Изучение взаимодействия фермента репарации формамидопиримидин-днк гликозилазы e. coli с фосфатными группами днк

На правах рукописи

РОГАЧЕВА МАРИЯ ВЛАДИМИРОВНА ИЗУЧЕНИЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТА РЕПАРАЦИИ ФОРМАМИДОПИРИМИДИН-ДНК ГЛИКОЗИЛАЗЫ E. COLI С ФОСФАТНЫМИ ГРУППАМИ ДНК 02.00.10 – биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2006

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Научный консультант: доктор химических наук, Кузнецова Светлана Александровна

Официальные оппоненты: доктор химических наук, Михайлов Сергей Николаевич доктор биологических наук, Вейко Наталья Николаевна

Ведущая организация: Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Защита состоится 28 ноября 2006 года в 16 часов на заседании диссертационного совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, д. 1, Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ им.

М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 27 октября 2006 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук /Смирнова И.Г./

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Клеточная ДНК в процессе своего функционирования постоянно подвергается воздействию различных экзогенных и эндогенных факторов, приводящих к ее повреждениям. Одним из наиболее агрессивных факторов окружающей среды является активный кислород, образующийся в качестве побочного продукта клеточного метаболизма, в результате окислительного стресса или под действием ионизирующей радиации. Он индуцирует окислительные повреждения ДНК, которые являются причинами преждевременного старения, заболеваний иммунной системы, кардиологических, онкологических и ряда других. Наиболее распространенным окислительным повреждением является 7,8-дигидро-8-оксогуанин (oxoG), обладающий высокой мутагенной активностью как in vitro, так и in vivo. Наличие oxoG в ДНК вызывает G:C T:A трансверсии, поскольку в процессе репликации oxoG может образовывать стабильную хугстиновскую пару с аденином. Кроме того, oxoG в составе нуклеозидтрифосфата встраивается в ДНК напротив аденина ДНК-матрицы, вызывая тем самым A:T C:G трансверсии. Такие повреждения эффективно корректируются клеткой с помощью репарационных механизмов, обеспечивающих стабильность и целостность генетической информации. Ключевую роль в этом процессе играют специфические ферменты ДНК-N-гликозилазы, распознающие и удаляющие повреждения в ДНК. Изучение взаимодействия таких ферментов с ДНК является актуальной задачей современной биоорганической химии и молекулярной биологии.

Настоящая работа посвящена изучению взаимодействия фермента эксцизионной репарации формамидопиримидин-ДНК гликозилазы (Fpg) Escherichia coli с ДНК. Этот фермент удаляет из ДНК остатки oxoG и является удобной моделью для исследования механизма действия репарирующих ферментов данного класса, поскольку аминокислотные последовательности прокариотических гомологов этого белка имеют высокую степень консервативности и общие мотивы третичной структуры. Настоящая работа планировалась и была начата в отсутствие структурных данных для Fpg.

Цель работы. Целью настоящей работы явилось изучение взаимодействия Fpg E. coli с фосфатными группами oxoG-содержащей ДНК в составе специфического фермент субстратного комплекса. Для решения этой задачи было необходимо: (1) синтезировать новые аналоги субстратов Fpg E. coli, содержащие модифицированные фосфатные группы;

(2) изучить влияние введенных модификаций на структуру ДНК;

(3) изучить связывание и каталитическое расщепление синтезированных аналогов субстратов ферментом и определить их количественные характеристики;

(4) осуществить дизайн и синтез oxoG-содержащих обратимых и необратимых ингибиторов Fpg E. coli и изучить их взаимодействие с ферментом;

(5) определить контакты Fpg E. coli с фосфатными группами oxoG-содержащей ДНК в растворе;

(6) на базе полученных экспериментальных данных в совокупности с данными литературы построить модель взаимодействия Fpg E. coli с фосфатными группами oxoG-содержащей ДНК.

Научная новизна и практическая значимость. До настоящего времени основное внимание исследователей было направлено на изучение взаимодействия Fpg E. coli с окисленными гетероциклическими основаниями ДНК и практически не уделялось внимания исследованию контактов с фосфатными группами ДНК. Вместе с тем эти контакты играют важнейшую роль в функционировании фермента. Так, при взаимодействии Fpg E. coli c поврежденной ДНК происходят значительные конформационные изменения в ее структуре, включающие расширение малой бороздки, частичное плавление и изгиб в месте модификации, выпетливание окисленного основания из спирали. Такие фермент-зависимые изменения структуры ДНК осуществляются в основном за счет образования специфических контактов аминокислот из активного центра Fpg E. coli c фосфатными группами ДНК в составе продуктивного фермент-субстратного комплекса. Важным обстоятельством является то, что в отличие от слабых неспецифических аддитивных взаимодействий Fpg E. coli с фосфатными группами неповрежденной ДНК, в специфическом фермент-субстратном комплексе такие контакты многократно усиливаются, приобретают кооперативный характер и реализуются по типу взаимодействия отдельных непосредственно контактирующих групп (Невинский, 2004).

В настоящей работе впервые изучены контакты фосфатных групп oxoG-содержащей ДНК с Fpg E. coli в составе специфического фермент-субстратного комплекса. С помощью реакционноспособных аналогов субстратов выявлено семь специфических контактов аминокислот активного центра фермента с фосфатными группами ДНК. Определена аминокислота, которая непосредственно взаимодействует с фосфатной группой в положении ДНК, каталитически расщепляемом ферментом. С этой целью разработан масс спектрометрический подход, основанный на использовании фермента, меченного стабильным изотопом азота. Впервые получены обратимые и необратимые oxoG содержащие ингибиторы Fpg E. coli и его эукариотического аналога – 8-оксогуанин-ДНК гликозилазы человека (hOgg1), что открывает возможность проведения структурных исследований комплексов этих ферментов с oxoG-содержащей ДНК. Синтезированные соединения представляют интерес как потенциальные терапевтические препараты для лечения заболеваний, вызванных окислительными повреждениями ДНК. Полученные в работе результаты в совокупности с данными других исследований пополняют сведения о процессах репарации ДНК, что позволяет направленно влиять на эти процессы в борьбе со многими опасными заболеваниями.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих международных конференциях: “Nucleosides, Nucleotides and Nucleic acids” (Leuven, 10- сентября 2002 г.), “Chemical & Biological Problems of Proteomics” (Новосибирск, 5-9 июля 2004 г.), “Биология – наука XXI века” (Пущино, 7-21 мая 2004 г. и 18-22 апреля 2005 г.), “Ломоносов 2004” и “Ломоносов 2005” (Москва, 10-13 апреля 2004 г. и 12-15 апреля 2005 г), “Computational Molecular Biology” (Москва, 18-21 июля 2005 г.).

