Влияние повреждений остатков гуанина в днк на функционирование днк-метилтрансфераз sssi (spiroplasma) и dnmt3a (мыши)

На правах рукописи

Мальцева Диана Васильевна ВЛИЯНИЕ ПОВРЕЖДЕНИЙ ОСТАТКОВ ГУАНИНА В ДНК НА ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ ДНК-МЕТИЛТРАНСФЕРАЗ SssI (Spiroplasma) И Dnmt3a (МЫШИ) 02.00.10 - биоорганическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата химических наук

Москва - 2009

Работа выполнена на кафедре химии природных соединений химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Научный консультант: доктор химических наук, профессор Громова Елизавета Сергеевна

Официальные оппоненты: доктор химических наук Демидкина Татьяна Викторовна доктор биологических наук Вейко Наталья Николаевна

Ведущая организация: Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Защита состоится 26 мая 2009 года в 16 часов на заседании Совета Д 501.001.41 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В.

Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Институт физико химической биологии им. А.Н. Белозерского, аудитория 501.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 24 апреля 2009 г.

Учёный секретарь Совета кандидат химических наук И.Г. Смирнова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Клеточная ДНК постоянно повергается воздействию веществ, содержащихся в окружающей среде или образующихся в процессе естественного метаболизма, способных вызывать её повреждение. Это способствует возникновению мутаций и нарушению функционирования различных систем клетки.

Мишенями для повреждающих агентов во многих случаях служат остатки гуанина.

Основным источником эндогенных повреждений гуанина являются активные формы кислорода, приводящие преимущественно к образованию 7,8-дигидро-8-оксогуанина (8-oxoG) — биомаркера окислительного стресса. Взаимодействие ДНК с некоторыми продуктами катаболизма, а также метилирующими агентами, содержащимися в окружающей среде, приводит к появлению в ДНК очень токсичного для клетки О6-метилгуанина (О6meG).

Среди загрязнителей окружающей среды одним из наиболее распространённых является бензо[a]пирен (B[a]P). В процессе метаболизма в эукариотических клетках B[a]P активируется до реакционноспособных диолэпоксидов, которые ковалентно присоединяются к ДНК по экзоциклической аминогруппе гуанина с преимущественным образованием (+)-цис- и (+)-транс-стереоизомерных В[a]P-N2-dG-аддуктов.

Действие окислительных и метилирующих агентов и В[a]P на остатки гуанина в ДНК клеток млекопитающих может нарушить процесс ферментативного метилирования CG последовательностей ДНК по атому углерода С5 остатков цитозина. Метилирование ДНК играет важную роль в регуляции многих клеточных процессов, в том числе транскрипции генов. Изменение активности генов, часто ассоциированное с аберрантным метилированием ДНК, является фактором, запускающим развитие многих заболеваний, в числе которых рак, диабет, заболевания сердечно-сосудистой системы. В клетках животных и человека метилирование CG-последовательностей в ДНК осуществляется С5-ДНК метилтрансферазами (МТазами) Dnmt1, Dnmt3a и Dnmt3b. Эти ферменты обладают сложной структурой, а молекулярные механизмы их действия ещё мало изучены. Показано, что все три МТазы важны как для установления, так и для поддержания нормального уровня метилирования ДНК. Представляется важным изучение влияния повреждений ДНК, приводящих к образованию 8-oxoG, O6meG и В[a]P-N2-dG, на функционирование МТаз.

Объектом исследования в настоящей работе стал каталитический домен Dnmt3a мыши (Dnmt3a-CD). В качестве второго объекта была выбрана прокариотическая МТаза SssI (М.SssI), которая, как и эукариотические ферменты, узнает в ДНК короткую CG последовательность и традиционно используется в качестве модельного фермента при изучении эукариотических МТаз.

Цель работы. Определение влияния повреждений остатков гуанина в ДНК на функционирование каталитического домена Dnmt3a мыши и М.SssI из Spiroplasma.

В работе решались следующие задачи: 1) исследование влияния 8-oxoG, O6meG и (+)-цис-В[a]P-N2-dG на различные стадии реакции метилирования ДНК каталитическим доменом Dnmt3a и М.SssI и 2) определение возможных молекулярных механизмов действия повреждений остатков гуанина в ДНК на функционирование Dnmt3a-CD и М.SssI.

Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые изучено взаимодействие Dnmt3a-CD и М.SssI с ДНК, содержащей 8-oxoG, O6meG и (+)-цис-В[a]P N2-dG. Замена остатков гуанина в ДНК на 8-oxoG и O6meG, в зависимости от локализации повреждённых остатков относительно участка узнавания и метилируемого цитозина, приводит к снижению/блокированию или увеличению степени метилирования ДНК МТазами Dnmt3a-CD и SssI. Впервые показано, что связывание Dnmt3a-CD с ДНК носит кооперативный характер. Предложенная модель связывания позволила определить значения констант диссоциации фермент-субстратных комплексов, на основании которых было установлено, что замена остатков гуанина на 8-oxoG и O6meG приводит к снижению сродства Dnmt3a-CD к ДНК и увеличению кооперативности связывания. При изучении кинетики метилирования в условиях «одного оборота» обнаружено, что Dnmt3a-CD наряду с каталитически компетентными образует непродуктивные комплексы с ДНК. Введение в ДНК 8-oxoG и O6meG практически не влияет на константу скорости реакции метилирования, однако приводит к изменению соотношения продуктивного и непродуктивного комплексов, что объясняет наблюдаемое влияние повреждённых остатков гуанина на метилирование ДНК МТазой Dnmt3a-CD. Обнаружено, что наличие (+)-цис-В[a]P-N2-dG в ДНК практически не изменяет эффективность связывания и метилирования ДНК МТазой SssI. Сравнение данных для (+)-цис- и (+)-транс-изомеров показало, что степень воздействия В[a]P повреждений остатков гуанина в ДНК на функционирование М.SssI определяется стереохимией В[a]P-N2-dG-аддуктов. Сделаны предположения о молекулярных механизмах действия повреждений остатков гуанина в ДНК на функционирование Dnmt3a-CD и М.SssI.

Таким образом, представленные данные позволяют предположить, что вредное воздействие повреждений остатков гуанина в ДНК может быть обусловлено не только их мутагенным действием, но и изменением статуса метилирования ДНК (эпигенетическим нарушением).

Полученные в работе результаты могут быть использованы в дальнейших исследованиях для выяснения взаимосвязи между повреждением ДНК, эпигенетическими изменениями и развитием различных заболеваний.

Публикации и апробация работы. По материалам диссертации опубликовано три статьи. Результаты работы были представлены на международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных по фундаментальным наукам «Ломоносов-2005» (Москва, 2005 г.) и международном симпозиуме FEBS-CNRS «Ферменты, модифицирующие ДНК и РНК: сравнение структуры, механизм, функции и эволюция» (Оссуа, Франция, 2007 г.).

Структура и объём работы. Диссертация изложена на 112 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, обсуждение результатов, экспериментальную часть, выводы и список литературы ( ссылок). Материал иллюстрирован 29 рисунками и 6 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Взаимодействие каталитического домена Dnmt3a и M.SssI с ДНК, содержащей 8-oxoG и O6meG Первая часть работы была посвящена изучению влияния 8-oxoG и O6meG на функционирование МТаз Dnmt3a мыши и SssI из Spiroplasma. Эти МТазы переносят метильную группу с кофактора S-аденозил-L-метионина (AdoMet) на атом углерода С остатка цитозина в CG-последовательности, образуя 5-метилцитозин (m5C). В качестве субстрата оба фермента могут использовать как ещё не метилированную ДНК, превращая её в полуметилированную, так и ДНК, уже содержащую метильную группу, превращая её в полностью метилированную. В структуре Dnmt3a выделяют регуляторный N-концевой домен и каталитический C-концевой домен, содержащий десять консервативных мотивов, характерных для МТаз, метилируюших атом углерода С5 остатка цитозина (Kumar et al., 1994;

Xie et al., 1999;

Jeltsch, 2006). В работе использовался каталитический домен Dnmt3a (Dnmt3a-CD), который в отсутствие N-концевого домена обладает каталитической активностью, сравнимой с активностью полноразмерного фермента (Gowher & Jeltsch, 2002).

