Моделирование механизмов ферментативных реакций гидролиза комбинированными методами квантовой и молекулярной механики

На правах рукописи

РОГОВ Александр Владимирович МОДЕЛИРОВАНИЕ МЕХАНИЗМОВ ФЕРМЕНТАТИВНЫХ РЕАКЦИЙ ГИДРОЛИЗА КОМБИНИРОВАННЫМИ МЕТОДАМИ КВАНТОВОЙ И МОЛЕКУЛЯРНОЙ МЕХАНИКИ 02.00.17 — математическая и квантовая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата физико-математических наук

Москва 2006

Работа выполнена в лаборатории химической кибернетики кафедры физической химии Химического факультета Московского Государственного университета им. М. В. Ломоносова Научный руководитель доктор физико-математических наук Григоренко Б.Л.

Официальные оппоненты доктор физико-математических наук профессор Тихонов А.Н.

кандидат химических наук Авакян В. Г.

Ведущая организация Институт проблем химической физики РАН

Защита состоится «21» декабря 2006 года в 16:15 в 337 аудитории Химического факультета МГУ на заседании диссертационного совета Д 501.001.50 при МГУ им. М. В. Ломоносова (119992, Москва, ГСП– Ленинские горы, д. 1, стр. 3, МГУ им. М. В. Ломоносова, Химический факультет).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан «20» ноября 2006 года.

Учёный секретарь диссертационного совета Д 501.001.50, кандидат химических наук Матушкина Н. Н.

Общая характеристика работы

Актуальность темы Возрастающий интерес к моделированию реакций, происходящих в живых системах, обусловливается потребностями био- и нанотехнологий, быстрым развитием информационных технологий. Наиболее перспективной группой методов моделирования реакций на данный момент можно считать гибридные методы квантовой и молекулярной механики (КМ/ММ). Анализ энергетических профилей химических реакций, построенных с использованием методов КМ/ММ, позволяет детализировать механизмы химических превращений с учетом реального белкового окружения или молекул растворителя.

Согласно основной идеи приближения КМ/ММ центральная реакционная часть системы рассматривается на квантовом уровне, а молекулярное окружение – в рамках подходов молекулярной механики.

Данная работа посвящена изучению важнейших химических реакций гидролиза, происходящих в биологических системах, с помощью комбинированных методов квантовой и молекулярной механики. Для детального анализа выбраны: гидролиз пептидной связи трипсином, гидролиз аденозинтрифосфата белком миозином, а также гидролиз гуанозинтрифосфата, происходящий в белке p21ras.

Работа является актуальной, что обусловлено возрастающим интересом к расчетам сечений поверхности потенциальной энергии для биохимических реакций, протекающих в сложном молекулярном окружении. В настоящее время становится возможным детально изучать важнейшие реакции гидролиза субстрата, проходящие в активном центре фермента, определять отдельные стадии этих реакций и обосновывать механизмы, предлагаемые по результатам экспериментальных исследований. Понимание процессов, происходящих внутри клетки на молекулярном уровне, позволит, в частности, установить критерии поиска активных компонентов новых лекарственных веществ.

Цель работы Работа носит преимущественно методический характер: демонстрируется применение оригинального комбинированного метода квантовой и молекулярной механики, основанного на теории потенциалов подвижных эффективных фрагментов.

Целью работы являлось изучение механизмов важнейших биохимических реакций с помощью данного варианта метода КМ/ММ на основе рассчитанных энергетических профилей реакций гидролиза рассматриваемых молекулярных систем.

В рамках заданной цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать реакции гидролиза пептидной связи трипсином. Построить энергетическую диаграмму химической реакции.

2. Изучить реакцию гидролиза трифосфатов в водной среде, включая исследование влияния катиона Mg2+ на протекание реакции.

3. Моделирование реакции гидролиза аденозинтрифосфата в реальном белковом окружении в миозине. Построить профиль потенциальной энергии реакции и сравнить полученные результаты с результатами гидролиза метилтрифосфата в водной среде.

4. Изучить реакцию гидролиза гуанозинтрифосфата в белке p21ras. Построить профиль потенциальной энергии реакции и сравнить результаты с ранее полученными данными для реакции гидролиза ГТФ в белке p21ras-GAP.

Научная новизна результатов 1. Моделирование механизмов химических реакций с помощью метода КМ/ММ позволило получить детальную картину химических превращений в реакциях гидролиза субстратов. С помощью использованной методики возможно отслеживать пути перемещения протонов, локализовать стационарные точки на поверхности потенциальной энергии, определять энергетические характеристики на отдельных стадиях реакции гидролиза.

2. Показано, что реакция гидролиза пептидной связи трипсином протекает по однопротонному механизму. Использование расширенной модели субстрата, при учете взаимодействия между аминокислотными остатками субстрата Thr11-Gly12-Pro13-Cys14-Lys15-Ala16-Arg17-Ile18-Ile19 и аминокислотными остатками белка His40-Phe41-Cys92, Ser190-Cys191-Gln192 Glu193-Asp194-Ser195, Ser214-Thp215-Gly216, позволило точно описать активный центр фермента. Рассчитанная энергия активации на первой стадии реакции не превысила 10 ккал/моль.

3. Впервые с помощью комбинированного метода квантовой и молекулярной механики проведено моделирование эффекта индуцированного соответствия.