Структура и объем диссертационной работы. Диссертационная работа изложена на 188 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы “Ферменты, участвующие в репарации 8-оксогуанина”, результаты и обсуждение, экспериментальная часть, выводы, список литературы и приложение. Материал иллюстрирован 70 рисунками и 28 таблицами. Библиографический указатель включает в себя 244 цитированные работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Одним из наиболее эффективных подходов к исследованию структуры и функций ферментов нуклеинового обмена является изучение их взаимодействия с синтетическими аналогами субстратов, содержащими направленные модификации – замены отдельных атомов или групп атомов в молекуле нуклеиновой кислоты (НК). Этот подход позволяет выявить субстратную базу, зондировать контакты белка и НК, определить положение субъединиц белка относительно друг друга и их позиционное расположение на молекуле НК.

В отличие от метода рентгеноструктурного анализа, позволяющего получать данные о строении активных центров белков и взаимодействии отдельных групп белка с НК в кристаллическом фермент-субстратном комплексе, подход, основанный на использовании синтетических аналогов субстратов и включающий возможность вариации структуры субстрата при его синтезе, дает возможность изучать молекулярные аспекты НК-белкового узнавания в физиологических условиях и, соответственно, получать более точные данные о функционировании белков и НК.

В настоящей работе для изучения взаимодействия Fpg E. coli с фосфатными группами поврежденной ДНК были использованы синтетические модифицированные ДНК-дуплексы, содержащие пирофосфатные и О-этилзамещенные пирофосфатные межнуклеотидные группы (Kuznetsova et. al., 2003). Выбор таких модификаций был обусловлен тем, что они обладают рядом существенных преимуществ по сравнению с другими. Так, природа модифицированных фрагментов родственна природе заменяемых элементов субстрата, метод введения модификаций достаточно прост, эффективен и позволяет ввести модифицированную группу в любое заданное положение углеводофосфатного остова ДНК.

Кроме того, замещенная пирофосфатная группа в составе ДНК-дуплексов является реакционноспособной и может образовывать ковалентную связь со сближенными нуклеофильными группами аминокислот НК-связывающих белков без каких-либо внешних воздействий. Это позволяет идентифицировать такие аминокислоты и получать сведения о строении НК-связывающих и каталитических центров белков, а также о механизме их действия в целом.

1. Дизайн и синтез новых аналогов субстратов фермента Fpg E. coli Конструирование модифицированных ДНК-дуплексов проводили на основе 29/22 звенных синтетических ДНК-дуплексов гетерогенного состава, содержащих в середине одной из цепей остаток oxoG, поскольку ранее было установлено, что эффективность взаимодействия таких дуплексов с Fpg E. coli аналогична эффективности взаимодействия с природными ДНК (Castaing et. al., 1993). Структура ДНК-дуплексов I-XII и IV’, VII’-X’, использованных в работе, приведена на рисунке 1.

IV’ A I II III IV V VI 5’AGCTTGCATGCp2--Cp1--Tp0(8-oxoG)p-1Ap-2Gp-3GTCGACTCTAGAG 3’ 3’ GAACGTACGp(-3)Gp(-2)Ap(-1)---C--p(0)T--C--CAGCTGAG 5’ X IX VIII VII X’ IX’ VIII’ VII’ AGCTTGCATGCCTGp-1AGGTCGACTCTAGAG XI GAACGTACGGAC--TCCAGCTGAG XII AGCTTGCATGCCT(8-oxoG)AGGTCGACTCTAGAG GAACGTACGGA----C---TCCAGCTGAG Б Рис. 1. (А) Структура модифицированных ДНК-дуплексов I–XII и IV’, VII’-X’, синтезированных в работе.

ДНК-дуплексы, содержащие О-этилзамещенные пирофосфатные и пирофосфатные группы, обозначены I-XI и IV’, VII’-X’, соответственно. Стрелками указаны положения модифицированных межнуклеотидных групп pn.

(Б) Структура 8-оксогуанина и модифицированных межнуклеотидных групп.

Каждый модифицированный дуплекс, содержал только одну модифицированную межнуклеотидную группу в положении, указанном стрелкой. Выбор таких позиций для модификации позволяет выявить роль каждой отдельной фосфатной группы внутри связываемого ферментом участка поврежденной ДНК в процессе функционирования Fpg E.

coli.

Олигонуклеотиды, содержащие модифицированные межнуклеотидные группы, получали в результате матрично-зависимой конденсации (химического лигирования) 5’-концевого фосфата одного олигонуклеотида с 3’-О-этилфосфатом (либо с 3’-фосфатом) смежного олигонуклеотида, ориентированных на комплементарной матрице, в соответствии со схемой:

X = H или С2Н5, КДИ - 1-этил-3(3’-диметиламинопропил)карбодиимид, вертикальными линиями обозначены олигонуклеотиды, горизонтальными линиями – водородные связи между комплементарными парами оснований.

Выходы продуктов химического лигирования приведены в таблице 1.

Таблица 1.

Химическое лигирование модифицированных ДНК-дуплексов.

Р2 Р1 Р0 Р-1 Р-2 Р-3 Р(0) Р(-1) Р(-2) Р(-3) Фосфатная группа ДНК- дуплекс I II III IV V VI VII VIII IX X Выход*, % 20 43 60 54 44 35 46 29 34 ДНК- дуплекс IV’ VII’ VIII’ IX’ X’ Выход*, % 95 94 89 82 *Ошибка измерений не превышала 5%.

Эффективность химического лигирования зависела от природы нуклеотидов в узле образования модифицированной связи и наличия заместителя у 3’-концевого фосфата. Так, при введении дизамещенных пирофосфатных групп, не содержащих ненуклеотидных заместителей, эффективность лигирования была значительно выше и достигала 95% (ДНК дуплекс IV’). Это cвязано с различием в нуклеофильности дианион- и моноанионфосфатов, участвующих в реакции. При введении О-этилзамещенных пирофосфатных групп более высокие выходы были получены при реализации контакта 5’ТoxoG3’ (ДНК-дуплекс III).

