Влияние холестерина и его эфиров на синтез лейкотриенов 5-липоксигеназой клеток млекопитающих

На правах рукописи

АЛЕКСАНДРОВ Дмитрий Андреевич ВЛИЯНИЕ ХОЛЕСТЕРИНА И ЕГО ЭФИРОВ НА СИНТЕЗ ЛЕЙКОТРИЕНОВ 5-ЛИПОКСИГЕНАЗОЙ КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ 02.00.10 – биоорганическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва –2006 1

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений Химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова и в отделе биокинетики НИИ Физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Научный консультант: доктор химических наук Судьина Галина Федоровна

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор, Вржещ Петр Владимирович доктор биологических наук, профессор, Ланкин Вадим Зиновьевич

Ведущая организация: Институт биохимии РАН им. Баха

Защита состоится 26 декабря 2006 года в 16 часов на заседании Диссертационного совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, д. 1, строение 40, Институт Физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ.

Автореферат разослан 24 ноября 2006 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук Смирнова И.Г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Лейкотриены (LTs) представляют собой группу физиологически активных соединений, играющих важную роль как в системе защиты организма, так и в развитии воспалительных процессов. Установлено, что лейкотриены являются медиаторами таких заболеваний как аллергия, экзема, бронхиальная астма, атеросклероз, сердечно-сосудистые заболевания, псориаз и другие. Кроме того, лейкотриены используются лейкоцитами в качестве молекул межклеточного взаимодействия и влияния на функцию других клеток. Лейкотриены являются продуктами диоксигенирования арахидоновой кислоты (АА). В нейтрофилах человека (polymorphonuclear leukocytes, PMNL) ключевым ферментом синтеза лейкотриенов является 5-липоксигеназа (5-LO, КФ 1.13.11.34). Основными метаболитами АА в нейтрофилах являются лейкотриен В4 (LTB4) и 5-гидроксиэйкозатетраеновая кислота (5 НЕТЕ). Учитывая широкий спектр биологического действия лейкотриенов, подробное изучение механизмов регуляции их синтеза является актуальной задачей биоорганической химии, молекулярной биологии и медицины.

При развитии атеросклероза синтез лейкотриенов в лейкоцитах может модулироваться холестерином, огромное значение которого в атерогенезе является общепризнанным. В атеросклеротических бляшках обнаружен также сульфат холестерина (СХ), однако его биологическая роль пока мало изучена. Исследование механизмов регуляции активности 5-LO под действием холестерина и его эфиров особенно актуально в свете недавнего открытия того, что в атеросклеротических зонах резко повышена экспрессия 5-LO. В этой связи, исследование действия сульфата и других производных холестерина на синтез лейкотриенов представляет несомненный интерес.

Цель и задачи исследования. Целью работы стало комплексное исследование влияния холестерина и его эфиров на продукцию лейкотриенов в различных клетках млекопитающих и бесклеточных системах, а также определение основных закономерностей взаимодействия эфиров холестерина с 5-липоксигеназой и другими участниками метаболического каскада арахидоновой кислоты.

Для выполнения работы необходимо было решить следующие задачи:

- охарактеризовать воздействие холестерина и его эфиров на синтез лейкотриенов в лейкоцитах человека;

- исследовать действие сульфата холестерина на высвобождение субстрата синтеза лейкотриенов – арахидоновой кислоты;

- исследовать действие сульфата холестерина на локализацию фермента 5-LO в клетке;

- определить кинетические параметры взаимодействия анионных производных холестерина с 5-LO из гомогенатов клеток.

Научная новизна и практическая значимость работы. В диссертационной работе впервые показано, что анионные производные холестерина являются регуляторами синтеза лейкотриенов в нейтрофилах человека. Согласно полученным в данной работе результатам, СХ действует на синтез лейкотриенов по нескольким механизмам.

СХ ингибировал высвобождение АА, т.е. снижал концентрацию субстрата для синтеза лейкотриенов. Показано, что СХ частично вытеснял сPLA2 из состава ядерных мембран. Кроме того, согласно данным иммуноблоттинга, СХ ингибировал транслокацию и связывание 5-LO с ядерной мембраной PMNL, что снижало активность фермента и синтез лейкотриенов в клетках.

Продемонстрирован прямой ингибирующий эффект сульфата и фосфата холестерина на 5-LO в гомогенатах клеток. На примере фосфата холестерина было показано, что анионные эфиры холестерина являются прямыми ингибиторами 5-LO, подавляющими активность фермента по неконкурентному механизму. Определена константа ингибирования Кi 5-LO фосфатом холестерина, составившая 110 мкМ. Открытое в данной работе свойство СХ подавлять синтез лейкотриенов указывает на возможную регуляторную роль сульфотрансфераз и сульфатаз в образовании 5-LO продуктов в организме.

Изучено влияние на синтез лейкотриенов, оказываемое различными агентами, регулирующими содержание холестерина и его эфиров в клетке. Показано, что холестерин увеличивает ингибирующий эффект СХ. В то же время, агенты способные экстрагировать холестерин, такие как метил--циклодекстрин (MCD), значительно ослабляют ингибирующее действие холестерина и СХ, оказываемое ими на активность 5 LO и синтез лейкотриенов.

Обнаружено, что СХ подавляет экспрессию 5-LO в клетках ММ6. Предложена модель этого процесса, в которой экспрессия гена 5-LO контролируется на уровне транскрипции посредством связывания СХ с ретиноидными ядерными рецепторами ROR1.