В качестве аналогов субстратов были использованы производные 30-ти звенных неметилированного (GCGC/CGСG) и полуметилированного (GCGC/CGMG) ДНК дуплексов, содержащих один участок узнавания МТаз (выделен жирным шрифтом, метилируемое основание подчеркнуто):

5’-CTGAATACTACTTGCGCTCTCTAACCTGAT 5’-CTGAATACTACTTGCGCTCTCTAACCTGAT 3’-GACTTATGATGAACGCGAGAGATTGGACTA 3’-GACTTATGATGAACGMGAGAGATTGGACTA GCGC/CGСG GCGC/CGMG Повреждённый остаток гуанина (8-охоG или O6meG, N) вводился в одну из цепей в участок узнавания МТаз (GCNC/CGMG, GCGC/CNMG и GCNC/CGCG), с 5’-стороны от участка узнавания (NCGC/CGMG, GCGC/CGMN и NCGC/CGCG) и на расстоянии двух или четырёх нуклеотидных остатков от него (GCGCTC/CGMGAN или GCGCTCTC/CGMGAGAN) (табл. 1 и 2).

Таблица 1. Параметры взаимодействия Dnmt3a-CD и М.SssI с ДНК-дуплексами, содержащими 8-охоG Dnmt3a-CD M.SssI ДНК-дуплекса 2 отн б -1 в г vотн (%)б Kd1 (нМ) Kd2 (нМ) Kd1Kd2 (нМ ) v (%) kst (ч ) R (%) GCGC 25 ± 8 33 ± 11 830 100 4.1 ± 0.3 30 ± 3 CGMG NCGC 14000 ± 4000 26 ± 5 3.0 ± 0.6 23 ± 4 140 ± CGMG GCNC 9000 ± 1400 4±2 3.1 ± 0.3 4±1 0. CGMG GCGC 21 ± 3 13 ± 3 270 20 ± 2 2.2 ± 0.1 14 ± 2 130 ± CGMN GCGC 11 ± 1 15 ± 1 165 180 ± 10 5.4 ± 0.6 31 ± 4 150 ± CNMG GCGCTC 14 ± 1 12 ± 2 170 70 ± 10 3.0 ± 0.1 30 ± 5 90 ± CGMGAN GMGC 2400 ± CGMG GCGC 60 ± CGCG Неспецифическийд 31 ± 3 28 ± 7 ДНК-дуплекс а Участок узнавания МТаз и метилируемый цитозин выделены жирным шрифтом и подчёркиванием соответственно;

N — 8-охоG;

M — m5C.

б Относительная скорость метилирования. vo для GCGC/CGMG принята за 100% (0.7 нМ/мин для Dnmt3a-CD;

14 нМ/мин для M.SssI).

в Константа скорости реакции метилирования в условиях «одного оборота» (single turnover).

г Отношение концентрации метилированной ДНК в конечной точке реакции (рис. 3А) к общей концентрации ДНК в реакционной смеси.

д 5'–CTGATTACTACTTCCTACCCCTTACCTGAT-3'/5'-ATCAGGTAAGGGGTAGGAAGTAGTAATCAG-3' Начальные скорости метилирования Dnmt3a-CD повреждённых ДНК-дуплексов. Для того чтобы оценить влияние 8-oxoG и O6meG на способность Dnmt3a-CD метилировать ДНК, были определены начальные скорости метилирования, vо, ДНК-дуплексов, содержащих 8-oxoG или O6meG, каталитическим доменом Dnmt3a в условиях 1.7-кратного избытка ДНК по отношению к ферменту. Уровень метилирования определяли по включению тритиевой метки в ДНК, происходящему в процессе переноса метильной группы от [CH3-3Н]AdoMet в ходе ферментативной реакции. На основании полученных линейных зависимостей количества метилированной ДНК от времени (рис. 1) были определены vо и рассчитаны значения относительных начальных скоростей метилирования (vотн) (табл. 1 и 2).

А Б Рис. 1. Метилирование Dnmt3a-CD полуметилированных ДНК-дуплексов, содержащих 8-oxoG (А) или O6meG (Б), в условиях избытка ДНК. СДНК 1.5 мкM, СDnmt3a-CD 0.88 мкM, С [CH 3 3H ] AdoMet 2 мкM.

8-oxoG. Для полуметилированных субстратов, содержащих 8-oxoG, в большинстве случаев наблюдалось снижение эффективности метилирования по сравнению с неповреждённым субстратом GCGC/CGMG (табл. 1). Наибольшее уменьшение скорости метилирования (в раз) наблюдалось для дуплекса GCNC/CGMG, содержащего 8-oxoG в участке узнавания с 3’-стороны от цитозина-мишени. Однако скорость метилирования дуплекса GCGC/CNMG, содержащего 8-oxoG напротив метилируемого цитозина, увеличивалась в 1.8 раза по сравнению с неповреждённым GCGC/CGMG.

