авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Механизм ферментативных реакций гидролиза гуанозинтрифосфата по результатам молекулярного моделирования

На правах рукописи

ШАДРИНА Мария Сергеевна МЕХАНИЗМ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ ГИДРОЛИЗА ГУАНОЗИНТРИФОСФАТА ПО РЕЗУЛЬТАТАМ МОЛЕКУЛЯРНОГО МОДЕЛИРОВАНИЯ 02.00.17 — математическая и квантовая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата физико-математических наук

Москва 2008

Работа выполнена в лаборатории химической кибернетики кафедры физической химии Химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова Научный руководитель доктор физико-математических наук Григоренко Белла Людвиговна Официальные оппоненты доктор физико-математических наук Ефремов Роман Гербертович доктор физико-математических наук Венер Михаил Владимирович Ведущая организация Институт биохимической физики им. Н.М.Эмануэля РАН

Защита состоится «23» октября 2008 года в 16:30 в 337 аудитории Химического факультета МГУ на заседании диссертационного совета Д 501.001.50 при МГУ имени М В. Ломоносова (119991, Москва, ГСП–2 Ленинские горы, д. 1, стр. 3, МГУ имени М. В. Ломоносова, Химический факультет).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан «» _ 2008 года.

Учёный секретарь диссертационного совета Д 501.001.50, кандидат химических наук Матушкина Н. Н.

Общая характеристика работы

Актуальность темы Исследование механизмов реакций ферментативного катализа, включая стадии элементарных химических превращений в активных центрах белков, необходимо для получения знаний о функционировании клеток живых организмов, для решения практических задач фармацевтики и биотехнологии. Результаты экспериментальных методов, применяемых для изучения ферментативных реакций, включая традиционные кинетические исследования, часто в сочетании с приемами генной инженерии, а также исследования методами рентгеноструктурного анализа (РСА) и ядерно-магнитного резонанса (ЯМР) комплексов ферментов с аналогами субстратов или ингибиторами, предоставляют важнейшую информацию о механизмах сложных превращений в белках.

Результаты компьютерных расчетов на основе современных методов молекулярного моделирования, а именно, молекулярной механики (ММ), молекулярной динамики (МД), квантовой химии и комбинированных подходов квантовой механики – молекулярной механики (КМ/ММ), позволяют существенно дополнить экспериментальные исследования, добавить новую информацию и обеспечить визуализацию процессов ферментативного катализа с атомным разрешением.

Диссертация посвящена изучению методами молекулярного моделирования одной из важнейших биохимических реакций - ферментативного гидролиза гуанозинтрифосфата (ГТФ) в различных гуанозиннуклеотид связывающих белках (G белках). Несмотря на большой объем накопленной экспериментальной информации по кинетическим и структурным данным для реакции GTP + H2O GDP + Pi где GTP и GDP обозначают гуанозинтрифосфат и гуанозиндифосфат, Pi – неорганический фосфат, и на неоднократные попытки ее теоретического осмысления, заключение о механизме этой реакции в различных средах остаётся предметом дискуссий в научной литературе.

Цель работы Цель работы заключалась в систематическом изучении элементарных стадий реакции гидролиза гуанозинтрифосфата в различных G-белках с использованием методов КМ/ММ, молекулярной механики и молекулярной динамики и установлении общего механизма химических превращений в активных центрах ферментов.

В работе решались следующие задачи:

1. Выделить типы активных центров G-белков и аминокислотные остатки, участвующие в связывании и гидролизе ГТФ, на основании экспериментальных структурных данных и результатов молекулярного моделирования.

2. Провести детальные расчеты полных профилей энергии вдоль реакционного пути реакции гидролиза GTP + H2O GDP + Pi от фермент-субстратных комплексов до продуктов для выделенных репрезентативных ферментативных систем.

3. Построить структуры фермент-субстратных комплексов для различных представителей G-белков и сформулировать прогнозы о механизме гидролиза ГТФ в этих системах.

Научная новизна результатов 1. Молекулярное моделирование позволило получить детальную картину химических превращений в реакциях гидролиза ГТФ в различных G-белках. С помощью метода КМ/ММ были локализованы стационарные точки на поверхностях потенциальной энергии, определены энергетические характеристики отдельных стадий реакций, что в конечном итоге позволило предложить единый механизм химической реакции ферментативного гидролиза ГТФ.

2. Получены структуры фермент-субстратных комплексов для ряда G-белков, отражающие основные типы активных центров, и проведен их сравнительный анализ. Выделены основные аминокислотные остатки, участвующие в связывании и гидролизе ГТФ для разных типов активных центров.

3. Для сигнального белка p21Ras построен энергетический профиль реакции гидролиза GTP + H2O GDP + Pi.

4. Для фактора роста EF-Tu построен энергетический профиль реакции гидролиза GTP + H2O GDP + Pi для двух случаев: в присутствии и отсутствии рибосомы.