Полученные в данной работе данные могут быть использованы в разработке новых методов диагностики и терапии воспалительных процессов.

Апробация работы. Основные результаты работы представлены на Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2004), ASDD – International Symposium “Advances in science and drug discovery” (Москва – Санкт Петербург, 2005), 31 Конгрессе Европейского Биохимического сообщества FEBS- (Стамбул, 2006).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи в отечественном и иностранном журналах.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка литературы.

Диссертация изложена на 127 страницах и содержит 47 рисунков и 4 таблицы.

Список сокращений.

PMNL – полиморфноядерные лейкоциты человека;

5-LO – 5-липоксигеназа;

АА – арахидоновая кислота, 5,8,11,14-цис-эйкозатетраеновая кислота;

LTB4 – лейкотриен В4, 5S,12R-5,12-дигидрокси-6-цис-8,10-транс-14-цис эйкозатетраеновая кислота;

5-HETE – 5(S)-гидрокси-6-транс-8,11,14-цис-эйкозатетраеновая кислота;

5-HpETE – 5(S)-гидроперокси-6-транс-8,11,14-цис-эйкозатетраеновая кислота;

iso-LTB4 – 5S,12(S)R-5,12-дигидрокси-6,8,11,14-транс-эйкозатетраеновые кислоты;

X – холестерин;

CX – сульфат холестерина;

ФХ – фосфат холестерина.

5-липоксигеназный путь метаболизма арахидоновой кислоты OH OOH 5-LO COOH COOH COOH арахидоновая 5S-HpETE 5S-HETE кислота (АА) 5-LO O COOH 5S,12SR-diHETEs LTA (iso-LTB4) LTA4 гидролаза OH COOH -OH-LTB4 LTB OH ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ I Действие холестерина и его производных на синтез продуктов 5-LO активности в нейтрофилах человека в суспензии и при взаимодействии с различными биологическими поверхностями Роль липидов в регуляции клеточных ответов изучена намного меньше, чем генная и белковая регуляция. Основная сложность, но вместе с тем и преимущество, липидного воздействия состоит в том, что липиды оказывают глобальный эффект на регулировку всей клеточной машины. Касательно 5-LO, в бесклеточной системе, в экспериментах с липидными везикулами, недавно было показано, что флюидизация мембран является одним из ключевых факторов, способствующих связыванию 5-LO с мембраной и последующей активации фермента. В экспериментах с использованием везикул различного состава было обнаружено, что наличие в них катионных липидов (1,2 димиристоил-глицеро-3-этилфосфохолин) увеличивает, а анионных (1-пальмитоил-2 олеил-глицеро-глицерин-3-фосфат) – снижает активность 5-LO [Pande et al., 2004].

Показано, что анионные производные галактоцереброзидов – сульфатиды, также подавляют активность 5-LO [Sud'ina et al., 2001].

Уникальное положение среди прочих липидов занимает холестерин, который является важнейшим структурообразующим компонентом клеточных мембран, а также присутствует в плазме крови, где происходит его этерификация. Недавно было обнаружено, что 5-LO вовлечена в развитие атеросклероза. Эти данные делают заманчивым исследование эффектов, которые могут оказывать холестерин и его производные на активность этого фермента. Описанные ниже исследования влияния холестерина и его эфиров на синтез лейкотриенов в нейтрофилах человека проведены впервые.

I.1. Подавление синтеза лейкотриенов свободным холестерином и его производными в PMNL Было исследовано воздействие холестерина (Х), его сульфата (СХ), фосфата (ФХ) и ацетата (АХ) на синтез лейкотриенов и 5-НЕТЕ в нейтрофилах человека (PMNL, polymorphonuclear leucocytes). PMNL выделялись из цельной крови и ресуспендировались в среде инкубации. В среду вводили холестерин и различные его производные. Инкубация проводилась при 37оС в течение 30 мин. После этого к смеси добавлялся ионофор А23187, что приводило к инициации активности 5-LO и синтезу 5-НЕТЕ и LTs. Образование метаболитов АА начиналось после резкого увеличения концентрации ионов Са2+, вызванного добавлением ионофора А23187 и продолжалось 10-15 мин. Вследствие постепенной инактивации 5-LO, уже через 10 мин количество образовавшегося продукта достигало максимума и выходило на плато. Остановка инкубации осуществлялась через 10 мин добавлением к реакционной смеси равного объема охлажденного до -18оС МеОН с внутренним стандартом простагландином B2. Количество продуктов активности 5-LO определялось хроматографически. Полученные данные представлены на рис. 1.

а iso-LTB4 LTB4 5-HETE Сумма продуктов Количество 5-LO продуктов, нг/ Рис. 1 Сравнение эффектов Х и его эфиров, оказываемых на 5-LO активность в PMNL. Приводится PMNL количество всех продуктов 5-LO активности: 5-НЕТЕ и лейкотриенов.

а – концентрация липидов 10 мкг/мл;

Контроль СХ ФХ АХ Х б – концентрация липидов 25 мкг/мл.

б iso-LTB4 LTB4 5-HETE Сумма продуктов Количество 5-LO продуктов, нг/ PMNL Сравнение действия самого Контроль СХ ФХ АХ Х холестерина и различных его производных на синтез лейкотриенов в нейтрофилах человека показало, что анионные производные холестерина, СХ и ФХ, существенно влияют на образование продуктов активности 5-LO.