Показано, что только за счет сжатия активного центра при встраивании в него модельного субстрата может происходить снижение активационного барьера до 3 ккал/моль.

4. Впервые определено, что реакция гидролиза метилтрифосфата в водном окружении протекает по механизму нуклеофильного замещения второго порядка SN2 в присутствии катиона Mg2+. В отсутствие Mg2+ реакция протекает в две стадии с образованием интермедиата по механизму SN1. Энергетические барьеры, рассчитанные методом функционала плотности и теории возмущений второго порядка, не превышают 17 ккал/моль.

5. Результаты данной работы позволяют представить общую картину протекания реакций фосфорилирования в водном растворе и в присутствии белковой матрицы. Выявлена общая закономерность при рассмотрении реакций гидролиза АТФ и ГТФ в белках: белковая матрица способствует ослаблению гидролизуемой связи P-O еще до начала реакции, что приводит к снижению активационных барьеров рассматриваемых ферментативных реакций по сравнению с подобными барьерами, полученными для реакции гидролиза метилтрифосфата в воде.

6. Продемонстрирована практическая значимость комбинированного метода квантовой и молекулярной механики, основанного на теории потенциалов эффективных фрагментов: на примере различных биохимических реакций гидролиза, включая хорошо изученную экспериментально реакцию гидролиза пептидной связи трипсином и сложную реакцию гидролиза ГТФ белком p21ras.

Эффективность метода подтверждается сравнением полученных результатов моделирования с результатами других теоретических исследований и с экспериментальными данными, накопленными по рассматриваемым системам.

Это дает основание полагать, что метод может быть использован для определения механизмов других возможных реакций, протекающих в живых системах, и служить важнейшим источником данных о неизученных в настоящее время биохимических реакциях.

Практическая значимость данной работы заключается в том, что результаты данного исследования помогают детализировать механизм химической реакции, а, следовательно, дают принципиальную возможность управлять ферментативными реакциями. В частности, понимание механизма реакции гидролиза субстрата трипсином облегчает создание новых ингибиторов, а понимание механизма реакции гидролиза гуанозинтрифосфата в белке p21ras дает возможность влиять на процессы деления клеток.

Результаты исследования могут быть использованы в разработке биологически активных соединений и новых лекарственных препаратов.

Апробация работы и публикации Материалы диссертации были представлены на V Ежегодной международной молодежной конференции, Институт Биохимической физики РАН им. М.Н. Эмануэля (Москва, 2005), II Российская школе-конференции «Молекулярное моделирование в химии, биологии и медицине» (Саратов, 2004), Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2004» (Москва, 2004), Английской секции международной конференции студентов и аспирантов «Ломоносов-2004» (Москва, 2004), III Международной конференции по водородным связям и молекулярному взаимодействию (Киев, 2006).

Результаты работы опубликованы в 10 печатных изданиях, в том числе в 5 тезисах докладов.

Структура и объем работы Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов и списка цитируемой литературы из 130 наименований. Работы изложена на 135 страницах и включает рисунков и 17 таблиц.

Содержание работы Первая глава посвящена описанию методик моделирования, включая методы квантовой химии, оригинального комбинированного метода квантовой и молекулярной механики (КМ/ММ), а также методов классической механики - молекулярного докинга и молекулярной динамики, которые необходимы на начальных стадиях моделирования.

Методы квантовой химии (метод Хартри-Фока, метод теории возмущений второго порядка в варианте Меллера-Плессе) были использованы для обоснования выбора базиса LANL2DZdp ECP с одноименным потенциалом для моделирования реакций гидролиза трифосфатов в воде и в белковом окружении.

Согласно общей идеи комбинированных КМ/ММ подходов [Warshel A., Levitt M., 1976] в основе используемого метода лежит разделение рассматриваемой системы на две части, одна из которых рассматривается на квантовом уровне (КМ часть), а другая – в рамках методов молекулярной механики (ММ часть). В используемом в данной работе подходе [Григоренко Б.Л. и др., 2002], взаимодействие между КМ и ММ подсистемами описывается с помощью неэмпирического метода потенциалов эффективных фрагментов (ПЭФ). Метод потенциалов эффективных фрагментов [Gordon M.S. и др., 2001] был разработан для моделирования влияния сольватации в рамках дискретных моделей описания растворителя. Основная идея метода заключается в замене молекул растворителя эффективными фрагментами, потенциалы которых входят в одноэлектронную часть оператора Гамильтона молекулы растворенного вещества.

После обобщения теории ПЭФ данный вариант комбинированного метода КМ/ММ может быть представлен в виде следующей схемы:

1. Молекулярно-механическая подсистема разбивается на фрагменты, типичные для белковых систем, геометрические параметры которых с определенной точностью можно считать фиксированными. Построенные эффективные фрагменты используются в рамках метода ПЭФ при описании влияния окружения па квантово-механическую подсистему.

2. Для каждого фрагмента неэмпирическими методами квантовой химии предварительно рассчитываются параметры электростатического и отталкивательного потенциалов.

Электростатический потенциал представляется в виде мультипольного разложения вплоть до октупольных вкладов, а отталкивательный потенциал представляется в виде линейной комбинации гауссовых функций.

3. Взаимодействие между эффективными фрагментами описывается в рамках молеку лярной механики. В ходе оптимизации геометрических параметров всей системы геометрия эффективных фрагментов остается фиксированной.

4. Конформационная нежесткость ММ подсистемы обеспечивается подвижными пептидными цепями.