Объяснена роль аминокислотного остатка гистидина 85 в этих реакциях.

5. С использованием данных о структурах реагентов и переходных состояний, полученных методом КМ/ММ, рассчитаны и сопоставлены с экспериментальными результатами кинетические изотопные эффекты 18О/16О для реакций гидролиза ГТФ в системах p21Ras, p21Ras*RasGAP, EF-Tu.



6. Показано, что реакция гидролиза ГТФ для различных G-белков протекает по единообразному диссоциативному механизму: на первой стадии отщепляется гамма-фосфатная группа ГТФ, затем происходит нуклеофильная атака реакционной молекулы воды по атому фосфора отщепляющейся фосфатной группы с последующим переносом протонов и образованием неорганического фосфата и ГДФ.

Практическая значимость данной работы заключается в том, что результаты исследования позволяют детализировать механизм химической реакции на молекулярном уровне и, следовательно, дают принципиальную возможность управлять ферментативными реакциями. Результаты исследования могут быть использованы в разработке новых биологически активных соединений и лекарственных препаратов.

Апробация работы и публикации Материалы диссертации были представлены на V международной молодежной конференции (Институт биохимической физики РАН им. М.Н. Эмануэля, Москва, 2005), 3-й Всероссийской школе-симпозиуме «Динамика и структура в химии и биологии» (Москва, 2005), III международной конференции по водородным связям и молекулярному взаимодействию (Киев, 2006), 5-й Всероссийской конференции "Молекулярное моделирование" (Москва, 2007), 4-м международном симпозиуме «Компьютерные методы в токсикологии и фармакологии, включающие Интернет ресурсы» (Москва, 2007), 2-й международной конференции «Biocatalysis 2008» (Москва, 2008).

Результаты работы опубликованы в 10 печатных работах, в том числе в статьях в рецензируемых научных журналах.

Структура и объем работы Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов и списка цитируемой литературы из 112 наименований. Работа включает 92 рисунка и таблицу.

Содержание работы Первая глава посвящена описанию методов моделирования (КМ/ММ, молекулярной динамики, молекулярной механики) и литературным данным по объектам моделирования – G-белкам.

Общая идея комбинированного метода квантовой и молекулярной механики (КМ/ММ) сводится к разделению рассматриваемой системы на две части.

В квантовую подсистему (КМ-часть) включаются наиболее важные для реакции атомы, при этом энергии и силы, действующие на атомы, рассчитываются методами квантовой химии. В молекулярно-механическую подсистему (ММ-часть) входят оставшиеся аминокислотные остатки и молекулы воды;

при этом энергии и силы вычисляются с использованием эмпирических силовых полей. В данной реализации метода КМ/ММ взаимодействие между КМ- и ММ-подсистемами описывается с помощью теории потенциалов эффективных фрагментов [Grigorenko B.L. и др., 2002].

В качестве эффективного фрагмента рассматривается часть молекулы, внутренние координаты которой можно считать фиксированными. В этом подходе аминокислотные остатки разбиваются на фрагменты, типичные для полипептидных систем;

молекулы воды представляют собой отдельные фрагменты. Влияние окружения (ММ-части) на квантово-механическую часть описывается электростатическими и обменно-отталкивательными вкладами в одноэлектронную матрицу квантового гамильтониана.

Компьютерная реализация данного варинта метода КМ/ММ основана на использовании двух пакетов компьютерных программ: PC GAMESS [Грановский A.A.] и TINKER [Ponder J.W.]. Геометрическая оптимизация и расчеты энергии в КМ части выполнены методом Хартри-Фока с использованием базиса LANL2DZ(d,p)_ECP. Взаимодействие между атомами, входящими в эффективные фрагменты ММ-части, рассчитано методом молекулярной механики с силовым полем AMBER.

Метод молекулярной динамики преимущественно использовался для предварительной оптимизации геометрических конфигураций фермент-субстратных комплексов и для уточнения положений молекул воды и каталитических аминокислотных остатков в активных центрах ферментов. Начальные координаты тяжелых атомов были взяты из структур, содержащихся в банке данных белковых структур (PDB). Расчеты проводились с использованием программных пакетов HyperChem 7 и NAMD 2.6 с применением силовых полей AMBER и Charmm 27.





C помощью метода молекулярного докинга изучалось положение молекулы гуанозинтрифосфата в активных сайтах некоторых G-белков. Расчеты выполнялись с помощью программы Autodock 3.0, позволяющей изучать связывание лиганда с белком, оценивать комплементарность белка и лиганда, находить энергию связывания лиганда в комплексе с белком.

