окружения активного центра белка. Одновременно с отщеплением фосфатной группы происходит стереоинверсия -фосфатной группы.
Расстояние P - O изменяется от 1,7 в структуре реагентов до 2,4 в структуре первого переходного состояния и составляет 3,2 для геометрической конфигурации интермедиата.
• На следующих стадиях реакции молекула воды нуклеофильно атакует фосфор, затем происходит перенос двух протонов по цепи из двух молекул воды и аминокислотного остатка Gln61. На промежуточной стадии образуется HPO42-. В завершение реакции протон от аминокислотного остатка Gln61 по цепи водородных связей переходит на HPO42-, образуя продукт реакции H2PO42 Ранее методом КМ/ММ в рамках сходных приближений были проведены расчеты профиля реакции гидролиза ГТФ в белковом комплексе p21Ras*RasGAP и сформулированы предложения по механизму реакции [Grigorenko B.L. и др., 2005].
Результаты нашей работы с p21Ras позволили сопоставить механизм реакции в этих двух системах и показать, что реакция гидролиза ГТФ для p21Ras и p21Ras*RasGAP проходит по аналогичному механизму. На Рис. 2 сопоставлены энергетические профили реакции гидролиза ГТФ для этих систем. Отметим, что для белкового комплекса p21Ras*RasGAP барьер реакции ниже на 4,2 ккал/моль, чем для белка p21Ras. Полученная разность энергий активации соответствует экспериментальному значению по константам скоростей гидролиза для рассматриваемых систем.
Заметное снижение активационного барьера для системы p21Ras*RasGAP происходит за счет двух факторов:
• фиксации аминокислотного остатка Gln61 в положении, удобном для проведения реакции гидролиза;
• предоставления т.н. «аргининового пальца» - Arg789 (RasGAP), в активный центр белка p21Ras, что способствует отщеплению гамма-фосфатной группы при гидролизе и стабилизирует переходное состояние.
Рис.2. Сравнение профилей реакции гидролиза ГТФ в белках p21Ras и p21Ras*RasGAP.
Кроме того, энергетический баланс реакции гидролиза ГТФ в белке p21Ras меньше, чем в белке p21Ras*RasGAP. Это свидетельствует о том, что аминокислотное окружение белка p21Ras*RasGAP лучше компенсирует перераспределение зарядов в активном центре при образовании продуктов гидролиза.
В структурах фермент-субстратных комплексов p21Ras и p21Ras*RasGAP прослеживается четкая сеть водородных связей. Следует выделить наиболее важные из них:
Магниевый центр. Катион магния координируется Thr35, Ser17, двумя атомами кислорода фосфатных групп ГТФ и двумя молекулами воды.
Координация - и -кислородов. Аминокислотные остатки Gly13, Lys16, Gly60 образуют водородные связи с - и -кислородами фосфатных групп ГТФ, что приводит к перераспределению электронной плотности, таким образом, облегчая отщепление -фосфатной группы.
Координация реакционной молекулы воды. Водородная связь от атома кислорода основной цепи Thr35 удерживает реакционную молекулу воды в оптимальном для реакции положении.
Также есть некоторые различия между структурами фермент-субстратных комплексов эти двух систем:
Роль остатка Gln61. Боковая цепь Gln61 в белке p21Ras позиционирует вторую молекулу воды, а в комплексе p21Ras*RasGAP - реакционную молекулу воды, и остаток Gln61 непосредственно участвует в реакции.
Роль «аргининового пальца». В белке p21Ras*RasGAP появляется «аргининовый палец», который образует водородные связи с - и -кислородами гуанозинтрифосфата. Таким образом, Arg789 дополнительно способствует отщеплению гамма-фосфатной группы.
В третьей главе приведены результаты расчетов и анализа энергетических профилей реакции гидролиза ГТФ другим G-белком - фактором элонгации Tu (EF Tu), который играет важную роль в процессе биосинтеза белков, катализируя присоединение тройного комплекса EF-Tu*GTP*аа-tRNA к А сайту рибосомы.