Предложенный КМ/ММ метод реализован с использованием двух пакетов компьютерных программ: PC GAMESS [Грановский A.A.] и TINKER [Ponder J.W. и др., 1987].

На предварительных стадиях моделирования для оценки параметров фермент субстратных комплексов были использованы методы молекулярного докинга и молекулярной динамики. Расчеты по молекулярному докингу были выполнены с программой Autodock3.0, позволяющей изучать связывания лиганда с белком, оценивать комплементарность (структурную и химическую) белка и лиганда, находить энергию связывания лиганда в комплексе с белком.

В нашей работе [1] были проведены оценки сродства ряда производных гуанозиннуклеотидов к активным центрам ГТФ-связывающих белков. Рассчитанные геометрические конфигурации комплексов служили источником информации об исходных координатах реагентов в ферментативных реакциях гидролиза гуанозинтрифосфата. В работе были проанализированы 48 структур фермент-субстратных комплексов.

Для исследования подвижности петли белка p21ras, содержащей один из ключевых аминокислотных остатков Gln61, который принимает непосредственное участие в реакции, был использован метод молекулярной динамики. Моделирование проводилось с помощью программы HyperChem7 с силовым полем AMBER99.

Во второй главе описано моделирование реакции гидролиза пептидной связи субстрата трипсином. Сериновые протеазы составляют почти третью часть всех известных протеаз. Этот класс ферментов традиционно выделяется вследствие наличия группы остатков аспарагиновой кислоты (Asp), гистидина (His) и серина (Ser), названной каталитической триадой. В главе приводятся литературные экспериментальные и теоретические сведения об этой реакции. В качестве результата моделирования приводится анализ реакции гидролиза с участием двух различным моделей, построенных на базе трипсинового панкреатического ингибитора.

Начальная геометрическая конфигурация атомов для первой и второй модели (соответственно, модели I и II) выбиралась на основе структуры трипсина с панкреатическим трипсиновым ингибитором, полученной методом рентгеноструктурного анализа (РСА, разрешение 1.9 ) [Marquart M. и др., 1983] из Брукхэвеновского банка данных белков (код структуры 2PTC) [Protein Data Bank, URL http://www.rcsb.org/pdb/].

Модель I представляла собой пептидную цепь CH3(NHCO-CH2)2-HN-CO-(CH2 NHCO)CH3 (соответствует остаткам CysI14-LysI15-AlaI16-ArgI17-IleI18 в структуре с кодом 2PTC) в качестве субстрата (жирным шрифтом показан фрагмент с разрываемой ферментом связью C-N), и все аминокислотные остатки фермента в радиусе примерно 15 от O Ser195. На рис. 1 приведена часть молекулярной системы в рамках модели I, состоящая из остатков каталитической триады Asp102, His57 и Ser195, центральной части субстрата и одной молекулы воды, отнесенная к квантовой подсистеме. 40 атомов относились к КМ части, включая 5 замыкающих атомов водорода. ММ часть состояла из 621 атома, объединенных в 191 эффективный фрагмент. Граница КМ/ММ проходила через С-С ковалентные связи Asp, His и Ser, С-С и С-N связи центральной части субстрата (см. рис. 1).

Рис. 1. Квантовая часть модели I.

В качестве субстрата для модели II брали фрагмент панкреатического ингибитора, более точно соответствующий структуре активного центра, в отличие от субстрата модели I. Модель II включала 812 атомов. На рисунке 2 представлена квантовая подсистема, состоящая из остатков каталитической триады His57 и Ser195, пептидной цепи CH3-CONH-CH(CH3)-CO-NH-CH(CH3)-CONH-CH3 (жирным шрифтом выделен участок с разрываемой связью). Всего 56 атомов относились к КМ части, включая замыкающих атомов водорода. ММ часть состояла из 756 атомов, объединенных в эффективный фрагмент.

Рис. 2. Квантовая подсистема модели II.

Геометрическая оптимизация выполнялась ограниченным методом Хартри-Фока с базисом 6-31G (HF/6-31G) для КМ части, ММ взаимодействия описывались силовым полем OPLSAA (для модели I) и AMBER (для модели II). Оценка энергий в стационарных точках проводилась с учетом электронной корреляции методом теории возмущений Меллера-Плессе второго порядка с базисом 6-31+G* (MP2/6-31+G*//RHF/6-31G). В рамках второй модели, для отдельной части системы, состоящей из 183 атомов, проводили дополнительный расчет MP2 в трех точках на ППЭ в базисе 6-31G* (с добавлением диффузных функций на атомы N, O) – MP2/6-31+’G*//RHF/6-31G.

Реакция гидролиза пептидной связи начинается со стадии ацилирования. Кислород Ser195 атакует карбонильный атом углерода пептидной связи субстрата, что приводит к образованию тетраэдрического интермедиата (ТИ1). His57 выступает в качестве основания и принимает протон от Ser195. Образовавшийся ион His57-H+ стабилизируется водородной связью с Asp102. Оксианион тетраэдрического интермедиата стабилизируется взаимодействием с NH группами главной цепи (оксианионовой дыры). Тетраэдрический интермедиат разрушается, при этом His57-H+ реагирует как кислота, амин уходит из сферы реакции, образуется ацил-ферментный комплекс. Следующий этап реакции – деацилирование повторяет описанную выше последовательность стадий: вода атакует ацилферментный комплекс, и при помощи основания His57 образуется второй тетраэдрический интермедиат. При разрушении интермедиата образуется Ser195 и продукт реакции - карбоновая кислота.