В данной работе были рассмотрены три класса G-белков: мономерные, гетеротримерные G-белки и белковые факторы. Известно, что для всех G-белков характерен цикл гидролиза, в котором белок и молекула ГТФ, проходя через ряд изменений, возвращаются в исходное состояние. При этом белок бывает в двух состояниях: активном, в котором он связан с ГТФ и может передавать сигнал на эффектор, и неактивном, когда связан с ГДФ и передавать сигнал не может. Переход из активного состояния в неактивное проходит при помощи белка-активатора.

Обратный переход осуществляется при помощи обменного фактора.

Из литературных данных известно, что гидролиз ГТФ может проходить в чистом G-белке или в присутствии белка-активатора. Обычно в качестве белка активатора выступают белки GAP или RGS белки. Поэтому большинство выбранных систем рассматривалось в присутствии и в отсутствии белка-активатора.

Для выбранных трех классов G-белков известно большое число экспериментальных исследований, включая данные кристаллографического анализа, кинетических и мутационных исследований.

Вторая глава содержит результаты исследований механизма реакции гидролиза гуанозинтрифосфата в белковых комплексах p21Ras и p21Ras*RasGAP, которые участвуют в передаче сигнала роста в клетке. Из экспериментальных данных известно, что гидролиз гуанозинтрифсофата может проходить в чистом белке p21Ras (в лабораторных условиях) или в белковом комплексе p21Ras*RasGAP (в живых организмах). Присутствие субъединицы RasGAP ускоряет гидролиз ГТФ в 105 раз. Из кинетических данных известно, что наиболее критичные мутации в этих белках – мутации по аминокислотным остаткам Gln61 белка p21Ras и Arg789 белка RasGAP.

Были рассмотрены кристаллические структуры белковых комплексов p21Ras*GTP(N), где GTP(N) – аналог ГТФ, в котором мостиковый,-кислород заменен атомом азота (код PDB:5P21), и p21Ras*RasGAP*GDP*AlF3 (код PDB:1WQ1). При моделировании в этих структурах молекулы аналогов, GTP(N) или GDP*AlF3, заменялись молекулой ГТФ. Сравнение кристаллических структур белка p21Ras из структур 5P21 и 1WQ1 показало, что основные отличия наблюдаются в цепи, состоящей из аминокислотных остатков 59-71. Из литературных данных известно, что петля L4 (аминокислотные остатки 61-67) обладает большой конформационной гибкостью, и изменение ее конформации может влиять на ГТФазную активность белка p21Ras.

С помощью метода молекулярного докинга было проведено исследование комплекса p21Ras*GTP с разными конформациями цепи аминокислотных остатков 59-70 в белке p21Ras. Сравнительными критериями, определяющими однозначность найденного положения, служили вероятность связывания и стандартное отклонение.

Найдено, что вероятности связывания для конформации с исходным положением цепи 59-70 и конформации с «развернутым» (аналогично структуре p21Ras*RasGAP) положением цепи 59-70 равны 99 и 97%, соответственно. При этом стандартное отклонение от данных РСА в обоих случаях равно 0,36. Таким образом, мы показали, что связывание молекулы ГТФ в активном центре белка p21Ras не зависит от конформаций цепи аминокислотных остатков 59-70, в том числе, и от положения Gln61.

Для расчетов методом КМ/ММ была взята часть структуры белка p21Ras. В КМ-часть были включены 33 атома, в ММ-часть - 1464 атома, объединенных в эффективных фрагмента. На Рис.1 приведена оптимизированная структура активного центра фермент-субстратного комплекса p21Ras*GTP.

Результаты расчетов методом КМ/ММ энергетических профилей показывают, что реакции гидролиза ГТФ в белке p21Ras проходит по диссоциативному механизму:

• На первой стадии происходит отщепление -фосфатной группы ГТФ под действием окружения активного центра белка. Одновременно с отщеплением фосфатной группы происходит стереоинверсия -фосфатной группы.

Расстояние P - O изменяется от 1,7 в структуре реагентов до 2,4 в структуре первого переходного состояния и составляет 3,2 для геометрической конфигурации интермедиата.

• На следующих стадиях реакции молекула воды нуклеофильно атакует фосфор, затем происходит перенос двух протонов по цепи из двух молекул воды и аминокислотного остатка Gln61. На промежуточной стадии образуется HPO42-. В завершение реакции протон от аминокислотного остатка Gln61 по цепи водородных связей переходит на HPO42-, образуя продукт реакции H2PO42 Ранее методом КМ/ММ в рамках сходных приближений были проведены расчеты профиля реакции гидролиза ГТФ в белковом комплексе p21Ras*RasGAP и сформулированы предложения по механизму реакции [Grigorenko B.L. и др., 2005].

Результаты нашей работы с p21Ras позволили сопоставить механизм реакции в этих двух системах и показать, что реакция гидролиза ГТФ для p21Ras и p21Ras*RasGAP проходит по аналогичному механизму. На Рис. 2 сопоставлены энергетические профили реакции гидролиза ГТФ для этих систем. Отметим, что для белкового комплекса p21Ras*RasGAP барьер реакции ниже на 4,2 ккал/моль, чем для белка p21Ras. Полученная разность энергий активации соответствует экспериментальному значению по константам скоростей гидролиза для рассматриваемых систем.