Известно, что гидролиз ГТФ может проходить в самом белке EF-Tu (в лабораторных условиях) или на рибосоме (в живой клетке). Кинетические исследования показали, что на рибосоме гидролиз идет в 105 раз быстрее, чем в чистом EF-Tu. Из данных мутационного анализа известно, что наиболее важными аминокислотными остатками для реакции гидролиза в присутствии рибосомы является His85. При этом в чистом белке EF-Tu мутация His85 на скорость гидролиза не влияет.
Из-за экспериментальных сложностей структура комплекса EF-Tu с рибосомой до сих пор не получена. В известных кристаллографических структурах EF-Tu с аналогами ГТФ остаток His85 развернут в сторону от активного центра, и между ним и активным центром располагаются боковые цепи Val20 и Ile61 (т.н., «гидрофобные ворота»), которые полностью закрывают доступ His85 в активный центр (Рис.3).
Согласно рабочей гипотезе [Pape T. и др., 1998] при образовании сложной системы EF-Tu*GTP*аа-tRNA-рибосома происходят конформационные изменения в факторе элонгации, в результате чего «гидрофобные ворота» открываются и боковая цепь His85 разворачивается к активному центру и принимает прямое участие в реакции гидролиза.
В качестве начальной конфигурации для расчетов механизма гидролиза ГТФ в белке EF-Tu была использована кристаллическая структура белкового комплекса EF Tu*GTP(N) (код PDB:1EFT). С помощью метода молекулярной динамики мы смоделировали конформационные изменения в белке EF-Tu, т.е. раздвинули «гидрофобные ворота» и развернули остаток His85 в сторону -фосфатной группы. В результате была получена структура фактора EF-Tu с положениями аминокислотных остатков в активном центре белка, соответствующими активному состоянию белка, или комплексу EF-Tu*GTP*аа-tRNA-рибосома.
В ходе исследования были рассмотрены две модели: модель «закрытой конформации» (остаток His85 внутри активного центра), которая соответствует Lys Gly 2. 2. Mg2+ P 2.76 3. P 2. Gln61 2. Gly13 P Рис.1. Активный центр фермент-субстратного комплекса для белка p21Ras*GTP.
Рис.3. Кристаллическая структура активного центра белка EF-Tu.
Рис.4. Геометрическая конфигурация структуры реагентов для EF-Tu в закрытой конформации.
Рис.5. Геометрическая конфигурация структуры реагентов для EF-Tu в открытой конформации.
Рис.7. Наложение активных центров фермент-субстратных комплексов EF-Tu в закрытой конформации (зеленый) и p21Ras*RasGAP (синий).
Рис.8. Наложение активных центров первых переходных состояний EF-Tu в закрытой конформации (зеленый) и p21Ras*RasGAP (синий).
Рис.10. Кристаллическая структура белкового комплекса Ran*RanGAP*RanBP1*GTP(N).
Рис.11. Конфигурация активного центра в рассчитанной структуре фермент-субстратного комплекса в белке Ran*RanGAP*RanBP1.
Рис.12. Кристаллическая структура белкового комплекса Gs*GTP(S) (зеленым выделено скорректированное положение остатков Gln227 и Arg201).
Рис.13. Активный центр фермент-субстратного комплекса Gs* GTP по результатам моделирования.
Рис.14. Наложение кристаллических структур активных центров мономерных G-белков с активирующими частицами.
комплексу EF-Tu*GTP*аа-tRNA-рибосома, и модель «открытой конформации» (His вне активного центра), которая соответствует комплексу EF-Tu*GTP.
Модель «закрытой конформации» включает молекулу ГТФ, 210 молекул воды, катион магния и аминокислотные остатки белка EF-Tu. В КМ-часть были включены 36 атомов, в ММ-часть - 1811 атомов, объединенных в 556 эффективных фрагментов. На Рис. 4 приведена структура полученного фермент-субстратного комплекса для модели «закрытой конформации».
Было показано, что реакция гидролиза ГТФ в этом случае проходит в одну стадию. При этом сначала, как и в случае белка p21Ras, происходит отщепление гамма-фосфатной группы, которая изменяет свою конформацию через образование плоской частицы PO3-. Затем происходит нуклеофильная атака реакционной молекулы воды по -фосфору с одновременным переносом протона на непротонированный атом азота аминокислотного остатка His85.