Скорость метилирования неметилированных субстратов NCGC/CGCG и GCNC/CGCG была снижена в 2 и 1.3 раз соответственно по отношению к vо для дуплекса GCGC/CGCG. Поскольку vо полуметилированного дуплекса GCNC/CGMG значительно снижена, можно предположить, что в случае дуплекса GCNC/CGCG Dnmt3a-CD предпочтительно метилирует цитозин в неповреждённой цепи.

O6meG. Как видно из табл. 2, снижение скорости метилирования в 3.2 раза по сравнению с неповреждённым субстратом GCGC/CGMG наблюдается только для дуплекса GCNC/CGMG, содержащего O6meG в участке узнавания в метилируемой цепи. При этом vо для дуплексов, содержащих O6meG рядом с СG-сайтом (NCGC/CGMG) и в участке узнавания напротив цитозина-мишени (GCGC/CNMG) были соответственно в 2 и 3 раза больше по отношению к скорости метилирования GCGC/CGMG. Введение O6meG на расстоянии четырёх нуклеотидных остатков от участка узнавания (GCGCTCTC/CGMGAGAN) практически не оказывало влияния на способность Dnmt3a-CD метилировать цитозин в СG-сайте.

Таблица 2. Параметры взаимодействия Dnmt3a-CD и М.SssI с ДНК-дуплексами, содержащими O6meG Dnmt3a-CD M.SssI ДНК-дуплекса vотн (%)б kst (ч-1) R (%)в vотн (%)б GCGC 100 2.5 ± 0.1 25 ± 2 CGMG NCGC 198 ± 17 2.7 ± 0.3 33 ± 2 101 ± CGMG GCNC 31 ± 8 2.1 ± 0.2 7.8 ± 0.1 4± CGMG GCGC 330 ± 38 5.3 ± 1.7 25 ± 6 67 ± CNMG GCGCTCTC 92 ± 11 2.6 ± 0.4 22 ± 2 105 ± CGMGAGAN a N — O6meG, остальные обозначения такие же, как в табл. 1.

б Относительная скорость метилирования. vo для дуплекса GCGC/CGMG принята за 100% (0.7 нМ/мин для Dnmt3a-CD;

в 11 нМ/мин для M.SssI). Отношение концентрации метилированной ДНК в конечной точке реакции (рис. 3Б) к общей концентрации ДНК в реакционной смеси.

Изменения скорости метилирования ДНК Dnmt3a-CD при замене остатков гуанина на 8-oxoG или O6meG прежде всего могут быть связаны с изменением сродства Dnmt3a-CD к повреждённым субстратам. Чтобы это проверить, была изучена устойчивость комплексов Dnmt3a-CD с ДНК-дуплексами, содержащими повреждённые остатки.

Связывание Dnmt3a-CD c повреждёнными ДНК-дуплексами. Изучение образования комплексов проводили методом прямого титрования фиксированного количества флуоресцентно-меченной ДНК аликвотами Dnmt3a-CD, измеряя значение поляризации флуоресценции реакционной смеси. Флуоресцентная метка вводилась на 5’-конец одной из цепей ДНК-дуплексов. Реакционные смеси содержали аналог кофактора S-аденозил-L гомоцистеин (AdoHcy), который способствует образованию специфического комплекса C5-МТаз с ДНК (Wyszynski et al., 1993) и предотвращает побочную реакцию дезаминирования цитозина (Shen et al., 1992;

Zingg et al. 1996).

В случае дуплексов GCGC/CGMG, GCGC/CGMN, GCGC/CNMG, GCGCTC/CGMGAN и GCGCTCTC/CGMGAGAN кривые связывания были похожи на гиперболические кривые (рис. 2), обычно наблюдаемые при связывании белков с ДНК в соотношении 1:1. Однако в случае дуплексов NCGC/CGMG и GCNC/CGMG кривые связывания носили чётко выраженный сигмоидальный характер, что указывало на наличие положительной кооперативности. Были рассчитаны значения коэффициента Хилла (вставка на рис. 2А), которые в случае 8-oxoG-содержащих дуплексов варьировались от 1.2 для GCGC/CGMN и GCGC/CNMG до 1.8 для NCGC/CGMG и GCNC/CGMG.