Заметное снижение активационного барьера для системы p21Ras*RasGAP происходит за счет двух факторов:

• фиксации аминокислотного остатка Gln61 в положении, удобном для проведения реакции гидролиза;

• предоставления т.н. «аргининового пальца» - Arg789 (RasGAP), в активный центр белка p21Ras, что способствует отщеплению гамма-фосфатной группы при гидролизе и стабилизирует переходное состояние.

Рис.2. Сравнение профилей реакции гидролиза ГТФ в белках p21Ras и p21Ras*RasGAP.

Кроме того, энергетический баланс реакции гидролиза ГТФ в белке p21Ras меньше, чем в белке p21Ras*RasGAP. Это свидетельствует о том, что аминокислотное окружение белка p21Ras*RasGAP лучше компенсирует перераспределение зарядов в активном центре при образовании продуктов гидролиза.

В структурах фермент-субстратных комплексов p21Ras и p21Ras*RasGAP прослеживается четкая сеть водородных связей. Следует выделить наиболее важные из них:

Магниевый центр. Катион магния координируется Thr35, Ser17, двумя атомами кислорода фосфатных групп ГТФ и двумя молекулами воды.

Координация - и -кислородов. Аминокислотные остатки Gly13, Lys16, Gly60 образуют водородные связи с - и -кислородами фосфатных групп ГТФ, что приводит к перераспределению электронной плотности, таким образом, облегчая отщепление -фосфатной группы.

Координация реакционной молекулы воды. Водородная связь от атома кислорода основной цепи Thr35 удерживает реакционную молекулу воды в оптимальном для реакции положении.

Также есть некоторые различия между структурами фермент-субстратных комплексов эти двух систем:

Роль остатка Gln61. Боковая цепь Gln61 в белке p21Ras позиционирует вторую молекулу воды, а в комплексе p21Ras*RasGAP - реакционную молекулу воды, и остаток Gln61 непосредственно участвует в реакции.

Роль «аргининового пальца». В белке p21Ras*RasGAP появляется «аргининовый палец», который образует водородные связи с - и -кислородами гуанозинтрифосфата. Таким образом, Arg789 дополнительно способствует отщеплению гамма-фосфатной группы.

В третьей главе приведены результаты расчетов и анализа энергетических профилей реакции гидролиза ГТФ другим G-белком - фактором элонгации Tu (EF Tu), который играет важную роль в процессе биосинтеза белков, катализируя присоединение тройного комплекса EF-Tu*GTP*аа-tRNA к А сайту рибосомы.

Известно, что гидролиз ГТФ может проходить в самом белке EF-Tu (в лабораторных условиях) или на рибосоме (в живой клетке). Кинетические исследования показали, что на рибосоме гидролиз идет в 105 раз быстрее, чем в чистом EF-Tu. Из данных мутационного анализа известно, что наиболее важными аминокислотными остатками для реакции гидролиза в присутствии рибосомы является His85. При этом в чистом белке EF-Tu мутация His85 на скорость гидролиза не влияет.

Из-за экспериментальных сложностей структура комплекса EF-Tu с рибосомой до сих пор не получена. В известных кристаллографических структурах EF-Tu с аналогами ГТФ остаток His85 развернут в сторону от активного центра, и между ним и активным центром располагаются боковые цепи Val20 и Ile61 (т.н., «гидрофобные ворота»), которые полностью закрывают доступ His85 в активный центр (Рис.3).

Согласно рабочей гипотезе [Pape T. и др., 1998] при образовании сложной системы EF-Tu*GTP*аа-tRNA-рибосома происходят конформационные изменения в факторе элонгации, в результате чего «гидрофобные ворота» открываются и боковая цепь His85 разворачивается к активному центру и принимает прямое участие в реакции гидролиза.

В качестве начальной конфигурации для расчетов механизма гидролиза ГТФ в белке EF-Tu была использована кристаллическая структура белкового комплекса EF Tu*GTP(N) (код PDB:1EFT). С помощью метода молекулярной динамики мы смоделировали конформационные изменения в белке EF-Tu, т.е. раздвинули «гидрофобные ворота» и развернули остаток His85 в сторону -фосфатной группы. В результате была получена структура фактора EF-Tu с положениями аминокислотных остатков в активном центре белка, соответствующими активному состоянию белка, или комплексу EF-Tu*GTP*аа-tRNA-рибосома.

В ходе исследования были рассмотрены две модели: модель «закрытой конформации» (остаток His85 внутри активного центра), которая соответствует Lys Gly 2. 2. Mg2+ P 2.76 3. P 2. Gln61 2. Gly13 P Рис.1. Активный центр фермент-субстратного комплекса для белка p21Ras*GTP.