Видно, что Х не оказывал влияния на синтез LTs в концентрации 10 мкг/мл (рис.

1а), однако был эффективен в концентрации 25 мкг/мл (рис. 1б). СХ подавлял синтез LTs уже в концентрации 10 мкг/мл. ФХ оказался еще более сильным ингибитором, при этом повышение концентрации СХ и ФХ приводило к существенному увеличению ингибирующего воздействия. В то же время, АХ, также имеющий массивную, но электронейтральную эфирную группу, оказался более слабым эффектором, чем Х и практически не оказывал влияния на активность 5-LO и синтез LTs. Этот результат позволил предположить существенную роль отрицательного заряда боковых эфирных групп производных холестерина в подавлении метаболизма АА по 5-липоксигеназному пути. Эта гипотеза была проверена нами и результаты будут изложены ниже.

I.2. СХ стимулирует адгезию PMNL к коллагену и эндотелию Взаимодействие липидов с клеточной мембраной может приводить к активации адгезионных рецепторов и прикреплению нейтрофилов к поверхности. В организме адгезия и активация нейтрофилов при взаимодействии с эндотелием может вызывать дисфункцию эндотелия.

Эффект СХ на адгезионные свойства нейтрофилов изучался на поверхностях, покрытых коллагеном, и на монослое эндотелиальных клеток, полученных из пуповинных вен человека. Таким образом, были смоделированы условия неповрежденного сосуда (эндотелий) и поврежденного, когда открывается свободный доступ к экстраклеточному матриксу (коллаген). СХ увеличивал адгезию нейтрофилов к коллагену в 3 раза по сравнению с контрольными клетками (рис. 2а).

а б Количество 5-LO продуктов, % от контрол Коллаген Коллаген Эндотелий Эндотелий Адгезия, % 40 Конт роль СХ Контроль СХ Рис. 2 Влияние СХ (25 мкг/мл) на адгезию PMNL к эндотелию и коллагену и синтез LTs и 5 НЕТЕ. а - Степень адгезии нейтрофилов к коллагену и эндотелию в присутствии СХ. б - СХ подавляет стимулированный кальциевым ионофором А23187 синтез LTs при адгезии нейтрофилов к коллагену и эндотелию.

На монослое эндотелия СХ действовал еще эффективнее (увеличение адгезии в раз). Адгезионные взаимодействия были специфическими и подавлялись в присутствии моноклональных антител к адгезионным рецепторам (данные не показаны).

Для того чтобы понять, как СХ влияет на синтез LTs при взаимодействии PMNL с коллагеном и эндотелием, мы стимулировали клетки кальциевым ионофором А23187 в тех же условиях, при которых исследовали адгезию к коллагену и эндотелию. В отсутствие ионофора СХ не стимулировал синтез LTs. При инкубациях на коллагене СХ подавлял стимулированный ионофором синтез LTs на 75-85%, а в инкубациях с эндотелием - на 81-90% (рис.2б).

Эндотелиальные клетки не содержат 5-LO. Таким образом, СХ ингибировал синтез лейкотриенов в нейтрофилах как в суспензии, так и при адгезии к поверхностям, покрытым коллагеном или монослоем эндотелиальных клеток.

Установлено, что активация 5-LO в клетке происходит при повышении внутриклеточной концентрации Са2+, которое приводит к транслокации фермента к ядерной мембране и связыванию с ней. Известно, что N-концевой домен 5-LO подобен С2-домену протеинкиназы С и при росте внутриклеточного уровня Са2+ именно он прикрепляется к мембране клетки. Показано, что в связывании белка с мембраной участвуют остатки триптофана 13, 75 и 102. По-видимому, электростатическое взаимодействие фермента с мембраной играет в связывании важную роль, поскольку катионные группы фосфатидилходина способствуют связыванию 5-LO с мембраной [Skorey et al., 1998;

Reddy et al., 2000;

Kulkarni et al., 2002].

Итак, начальными стадиями в активации синтеза лейкотриенов в клетках являются:

- подъем концентрации внутриклеточного кальция;

- высвобождение АА под действием сPLA2;

- транслокация 5-LO к ядерной оболочке.

Мишенями для СХ a-priori могут быть все эти процессы.

Следующим этапом работы стало исследование действия СХ на высвобождение АА и на транслокацию 5-LO к ядру. Динамика внутриклеточного кальция не рассматривалась как лимитирующий фактор, поскольку в качестве стимула синтеза лейкотриенов в экспериментах был использован кальциевый ионофор А23187.

I.3. СХ снижает доступность субстрата для 5-LO Для определения влияния, оказываемого СХ на высвобождение внутриклеточной АА из мембран, клетки инкубировались с радиоактивно меченой С-АА, а затем промывались для удаления не связавшейся радиоактивности. Синтез LTs инициировали ионофором А23187. Продукты 5-LO активности и высвобожденная АА детектировались по радиоактивности. В инкубациях с СХ высвобождение АА и ее дальнейший метаболизм были сильно и концентрационно-зависимо подавлены (рис. 3).