Расчет энергий методом MP2/6-31+G* для найденных стационарных точек для модели I приведен в таблице 1 в первой строке. Разница энергий в 38 ккал/моль между ТИ1 и фермент-субстратным слишком велика, учитывая, что экспериментальная энергия активации на стадии ацилирования составляет около 15 ккал/моль [Strajbl M. и др., 2000].

Таблица 1. Относительные энергии (в ккал/моль) для найденных стационарных точек, рассчитанные методом КМ(MP2/6-31+G*)/ММ(OPLSAA).

Моделируемая стадия ФС ТИ1 ФА1 ФА2 ТИ2а ТИ2б ФП Весь цикл 0 38.0 26.2 34.0 40.7 36.0 15. Стадия ацилирования без включения молекулы воды 28. 0 20.4 - - - в КМ части, оптимизация (25.9)* HF/6-31G * - Оптимизация с базисом 6-31+G* Большое отличие в энергии, полученной методом КМ/ММ, от экспериментальной величины, по всей видимости, связано с несоответствием модельного субстрата и активного центра фермента. Поэтому, мы использовали другую модель (модель II) для проверки данной гипотезы.

Для второй модели серия расчетов включала только стадию ацилирования.

Полученные энергии, соответствующие стационарным точкам на поверхности потенциальной энергии представлены в таблице 2.

Таблица 2. Энергия (в ккал/моль) по отношению к ФС для модели II.

Система ПС ТИ 56 атомов КМ(HF/3-21G)/221 ЭФ ММ(AMBER) 9.6 -6. 183 атома MP2/6-31G+’*//HF/3-21G 8.2 -18. 56 атомов КМ(HF/6-31G)/221 ЭФ ММ(AMBER) 6.6 -6. 56 атомов КМ(MP2/6-31+G*//HF/6-31G)/221 ЭФ ММ(AMBER) 7.9 -11. Результаты, полученные для модели II качественным образом отличаются от результатов, полученных для модели I. В таблице 3 приведены значения некоторых межъядерных расстояний для первой и второй модели для структуры фермент субстратного комплекса, а также, в последнем столбце, значения этих параметров, полученные методом РСА. Сжатие активного центра трипсина в случае модельного субстрата II приводит к уменьшению пути переноса протонов в пространстве, что приводит к снижению энергетического барьера. Меньшая длина водородных связей для структуры тетраэдрического интермедиата приводит к его стабилизации.

Таблица 3. Некоторые параметры моделируемых систем (в ).

Модель 1 Модель 2 Модель КМ(HF/6- КМ(HF/3- КМ(HF/6- Эксперимент РСА Значение параметра [Marquart M., 1983] 31G)/ММ 21G)/ММ 31G)/ММ (OPLSAA) (AMBER) (AMBER) R(О1 Asp102 - N His57) 2.85 2.85 2.86 2. R(O Ser195 - N His57) 2.86 2.60 2.64 2. R(O Ser195 – Cкарбонильн.) 2.95 2.28 2.42 2. R(N His57 – Nпептид. субст) 4.38 3.92 4.12 4. Ясно, что стадия ацилирования требует больше энергетических затрат, нежели стадия деацилирования. При этом переход от фермент-субстратного комплекса к тетраэдрическому интермедиату требует наибольших энергетических затрат. Присутствие молекулы воды вблизи реакционного центра на стадии ацилирования приводит к дестабилизации тетраэдрического интермедиата (модель I) на 10 ккал/моль (MP2/6 31+G*) по сравнению с реакцией без участия воды. Полученная энергия активация на стадии ацилирования для второй модели, не превышающая 10 ккал/моль, хорошо согласуется с экспериментальными данными.

В этой главе также приведена оценка влияния субстрата на активный центр фермента. Если рассмотреть многообразие структур сериновых протеаз, то можно определить следующую закономерность: расстояние N-His-OSer для «свободных» ферментов, как правило, на 0,1-0,2 больше, чем в комплексах фермента с ингибитором.

То есть, связывание с субстратом приводит к заметному сжатию активного центра, тем самым подтверждается принцип индуцированного соответствия.

Мы оценили насколько важны могут быть эффекты сжатия фермента при связывании с субстратом. Расстояние N-His-OSer было принято равным наиболее характерному для системы без субстрата – 2.7. Фиксируя это расстояние, мы оптимизировали все геометрические параметры фермент-субстратного комплекса (КМ:

RHF/6-31G, ММ: OPLSAA). Расстояние N-His-HSer оказалось равным 1,76. Далее, расстояние N-His-OSer было принято равным 2.6 для сжатой модели фермент субстратного комплекса, как результат связывания фермента и субстрата. Проведена оптимизация геометрических параметров структуры методом КМ/ММ. В полученной структуре, расстояние между N-His и HSer оказалось равным 1,65. Перенос протона от Ser к His, который приводит к образованию тетраэдрического интермедиата, отвечает за лимитирующую стадию всего каталитического цикла сериновых протеаз [Hedstrom L., 2002]. Поэтому, разница в энергии между точкой на ППЭ с растянутой водородной связью (1,76 ) и стационарной точкой со связью N-His и HSer равной 1,65, может служить как ориентировочная доля энергии активации, на которую может произойти уменьшение энергетического барьера на стадии ацилирования, как результат связи фермента и субстрата. Расчеты методом КМ/ММ показывают снижение энергетического барьера на ккал/моль за счет подобного сжатия. Принимая во внимание, что общая энергия активации на первой стадии оценивается в 9,6 ккал/моль [2], наш анализ показывает, что 3 ккал/моль в энергии активации приводят к изменению константы скорости реакции на 3 порядка.