2. Исследование структуры ДНК-дуплексов, содержащих пирофосфатную и O-этилзамещенную пирофосфатную группы Для оценки влияния пирофосфатной и О-этилзамещенной пирофосфатной групп на структуру ДНК был использован комбинированный метод квантовой и молекулярной механики (КМ/ММ), являющийся одним из самых современных и перспективных методов теоретического моделирования больших биомолекулярных систем (Thiel et. al., 1996).

Основная идея данного подхода заключается в комбинировании неэмпирических методов квантовой химии высокого уровня точности для моделирования наиболее важной части исследуемой системы с классическими методами описания остальной части рассматриваемой системы. Метод КМ/ММ позволяет явно учитывать взаимодействие рассматриваемой системы с окружением. Это особенно важно в случае биологических процессов, происходящих исключительно в растворах, в значительной степени определяющих их протекание и влияющих на свойства исследуемых систем.

Поскольку в структурных базах данных отсутствуют координаты oxoG-содержащего ДНК-дуплекса, в качестве модельной системы был выбран наиболее детально изученный ДНК-дуплекс, имеющий спираль В-типа (Wu et al., 2003) (код в базе данных по белковым структурам 1NAJ):

5’ CGCGAATTCGCG 3’ XIII 3’ GCGCTTAAGCGC 5’ Пирофосфатная или О-этилзамещенная пирофосфатная группы были встроены в центральную часть дуплекса XIII вместо одной из фосфодиэфирных связей. В качестве квантовой подсистемы рассматривался фрагмент углеводофосфатного остова, содержащий модифицированную или природную фосфатную группы, их противоион/ны и молекулы воды, входящие в первое сольватное окружение. Оптимизацию геометрической конфигурации водного окружения проводили методом молекулярной динамики. Полную оптимизацию всех геометрических параметров рассматриваемых систем проводили, используя модифицированный квантово-химический пакет программ PC GAMESS и молекулярно-механический пакет TINKER. Квантово-химические расчеты проводили в рамках теории функционала электронной плотности с использованием гибридного функционала РBЕ0 в базисе 6-31G** с добавлением диффузных функций на несвязанные атомы кислорода. Остальные фрагменты системы описывались методом молекулярной механики с использованием стандартного силового поля AMBER99.

Полученные геометрические параметры немодифицированного ДНК-дуплекса хорошо согласовывались с экспериментальными данными, что свидетельствовало о том, что выбранный вариант гибридного метода КМ/ММ адекватно описывает строение и свойства исследуемых систем (таблица 2).

Результаты моделирования модифицированных ДНК-дуплексов показали, что пирофосфатная и О-этилзамещенная пирофосфатная группы встраиваются в структуру ДНК без удлинения межнуклеотидного расстояния и без нарушения стэкинг- и Уотсон Криковских взаимодействий оснований, фланкирующих модифицированную группу (рис. 2, таблица 2). Это достигается при помощи выпетливания одного фосфата пирофосфатной группировки, связанного с С5’ атомом. Угол спирального вращения в месте пирофосфатной и замещенной пирофосфатной группировок увеличивается на 2.7 и 5.5 градусов, соответственно. Атомы фосфора пирофосфатной группы, связанные с С3’ и С5’ атомами, удалены от атома Рис. 2. Суперпозиция КМ/ММ структур ДНК-дуплекса фосфора немодифицированного XIII (серая) и ДНК-дуплекса, содержащего О-этилзамещенную пирофосфатную группу (черная).

фосфата в той же позиции на Противоионы и молекулы воды опущены.

расстояния 1.0 и 2.4, соответственно.

Таблица 2.

Локальные параметры спирали оптимизированных структур ДНК-дуплексов.

ПФa ЗПФб ПФa ЗПФб Дуплекс ЯМР XIII ЯМР XIII Расстояния между соседними атомами вдоль оси спирали, Пара оснований P–P C1’ – C1’ 6 A/T 6.9 6.8 6.3 6.1 4.8 4.9 4.7 4. 7 T/T 6.7 6.5 7.0 (5.3) 7.8 (5.5) 4.8 4.8 4.9 4. Пара Расстояние между парами вдоль Угол спирального вращения t, оснований оси спирали h, (град.) 6 A/T 3.0 3.1 3.1 3.1 34.8 32.0 32.6 33. 7 T/A 3.1 3.0 3.0 3.0 37.8 34.5 37.2 40. Для сравнения приведены параметры ЯМР структуры ДНК-дуплекса XIII (Wu et al., 2003).

a ДНК-дуплекс, содержащий пирофосфатную группу;

б ДНК-дуплекс, содержащий О-этилзамещенную пирофосфатную группу.

Таким образом, результаты моделирования свидетельствуют о том, что структура ДНК дуплексов, содержащих пирофосфатную или О-этилзамещенную пирофосфатную группы, очень близка к структуре немодифицированной ДНК. Такие соединения могут быть использованы для выявления роли фосфатных групп в ДНК-белковых взаимодействиях.

3. Специфическое связывание модифицированных ДНК-дуплексов с Fpg E. coli Важным этапом настоящей работы явилось исследование взаимодействия Fpg E. coli c фосфатными группами поврежденной ДНК на стадии образования специфического фермент субстратного комплекса (Рис. 3). Изучена зависимость степени комплексообразования от концентрации фермента.

По полученным данным рассчитаны константы диссоциации комплексов ДНК-белок. Результаты представлены в таблице Рис. 3. Радиоавтограф 10%-ного неденатурирующего ПААГ, 3. Было установлено, что иллюстрирующий связывание фермента Fpg E. coli (4 нМ) с 0.5 нМ ДНК дуплексами I-VI, IV’ и XII (дорожки с четными номерами). ДНК-дуплексы I все синтезированные VI, IV’ и XII в отсутствие фермента (дорожки с нечетными номерами).

модифицированные ДНК дуплексы узнаются ферментом и специфически связываются с ним.

Таблица 3.

Константы диссоциации комплексов Fpg E. coli с ДНК-дуплексами I-X, IV’, VII’-X’, XII.