Рис.3. Кристаллическая структура активного центра белка EF-Tu.

Рис.4. Геометрическая конфигурация структуры реагентов для EF-Tu в закрытой конформации.

Рис.5. Геометрическая конфигурация структуры реагентов для EF-Tu в открытой конформации.

Рис.7. Наложение активных центров фермент-субстратных комплексов EF-Tu в закрытой конформации (зеленый) и p21Ras*RasGAP (синий).

Рис.8. Наложение активных центров первых переходных состояний EF-Tu в закрытой конформации (зеленый) и p21Ras*RasGAP (синий).

Рис.10. Кристаллическая структура белкового комплекса Ran*RanGAP*RanBP1*GTP(N).

Рис.11. Конфигурация активного центра в рассчитанной структуре фермент-субстратного комплекса в белке Ran*RanGAP*RanBP1.

Рис.12. Кристаллическая структура белкового комплекса Gs*GTP(S) (зеленым выделено скорректированное положение остатков Gln227 и Arg201).

Рис.13. Активный центр фермент-субстратного комплекса Gs* GTP по результатам моделирования.

Рис.14. Наложение кристаллических структур активных центров мономерных G-белков с активирующими частицами.

комплексу EF-Tu*GTP*аа-tRNA-рибосома, и модель «открытой конформации» (His вне активного центра), которая соответствует комплексу EF-Tu*GTP.

Модель «закрытой конформации» включает молекулу ГТФ, 210 молекул воды, катион магния и аминокислотные остатки белка EF-Tu. В КМ-часть были включены 36 атомов, в ММ-часть - 1811 атомов, объединенных в 556 эффективных фрагментов. На Рис. 4 приведена структура полученного фермент-субстратного комплекса для модели «закрытой конформации».

Было показано, что реакция гидролиза ГТФ в этом случае проходит в одну стадию. При этом сначала, как и в случае белка p21Ras, происходит отщепление гамма-фосфатной группы, которая изменяет свою конформацию через образование плоской частицы PO3-. Затем происходит нуклеофильная атака реакционной молекулы воды по -фосфору с одновременным переносом протона на непротонированный атом азота аминокислотного остатка His85.

Модель «открытой конформации» включает молекулу ГТФ, 100 молекул воды, катион магния и аминокислотные остатки белка EF-Tu. В КМ-часть были включены 24 атомов, в ММ-часть - 448 эффективных фрагментов (1481 атомов). На Рис. 5 приведена структура полученного фермент-субстратного комплекса для модели «открытой конформации».

Было найдено, что механизм реакции в модели «открытой конформации» также включает одну стадию, но в отличие от модели «закрытой конформации» гидролиз проходит без непосредственного участия аминокислотного остатка His85. Начало реакции проходит аналогичным образом: отщепляется -фосфатная группа, происходит нуклеофильная атака молекулы воды. Но перенос протонов осуществляется по цепи водородных связей двух молекул воды.

На Рис.6 приведено сравнение энергетических профилей реакции гидролиза ГТФ в двух моделях. Для модели «открытой конформации» барьер активации получен ниже на 7.2 ккал/моль. Это значение соответствует известным кинетическим данным по скоростям реакции для чистого белка EF-Tu и комплекса EF-Tu*GTP*аа tRNA-рибосома.

В структурах фермент-субстратных комплексов для обоих случаев прослеживается четкая сеть водородных связей. Наиболее важные из них следующие:

Магниевый центр. Катион магния координируется Thr62, Thr25, двумя атомами кислорода фосфатной группы ГТФ и 2 молекулами воды.

Координация - и -кислородов. Аминокислотные остатки Asp21, Lys24, молекулы воды образуют водородные связи с - и -кислородами фосфатной группы ГТФ, что приводит к перераспределению электронной плотности, таким образом, облегчая отщепление -фосфатной группы.

Координация реакционной молекулы воды. Водородная связь от атома кислорода основной цепи Thr62 удерживает реакционную молекулы водя в оптимальном положении.

Различие между фермент-субстратными комплексами двух моделей:

Роль остатка His85. В системе, моделирующей комплекс EF-Tu*GTP*аа tRNA-рибосома, аминокислотный остаток His85 координирует реакционную молекулу воды;

Анализ строения фермент-субстратных комплексов с белками p21Ras и EF-Tu показывает общие структурные элементы.

Рис.6. Сравнение профилей реакции гидролиза ГТФ в двух моделях белка EF-Tu.

В четвертой главе сопоставлены результаты расчетов методом КМ/ММ полных энергетических профилей, структур реагентов, интермедиатов и продуктов, а также кинетических изотопных эффектов для реакции гидролиза ГТФ в белках и комплексах: p21Ras, p21Ras* RasGAP, EF-Tu.