В третьей главе описано моделирование реакции гидролиза метилтрифосфата (МТФ) в водной среде. Моделирование реакции гидролиза метилтрифосфата позволяет установить реперную точку для оценки каталитического эффекта ферментативных реакций гидролиза гуанозинтрифосфата (ГТФ) и аденозинтрифосфата (АТФ). Сравнение результатов моделирования реакции гидролиза в белковом окружении с похожей реакцией в водном окружении позволяет прояснить специфическую функцию белковой матрицы.

При моделировании реакций с участием трифосатов (МТФ, АТФ и ГТФ) был выбран определенный базис, отвечающий требованиям по точности и времени расчета.

Рассмотрев несколько базисов на примере моделирования простой реакции образования H2PO4- из PO3- c H2O, мы остановили свой выбор на базисе LANL2DZdp ECP [Hay P. J., Wadt W. R., 1985] с соответствующим псевдопотенциалом для атома фосфора.

Использование базиса LANL2DZdp ECP позволило обеспечить точность, сопоставимую с точностью, полученной с использованием базиса 6-311++G**, при существенно меньших временных затратах.

Для моделирования реакции гидролиза метилтрифосфата рассматривали две основные модели:

1. Модель с участием иона метилтрифосфата, пяти молекул воды, и 75 эффективных фрагментов – молекул воды в молекулярно-механической части – модель I.

2. Модель с участием иона метилтрифосфата, иона магния, семи молекул воды, и эффективных фрагмента – молекул воды в молекулярно-механической части – модель II.

Все расчеты проведены с использованием функционала плотности B3LYP. Кроме того, были выполнены расчеты с использованием методов теории возмущений второго порядка в варианте Меллера-Плессе.

Для модели без присутствия иона Mg2+ в системе реакция протекает в две стадии.

На первой стадии реакции вода, выступая в роли нуклеофила, атакует атом фосфора.

Такая реакции становится возможной при раскрытии «зонта» из атомов кислорода на фосфатной группе (происходит растягивание связи O - P до 2.21 в первом переходном состоянии). Далее, происходит окончательный разрыв связи O - P, и образование новой связи между кислородом каталитической воды Ow и P. При этом оба протона также связаны с кислородом. Эта стационарная точка соответствует структуре интермедиата в данной реакции. На заключительной стадии реакции протон от каталитической молекулы воды переходит на соседнюю молекулу воды и по цепочке передается на кислород фосфатной группы, образуя неорганический фосфат H2PO4- в качестве продукта реакции.

Для модели с участием катиона Mg2+ в реакции механизм несколько отличается. На первой стадии также происходит увеличение расстояния O - P и предоставляется возможность каталитической молекуле воды нуклеофильно атаковать -фосфор. При расстоянии O - P равном 2.51 фиксируется переходное состояние. Интермедиат в реакции на последующей стадии зафиксировать не удалось, минимизация геометрии приводила к продукту реакции. Присутствие катиона Mg2+ приводит к изменению электронной плотности на -фосфоре в ходе реакции, способствуя образованию ковалентной связи с кислородом каталитической воды.

20. 15. 10. Ккал/моль 5.00 MP2 без Mg B3LYP без Mg 0. B3LYP c Mg Реагенты ПС1 Интермедиат ПС2 Продукты MP2 с Mg -5. -10. -15. Координата реакции -20. Рис. 3. Энергетическая диаграмма для реакции гидролиза метилтрифосфата в присутствии иона Mg2+ и в его отсутствии.

На энергетической диаграмме на рис. 3 приведено сравнение результатов расчетов, выполненных различными методами для моделей I и II.

Стадия отщепления -фосфатной группы и нуклеофильная атака воды является лимитирующей. Энергетический барьер в случае реакции в присутствии катиона Mg2+ снижается, составляя 11.1 ккал/моль (методом B3LYP). Однако, расчет энергии методом теории возмущений второго порядка в варианте Меллера-Плессе в стационарных точках, найденных методом B3LYP дает оценку энергетического барьера – 15.9 ккал/моль.

Суммарный энергетический эффект реакции составляет -8.6 ккал/моль в случае реакции в присутствии катиона Mg2+ и -16.4 ккал/моль в случае его отсутствия в приближении теории функционала плотности, и -3.9 ккал/моль и -13.3 ккал/моль, соответственно, в приближении теории возмущений второго порядка.