ДНК-дуплекс I II III IV V VI VII VIII IX X XII KD, (нМ) 0.2 0.7 1.0 3.0 1.1 0.4 0.5 0.7 0.4 0.6 0. ДНК-дуплекс IV’ VII’ VIII’ IX’ X’ KD, (нМ) 4.1 1.0 2.0 2.0 2. Величину KD определяли по результатам 3-6 экспериментов, ошибка измерений не превышала 20%.

Эффективность связывания зависела от положения модифицированной межнуклеотидной фосфатной группы и ее природы. Так, модификация Р2 фосфатной группы, расположенной на расстоянии двух нуклеотидов с 5’-конца от 7,8-дигидро-8-оксогуанозина (oxodG) (ДНК дуплекс I), приводила к двукратному увеличению эффективности связывания. В то же время введение пирофосфатной и О-этилзамещенной пирофосфатной групп непосредственно в 3’ положение oxodG (ДНК-дуплексы IV и IV’) приводило к уменьшению эффективности связывания примерно на порядок по сравнению с природным субстратом. Модификация фосфатных групп в остальных положениях не оказывала существенного влияния на эффективность связывания. Отсутствие ненуклеотидного заместителя в пирофосфатном остатке приводило к уменьшению эффективности связывания модифицированных ДНК дуплексов ферментом Fpg E. coli, что может быть связано с наличием дополнительного заряда в пирофосфатной группировке.

Специфичность связывания Fpg E. coli с модифицированными ДНК-дуплексами была подтверждена по результатам двух независимых экспериментов (рис. 4). Так, эффективность связывания всех исследуемых 32Р-меченных ДНК дуплексов с белком при добавлении избытка субстрата, не содержащего радиоактивную метку, уменьшалась вплоть до его полного ингибирования в случае 150-кратного избытка. В то же время добавление таких же избытков ДНК дуплекса XI аналогичной структуры, но содержащего остаток гуанина вместо остатка oxoG и не являющегося субстратом этого Рис. 4. Изменение эффективности связывания фермента, не оказывало влияния на Р-меченного ДНК-дуплекса IV c Fpg E. coli при добавлении избытка ДНК-дуплексов IV (a) и XI эффективность связывания. (б), не содержащих радиоактивной метки.

Таким образом, синтезированные в работе модифицированные ДНК-дуплексы специфически и с высокой эффективностью связываются с Fpg E. coli и могут быть использованы в качестве аналогов субстратов этого фермента при изучении его взаимодействия с фосфатными группами ДНК.

4. Каталитическое расщепление модифицированных ДНК-дуплексов Fpg E. coli Механизм каталитического расщепления субстрата ферментом Fpg E. coli включает выпетливание и удаление остатка oxoG из двойной спирали ДНК путем разрыва N-гликозидной связи. На следующей стадии происходит расщепление двух фосфодиэфирных связей ДНК по механизму последовательного,-элиминирования в соответствии со схемой:

5' 5' 5' 5' O H N O O O O - NH O O P O O P O O P O HO P O NH N O O O N O OH O OH O O АР-лиазная O H3C H O H + активность N-гликозилазная элимини O + O OH активность - рование OH элимини O P O O P O OH O P O рование O P O O O O O 3' 3' 3' 3' В результате в ДНК образуется одноцепочечный разрыв, фланкированный 3’- и 5’ концевыми фосфатами, а остаток дезоксирибозы и поврежденное основание удаляются.

Для выявления роли каждой фосфатной группы участка ДНК, специфически взаимодействующего с Fpg E. coli, в функционировании фермента, было изучено каталитическое расщепление модифицированных ДНК-дуплексов ферментом (таблица 4).

Таблица. 4.

Кинетические параметры каталитического расщепления ДНК-дуплексов I-X и IV’ ферментом Fpg E. coli.

Км Vmax kкат kкат/Км Относительная ДНК-дуплекс эффективность, % (нМмин-1) (мин-1) (нМ-1мин-1) (нМ) I 4.8 0.10 0.48 0.10 II 5.2 0.12 0.60 0.12 III 5.6 0.09 0.45 0.08 на IV 0.0 0.0 0.0 на IV’ 0.0 0.0 0.0 на V 0.0 0.0 0.0 VI 6.0 0.05 0.24 0.04 VII 6.3 0.08 0.42 0.07 VIII 6.2 0.09 0.43 0.07 IX 7.4 0.10 0.49 0.07 X 7.0 0.10 0.49 0.08 XII 7.3 0.08 0.42 0.06 а ДНК дуплексы IV, IV’ и V – негидролизуемые аналоги субстратов (н).

Кинетические эксперименты проводились не менее трех раз;

ошибка измерений не превышала 15% Установлено, что все модифицированные ДНК-дуплексы, за исключением дуплексов IV, IV’ и V, расщепляются ферментом. Эффективность каталитического расщепления зависела от положения модифицированной группы по отношению к остатку oxoG. Так, введение О-этилзамещенных пирофосфатных групп с 5’-конца от oxodG (ДНК-дуплексы I-III) приводило к увеличению эффективности расщепления в 1.4-2.0 раза по сравнению с расщеплением физиологического субстрата Fpg E. coli аналогичного строения (ДНК-дуплекс XII). Введение модифицированной группы с 3’-конца от поврежденного нуклеозида приводило к противоположному эффекту. Так, ДНК-дуплекс VI расщеплялся на 30% менее эффективно, чем ДНК-дуплекс XII. ДНК-дуплексы IV, IV’ и V не расщеплялись Fpg E. coli даже в условиях 10-кратного избытка фермента и инкубации реакционной смеси в течение 12 часов. ДНК-дуплексы IV, IV’ и V оказались негидролизуемыми аналогами субстратов Fpg E. coli, поскольку они специфически связывались, но не расщеплялись ферментом. Такого рода соединения могут быть использованы в качестве ингибиторов действия Fpg E. coli, а также в структурных исследованиях комплексов этого фермента c oxoG-содержащими ДНК.

Введение модифицированных межнуклеотидных фосфатных групп в цепь, комплементарную поврежденной, практически не повлияло на эффективность каталитического расщепления ДНК-дуплексов VII-X Fpg E. coli (таблица 4).

Таким образом, фосфатные группы, находящиеся с 5’-конца от повреждения в oxoG содержащей цепи ДНК, важны для эффективного каталитического расщепления субстрата ферментом;

их модификация приводит к увеличению эффективности расщепления.