Анализ полученных структур фермент-субстратных комплексов и механизмов реакции гидролиза позволяет выделить общее черты и ключевые структурные элементы активных центров G-белков. На Рис.7 и 8 приведено наложение структур фермент-субстратных комплексов и структур, отвечающих переходному состоянию стадии разрыва связи фосфор-кислород для систем EF-Tu и p21Ras*RasGAP.

На Рис.7 видно, что, несмотря на некоторые отличия в аминокислотных остатках, сеть водородных связей в активных центрах белков остается без изменения.

Это позволяет утверждать о консервативной роли отдельных аминокислотных остатков в связывании и гидролизе гуанозинтрифосфата.

Также при наложении структур первого переходного состояния (Рис.8) для систем EF-Tu и p21Ras*RasGAP обнаруживается явное сходство в расположении участников реакции, что говорит о единообразном механизме химической реакции гидролиза ГТФ. Таким образом, мы считаем, что для систем с единым строением активного центра реакция гидролиза идет по одному механизму.

Для всех рассмотренных методом КМ/ММ систем была проведена оценка кинетического изотопного эффекта (КИЭ). Под КИЭ понимают изменение скорости химической реакции при замене в молекуле реагирующего вещества какого-либо атома его изотопом. В недавних экспериментальных работах [Du X. и др., 2008] был разработан метод определения значений КИЭ, (18O), при замещении изотопа кислорода 16O на 18O в различных положениях в молекуле ГТФ. Для удобства представления и экспериментальных, и теоретических результатов мы используем т.н. «индекс замещения». При его определении мы учитывали различную значимость - и -атомов кислорода ГТФ для реакции гидролиза. Очевидно, что - мостиковый кислород играет ключевую роль в реакции, соответствующей диссоциативному механизму. Следовательно, мы можем заключить, что меченный - мостиковый кислород в экспериментах с 18О должен вносить наибольший вклад в кинетические изотопные эффекты, в то время как, изотопно-замещенные немостиковые атомы кислорода также важны, но в меньшей степени. Именно поэтому мы предлагаем использовать подобную характеристику для субстратов ГТФ, меченных по разным атомам кислорода (см. таблицу в левой части Рис.9). Известные результаты экспериментального определения (18O) для гидролиза ГТФ в Ras и Ras*RasGAP [Du X. и др., 2004] показывают практически линейную зависимость (18O) от индекса замещения (Рис. 9).

Для теоретической оценки значений (18O) мы вычислили колебательные частоты в стационарных точках на поверхностях потенциальной энергии, найденных ранее для реакций гидролиза ГТФ в белках Ras, Ras*RasGAP, EF-Tu, для экспериментально исследованных вариантов изотопного замещения в ГТФ. Мы использовали простейшее приближение теории переходного состояния, в котором учитывали только разницу в энергиях нулевых колебаний реагентов и переходных состояний:

k 16 # # ( O) = 18 Fe ( U16 U18 )/RT k Здесь U# обозначает разницу в потенциальных энергиях между переходным состоянием и фермент-субстратным комплексом, скорректированную с учетом энергии нулевых колебаний, а предэкспоненциальный множитель F равен отношению соответствующих сумм по состояниям, которые были оценены через вклад от реакционной колебательной моды. Примечательно, что рассчитанные нами значения (18O), как и экспериментально измеренные, представляют практически линейную зависимость от индекса замещения (Рис.9).

Рис.9. Зависимость КИЭ от индекса замещения для белков p21Ras и p21Ras*RasGAP.

В таблице в левой части звездочкой помечены атомы O18.

Такая зависимость наблюдается для всех систем, рассмотренных в данной работе: p21Ras, p21Ras*RasGAP и EF-Tu в закрытой и открытой конформациях.

Очевидно, что все три системы обладают сходным поведением при изотопном замещении в молекуле ГТФ. Поскольку вычисленные значения (18O) были получены для теоретически установленного диссоциативного механизма реакции, у нас есть достаточные основания полагать, что экспериментальные данные также согласуются с диссоциативным механизмом для ферментативного гидролиза ГТФ.

Пятая глава посвящена обобщению результатов моделирования структур фермент-субстратных комплексов, полученных методами молекулярного докинга, молекулярной динамики и КМ/ММ для ряда G-белков.

Мономерный белок Ran участвует в транспорте веществ через ядерную мембрану. Реакция гидролиза в белке Ran проходит в 10 раз медленнее, чем в белке p21Ras. Присутствие RanGAP увеличивает скорость гидролиза на 5 порядков.