В четвертой главе описано моделирование реакции гидролиза аденозинтрифосфата и гуанозинтрифосфата в биохимических системах. Реакция гидролиза АТФ рассматривается на примере белка миозина. Гидролиз протекает в активном центре белка, образованном молекулой АТФ, катионом магния Mg2+ и аминокислотными остатками, связанными с АТФ, магнием и реакционными молекулами воды водородными связями: Glu470, Phe469, Gly469, Gly468, Ala467, Ile466, Asp465, Thr184, Arg247, Ser245, Asn244. Необходимую для протекания реакции конфигурацию реакционного центра обеспечивают два фактора: катион магния Mg2+, который координирует атомы кислорода трифосфата, а также т.н. «солевой мостик», образованный водородными связями между аминокислотными остатками двух полипептидных цепей Glu470 и Arg247 [Onishi H. и др., 2004]. Реакцию гидролиза ГТФ рассматривали на примере двух различных белков: p21ras и p21ras-GAP. Белок p21ras является центральным регулятором процессов передачи клеточных сигналов внутрь клетки, относится к классу мембранных G-белков (GTP-binding protein – ГТФ-связывающие белки), основная функция которых заключается в передаче сигнала от внешних рецепторов на эффекторные системы плазматической мембраны. Второй белок представляет собой комплекс белка p21ras и активирующего белка GAP (GTP-activating protein – ГТФ активирующий белок), который помогает белку p21ras принять конформацию, удобную для гидролиза ГТФ, но напрямую не участвует в реакции гидролиза.

Для моделирования реакции гидролиза АТФ в данной работе использована структура молекулы миозина из Брукхэвеновского банка данных белков с кодом 1VOM [Smith C.A., Rayment I., 1996]. Выбор обусловлен значительным количеством теоретических и экспериментальных данных, относящихся к этой структуре. В модель включены атомы белка (115 аминокислотных остатков) и молекулы воды, находящиеся на расстоянии не более 16 от P. В местах разрывов химических связей добавлены концевые CH3-группы для насыщения свободной валентности граничных атомов.

Комплекс Mg·АТФ полностью депротонирован, АТФ присутствует с зарядом 4-.

Квантовая часть состояла из 47 атомов, молекулярно-механическая часть включала эффективных фрагментов. Расчеты выполнены комбинированным методом квантовой и молекулярной механики. Расчеты для квантовой части выполнялись с использованием метода Хартри-Фока с базисом LANL2DZdp ECP.

Для структуры, соответствующей фермент-субстратному комплексу (рис. 4), расстояние P - O составило 1.78, а расстояние между P и кислородом каталитической воды Wat1 – 2.70. Отметим, что расстояние P - O для системы АТФ/миозин такое же, что и для системы ГТФ/Ras-GAP [Topol I.A. и др., 2004], тогда как соответствующее расстояние для системы метилтрифосфата в воде составляет 1.69. То есть, в системе АТФ/миозин, также как и в системе ГТФ/Ras-GAP, связывание субстрата с белком приводит к ослаблению связи P - O по сравнению с похожей реакцией в водном растворе. Данные анализа натуральных связевых орбиталей подтверждают предположение: число заселенности несвязывающей орбитали *(P-O) почти в два раза выше (0.24 а.е.), чем числа заселенности других связывающих орбиталей *(P-O) АТФ, что приводит к ослаблению именно P-O связи.

Согласно расчетам, реакция протекает следующим образом (жирными стрелками на рис. 4 обозначены переносы атомов и частиц): вода Wat1 нуклеофильно атакует фосфатную группу АТФ (начальное расстояние 2.70 ), и один протон переходит на воду Wat2 вдоль водородной связи с начальным расстоянием 2.72. Геометрическая конфигурация переходного состояния характеризуется почти плоским углом PO3, группа PO3 находится на достаточном расстоянии от АДФ (2.24 по сравнению с 1.78 в фермент-субстратном комплексе). В стационарной точке, соответствующей продуктам реакции, образуются АДФ + HPO42-, а протон переходит на аминокислотный остаток Glu459. Можно предположить, что полученная структура является промежуточной во всем процессе гидролиза. Вероятно, что временное протонирование группы Glu должно привести к раскрытию солевого мостика Arg238-Glu459, что приведет к выходу неорганического фосфата (предположительно в форме H2PO4-) из активного центра.

Энергетический барьер при образовании переходного состояния составляет ккал/моль, а продукты реакции (АДФ + HPO42-) лежат на 3.5 ккал/моль ниже стационарной точки, соответствующей структуре фермент-субстратного комплекса.

Arg 3. Ser (4.13) 1. 1. 2.87 (2.19) Mg Wat (2.94) 3. 2.70 ATP P O P 2. 2. 3. (2.85) 3. (2.75) 2. (3.62) 2.71 3. 2.67 2. 4.38 Wat2 (2.75) (4.37) Ser Lys Glu Рис. 4. Оптимизированная геометрия фермент-субстратного комплекса. В расчетах, фосфатные группы АТФ, катион магния, боковые цепи Glu459 и Arg238, а также две молекулы воды Wat1 и Wat2 включены в КМ часть. Расстояния приведены в ангстремах.

Значения, приведенные в скобках, относятся к кристаллической структуре с кодом 1VOM.

Отметим, что теоретически полученные результаты находятся в соответствии с экспериментальными наблюдениями, включая эксперименты по кислородному обмену и эксперименты, подтверждающие роль солевого мостика Arg238-Glu459. Также отметим, что данная работа является первым теоретическим моделированием реакции гидролиза АТФ в миозине, в результате которой получены приемлемые значения для энергетических барьеров.