Фосфатные группы, расположенные в противоположной цепи ДНК, не играют существенной роли в каталитическом расщеплении субстратов Fpg E. coli. В то же время две последовательные фосфатные группы ДНК, находящиеся в 3’-положении к остатку oxoG, являются чрезвычайно важными для эффективного каталитического расщепления ДНК ферментом Fpg E. coli;

их модификация приводит к ингибированию действия фермента.

5. Изучение взаимодействия ДНК-дуплексов, содержащих модифицированные группы с 3’-конца от повреждения, c Fpg E. coli и hOgg В ходе настоящей работы было установлено, что ДНК-дуплексы IV, IV’ и V являются ингибиторами не только Fpg E.coli, но и его эукариотического аналога 8-оксогуанин-ДНК гликозилазы человека. Этот фермент обладает сходной с Fpg E. coli субстратной специфичностью, но принадлежит к другому структурному классу. hOgg1, в отличие от Fpg E. coli, не удаляет остаток дезоксирибозы из ДНК, а лишь расщепляет углеводофосфатный остов с 3’-конца от апурин/апиримидинового (АР) участка по механизму -элиминирования.

Было показано, что hOgg1 специфически связывается с ДНК-дуплексами IV, IV’ и V, но не расщепляет их. В то же время этот фермент эффективно расщепляет модифицированные ДНК-дуплексы, содержащие О-этилзамещенные пирофосфатные группы в других положениях углеводофосфатного остова ДНК (рис. 5).

Рис. 5. Радиоавтограф ПААГ, полученный при изучении взаимодействия Fpg E. coli и hOgg1 с ДНК дуплексами III-V, IV’ и XII. Реакции проводили, инкубируя 50 нМ ДНК-дуплексы IV, IV’, III, XII и V c 5 нМ Fpg E. coli (дорожки 2, 4, 10, 13 и 16, соответственно) или с 26 нМ hOgg1 (дорожки 6, 8, 11, 14 и 17, соответственно). Контрольные ДНК-дуплексы IV, IV’;

IV’, IV и III, XII, V – дорожки 1, 3;

5, 7 и 9, 12, 15, соответственно.

Ингибирование каталитической активности обеих ДНК гликозилаз Fpg E. coli и hOgg возможно как на стадии удаления поврежденного основания (N-гликозилазной активности), так и расщепления углеводофосфатного остова ДНК (-лиазной активности). При изучении механизма взаимодействия модифицированных ДНК-дуплексов IV, IV’ и V с ферментами Fpg E. coli и hOgg1 было установлено, что модификация фосфатных групп, расположенных непосредственно с 3’-конца от поврежденного нуклеозида и на расстоянии одного нуклеотида от него, приводит к ингибированию N-гликозилазной активности обоих ферментов, и окисленное гетероциклическое основание oxoG не удаляется из ДНК.

Поскольку в составе ДНК пирофосфатная группа является химически стабильной, а замещенная пирофосфатная группа обладает реакционной способностью, то ДНК-дуплекс IV’ является специфическим обратимым ингибитором, а ДНК-дуплексы IV и V – необратимыми ингибиторами 8-оксогуанин-ДНК гликозилаз Fpg E. coli и hOgg1. Так как эти ферменты имеют различную пространственную организацию и являются представителями разных суперсемейств ДНК гликозилаз, возможно, что пирофосфатные/замещенные пирофосфатные группы, введенные в ДНК с 3’-конца от повреждения, будут также ингибировать N-гликозалазную активность других ДНК гликозилаз. В пользу этого предположения свидетельствуют полученные в работе данные об ингибировании ДНК дуплексом IV ДНК гликозилазы человека Neil1.

В последние годы достигнуты определенные успехи в кристаллизации ковалентных комплексов ДНК гликозилаз с аналогами субстратов, содержащими АР-участки, а также комплексов ДНК, содержащих поврежденные гетероциклические основания, с мутантными каталитически неактивными формами ферментов. Однако знание структурных аспектов специфического узнавания и удаления поврежденного основания ДНК гликозилазами “дикого” типа ограничено тем обстоятельством, что до настоящего времени не удается получить кристаллы комплексов каталитически активных форм ферментов с ДНК, содержащими окисленное основание. Это связано с тем, что ферменты “дикого” типа расщепляют свои субстраты намного быстрее, чем протекает процесс кристаллизации и сбор данных. Найденные в работе специфические обратимые и необратимые ингибиторы могут быть использованы для структурных исследований комплексов oxoG-содержащих ДНК с каталитически активными формами 8-оксогуанин-ДНК гликозилаз. Кроме того, данные соединения представляют интерес как потенциальные терапевтические препараты для лечения различных генетических заболеваний, поскольку поврежденные ДНК, образующиеся под действием лекарственных препаратов, используемых в химиотерапии, являются субстратами ферментов репарации, в частности, ДНК гликозилаз. Ингибирование процесса эксцизионной репарации оснований к настоящему времени является наименее изученным подходом генной терапии (Laval et. al., 2005).

6. Региоспецифическое ковалентное связывание Fpg E. coli с ДНК-дуплексами, содержащими О-этилзамещенные пирофосфатные межнуклеотидные группы Важной задачей настоящей работы явилось зондирование активного центра Fpg E. coli и определение контактов белка с фосфатными группами ДНК. Для этого в работе использовали ДНК-дуплексы I-X, содержащие реакционноспособные О-этилзамещенные пирофосфатные группы. Как было установлено ранее, в составе специфического фермент субстратного комплекса замещенные пирофосфатные группы взаимодействуют с пространственно сближенными нуклеофильными группами аминокислотных остатков белка с образованием ковалентной связи (Kuznetsova et. al., 1996). Образование ковалентной связи протекает по механизму нуклеофильного замещения у дизамещенного атома фосфора в соответствии со схемой:

горизонтальными линиями обозначены олигонуклеотиды;

вертикальными линиями – водородые связи между комплементарными парами оснований;

- боковой радикал нуклеофильной аминокислоты.

Преимуществом такого подхода является то, что реакция протекает без какой-либо дополнительной активации в условиях, близких к физиологическим.

Региоспецифическое ковалентное связывание Fpg E. coli с ДНК-дуплексами I-X, проводили в условиях существования специфических фермент-субстратных комплексов.