Модель «открытой конформации» включает молекулу ГТФ, 100 молекул воды, катион магния и аминокислотные остатки белка EF-Tu. В КМ-часть были включены 24 атомов, в ММ-часть - 448 эффективных фрагментов (1481 атомов). На Рис. 5 приведена структура полученного фермент-субстратного комплекса для модели «открытой конформации».
Было найдено, что механизм реакции в модели «открытой конформации» также включает одну стадию, но в отличие от модели «закрытой конформации» гидролиз проходит без непосредственного участия аминокислотного остатка His85. Начало реакции проходит аналогичным образом: отщепляется -фосфатная группа, происходит нуклеофильная атака молекулы воды. Но перенос протонов осуществляется по цепи водородных связей двух молекул воды.
На Рис.6 приведено сравнение энергетических профилей реакции гидролиза ГТФ в двух моделях. Для модели «открытой конформации» барьер активации получен ниже на 7.2 ккал/моль. Это значение соответствует известным кинетическим данным по скоростям реакции для чистого белка EF-Tu и комплекса EF-Tu*GTP*аа tRNA-рибосома.
В структурах фермент-субстратных комплексов для обоих случаев прослеживается четкая сеть водородных связей. Наиболее важные из них следующие:
Магниевый центр. Катион магния координируется Thr62, Thr25, двумя атомами кислорода фосфатной группы ГТФ и 2 молекулами воды.
Координация - и -кислородов. Аминокислотные остатки Asp21, Lys24, молекулы воды образуют водородные связи с - и -кислородами фосфатной группы ГТФ, что приводит к перераспределению электронной плотности, таким образом, облегчая отщепление -фосфатной группы.
Координация реакционной молекулы воды. Водородная связь от атома кислорода основной цепи Thr62 удерживает реакционную молекулы водя в оптимальном положении.
Различие между фермент-субстратными комплексами двух моделей:
Роль остатка His85. В системе, моделирующей комплекс EF-Tu*GTP*аа tRNA-рибосома, аминокислотный остаток His85 координирует реакционную молекулу воды;
Анализ строения фермент-субстратных комплексов с белками p21Ras и EF-Tu показывает общие структурные элементы.
Рис.6. Сравнение профилей реакции гидролиза ГТФ в двух моделях белка EF-Tu.
В четвертой главе сопоставлены результаты расчетов методом КМ/ММ полных энергетических профилей, структур реагентов, интермедиатов и продуктов, а также кинетических изотопных эффектов для реакции гидролиза ГТФ в белках и комплексах: p21Ras, p21Ras* RasGAP, EF-Tu.
Анализ полученных структур фермент-субстратных комплексов и механизмов реакции гидролиза позволяет выделить общее черты и ключевые структурные элементы активных центров G-белков. На Рис.7 и 8 приведено наложение структур фермент-субстратных комплексов и структур, отвечающих переходному состоянию стадии разрыва связи фосфор-кислород для систем EF-Tu и p21Ras*RasGAP.
На Рис.7 видно, что, несмотря на некоторые отличия в аминокислотных остатках, сеть водородных связей в активных центрах белков остается без изменения.
Это позволяет утверждать о консервативной роли отдельных аминокислотных остатков в связывании и гидролизе гуанозинтрифосфата.
Также при наложении структур первого переходного состояния (Рис.8) для систем EF-Tu и p21Ras*RasGAP обнаруживается явное сходство в расположении участников реакции, что говорит о единообразном механизме химической реакции гидролиза ГТФ. Таким образом, мы считаем, что для систем с единым строением активного центра реакция гидролиза идет по одному механизму.
Для всех рассмотренных методом КМ/ММ систем была проведена оценка кинетического изотопного эффекта (КИЭ). Под КИЭ понимают изменение скорости химической реакции при замене в молекуле реагирующего вещества какого-либо атома его изотопом. В недавних экспериментальных работах [Du X. и др., 2008] был разработан метод определения значений КИЭ, (18O), при замещении изотопа кислорода 16O на 18O в различных положениях в молекуле ГТФ. Для удобства представления и экспериментальных, и теоретических результатов мы используем т.н. «индекс замещения». При его определении мы учитывали различную значимость - и -атомов кислорода ГТФ для реакции гидролиза. Очевидно, что - мостиковый кислород играет ключевую роль в реакции, соответствующей диссоциативному механизму. Следовательно, мы можем заключить, что меченный - мостиковый кислород в экспериментах с 18О должен вносить наибольший вклад в кинетические изотопные эффекты, в то время как, изотопно-замещенные немостиковые атомы кислорода также важны, но в меньшей степени. Именно поэтому мы предлагаем использовать подобную характеристику для субстратов ГТФ, меченных по разным атомам кислорода (см. таблицу в левой части Рис.9). Известные результаты экспериментального определения (18O) для гидролиза ГТФ в Ras и Ras*RasGAP [Du X. и др., 2004] показывают практически линейную зависимость (18O) от индекса замещения (Рис. 9).