Для реакции гидролиза ГТФ в белке p21ras начальная геометрическая конфигурация атомов структуры белка p21ras и ГТФ выбиралась, используя координаты структуры белкового комплекса p21ras-GppNp, полученного методом рентгеноструктурного анализа (РСА, разрешение 1.35 ) [Pai E.F. и др., 1990] из Брукхэвеновского банка данных белков (код структуры 5p21). Кроме этого аминокислотный остаток Gln61 (входит в петлю L4 белка) развернули в сторону фосфатной группы ГТФ, т.к. по нашему предположению, именно этот аминокислотный остаток принимает непосредственное участие в реакции гидролиза [Topol I.A. и др., 2004] С помощью метода молекулярной динамики, мы показали, что остаток Gln61 в структуре, полученной из белка p21ras после развороте петли L4, подходит на такое же расстояние, как и в белке p21ras-GAP. Это свидетельствует, о возможности прямого участия аминокислотного остатка Gln61 в реакции гидролиза ГТФ в белке p21ras.

С помощь метода молекулярного докинга проводили сравнение стабильностей комплекса белок p21ras – ГТФ с разными конформациями цепи аминокислотных остатков 59-70 в белке p21ras. Сравнительными критериями, определяющими однозначность найденного положения, служили вероятность связывания и стандартное отклонение. В результате показано, что вероятность связывания для конформации, соответствующей положению цепи аминокислотных остатков, аналогичным для структуры с кодом 5p21, и конформации с развернутой петлей L4, равна 99 и 97%, соответственно. При этом, стандартное отклонение от данных РСА в обоих случаях равно 0.36. Таким образом, мы показали равноценность связывания молекулы ГТФ в активном центре белка p21ras при различных конформациях цепи аминокислотных остатков 59-70.

Для расчетов КМ/ММ использовали модель, включающую ГТФ, молекулу воды, катиона магния и аминокислотных остатков белка p21ras в радиусе примерно 20 от атома фосфора -фосфатной группы ГТФ. В КМ часть было включено 30 атомов, включая 2 замыкающих атома углерода и 6 замыкающих атомов водорода. ММ часть состояла из 1344 атомов, объединенных в 405 эффективных фрагментов. Граница КМ/ММ проходила через С-Сd связь Gln61 и Р-О5* связь ГТФ.

Определили, что реакция протекает в две стадии. На первой стадии происходит отщепление -фосфатной группы ГТФ под действием окружения активного центра белка.

Объединенное воздействие аминокислотных остатков Gln61 и Lys16 и молекулы воды приводит к перераспределению зарядов на - и -фосфатных группах ГТФ. Увеличивается расстояния между фосфором -фосфатной группы и мостиковым кислородом.

Одновременно с отщеплением фосфатной группы наблюдается «разворачивание» торсионного угла фосфата. При расстоянии P-O равном 2.3 была найдена седловая точка на потенциальной поверхности, соответствующая структуре переходного состояния.

При этом торсионный угол на -фосфатной группе равнее 176°. При дальнейшем движении по ППЭ, образуется интермедиат, состоящий из молекулы воды, аминокислотного остатка Gln61, заряженной частицы РО3- и молекулы ГДФ. Торсионный угол на -фосфатной группе равен 178°. По сравнению со структурой переходного состояния, расстояние от вода до -фосфатной группы изменилось с 2.63 до 2.22.

На второй стадии реакции вода нуклеофильно атакует -фосфор, при этом происходит перенос двух протонов: протона от реакционной воды на атом кислорода аминокислотного остатка Gln61 и, одновременно, протона от атома азота остатка Gln61 на кислород -фосфатной группы. В ходе второй стадии образуется второе переходное состояние, которое представляет собой восьмичленное кольцо. По завершению реакции, протон с остатка Gln61 переходит на ближайший кислород заряженной частицы РО3-.

Протон от молекулы воды переходит на карбонильный кислород остатка Gln61. В результате образуются продукты реакции, состоящие из неорганического фосфата Н2РО4-, молекулы ГДФ и аминокислотного остатка Gln61 в таутомерной форме. Несмотря на то, что таутомерная форма остатка Gln61 является неустойчивой, в данном окружении ее образование энергетически выгодно. Катион магния в ходе реакции не меняет своего положение. Это свидетельствует о том, что основная роль магния заключается в координировании двух кислородов - и -фосфатных групп ГТФ.

Сравнение энергетических профилей для белков ras и ras-GAP +13. E, ккал/моль ПС ПС +10. +4. +3. 0. -2. ГТФ+H2O+E -5. -3. Реагенты ГДФ+PO3+H2O+E -9. ГДФ+Pi+E* Интермедиат Продукты Координата реакции Рис. 5. Сравнение профилей потенциальной энергии реакции гидролиза в белках p21ras (показано синим цветом) и p21ras-GAP (показано красным цветом).

На рис. 5 сопоставлены энергетический профиль пути реакции гидролиза ГТФ в белке p21ras с профилем пути реакции гидролиза ГТФ в белке p21ras-GAP [Topol I.A. и др., 2004]. Реакция гидролиза протекает по сходному механизму. Энергетический профиль пути реакции приведен на рис. 5.

Основное отличие между этими белками заключается в наличии аминокислотного остатка Arg789 в комплексе p21ras-GAP. Основанная роль остатка Arg789 заключается в координировании остатка Gln61 в оптимальном положении для реакции гидролиза.

Поэтому в отсутствие остатка Arg789 двойной перенос протонов осуществляется с большим барьером. При этом барьер отщепления -фосфатной группы ГТФ для белков p21ras и p21ras-GAP значительно не отличается. Энергетический эффект реакции гидролиза ГТФ в белке p21ras меньше, чем в белке p21ras-GAP. Это свидетельствует о том, что аминокислотное окружение белка p21ras-GAP лучше компенсирует перераспределение зарядов в активном центре при образовании продуктов гидролиза.