А Б Рис. 2 Кривые связывания флуоресцентно-меченных ДНК-дуплексов (10 нМ), содержащих 8-oxoG (А) и O6meG (Б), с Dnmt3a-CD в присутствии AdoHcy (0.1 мМ). Р — значение поляризации флуоресценции. Сплошные линии — теоретические кривые, полученные при обработке экспериментальных данных по уравнениям 1–5. Вставка:

данные по связыванию трёх ДНК-дуплексов, представленные в координатах Хилла.

Обозначения:, GCGC/CGMG;

, NCGC/CGMG;

, GCNC/CGMG;

, GCGC/CGMN;

, GCGC/CNMG;

, GCGCTC/CGMGAN или GCGCTCTC/CGMGAGAN.

Однако при расчёте констант диссоциации (Кd) фермент-субстратных комплексов модель Хилла имеет серьёзные ограничения, так как не учитывает изменение равновесной концентрации свободного фермента в результате его связывания с субстратом. Поэтому далее для определения Кd были использованы несколько других моделей связывания.

1) Модель связывания фермента с ДНК со стехиометрией 1:1 в двух вариантах, в которых за связывающую белковой единицу принят мономер или димер Dnmt3a-CD. В обоих случаях данная модель давала значительную систематическую погрешность даже в случае неповреждённого дуплекса GCGC/CGMG и была отклонена. 2) Модель, предполагающая независимое связывание двух белковых единиц с одной молекулой ДНК, также не улучшила ситуацию. 3) Значительное снижение систематической погрешности было достигнуто при использовании модели последовательного связывания двух белковых единиц (двух гомодимеров Dnmt3a-CD) с одной молекулой ДНК (схема 1).

E ES 2 E2S, где Е — гомодимер Dnmt3a-CD, S — флуоресцентно-меченная ДНК, K d1 Kd ES и E2S — фермент-субстратные комплексы.

Схема Данная модель связывания описывается системой уравнений 1–5, позволяющей рассчитать Kd1 и Kd2 (табл. 1).

P = P0 + ( Pmax P0 )(0.5[ES] + [E 2S]) /[S]0 (1), где P0 и Pmax — значения поляризации флуоресценции свободной и полностью [E][S] /[ES] = K d1 (2) связанной ДНК соответственно;

[E]0 — общая [E][ES] /[E 2S] = K d 2 (3) концентрация Dnmt3a-CD;

[S] и [S]0 — [E] + [ES] + 2[E 2S] = [E ]0 (4) концентрации свободной и связанной ДНК.

[S] + [ES] + [E 2S] = [S]0 (5) Предполагается, что значение Р комплекса E2S в два раза больше значения Р для ES, а объём E2 приблизительно в два раза больше объёма, занимаемого Е. Важно отметить, что обработка экспериментальных данных в соответствии с уравнениями 1–5, в отличие от модели Хилла, позволяет учесть уменьшение равновесных концентраций свободных ДНК и фермента при образовании комплекса.

Для дуплексов NCGC/CGMG и GCNC/CGMG значение Kd1 превышало Kd2 по крайней мере в десять раз, что свидетельствовало о снижении содержания в системе комплекса ES до стехиометрически незначимых количеств и не позволяло определить точные значения индивидуальных констант. Однако значения произведений Kd1Kd2 в этих случаях были рассчитаны с хорошей точностью (табл. 1). Из расчётов также следовало, что значения Kd1 и Kd2 зависят друг от друга. Это предполагает, что связывание Dnmt3a-CD с NCGC/CGMG и GCNC/CGMG носит характер кажущейся кооперативности. Для субстрата GCGC/CGMG и дуплексов, содержащих повреждённый остаток гуанина (8-oxoG или O6meG) в метилированной цепи (GCGC/CGMN, GCGC/CNMG, GCGCTC/CGMGAN и GCGCTCTC/CGMGAGAN), значения Kd1 и Kd2 были близки. Близость значений Kd1 и Kd свидетельствует о том, что связывание Dnmt3a-CD в этих случаях также носит характер кажущейся кооперативности, так как в случае реализации независимого связывания двух димеров фермента с ДНК отношение макроскопических констант (Kd2/Kd1) равнялось бы четырём (Диксон и Уэбб, 1982).