Интересно, что высвобождение С-АА ингибировалось как в присутствии, так и в отсутствие экзогенной 20 мкМ АА. На рис. 3б представлена сумма образовавшихся 5-LO продуктов. Клетки также как и в предыдущем случае инкубировались в присутствии 14С АА и затем к части из них добавлялась немеченая 20 мкМ АА. Как видно, в присутствии экзогенной АА количество продуктов 5-LO активности значительно увеличивается, однако ингибирование под действием СХ сохраняется. Таким образом, СХ подавляет синтез лейкотриенов, уменьшая количество доступного для 5-LO субстрата.

Высвобождение АА происходит с участием различных фосфолипаз. Известно, что в нейтрофилах эту функцию выполняет сPLA2 [Channon et al., 1990]. Ядерная локализация этого фермента является необходимым условием для его ферментативной активности.

Суммарная метка 14С-АА, у.е.

а 20 без АА 15 20 мкМ АА Рис. 3 СХ концентрационно зависимо подавляет высвобождение АА (а) и 5-LO активность (б) в PMNL.

0 10 25 50 100 Данные получены на клетках, CХ, мкг/мл стимулированных ионофором А без АА 800 б после прединкубации с С-АА в 20 мкМ АА Количество 5-LO продуктов, нг/10 PMNL присутствии и в отсутствие экзогенной АА.

0 10 25 50 100 CХ, мкг/мл Чтобы понять, как влияет СХ на сPLA2, мы, используя метод иммуноблоттинга, проверили локализацию этого фермента.

Полученные результаты показали, что введение в инкубацию СХ вызывает частичное вытеснение сPLA2 из ядерной мембраны PMNL. Это, по-видимому, приводит к затруднению высвобождения АА и снижает, таким образом, количество продуктов активности 5-LO (рис. 4).

Рис. 4 СХ Липоксигеназная 9 201 вытесняет сPLA2 из активность, M C M C M C M C нг/107 клеток ядерной мембраны. М – ядерная мембранная cPLA фракция, С – цитоплазматическая.

- + A23187 + + + CХ Таким образом, СХ ингибирует синтез лейкотриенов путем снижения количества высвободившейся под действием стимула свободной АА. Добавление экзогенной АА (рис.3), однако, не снимало ингибирующего действия СХ.

I.4. CХ препятствует транслокации 5-LO к ядерной мембране PMNL Полученные данные позволяли предположить, что подавление синтеза лейкотриенов может происходить и за счет ингибирования активности 5-LO. Это подавление может осуществляться как путем прямого ингибирования фермента, так и за счет подавления его транслокации к ядерной мембране и дальнейшей активации.

Чтобы понять, что происходит с 5-LО при действии СХ и стимулирвании ионофором, мы совместили обычный эксперимент на тестирование активности с иммуно блоттингом используемых клеток. На рис. 5 видно, что в интактных клетках 5-LO находится в цитозоле. При активации клеток ионофором наблюдается ее транслокация к ядерной мембране и активируется синтез лейкотриенов и 5-НЕТЕ. Введение в инкубацию СХ препятствует транслокации 5-LO к ядерной мембране, и синтез лейкотриенов по сравнению с интактными клетками резко снижается.

Рис. 5 СХ препятствует Липоксигеназная 9 179 активность, транслокации 5-LO к MC MC MC MC нг/107 клеток ядерной мембране в 5-LO PMNL. М – ядерная - мембранная фракция, С – A23187 - + + + CХ + - - цитоплазматическая.

Можно было предположить также и непосредственное взаимодействие СХ и 5-LO. Поэтому мы исследовали возможность прямого ингибирования 5-LO под действием СХ.

I.5. СХ подавляет активность 5-LO в цитозольной фракции PMNL Определение прямого ингибирующего воздействия СХ на 5-LO проводилось на цитозольной фракции PMNL. В этих условиях основным продуктом метаболизма АА является 5-НрЕТЕ (соответственно, детектируется 5-НЕТЕ). Как видно из рис. 6, и в этом случае СХ сохранял ингибирующее воздействие, хотя и меньшее по величине, по сравнению с экспериментами на цельных клетках.

Таким образом, было показано, что СХ способен напрямую взаимодействовать с 5 ЛО. На основе полученных результатов можно сформулировать следующий вывод: СХ оказывает влияние на все факторы регуляции активности 5-LO. Это:

- снижение доступности арахидоновой кислоты, субстрата для 5-LO, - подавление транслокации 5-LO к ядерной мембране;

- и, наконец, непосредственное ингибирование 5-LO.

Рис. 6 СХ ингибирует синтез Количество 5-LO продуктов, нг/10 6 PMNL 14 trans-LTB4 epi-trans-LTB лейкотриенов в экспериментах с 5-HETE Сумма продуктов цитозольной фракцией PMNL. Цитозольную фракцию из PMNL инкубировали в течение 15 мин в присутствии соответствующих концентраций СХ и 0,2 мМ АТР. Затем реакцию инициировали добавлением АА и Са2+ (конечная концентрация 20 мкМ и 2 мМ, соответственно).

Контроль 10 50 СХ, мкг/мл I.6. Исследование роли отрицательного заряда эфиров холестерина в подавлении синтеза лейкотриенов В проведенных нами исследованиях СХ всегда оказывал более сильное ингибирующее воздействие на синтез лейкотриенов и 5-НЕТЕ по сравнению с Х. Вносит ли отрицательный заряд сульфатной группы СХ какой-нибудь вклад в ингибирующий эффект? Для выполнения такого исследования нами был синтезирован фосфат холестерина (ФХ).