Основные результаты и выводы 1. Комбинированным методом квантовой и молекулярной механики с подвижными эффективными фрагментами построен энергетический профиль пути реакции гидролиза модельного субстрата в активном центре сериновых протеаз.

Аминокислотные остатки субстрата Thr11-Gly12-Pro13-Cys14-Lys15-Ala16-Arg17 Ile18-Ile19 и аминокислотные остатки белка His40-Phe41-Cys92, Ser190-Cys191 Gln192-Glu193-Asp194-Ser195, Ser214-Thp215-Gly216 вносят основной вклад во взаимодействие субстрата с активным центром фермента. Методом КМ/ММ дана оценка энергии активации 9.6 ккал/моль для стадии ацилирования.

2. В соответствии с феноменологическим принципом индуцированного соответствия показано, что сжатие активного центра фермента трипсина при встраивании субстрата может способствовать снижению активационного барьера на 3 ккал/моль.

3. По результатам КМ/ММ моделирования определено, что реакция гидролиза метилтрифосфата в водном окружении в присутствии катиона Mg2+ протекает по механизму нуклеофильного замещения второго порядка SN2. В отсутствие Mg2+ реакция протекает в две стадии с образованием интермедиата по механизму SN1.

Энергетические барьеры, рассчитанные методом функционала плотности и теории возмущений Меллера-Плессе второго порядка, не превышают 17 ккал/моль.

4. Методом КМ/ММ построен профиль пути реакции гидролиза аденозинтрифосфата (АТФ) в миозине. Предложен механизм каталитического действия миозина в реакции гидролиза АТФ с непосредственным участием солевого мостика Arg-Glu.

5. Построен энергетический профиль пути реакции гидролиза гуанозинтрифосфата (ГТФ) в белке p21ras. Сопоставлены результаты, полученные для реакции гидролиза ГТФ, протекающей в белках p21ras и p21ras-GAP.

6. Отмечены общие черты для реакций гидролиза АТФ и ГТФ в соответствующих белках: белковая матрица способствует ослаблению гидролизуемой связи P-O еще до ее разрыва, что приводит к снижению активационных барьеров рассматриваемых ферментативных реакций по сравнению с подобными барьерами, полученными для реакции гидролиза метилтрифосфата в воде.

Основные публикации по теме диссертации 1. Шадрина, М.С.;

Рогов, А.В.;

Бравая, К.Б.;

Немухин, А.В. Молекулярный докинг производных гуанозиннуклеотидов в ГТФ-связывающие белки // Вестник Московского Университета. Химия, 2005, том 46, №6, c. 363-369.

2. Nemukhin, A.V.;

Grigorenko, B.L.;

Rogov, A.V.;

Topol, I.A.;

Burt, S.K. Modeling of serine protease prototype reactions with the flexible effective fragment potential quantum mechanical/molecular mechanical method // Theor.Chem.Accounts, 2004, V.111, pp. 36-48.

3. Григоренко, Б.Л.;

Рогов, А.В.;

Князева, М.А.;

Исаева, Е.В.;

Немухин, А.В.

Моделирование механизма реакции гидролиза гуанозинтрифосфата белковым комплексом RAS–GAP // Вестник Московского Университета. Химия, 2005, том 46, №1, с. 19-23.

4. Grigorenko, B. L.;

Rogov, A. V.;

Nemukhin, A. V. Mechanism of Triphosphate Hydrolysis in Aqueous Solution: QM/MM Simulations in Water Clusters // J. Phys. Chem. B., 2006, V. 110(9), pp. 4407-4412.

5. Рогов А.В., Григоренко Б.Л., Шадрина М.С., Бравая К.Б., Доброгорская Я.И., Немухин А.В. Моделирование ферментативных реакций гидролиза гуанозинтрифосфата // II Российская школа-конференция “Молекулярное моделирование в химии, биологии и медицине”, Саратов, 13-16 октября, 2004. – Сборник тезисов докладов.

6. Рогов А.В., Аносова Е.В., Григоренко Б.Л., Немухин А.В. Моделирование механизмов реакций гидролиза трифосфатов // V Ежегодная международная молодежная конференция Института Биохимической физики РАН им. Н.М. Эмануэля, Москва, 14- декабря, 2005. – Сборник тезисов докладов, с. 96-97.

7. Rogov A.V. Quantum mechanical/molecular mechanical modeling of hydrolysis reaction of peptide bonds by trypsin // Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам (английская секция) «Ломоносов-2004», Москва, апрель, 2004.

– Сборник тезисов докладов.

8. Рогов А.В., Григоренко Б.Л., Немухин А.В. Моделирование реакции гидролиза пептизной связи трипсином методами квантовой и молекулярной механики // Международная конференция студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2004», Москва, апрель, 2004. – Сборник тезисов докладов.

9. Grigorenko B.L., Rogov A.V., Shadrina M.S., Anosova E.V. The role of hydrogen bonding in triphosphate hydrolysis in proteins and solutions // III International Conference on Hydrogen Bonding and Molecular Interactions, Kyiv, Ukraine, May 15-21, 2006.– Book of abstracts, p.47.

10. Nemukhin A.V., Gariev I.A., Rogov A.V., Varfolomeev S.D. Serine hydrolases catalytic site:

geometry invariants and modeling catalytic activity // Mendeleev Communications, 2006. – принята к печати.