Для теоретической оценки значений (18O) мы вычислили колебательные частоты в стационарных точках на поверхностях потенциальной энергии, найденных ранее для реакций гидролиза ГТФ в белках Ras, Ras*RasGAP, EF-Tu, для экспериментально исследованных вариантов изотопного замещения в ГТФ. Мы использовали простейшее приближение теории переходного состояния, в котором учитывали только разницу в энергиях нулевых колебаний реагентов и переходных состояний:
k 16 # # ( O) = 18 Fe ( U16 U18 )/RT k Здесь U# обозначает разницу в потенциальных энергиях между переходным состоянием и фермент-субстратным комплексом, скорректированную с учетом энергии нулевых колебаний, а предэкспоненциальный множитель F равен отношению соответствующих сумм по состояниям, которые были оценены через вклад от реакционной колебательной моды. Примечательно, что рассчитанные нами значения (18O), как и экспериментально измеренные, представляют практически линейную зависимость от индекса замещения (Рис.9).
Рис.9. Зависимость КИЭ от индекса замещения для белков p21Ras и p21Ras*RasGAP.
В таблице в левой части звездочкой помечены атомы O18.
Такая зависимость наблюдается для всех систем, рассмотренных в данной работе: p21Ras, p21Ras*RasGAP и EF-Tu в закрытой и открытой конформациях.
Очевидно, что все три системы обладают сходным поведением при изотопном замещении в молекуле ГТФ. Поскольку вычисленные значения (18O) были получены для теоретически установленного диссоциативного механизма реакции, у нас есть достаточные основания полагать, что экспериментальные данные также согласуются с диссоциативным механизмом для ферментативного гидролиза ГТФ.
Пятая глава посвящена обобщению результатов моделирования структур фермент-субстратных комплексов, полученных методами молекулярного докинга, молекулярной динамики и КМ/ММ для ряда G-белков.
Мономерный белок Ran участвует в транспорте веществ через ядерную мембрану. Реакция гидролиза в белке Ran проходит в 10 раз медленнее, чем в белке p21Ras. Присутствие RanGAP увеличивает скорость гидролиза на 5 порядков.
На Рис.10 приведена структура активного центра белкового комплекса Ran*RanGAP*RanBP1 (код PDB:1K5D). Видно, что место «аргининового пальца» занимает остаток Tyr39, а боковая цепь Arg170 от активационной частицы GAP находится в стороне. С помощью метода молекулярной динамики мы показали, что нет стерических препятствий для участия остатка Arg170 в качестве «аргининового пальца» при условии, что петля с Tyr39 отходит в сторону (по аналогии с системой p21Ras*RasGAP). Однако несмотря на потенциальную возможность участия остатка Arg170, вероятно, его функцию выполняет Tyr39, что подтверждается данными по мутационному анализу по позиции 170.
Методом КМ/ММ была оптимизирована структура фермент-субстратного комплекса (Рис.11), для которого характерны указанные выше структурные элементы активного центра.
Анализ строения активного центра показал сходство с активными центрами ранее рассмотренных систем: наличие магниевого центра, каталитического и активационного остатков, остатков, координирующих реакционную молекулу воду и - и -кислороды ГТФ. Мы видим сходство с активными центрами белковых комплексов p21Ras*RasGAP и Gt*PDE*RGS9. Единственное отличие заключается в присутствие остатка Tyr39, который образует водородную связь с -кислородом ГТФ.
Таким образом, нами был проанализирован фермент-субстратный комплекс, соответствующий типу активного центра с «активационной» аминокислотой Tyr.