Таким образом, в процессе формирования фермент-субстратного комплекса два димера Dnmt3a-CD последовательно связываются с разными участками 30-ти звенного ДНК дуплекса. При локализации повреждённого остатка гуанина (8-oxoG или O6meG) в метилированной цепи, а также в случае неповреждённого субстрата сродство Dnmt3a-CD к каждому из участков связывания ДНК-дуплекса практически одинаково. Присутствие 8-oxoG или O6meG в метилируемой цепи в участке узнавания или рядом с ним способствует снижению сродства Dnmt3a-CD к первому участку связывания (Kd1 увеличивается), при этом МТаза связывается с первым участком связывания хуже, чем со вторым (Kd1 Kd2).

Реализация такого поведения возможна, когда первый связавшийся димер Dnmt3a-CD образует контакты со вторым димером и облегчает его связывание. Предложенная интерпретация хорошо согласуется с данными моделирования комплекса ДНК с Dnmt3a-CD в присутствии регуляторного фактора Dnmt3L, проведённого на основании РСА комплекса Dnmt3a-CD•Dnmt3L (Jia et al., 2007). Из этих данных следует, что с одной молекулой ДНК могут связываться два гетеродимера Dnmt3a-CD•Dnmt3L, при этом непосредственно с ДНК взаимодействует только Dnmt3a-CD, тогда как Dnmt3L не образует контактов с ДНК. В соответствии с этой моделью, Dnmt3a может метилировать два CG-сайта на расстоянии одного поворота спирали ДНК. Поскольку Dnmt3L обладает гомологией в первичной структуре с Dnmt3a (Jeltsch, 2006), в нашей модели (схема 1) в отсутствие Dnmt3L гетеродимеры Dnmt3a-CD•Dnmt3L имитируются гомодимерами Dnmt3a-CD•Dnmt3a-CD, при этом непосредственно с ДНК связывается только одна из молекул, входящих в состав гомодимера (рис. 3А). Первый гомодимер, по-видимому, связывается с CG-участком 30-ти звенного субстрата, а второй гомодимер взаимодействует с неспецифической нуклеотидной последовательностью, однако его связывание с ДНК облегчается за счёт взаимодействия с уже связавшимся димером Dnmt3a-CD•Dnmt3a-CD. В рамках предложенного механизма локализация повреждённых остатков гуанина в участке узнавания или рядом с ним может ослаблять связывание первого димера фермента (приводить к увеличению Kd1), не оказывая влияния на связывание второго димера (на Kd2), и в результате приводить к увеличению кажущейся кооперативности связывания и, как следствие, к увеличению Kd1Kd2, что и наблюдается при введении в ДНК 8-oxoG или O6meG (рис. 2, табл. 1) А Б В Рис. 3. Связывание Dnmt3a-CD с ДНК в продуктивной (А) и непродуктивных (Б и В) ориентациях.

Отметим, что использование модели, в которой за связывающую белковую единицу в схеме 1 принят мономер Dnmt3a-СD, а не димер, привело лишь к увеличению значений Kd1 и Kd2 в 2–3 раза и не изменило выявленных зависимостей и сделанных выводов.

Хотя введение в ДНК 8-oxoG или О6meG и приводит к снижению стабильности фермент-субстратных комплексов, концентрация субстратов, использованная для рис. (1500 нм), является насыщающей для всех субстратов (рис. 2). Отсюда следует, что изменения vо, вызванные заменой в ДНК остатков гуанина на 8-oxoG и О6meG, не обусловлены изменением сродства Dnmt3a-CD к повреждённой ДНК.

Интегральная кинетика метилирования Dnmt3a-CD повреждённых ДНК-дуплексов.

Было исследовано метилирование ДНК-дуплексов, содержащих повреждённые остатки гуанина, в условиях 10-кратного избытка Dnmt3a-CD по отношению к ДНК (условия «одного оборота») (рис. 4). Значения констант скорости реакции метилирования (kst) были рассчитаны на основании представления о псевдопервом порядке реакции (в условиях насыщения по ДНК и AdoMet) в соответствии с экспоненциальной зависимостью, учитывающей возможное неполное превращение субстрата в продукт (Fersht, 1999):

[MS] = [MS]f (1 e k t ), — концентрации [CH3-3H]-ДНК в момент где [MS] и [MS]f st времени t и в конечной точке реакции соответственно.

А Б Рис. 4. Метилирование Dnmt3a-CD ДНК-дуплексов, содержащих 8-oxoG (А) или О6meG (Б), в условиях «одного оборота». СДНК 0.3 мкM, СDnmt3a-CD 3 мкM, С [CH 3 3H ] AdoMet 1.2 мкM.