На Рис.10 приведена структура активного центра белкового комплекса Ran*RanGAP*RanBP1 (код PDB:1K5D). Видно, что место «аргининового пальца» занимает остаток Tyr39, а боковая цепь Arg170 от активационной частицы GAP находится в стороне. С помощью метода молекулярной динамики мы показали, что нет стерических препятствий для участия остатка Arg170 в качестве «аргининового пальца» при условии, что петля с Tyr39 отходит в сторону (по аналогии с системой p21Ras*RasGAP). Однако несмотря на потенциальную возможность участия остатка Arg170, вероятно, его функцию выполняет Tyr39, что подтверждается данными по мутационному анализу по позиции 170.

Методом КМ/ММ была оптимизирована структура фермент-субстратного комплекса (Рис.11), для которого характерны указанные выше структурные элементы активного центра.

Анализ строения активного центра показал сходство с активными центрами ранее рассмотренных систем: наличие магниевого центра, каталитического и активационного остатков, остатков, координирующих реакционную молекулу воду и - и -кислороды ГТФ. Мы видим сходство с активными центрами белковых комплексов p21Ras*RasGAP и Gt*PDE*RGS9. Единственное отличие заключается в присутствие остатка Tyr39, который образует водородную связь с -кислородом ГТФ.

Таким образом, нами был проанализирован фермент-субстратный комплекс, соответствующий типу активного центра с «активационной» аминокислотой Tyr.

Гетеротримерный белок Gs участвует в передаче сигнала с рецептора плазматической мембраны на аденилат циклазу. Константа гидролиза ГТФ в белке Gs составляет 0,06 с-1. Из кинетических данных известно, что для данного белка мутации по остаткам Gln227 и Arg201 являются критическими, но в полученной кристаллической структуре Gs*GTP(S) (код PDB:1AZT) эти остатки находится на расстоянии примерно 5 (Рис.12). Поэтому боковые цепи Gln227 и Arg201 были развернуты к активному центру, и для этой системы была рассчитана структура фермент-субстратного комплекса (Рис. 13).

Анализ строения активного центра показал сходство с активными центрами ранее рассмотренных систем: наличие магниевого центра, каталитического и активационного остатков, остатков, координирующих реакционную воду и - и атомы кислорода ГТФ. Таким образом, найденный фермент-субстратный комплекс Gs*GTP является аналогом полученных ранее фермент-субстратных комплексов p21Ras*RasGAP и Gt*PDE* RGS9*GTP.

Для проверки гипотезы о едином строении активных центров G-белков был проведен сравнительный анализ активных центров G-белков. Мы провели наложение кристаллических структур различных G-белков. В качестве примера на Рис. приведено сравнение активных центров мономерных белков в комплексе с активирующими белками.

Сравнительный анализ большого числа кристаллических структур G-белков, а также результаты молекулярного моделирования, приведенные в данной работе, подтвердили консервативность одних аминокислотных остатков и взимозаменяемость других.

В заключении нами было выделено несколько типов активных центров. G белки могут различаться по:

• каталитической аминокислоте – Gln (p21Ras), Asn (Rap1*Rap1GAP), His (EF Tu, Sar1), Glu (миозин, как пример аденозинтрифосфат-связывающего белка);

при этом в зависимости от сродства каталитической аминокислоты к протону реакция гидролиза может проходить в одну или две стадии, в частности, реакции гидролиза с участием остатков His и Glu проходят в одну стадию, с Gln и Asn проходят в две стадии;

• активационной аминокислоте – Arg (p21Ras*RasGAP), Tyr (Ran*RanGAP), Ser (Rab33, миозин).

Каталитическая и активационная аминокислоты могут принадлежать как самому G-белку, так и его активационной частице. В роли активационной частицы может выступать или белок-активатор (для всех ГТФаз) или спиральный домен (для гетеротримерных белков).

В зависимости от типа активного центра активационная частица может:

• фиксировать каталитическую аминокислоту в положении, удобном для проведения реакции гидролиза;

• предоставлять активационную аминокислоту в активный центр G-белка и таким образом способствовать отщеплению -фосфатной группы, стабилизируя переходное состояние при реакции гидролиза.

Несмотря на различия в строении G-белков, во всех рассмотренных случаях мы видим единое устройство активных центров. Как было показано для детально изученных систем p21Ras, p21Ras*RasGAP, EF-Tu, общее строение активных центров соответствует единой схеме прохождения реакции гидролиза.

Таким образом, мы считаем, что во всех рассмотренных G-белках со сходным строением активного центра, реакция гидролиза ГТФ протекает по единому диссоциативному механизму.

Основные результаты и выводы 1. Комбинированным методом квантовой и молекулярной механики (КМ/ММ) с подвижными эффективными фрагментами рассчитан полный энергетический профиль пути реакции гидролиза гуанозинтрифосфата в белке p21Ras от фермент субстратного комплекса до продуктов реакции гидролиза. Показано, что реакция гидролиза протекает по диссоциативному механизму.