Гетеротримерный белок Gs участвует в передаче сигнала с рецептора плазматической мембраны на аденилат циклазу. Константа гидролиза ГТФ в белке Gs составляет 0,06 с-1. Из кинетических данных известно, что для данного белка мутации по остаткам Gln227 и Arg201 являются критическими, но в полученной кристаллической структуре Gs*GTP(S) (код PDB:1AZT) эти остатки находится на расстоянии примерно 5 (Рис.12). Поэтому боковые цепи Gln227 и Arg201 были развернуты к активному центру, и для этой системы была рассчитана структура фермент-субстратного комплекса (Рис. 13).
Анализ строения активного центра показал сходство с активными центрами ранее рассмотренных систем: наличие магниевого центра, каталитического и активационного остатков, остатков, координирующих реакционную воду и - и атомы кислорода ГТФ. Таким образом, найденный фермент-субстратный комплекс Gs*GTP является аналогом полученных ранее фермент-субстратных комплексов p21Ras*RasGAP и Gt*PDE* RGS9*GTP.
Для проверки гипотезы о едином строении активных центров G-белков был проведен сравнительный анализ активных центров G-белков. Мы провели наложение кристаллических структур различных G-белков. В качестве примера на Рис. приведено сравнение активных центров мономерных белков в комплексе с активирующими белками.
Сравнительный анализ большого числа кристаллических структур G-белков, а также результаты молекулярного моделирования, приведенные в данной работе, подтвердили консервативность одних аминокислотных остатков и взимозаменяемость других.
В заключении нами было выделено несколько типов активных центров. G белки могут различаться по:
• каталитической аминокислоте – Gln (p21Ras), Asn (Rap1*Rap1GAP), His (EF Tu, Sar1), Glu (миозин, как пример аденозинтрифосфат-связывающего белка);
при этом в зависимости от сродства каталитической аминокислоты к протону реакция гидролиза может проходить в одну или две стадии, в частности, реакции гидролиза с участием остатков His и Glu проходят в одну стадию, с Gln и Asn проходят в две стадии;
• активационной аминокислоте – Arg (p21Ras*RasGAP), Tyr (Ran*RanGAP), Ser (Rab33, миозин).
Каталитическая и активационная аминокислоты могут принадлежать как самому G-белку, так и его активационной частице. В роли активационной частицы может выступать или белок-активатор (для всех ГТФаз) или спиральный домен (для гетеротримерных белков).
В зависимости от типа активного центра активационная частица может:
• фиксировать каталитическую аминокислоту в положении, удобном для проведения реакции гидролиза;
• предоставлять активационную аминокислоту в активный центр G-белка и таким образом способствовать отщеплению -фосфатной группы, стабилизируя переходное состояние при реакции гидролиза.
Несмотря на различия в строении G-белков, во всех рассмотренных случаях мы видим единое устройство активных центров. Как было показано для детально изученных систем p21Ras, p21Ras*RasGAP, EF-Tu, общее строение активных центров соответствует единой схеме прохождения реакции гидролиза.
Таким образом, мы считаем, что во всех рассмотренных G-белках со сходным строением активного центра, реакция гидролиза ГТФ протекает по единому диссоциативному механизму.
Основные результаты и выводы 1. Комбинированным методом квантовой и молекулярной механики (КМ/ММ) с подвижными эффективными фрагментами рассчитан полный энергетический профиль пути реакции гидролиза гуанозинтрифосфата в белке p21Ras от фермент субстратного комплекса до продуктов реакции гидролиза. Показано, что реакция гидролиза протекает по диссоциативному механизму.
2. Методом КМ/ММ с подвижными эффективными фрагментами рассчитан полный энергетический профиль пути реакции гидролиза гуанозинтрифосфата в белке EF Tu для двух вариантов конформации фермента, моделирующих белок в свободном состоянии и в комплексе с рибосомой. Показано, что в обоих случаях реакция гидролиза протекает по диссоциативному механизму.
3. Выделены общие характеристики реакции гидролиза ГТФ при сопоставлении результатов расчетов методом КМ/ММ: полных энергетических профилей, структур реагентов, интермедиатов и продуктов для химических превращений в белках и комплексах: p21Ras, p21Ras*RasGAP, EF-Tu. Прямое сопоставление вычисленных и экспериментальных значений кинетических изотопных эффектов при замещении 16О на 18О в молекуле ГТФ предоставляет поддержку гипотезе о диссоциативном механизме реакции ферментативном гидролиза ГТФ.