Использование эфира фосфорной кислоты особенно рационально, поскольку увеличение отрицательного заряда с –1 (у СХ) до –2 (у ФХ) практически не сопровождается в этом случае увеличением размера боковой группы. Такая компактность распределения отрицательного заряда и пространственная идентичность эфирных групп СХ и ФХ позволила сравнивать эффекты СХ и ФХ без учета стерических эффектов при переходе от одного соединения к другому.

Результаты сравнения ингибирующего действия СХ и ФХ на синтез лейкотриенов и 5-НЕТЕ в PMNL представлены выше на рис. 1. Для проверки эффективности влияния СХ и ФХ на активность 5-LO в других типах клеток, мы провели сравнительный анализ с использованием PMNL, а также клеточных линий RBL-1, MM6.

Результаты этого исследования представлены на рис. 7.

Как видно, во всех случаях ФХ оказывал более сильное ингибирующее воздействие на синтез 5-НЕТЕ и LTs, по сравнению с СХ. Эффективность ингибирования и отношение ингибирующих способностей ФХ и СХ оказались весьма сходными во всех типах клеток.

Таким образом, из результатов, представленных на рис. 1 и 7 следует, что в ряду Х, СХ, ФХ ингибирующая способность возрастает от Х к ФХ, что подтверждает нашу гипотезу о важной роли заряда в исследуемых эффектах эфиров холестерина.

RBL-1 Рис. 7 СХ и ФХ подавляют MM клеток 3000 синтез 5-НЕТЕ и LTs в различных PMNL типах клеток. Клетки инкубировались Количество 5-LO продуктов, нг/ 15 минут при 370С в присутствии или в 2000 отсутствие СХ/ФХ. Синтез инициировался 2 мкМ ионофором А23187 и 20 мкМ AA и продолжался еще 15 минут.

Контроль СХ 25 СХ 50 СХ 100 ФХ 25 ФХ 50 ФХ мкг/мл I.7. Изучение кинетических закономерностей ингибирования 5-LO фосфатом холестерина Кинетические кривые накопления продуктов активности 5-LO в присутствии и в отсутствие ФХ представлены на рис.8. Видно, что скорость синтеза со временем снижается и кривые накопления продукта выходят на плато. Это является следствием постепенной инактивации фермента в ходе реакции [Wong et al., 1988]. Начальную скорость аппроксимировали как количество продуктов, образующихся за первую минуту реакции.

1200 Контроль ФХ 50 ФХ Рис. 8 Типичные кривые накопления Сумма 5-LO продуктов, нг/10 клеток продуктов активности 5-LO. Приведены результаты, полученные в присутствии 50 и мкг/мл ФХ и в контрольных клетках.

0 5 10 t, мин Для определения механизма действия анионных производных холестерина были проведены кинетические исследования 5 липоксигеназного окисления АА на гомогенате клеток RBL-1, с использованием ФХ.

Время инкубации составило 1 мин, после чего реакция останавливалась добавлением равного объема охлажденного МеОН. Результаты, линеаризованные в координатах Лайнуивера-Берка, позволяют сделать вывод, что ФХ является неконкурентным ингибитором активности 5-LO (рис. 9а). Из данного графика была определена Км = а 89, б СP 1/V max, мин/М CP 79, CP 69, 59, 49, 1/v, мин/М 39, 29,8 19, -1/КМ 9, -Ki -0, -0,05 0 0,05 0,1 0,15 0, -150 -100 -50 0 50 100 1/[AA], 1/мкМ ФХ, мкМ Рис. 9 Характеристика действия ФХ на активность 5-LO в гомогенате клеток RBL-1. а – результаты по определению активности 5-LO, представленные в координатах Лайнуивера Берка. Использовались концентрации АА 5, 10, 20 мкМ. б – определение Ki для ФХ. Приведены средние значения по 3 независимым экспериментам.

Схема мкМ. Пересечение прямых с осью ординат E+S ES E+P позволило определить эффективные значения Vmax. Построение в координатах E+ I EI 1/Vmax от концентрации ингибитора даёт величину константы ингибирования Кi = EI + S ESI мкМ для ФХ в гомогенате RBL-1 (рис. 9б).

На основе имеющихся данных можно ES + I ESI предложить следующую классическую схему 1.

Недавно было показано, что структурно схожая с ФХ 3-оксо-тирукалловая кислота также способна напрямую связываться с 5-LO [Boden et al., 2001]. В свете этих данных можно предположить, что на молекуле белка 5-LO есть центр связывания веществ такой струтуры.

Принимая во внимание увеличение ингибирующего воздействия эфиров холестерина при переходе от сульфата к фосфату, нельзя исключить также влияния отрицательно заряженных эфиров холестерина на связывание АТР, необходимого для активации 5-LO.

II. Синтез лейкотриенов зависит от внутриклеточного содержания холестерина Еще в середине прошлого века Конрад Блох отмечал, что важны не только и, возможно, не столько свойства холестерина как мессенджера меж- и внутриклеточных процессов, сколько его уникальная способность стабилизировать клеточные мембраны. В исследованиях на разнообразных искусственных мембранах показано, что холестерин способен наилучшим образом обеспечить не только такие характеристики мембран как гибкость и проницаемость, но сформировать и сохранить их оптимальный баланс.