Оптимальные условия реакции подбирали, варьируя температуру, время инкубации и концентрацию реагирующих веществ. Поскольку ранее было показано, что наличие в реакционной смеси N-метилимидазола (N-MeIm) может приводить к увеличению эффективности реакции ковалентного связывания (Shabarova et. al., 1996), реакции проводили в присутствии и в отсутствие N-MeIm. Результаты представлены на рисунке 7 и в таблице 5.

Ковалентное связывание наблюдали в семи из десяти исследуемых ДНК-дуплексов.

Максимальная эффективность ковалентного связывания во всех случаях, за исключением дуплексов IV и V, достигалась при температуре 21°С и составила 30% (ДНК-дуплекс I). Для ДНК-дуплексов IV и V максимальные выходы ДНК-белковых комплексов наблюдали при температуре 37°С в присутствии 0.05 М N-MeIm (50 и 35%). Это связано с тем, что указанные соединения являются негидролизуемыми аналогами субстрата Fpg E. coli, и повышение температуры не приводит к их каталитическому расщеплению, а приводит к увеличению выходов ковалентных комплексов.

Рис. 7. Радиоавтографы электрофореза в 12% SDS-ПААГ реакционных смесей, образующихся при выдерживании ДНК-дуплексов I-XI в присутствии (дорожки с четными номерами) и в отсутствие (дорожки с нечетными номерами, соответственно) Fpg E. coli.

Таблица 5.

Ковалентное связывание Fpg E. coli с ДНК-дуплексами I-X, содержащими О-этилзамещенную пирофосфатную группу.

Выходы ковалентных ДНК-белковых комплексов*, % Условия реакции** Фосфатная дуплексы группа ДНК 0°С 21°С 37°С + + - + Р2 I 0 3 15 4 Р1 II 0 0 0 0 0 Р0 III 8 10 8 8 Р-1 IV 20 25 40 45 43 Р-2 V 3 10 8 20 7 Р-3 VI 3 10 5 1 Р(0) VII 0 0 0 0 0 Р(-1) VIII 1 10 3 15 Р(-2) IX 2 20 5 10 Р(-3) X 0 0 0 0 0 *Реакции проводили в течение 14 часов в отсутствие (-) и в присутствии (+) 0.05М N-MeIm, соотношение компонентов субстрат:фермент = 1:10.

**Указанные значения выходов коньюгатов определяли как среднее арифметическое трех независимых экспериментов. Ошибка измерений не превышала 10%.

Жирным шрифтом отмечены максимальные выходы ковалентных комплексов для каждого из исследуемых ДНК-дуплексов.

Следует отметить, что ковалентное связывание является специфическим, поскольку в случае нековалентного связывания наблюдалось образование одного специфического комплекса ДНК с белком. Кроме того, отсутствие продуктов ковалентного связывания Fpg E.

coli с ДНК-дуплексом XI, содержащим О-этилзамещеную пирофосфатную группу и остаток гуанина вместо oxoG (т.е. не способным образовывать специфический ДНК-белковый комплекс), также подтверждает специфичность ковалентного связывания.

Установлено, что ковалентная связь между олигонуклеотидами и Fpg E. coli в случае всех полученных ковалентных комплексов имеет фосфоамидную природу.

Образование ковалентных комплексов ДНК-дуплексов I, III-VI, VIII и IX с ферментом Fpg E. coli является первым прямым экспериментальным доказательством наличия семи специфических контактов нуклеофильных аминокислот из активного центра белка с межнуклеотидными Р2, Р0, Р-1, Р-2, Р-3 фосфатными группами oxoG-содержащей цепи и Р(-1) и Р(-2) фосфатными группами противоположной цепи ДНК в составе специфического фермент субстратного комплекса.

7. Определение природы аминокислоты Fpg E. coli, ковалентно связанной с фосфатной группой в положении ДНК, каталитически расщепляемом ферментом Высокая эффективность и специфичность ковалентного связывания (кросслинкинга) открыли возможность определения природы аминокислотных остатков Fpg E. coli, взаимодействующих с фосфатными группами поврежденной ДНК методом масс спектрометрии. В качестве объекта исследования был выбран продукт ковалентного связывания Fpg E. coli c ДНК-дуплексом IV, содержащим реакционноспособную O-этилзамещенную пирофосфатную группу в положении ДНК, каталитически расщепляемом ферментом. Анализ проводили по следующей схеме:

После ковалентного связывания ДНК-дуплекса IV с Fpg E. сoli, проводимого в препаративных количествах, протеолиза белковых компонентов смеси и выделения олигонуклеотидо-пептидного коньюгата проводили селективное расщепление фосфоамидной связи между олигонуклеотидным и пептидным фрагментами коньюгата (декросслинкинг). Полученный образец анализировали методом электроспрей масс спектрометрии. Были детектированы сигналы m/z 504.3, 768.4, и 531.6, соответствующие SVQRRAKY57, LMNDKLVVGVGNIY170 и RSIEQGGTTL двузарядным ионам пептидов фермента Fpg E. coli, соответственно. Для доказательства структуры пептидов использовали MС/MС анализ. В качестве примера на рисунке 8 приведен MС/MС спектр SVQRRAKY57 пептида.

Рис. 8. MС/MС спектр 50SVQRRAKY57 пептида Fpg E. coli.

Согласно результатам расщепления химотрипсином ковалентного комплекса Fpg E. coli с ДНК-дуплексом IV, только один пептид был ковалентно связан с ДНК. С помощью специально разработанного масс-спектрометрического подхода, основанного на использовании в качестве контроля фермента, меченного стабильным изотопом азота N, 157 170 207 было установлено, что наличие LMNDKLVVGVGNIY и RSIEQGGTTL пептидов в образце вызвано их неспецифической сорбцией на Q-сефарозе и их чрезвычайно высокой ионизационной способностью. Полученные результаты свидетельствовали о том, что фосфатная группа ДНК, связанная с 3’-OH oxodG, контактирует с нуклеофильной SVQRRAKY57 пептида. Потенциальными кандидатами для образования аминокислотой из ковалентной связи с ДНК были Arg-53, Arg-54 и Lys-56.