2. Методом КМ/ММ с подвижными эффективными фрагментами рассчитан полный энергетический профиль пути реакции гидролиза гуанозинтрифосфата в белке EF Tu для двух вариантов конформации фермента, моделирующих белок в свободном состоянии и в комплексе с рибосомой. Показано, что в обоих случаях реакция гидролиза протекает по диссоциативному механизму.

3. Выделены общие характеристики реакции гидролиза ГТФ при сопоставлении результатов расчетов методом КМ/ММ: полных энергетических профилей, структур реагентов, интермедиатов и продуктов для химических превращений в белках и комплексах: p21Ras, p21Ras*RasGAP, EF-Tu. Прямое сопоставление вычисленных и экспериментальных значений кинетических изотопных эффектов при замещении 16О на 18О в молекуле ГТФ предоставляет поддержку гипотезе о диссоциативном механизме реакции ферментативном гидролиза ГТФ.

4. Выделены основные структурные элементы активных центров G-белков и объяснены функции важнейших аминокислотных остатков, входящих в активные центры. Показано, что реакция гидролиза ГТФ для различных G-белков протекает по единому диссоциативному механизму: на первой стадии отщепляется фосфатная группа ГТФ, затем происходит нуклеофильная атака реакционной воды по атому фосфора отщепляющейся фосфатной группы с последующим переносом протонов с образованием неорганического фосфата и ГДФ.

5. По результатам моделирования гидролиза фосфатов в различных ферментах сделан вывод, что количество стадий в реакции гидролиза зависит от сродства каталитической аминокислоты к протону. Таким образом, реакции гидролиза с участием остатков His и Glu проходят в одну стадию, с Gln и Asn - в две стадии.

Публикации по теме диссертации 1. Шадрина М.С., Рогов А.В., Бравая К.Б., Немухин А.В. Молекулярный докинг производных гуанозиннуклеотидов в ГТФ-связывающие белки // Вестник Моск. Ун та, Серия 2, Химия, 2005, Т.46, №6, С.363-369.

2. Немухин А.В., Григоренко Б.Л., Шадрина М.С. Механизмы реакций ферментативного гидролиза нуклеозидтрифосфатов по данным расчетов методом квантовой и молекулярной механики // Российский химический журнал (Журнал Российского химического общества им. Д.И.Менделеева), 2007, Т.51, С.27-33.

3. Grigorenko B., Nemukhin A., Shadrina M., Topol I., Burt S. Mechanisms of guanosine triphosphate hydrolysis by Ras and Ras-GAP proteins as rationalized by ab initio QM/MM simulations // Proteins: Structure, Function and Bioinformatics, 2007, V.66, P.456-466.

4. Grigorenko B., Shadrina M., Topol I., Collins J., Nemukhin A., Mechanism of the Chemical Step for the Guanosine Triphosphate (GTP) Hydrolysis Catalyzed by Elongation Factor Tu //Biochim. Biophys. Acta: Proteins and Proteomics, 2008, doi:

10.1016/j.bbapap.2008.08.003.

5. Шадрина М.С., Григоренко Б.Л., Немухин А.В. Структура фермент-субстратного комплекса при гидролизе гуанозинтрифосфата фактором роста EF-Tu: Сопоставление результатов квантовой и молекулярной механики и молекулярной динамики // Вестник Моск. Ун-та, Серия 2, Химия, в печати.

6. Рогов А.В., Григоренко Б.Л., Шадрина М.С., Бравая К.Б., Доброгорская Я.И., Немухин А.В. Моделирование ферментативных реакций гидролиза гуанозинтрифосфата // Тезисы докладов II Российской школы-конференции “Молекулярное моделирование в химии, биологии и медицине”, Саратов, 2004, С.19.

7. Grigorenko B.L., Rogov A.V., Shadrina M.S., Anosova E.V. The role of hydrogen bonding in triphosphate hydrolysis in proteins and solutions // Book of abstracts of III International Conference on Hydrogen Bonding and Molecular Interactions, Kyiv, Ukraine, 2006, P. 8. Немухин А.В., Григоренко Б.Л., Шадрина М.С. Моделирование механизмов ферментативных реакций гидролиза нуклеозидтрифосфатов // Тезисы докладов 5-й Всероссийской конференции "Молекулярное моделирование", Москва, 2007, С.30.

9. Shadrina M.S., Grigorenko B.L., Nemukhin A.V. Modeling catalytic mechanisms of hydrolysis of nucleoside triphosphates (NTP) // Book of abstracts of Fourth International Symposium on Computational Methods in Toxicology and Pharmacology Integrating Internet Resources (CMTPI-2007), Moscow, 2007, P.147.

10. Shadrina M.S., Grigorenko B.L., Polyakov I.V., Knyazeva M.A., Nemukhin A.V.

Modeling enzymatic hydrolysis of nucleoside triphosphates // Book of abstracts of 2-nd International conference “Biocatalysis in non-conventional media”, Moscow, 2008, P.21.



 

Похожие работы:





 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.