Установлено также, что изменение соотношения холестерин/фосфолипиды в составе мембран приводит к значительным колебаниям активности многих трансмембранных белков. Вследствие этого, в настоящее время холестерин рассматривается как молекула, сформированная и отобранная в Количество 5-LO продуктов, нг/10 PMNL ходе эволюционного развития для обеспечения эффективности мембранной функции.

Приведенные ниже мкг/мл мкг/мл мкг/мл мкг/мл мкг/мл мкг/мл MCD MCD MCD Контроль Контроль Контроль результаты исследований Х, Х, Х, Х, Х, Х, показывают, что включение Контроль СХ, 10 мкг/мл СХ, 25 мкг/мл холестерина и его эфиров в состав Рис. 10 Влияние Х и СХ на синтез клеточных мембран оказывает лейкотриенов в PMNL. Кумулятивный эффект Х и СХ в влияние на биосинтез совместных инкубациях в отсутствие 20 мкМ АА.

лейкотриенов.

МCD взят в концентрации 0.5 мМ.

II.1. Действие МCD MCD способен образовывать комплексы с Х и другими стеролами и экстрагировать их из состава клеточных мембран. При фиксированных концентрациях СХ, введение в реакционную среду 0.5 мМ MCD увеличивало количество продуктов 5-LO активности. Интересно, что этот эффект наблюдался нами не только в инкубациях, содержащих СХ, но и в контрольных образцах, куда ни Х, ни СХ не вводились (рис. 10).

II.1.1. MCD увеличивает высвобождение АА из состава мембран Известно, что холестерин увеличивает жесткость и упругость мембран, повышает их устойчивость к лизису и нарушению целостности. Мы проверили, приводит ли снижение содержания холестерина или СХ в мембранах клетки к повышенному высвобождению АА и активации синтеза лейкотриенов.

Нейтрофилы предварительно инкубировались в присутствии радиоактивно меченой С-АА, а затем промывались от не включенной метки. К половине клеток добавлялся СХ. После этого в инкубацию вводился MCD в концентрациях 0;

1 и 2 мМ.

Синтез лейкотриенов ионофором А23187 не стимулировался. Анализ продуктов активности 5-LO проводился по УФ-поглощению и по радиоактивности, детекция не метаболизированной АА осуществлялась по радиоактивности. Результаты такого эксперимента представлены на рис.

Лейкотриены 11.

14С-АА Видно, что синтез Суммарная метка, С-АА лейкотриенов во всех инкубациях не достигал сколько-нибудь 20 значительной величины. В то же время, введение 1 мМ MCD приводило к заметному Контроль СХ Контроль СХ Контроль СХ высвобождению С-АА в MCD - MCD 1 мМ MCD 2 мМ контрольных клетках. В клетках, к которым был введен СХ, Рис. 11 MCD способствует высвобождение АА все еще высвобождению АА из состава клеточных мембран.

оставалось подавлено. В случае же Величины С-АА приводятся в условных мМ MCD наблюдалось дальнейшее единицах.

увеличение высвобождения АА как в контрольных клетках, так и в клетках, инкубировавшихся в присутствии СХ. Данный эксперимент показывает, что MCD способствует высвобождению АА, влияя на флюидизацию мембран и, возможно, активируя Са2+-независимые фосфолипазы. Исходя из полученных данных, можно было ожидать, что при активации клеток ионофором А23187 введение в инкубацию MCD будет компенсировать ингибирующее действие СХ, оказываемое им на синтез лейкотриенов.

II.1.2. Подавление синтеза лейкотриенов под действием СХ снимается при помощи MCD В инкубациях с кальциевым ионофором количество высвобожденной 14С-АА резко возрастало (рис. 12) по сравнению с экспериментами в отсутствие ионофора А23187 (рис.

11).

В этом случае следовало ожидать увеличения синтеза лейкотриенов в пробах, содержащих СХ при добавлении в них MCD. Действительно, введение в инкубацию MCD нивелировало ингибирующий эффект СХ и синтез лейкотриенов на 80% восстанавливался уже при концентрации MCD 1 мМ (рис 12).

Можно предположить два пути действия MCD. Во-первых, Лейкотриены Количество 5-LO продуктов, нг/10 7 PMNL 14С-АА это экстракция Х и СХ Суммарная метка, 14 С-АА непосредственно из клеточных мембран. В этом случае восстановление синтеза 150 лейкотриенов наблюдается за счет 50 флюидизации мембран, увеличения доступности Контроль СХ Контроль СХ Контроль СХ субстрата (АА), и стимуляции MCD - MCD 1 мМ MCD 2 мМ связывания 5-LO с ядерной Рис.12 MCD восстанавливает синтез мембраной. Во-вторых, лейкотриенов, подавленный под действием СХ. Количества взаимодействие MCD с СХ детектированной метки в виде суммы С-АА и ее возможно непосредственно в метаболитов приводятся в условных единицах.

среде инкубации. В таком случае понижается действующая концентрация СХ и, соответственно, уменьшается его эффект.

Вероятнее всего, на практике реализуются оба описанных механизма.

Таким образом, в данной работе было обнаружено, что агенты, увеличивающие жесткость клеточных мембран, такие как Х, увеличивают также и ингибирующий эффект СХ. В то же время, агенты, способствующие флюидизации мембран, такие как MCD и АА, способны значительно ослаблять ингибирующее действие СХ, оказываемое им на активность 5-LO и синтез лейкотриенов в целом.