Для того чтобы определить, какой из этих трех аминокислотных остатков участвует в образовании ковалентной связи с ДНК-дуплексом IV, было проведено изучение взаимодействия этого дуплекса с мутантными формами Fpg E. coli, содержащими замены Arg-53 Gly, Arg-54 Gly, Lys-56 Arg и Lys-56 Gly. Известно, что эти мутации не изменяют вторичную структуру Fpg E. coli, но частично дестабилизируют взаимодействия, обуславливающие его третичную структуру (Sidorkina et. al., 1998). Предварительно было установлено, что все исследуемые мутантные белки специфически связываются с ДНК дуплексом IV (таблица 6, рис. 9 A).

Методом региоспецифического ковалентного связывания было показано, что FpgK56R, FpgR54G и FpgR53G формируют ковалентные комплексы с Рис. 9. Нековалентное (А) и ковалентное (Б) связывание ДНК-дуплесом IV (рис. 9 Б). В отличие от ДНК-дуплекса IV c Fpg E. coli “дикого” типа и FpgK56R, них FpgK56G не образовывал ковалентного FpgK56G, FpgR53G, FpgR54G (дорожки 2-6, соответственно). Дорожка 1 на каждом геле комплекса с ДНК-дуплексом IV. соответствует ДНК-дуплексу IV в отсутствие белка.

Таким образом, в совокупности полученные результаты однозначно свидетельствуют о том, что ковалентную связь с фосфатной группой, расположенной с 3’-конца от oxodG, формирует аминокислота Lys-56 фермента Fpg E. coli.

Таблица 6.

Константы диссоциации комплексов Fpg E. coli “дикого” типа (wtFpg) и мутантных форм Fpg E. coli с ДНК-дуплексом IV.

wtFpg FpgK56R FpgK56G FpgR54G FpgR53G Белок KD, нМ 3.0 7.0 48 35 Величину KD определяли по результатам 3-6 экспериментов, ошибка измерений не превышала 20%.

8. Схема взаимодействия Fpg E. coli с фосфатными группами oxoG-содержащей ДНК в составе специфического фермент-субстратного комплекса в растворе К настоящему времени в литературе отсутствуют сведения о структуре комплекса Fpg E.

coli с oxoG-содержащей ДНК. Существуют данные рентгеноструктурного анализа ковалентного комплекса Fpg E. coli с ДНК, содержащей АР-участок (Zharkov et. al., 2002). В этой структуре разупорядочен фрагмент полипептидной цепи, содержащий аминокислоты, ответственные за взаимодействия с окисленным гетероциклическим основанием. Согласно этим данным, высококонсервативный остаток Lys-56 контактирует с фосфатной группой, расположенной непосредственно с 3’-конца от oxodG, что согласуется с результатами, полученными в настоящей работе. Базируясь на данных настоящего исследования, а также учитывая данные рентгеноструктурного анализа комплекса Fpg E. coli c AP-ДНК, предложена модель взаимодействия Fpg E. coli с oxoG-содержащей ДНК в растворе (рис. 10).

O O G2 C(-3) O K254 O O O OP O O O (-3) P O O O G1 C(-2) O O O P K O O O (-2) PO Y236 O O O H A1 T(-1) O R258 O K217 O O P O O (-1) O R O R108 PO O HN E2 O C(0) N O M O O P T214 O N O -1 O PO O N F NH2 N (0) PO H O O G-1 C(1) O K E O O O P- O O H70 O O (1) PO O A-2 T(2) N160 O O O O P-3 R O O O O (2) PO O (3) G-3 C O O Q водородные связи O P- O O O O O псевдо Уотсон-Криковские (3) PO O взаимодействия O O ван дер Ваальсовы O взаимодействия O Рис. 10. Схематическое изображение взаимодействий между фосфатными группами oxoG-содержащей ДНК и ферментом Fpg E. coli. Жирным шрифтом выделены фосфатные группы, для которых было обнаружено образование ковалентной связи с нуклеофильными аминокислотами.

Представленная схема дополнена сведениями о контактах фермента с поврежденной ДНК, полученными в результате анализа литературных данных. При построении этой схемы основывались на том, что образование водородных связей возможно, если доноры и акцепторы водорода в ДНК находятся на расстоянии не более 3.2 от соответствующих атомов в белке. Ван дер Ваальсовы взаимодействия считали возможными, если взаимодействующие группы находятся на расстоянии не более 4.5. Был учтен тот факт, что ковалентное связывание идет по дизамещенному атому фосфора О-этилзамещенной пирофосфатной группировки, который, по данным наших исследований, смещен в сторону С5’ атома на 2.3. Было учтено также, что углеводофосфатный остов ДНК в месте модификации обладает повышенной конформационной подвижностью за счет большей подвижности пирофосфатного остатка по сравнению с природным фосфатом. При сделанных допущениях выводы, основанные на результатах ковалентного связывания Fpg E.

coli с ДНК-дуплексами I-X, содержащими О-этилзамещенную пирофосфатную группу, правомерно использовать для определения контактов белка с фосфатными группами природного субстрата.

Согласно этой модели, специфические контакты с нуклеофильными аминокислотами из активного центра Fpg E. coli формируют пять фосфатных групп oxoG-содержащей цепи ДНК и две фосфатные группы противоположной цепи ДНК. В эти контакты вовлечены высококонсервативные остатки Lys-56, Arg-109, Lys-254 и Arg-258.

Из литературных данных известно, что Lys-56 является высококонсервативным аминокислотным остатком во всех прокариотических ферментах Fpg и играет важную роль в расщеплении фосфодиэфирной связи, образованной с участием фосфатной группы в 3' положении oxodG (Laval et. al., 1998). Аминокислотные остатки Lys-254 и Arg-258 входят в состав ДНК-связывающего мотива “цинковый палец”. Lys-88 и Arg-109 входят в состав структурного элемента, так называемой “читающей головки”, используемой ферментом при поиске повреждений в ДНК, а неконсервативный остаток Arg-33 участвует в поддержании измененной структуры ДНК в специфическом фермент-субстратном комплексе.