4. Выделены основные структурные элементы активных центров G-белков и объяснены функции важнейших аминокислотных остатков, входящих в активные центры. Показано, что реакция гидролиза ГТФ для различных G-белков протекает по единому диссоциативному механизму: на первой стадии отщепляется фосфатная группа ГТФ, затем происходит нуклеофильная атака реакционной воды по атому фосфора отщепляющейся фосфатной группы с последующим переносом протонов с образованием неорганического фосфата и ГДФ.
5. По результатам моделирования гидролиза фосфатов в различных ферментах сделан вывод, что количество стадий в реакции гидролиза зависит от сродства каталитической аминокислоты к протону. Таким образом, реакции гидролиза с участием остатков His и Glu проходят в одну стадию, с Gln и Asn - в две стадии.
Публикации по теме диссертации 1. Шадрина М.С., Рогов А.В., Бравая К.Б., Немухин А.В. Молекулярный докинг производных гуанозиннуклеотидов в ГТФ-связывающие белки // Вестник Моск. Ун та, Серия 2, Химия, 2005, Т.46, №6, С.363-369.
2. Немухин А.В., Григоренко Б.Л., Шадрина М.С. Механизмы реакций ферментативного гидролиза нуклеозидтрифосфатов по данным расчетов методом квантовой и молекулярной механики // Российский химический журнал (Журнал Российского химического общества им. Д.И.Менделеева), 2007, Т.51, С.27-33.
3. Grigorenko B., Nemukhin A., Shadrina M., Topol I., Burt S. Mechanisms of guanosine triphosphate hydrolysis by Ras and Ras-GAP proteins as rationalized by ab initio QM/MM simulations // Proteins: Structure, Function and Bioinformatics, 2007, V.66, P.456-466.
4. Grigorenko B., Shadrina M., Topol I., Collins J., Nemukhin A., Mechanism of the Chemical Step for the Guanosine Triphosphate (GTP) Hydrolysis Catalyzed by Elongation Factor Tu //Biochim. Biophys. Acta: Proteins and Proteomics, 2008, doi:
10.1016/j.bbapap.2008.08.003.
5. Шадрина М.С., Григоренко Б.Л., Немухин А.В. Структура фермент-субстратного комплекса при гидролизе гуанозинтрифосфата фактором роста EF-Tu: Сопоставление результатов квантовой и молекулярной механики и молекулярной динамики // Вестник Моск. Ун-та, Серия 2, Химия, в печати.
6. Рогов А.В., Григоренко Б.Л., Шадрина М.С., Бравая К.Б., Доброгорская Я.И., Немухин А.В. Моделирование ферментативных реакций гидролиза гуанозинтрифосфата // Тезисы докладов II Российской школы-конференции “Молекулярное моделирование в химии, биологии и медицине”, Саратов, 2004, С.19.
7. Grigorenko B.L., Rogov A.V., Shadrina M.S., Anosova E.V. The role of hydrogen bonding in triphosphate hydrolysis in proteins and solutions // Book of abstracts of III International Conference on Hydrogen Bonding and Molecular Interactions, Kyiv, Ukraine, 2006, P. 8. Немухин А.В., Григоренко Б.Л., Шадрина М.С. Моделирование механизмов ферментативных реакций гидролиза нуклеозидтрифосфатов // Тезисы докладов 5-й Всероссийской конференции "Молекулярное моделирование", Москва, 2007, С.30.
9. Shadrina M.S., Grigorenko B.L., Nemukhin A.V. Modeling catalytic mechanisms of hydrolysis of nucleoside triphosphates (NTP) // Book of abstracts of Fourth International Symposium on Computational Methods in Toxicology and Pharmacology Integrating Internet Resources (CMTPI-2007), Moscow, 2007, P.147.
10. Shadrina M.S., Grigorenko B.L., Polyakov I.V., Knyazeva M.A., Nemukhin A.V.
Modeling enzymatic hydrolysis of nucleoside triphosphates // Book of abstracts of 2-nd International conference “Biocatalysis in non-conventional media”, Moscow, 2008, P.21.