Сделанные выводы иллюстрирует следующая схема 2:

Схема А Са2+ AA Сплошной линией обозначены активирующие СХ Х воздействия, пунктиром – MCD ингибирующие.

5-LO 5-LO Ядерная Локализация Активация II.2. Действие комплекса ПЭГ-холестерин Известно, что комплекс Количество LTB4 нг/10 PMNL холестерина с полиэтиленгилколем (ПЭГ), способен встраиваться только во внешнюю мембрану клетки и не может транспортироваться к внутренним мембранам. Как 0 мкМ 1 мкМ 5 мкМ 25 мкМ повлияет избирательная ПЭГ-Х модификация плазматической Рис. 13 Продукция LTB4 концентрационно мембраны на синтез зависимо возрастает под воздействием комплекса ПЭГ лейкотриенов? Результаты такого холестерин (ПЭГ-Х).

исследования представлены на рис. 13.

Видно, что увеличение концентрации комплекса ПЭГ-холестерин не только не уменьшает количество продуктов 5-LO активности, но даже приводит к росту продукции LTB4. Общее количество продуктов активности 5-LO при этом практически не изменяется (данные не показаны).

Эти данные позволяют предположить, что в ингибировании синтеза лейкотриенов под действием холестерина играет роль липидный обмен с внутренними мембранами клетки, например, мембранами эндоплазматического ретикулума.

II.3. Эффект СХ чувствителен к ингибиторам эндоцитоза Можно ли заблокировать перенос холестерина и его эфиров внутрь клетки?

Известно, что везикулярный транспорт чувствителен к амфифильным аминам, таким как U18666A или хлорпромазин (CPZ). Мы провели ряд экспериментов чтобы выяснить, окажут ли ингибиторы этого класса какое либо влияние на эффекты СХ.

Действительно, эффекты СХ чувствительны к ингибиторам эндоцитоза – цитохолазину Д (Cyto D) и хлорпромазину. Введение этих веществ в инкубацию нивелировало ингибирующее воздействие СХ и в их присутствии синтез LTs по сравнению с контролем не снижался (рис.14).

Эти результаты демонстрируют, что эффекты СХ зависят от степени его интернализации.

Известно, что включение холестерина в состав мембран увеличивает упорядоченность их структуры и снижает их проницаемость. Отрицательный заряд эфирной группы СХ влияет на ориентацию положительно заряженных групп фосфатидилхолина и они локализуются ближе к внутренней части мембран из-за электростатического притяжения сульфатных групп СХ. Поэтому включение СХ стабилизирует мембраны и понижает их текучесть и эластичность. Недавно была Количество 5-LO продуктов, нг/10 PMNL предложена гипотеза о ключевой роли степени флюидизации клеточных мембран в регуляции активности 5-LO [Pande et al., 100 2005]. Полученные в нашей работе результаты хорошо согласуются с этим Контроль СХ Контроль СХ Контроль СХ предположением.

Cyto D CPZ Необходимо отметить Рис. 14 Ингибиторы эндоцитоза нивелируют также, что изменение подавление 5-LO активности под действием 25 мкг/мл биофизических параметров CХ. Cyto D – цитохолазин D, 10 мкM;

СPZ мембран при включении СХ также хлорпромазин, 30 мкM.

способно оказывать негативное влияние на связывание с ними 5-LO. В результате пониженное содержание 5-LO в ядерной мембранной фракции при активации клеток ионофором в присутствии СХ (рис.

5), совместно с затруднением высвобождения АА (рис. 3а) приводит к подавлению синтеза лейкотриенов. Есть данные, что АА способна сама стимулировать транслокацию 5-LO к ядерной мембране и дальнейшее связывание с ней фермента [Flamand et al., 2006].

Такой взгляд объединяет эффекты СХ на высвобождение АА и на связывание 5-LO с ядерной мембраной.

III. Влияние эфиров холестерина на экспрессию 5-LO в различных клетках Гипотеза о роли ядерных рецепторов в регуляции экспрессии 5-LO на уровне транскрипции Как было показано выше, СХ и ФХ оба проявили существенное ингибирующее воздействие на активацию 5-LO и синтез лейкотриенов в нейтрофилах. Существуют клеточные линии, например, ММ6 (клетки моноцитарно-макрофагальной линии), в которых экспрессия белка 5-LO происходит под действием специально добавляемых факторов (витамин D3 и TGF-). Следующим этапом нашей работы стало исследование влияния анионных производных холестерина на экспрессию 5-LO в клетках ММ6.

III.1. СХ подавлет Липоксигеназная 1 2 активность, экспрессию 5-LO в клетках 110 2 нг/5*106 клеток С М С М С М ММ 5-LO Было исследовано влияние СХ на синтез CХ добавлен в CХ введен в Контроль инкубацию ростовую среду лейкотриенов в ММ6 после Рис. 15 СХ подавляет синтез 5-LO в MM6. Клетки роста клеток в его выращивались в среде, содержащей 25 мкг/мл CХ (2), либо присутствии. Для этого СХ без него (1, 3). Клетки лизировались и фракционировались на вводился в ростовую среду мембранную ядерную (М) и цитозольную (С) фракции.

RPMI-1460 и клетки Показано количество белка 5-LO в цитозольной и культивировались обычным мембранной фракциях и уровни 5-липоксигеназной образом в течение 4 суток. За активности в клеточных инкубациях.

это время происходило увеличение клеточной массы ММ6 в 9-10 раз.