Построение и анализ этой схемы сделали возможным объяснение экспериментальных данных, полученных в настоящей работе. Так, увеличение эффективности нековалентного связывания ДНК-дуплекса I с ферментом может быть следствием образования дополнительных водородных связей между Lys-254 и дизамещенной фосфатной группой О этилзамещенной пирофосфатной группировки в положении Р2. Ингибирование выщепления остатка oxoG из ДНК-дуплексов IV, IV’ и V и уменьшение эффективности их связывания с ферментом может быть следствием изменения локализации аминокислотных остатков Thr-214, Glu-2 и Arg-258, принимающих непосредственное участие в каталитическом расщеплении поврежденной ДНК, а также нарушения специфических контактов Agr-258 и Asn-168 с модифицированными Р-1 и Р0 фосфатными группами, фланкирующими oxoG.

Увеличение эффективности каталитического расщепления модифицированных ДНК дуплексов I-III может быть объяснено перестройкой сети водородных связей между Р-1 и Р фосфатными группами и аминокислотными остатками Arg-258 и Lys-56.

Таким образом, девять фосфатных групп oxoG-содержащей ДНК из участка, специфически взаимодействующего с ферментом, образуют специфические контакты с аминокислотами из активного центра Fpg E. сoli, что подтверждает важнейшую роль этих контактов в функционировании фермента. Семь из них обнаружены в настоящей работе при изучении взаимодействия Fpg E. сoli с фосфатными группами ДНК в составе фермент субстратного комплекса в растворе. Установлено, что эти фосфатные группы контактируют с нуклеофильными группами аминокислот активного центра фермента.

Результаты проведенного исследования позволяют пополнить представления о каталитическом механизме действия, строении активного центра и структурно функциональных особенностях 8-оксогуанин-ДНК гликозилазы Fpg E. coli и ее про- и эукариотических гомологов.

ВЫВОДЫ 1. Осуществлен дизайн и синтез серии новых аналогов субстратов фермента репарации формамидопиримидин-ДНК гликозилазы Escherichia coli – ДНК-дуплексов, содержащих одновременно остаток 7,8-дигидо-8-оксо-2’-дезоксигуанозина и пирофосфатную либо О-этилзамещенную пирофосфатную межнуклеотидные группы в различных положениях углеводофосфатного остова.

2. Впервые комбинированным методом квантовой и молекулярной механики изучено влияние введенных модификаций на структуру двойной спирали ДНК. Установлено, что введение пирофосфатных и О-этилзамещенных пирофосфатных межнуклеотидных групп не оказывает влияния на стэкинг- и Уотсон-Криковские взаимодействия фланкирующих пар оснований и не приводит к увеличению расстояния между соседними нуклеотидами.

3. Изучено специфическое связывание и каталитическое расщепление модифицированных ДНК-дуплексов ферментом Fpg E. coli. Определены константы диссоциации и кинетические параметры ферментативных реакций. Выявлена значимость каждой фосфатной группы участка ДНК, покрываемого белком, в функционировании фермента.

4. Впервые синтезированы обратимые и необратимые oxoG-содержащие ингибиторы Fpg E. coli и его эукариотического аналога hOgg1;

изучен механизм их взаимодействия с ферментами.

5. Методом региоспецифического ковалентного связывания проведено зондирование активного центра Fpg E. сoli c помощью реакционноспособных аналогов субстратов, содержащих О-этилзамещенные пирофосфатные группы. Выявлено семь специфических контактов нуклеофильных аминокислот фермента с фосфатными группами ДНК в составе специфического фермент-субстратного комплекса.

6. С использованием метода масс-спектрометрии и набора мутантных форм Fpg E. сoli определена аминокислота Lys-56 из активного центра фермента, которая непосредственно взаимодействует с фосфатной группой, связанной с 3’-ОН 7,8-дигидо 8-оксо-2’-дезоксигуанозина (в положении ДНК, каталитически расщепляемом ферментом).

7. В результате анализа полученных экспериментальных данных и данных литературы предложена модель взаимодействия Fpg E. сoli с фосфатными группами oxoG содержащей ДНК в составе специфического фермент-субстратного комплекса в растворе.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Maria V. Rogacheva, Murat K. Saparbaev, Ivan M. Afanasov, Svetlana A. Kuznetsova. (2005) Two sequential phosphates 3’ adjacent to the 8-oxoguanosine are crucial for lesion excision by E. coli Fpg protein and human 8-oxoguanine-DNA glycosylase. Biochimie, 87, 1079-1088.

2. М.В. Тараненко, Е.М. Волков, M.K. Сапарбаев, С.A. Кузнецова. (2004) Новые негидролизуемые аналоги субстратов 8-оксогуанин-ДНК гликозилаз. Молекулярная биология, 38, 859-869.

3. Svetlana Kuznetsova, Anna Rykhlevskaya, Maria Taranenko, Olga Sidorkina, Tatiana Oretskaya, Jacques Laval. (2003) Use of crosslinking for revealing the DNA phosphate groups forming specific contacts with the E. coli Fpg protein. Biochimie, 85, 511-519.

4. Maria V. Rogacheva, A.N. Bochenkova, S.A. Kuznetsova, A.V. Nemukhin. (2005) Theoretical study of the double-stranded DNA structures with modified phosphate groups. Proceedings of the International Moscow Conference on Computational Molecular Biology, 332-333.

5. Рогачева M.В., Кузнецова С.А. (2005) Определение контактов фосфатных групп ДНК с аминокислотами фермента репарации Fpg E. coli. 9-я Международная Пущинская школа конференция молодых ученых “Биология – наука XXI века”, 47.

6. Рогачева M.В., Боченкова A.В. (2005) Теоретическое моделирование структуры ДНК дуплекса, содержащего пирофосфатную группу. Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам “Ломоносов – 2005”, Москва, 1, 102.

7. Maria Taranenko, Murat Saparbaev, Svetlana Kuznetsova. (2004) Two sequential phosphates 3’ adjacent to the 8-oxoguanine are crucial for lesion excision by 8-oxoguanine-DNA glycosylases. International Conference “Chemical & Biological Problems of Proteomics”, Novosibirsk, 36.

8. Тараненко M.В., Кузнецова С.A. (2004) Новые специфические ингибиторы 8-оксогуанин-ДНК гликозилаз. 8-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых “Биология – наука XXI века”, 35.

9. Афанасов И.M., Тараненко M.В., Кузнецова С.A. (2004) Определение роли фосфатных групп ДНК в функционировании фермента репарации Fpg E. coli. Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам “Ломоносов – 2004”, 1, 83.