Исследования на ММ6 продемонстрировали ингибирующее воздействие СХ на синтез LTs (рис. 15). Методом СХ ФХ иммуноблоттинга было 0 50 100 50 Липоксигеназная показано, что в клетках, активность, 1458 1007 851 633 нг/5*106 клеток культивировавшихся в среде, 5-LO содержащей 25 мкг/мл СХ, количество 5-LО оказалось значительно меньше, а уровень Рис. 16 СХ и ФХ не оказывают влияния на синтез 5-LO синтеза LTs – сниженным по в RBL-1. Клетки выращивались в присутствии указанных сравнению с контрольными количеств СХ/ФХ (мкг/мл), либо без них (0) в течение 4 суток.

клетками, росшими в Показано общее количество белка 5-LO (без отсутствие СХ. Отсюда был фракционирования) и количества продуктов 5 сделан вывод, что СХ каким-то липоксигеназной активности после стимуляции клеток образом препятствует кальциевым ионофором А23187.

экспрессии 5-LО в клетках ММ6.

Чтобы понять, является ли такое действие СХ универсальным, мы провели аналогичное исследование на клетках RBL-1. Было изучено влияние СХ и ФХ на экспрессию 5-LO. После четырех дней роста, т.е. при увеличении клеточной массы примерно в 7-8 раз, проводился тест на синтез LTs и на содержание 5-LO. Как и в случае с ММ6, в клетках, культивировавшихся в среде, содержащей эфиры холестерина, уровень синтеза LTs был значительно ниже. Однако, иммуноблоттинг показал, что количество белка 5-LО оставалось при этом неизменным (рис. 16).

III.2. Гипотеза об участии ретиноидных ядерных рецепторов ROR alpha 1 в регулировании экспрессии 5-LO Чем может быть Рис. 17 Иллюстрация гипотезы об участии комплекса СХ/ обусловлена такая ROR alpha 1 в регуляции экспрессии 5-LO в ММ6 на уровне зависимость эффекта от транскрипции.

типа клеток? Недавно было установлено, что СХ является лигандом ядерных ретиноидных рецепторов ROR alpha 1 [Kallen et al., 2004]. В свою очередь, промоторная область гена 5-ЛО является участком связывания для этих рецепторов. Таким образом, взаимодействие ROR alpha 1 с СХ и дальнейшее его связывание с промоторной областью гена 5-LO может приводить к ингибированию транскрипции и дальнейшей экспрессии белка (рис. 17). Аналогичное регулирование транскрипции гена 5-LO и TGF- посредством ROR alpha 1 было показано для мелатонина [Steinhilber et al., 1995;

Carlberg et al., 1995].

Таким образом, в клетках, в которых присутствует ROR alpha 1, можно ожидать подавление экспрессии 5-LO на уровне транскрипции. Клетки ММ6 экспрессируют рецептор ROR alpha 1 и именно в них мы наблюдали подавление эксперссии 5-LO. В то же время, клетки RBL-1 лишены ROR alpha 1 рецептора и в них подобного эффекта СХ/ФХ не наблюдалось.

ВЫВОДЫ 1. Анионные производные холестерина ингибируют синтез лейкотриенов в нейтрофилах человека и других клетках. Показана роль отрицательного заряда боковых эфирных групп эфиров холестерина в подавлении синтеза лейкотриенов.

2. Анионные производные холестерина ингибируют синтез лейкотриенов в клетке на уровне субстратной доступности, затрудняя высвобождение АА из состава липидов мембран, и препятствуют активации 5-LO путем ингибирования ее транслокации к ядерной мембране клетки.

3. Установлено, что анионные производные холестерина являются прямыми ингибиторами фермента 5-LO. На примере ФХ показан неконкурентный механизм ингибирования 5-LO и определена Кi = 110 мкМ.

4. Обнаружено, что СХ способен регулировать экспрессию 5-LO в клетках ММ6. Предложена модель, согласно которой регуляция может осуществляться на уровне транскрипции при участии ретиноидных ядерных рецепторов ROR1.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Александров Д.А. (2004) Сульфат холестерина в регуляции лейкотриенового синтеза 5 липоксигеназой нейтрофилов человека. Тезисы 8 Пущинской школы конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века», с. 42.

2. Aleksandrov D.A., Pushkareva M.A., Sudina G.F. (2005) Test-system for inhibitors of inflammatory and pro-oxidative processes at initial stages of ischemia and atherosclerosis. ASDD – International Symposium “Advances in science and drug discovery”. Abstracts, B-23.

3. Aleksandrov D.A., Zagryagskaya A.N., Pushkareva M.A., Bachschmid M., Peters-Golden M., Werz O., Steinhilber D., Sud'ina G.F. (2006) Cholesterol and its anionic derivatives inhibit 5-lipoxygenase activation in polymorphonuclear leukocytes and MonoMac cells. FEBS J., 273, 548-57.

4. Aleksandrov D.A., Pushkareva M.A., Galkina S.A., Sudina G.F. (2006) Test-system for inhibitors of inflammatory processes at initial stages of ischemia and atherosclerosis.

31 Meeting of the Federation of the European Biochemical Societies. Book of abstracts, 212.

5. Александров Д.А., Судьина Г.Ф. (2006) Подавление активности 5-липоксигеназы анионными производными холестерина. Биомедицинская химия. 52, 5, 501-517.