Выход продукта в конечной точке реакции, R, варьировал, но во всех случаях, включая неповреждённые субстраты, был ниже предполагаемых 100% (рис. 4;

табл. 1 и 2).

Неполное превращение субстрата могло быть обусловлено неспецифической дезактивацией фермента или субстрата в процессе реакции метилирования. Однако проведённые контрольные эксперименты исключили такую возможность, так как показали, что в условиях избытка фермента лимитирующим фактором накопления продукта реакции является ДНК, а в условиях избытка ДНК — фермент. Таким образом, неполное превращение субстрата, по видимому, обусловлено тем, что Dnmt3a-CD кроме продуктивного комплекса с ДНК (рис. 3А) образует прочный, медленно диссоциирующий непродуктивный комплекс. Это согласуется c данными, полученными методом поверхностного плазмонного резонанса, показывающими, что высвобождение ДНК из комплекса с Dnmt3a-CD происходит крайне медленно (Gowher et al., 2005).

В случае полуметилированных субстратов образование непродуктивных комплексов может быть обусловлено связыванием Dnmt3a-CD с ДНК со стороны уже метилированной цепи (рис. 3Б). Данное предположение подтверждается тем, что Dnmt3a-CD образует комплекс с полностью метилированным субстратом (табл. 1). Более того, при метилировании неметилированного субстрата значение R увеличивается до 60% по сравнению с 30% для полуметилированного неповреждённого субстрата (табл. 1). Возможен также ещё один вид непродуктивного связывания Dnmt3a-CD, когда оба димера фермента связываются неспецифически, т.е. ни один из димеров не взаимодействует с CpG участком (рис. 3В). Данное предположение подтверждается тем, что Dnmt3a-CD образует комплекс с 30-ти звенным ДНК-дуплексом, не содержащим участок узнавания (табл. 1). Это также объясняет только 60%-ный выход продукта реакции в случае неметилированного субстрата. Соотношение всех возможных типов связывания зависит от сродства фермента к участку ДНК, который связывается первым, а также, вероятно, от относительной скорости связывания, поскольку образовавшийся комплекс ДНК с ферментом диссоциирует очень медленно и перераспределения Dnmt3a-CD во время реакции метилирования, по-видимому, не происходит.

8-oxoG. Как видно из табл. 1, присутствие 8-oxoG в участке узнавания или рядом с ним увеличивает вероятность непродуктивного связывания фермента с ДНК (значение R уменьшается). Важно, что изменения R хорошо соотносились с изменениями vотн (табл. 1).

Наибольшее уменьшение значений R и vотн наблюдалось в случае дуплекса GCNC/CGMG.

Значения kst для всех ДНК-дуплексов отличались не более, чем в два раза (табл. 1). Это свидетельствует о том, что в продуктивном фермент-субстратном комплексе реакция метилирования протекает с постоянной скоростью, и практически не зависит от присутствия 8-oxoG в ДНК и его локализации. Таким образом, снижение скорости метилирования 8-oxoG-содержащей ДНК обусловлено уменьшением количества продуктивного фермент субстратного комплекса.

О6meG. Изменение значения R наблюдалось только для дуплексов, содержащих О6meG в метилируемой цепи (табл. 2). Так, в случае дуплекса GCNC/CGMG, в котором повреждённый остаток гуанина расположен в участке узнавания рядом с цитозином мишенью, значение R уменьшалось (в 3.2 раза), что соответствовало снижению vо. А в случае дуплекса NCGC/CGMG, содержащего О6meG рядом с участком узнавания, наблюдалось увеличение vо, при этом R также увеличивалось в 1.4 раза. Значения kst для всех дуплексов практически не отличались, кроме дуплекса GCGC/CNMG, содержащего О6meG напротив цитозина-мишени, для которого наблюдалось увеличение значения kst в 2.1 раза.

По-видимому, изменения vо, наблюдаемые при локализации O6meG в метилируемой цепи, обусловлены изменениями соотношения количеств продуктивного и непродуктивного фермент-субстратных комплексов, а при локализации O6meG напротив цитозина-мишени — увеличением kst (ускорением самой реакции метилирования).

Начальные скорости метилирования М.SssI повреждённых ДНК-дуплексов. Чтобы оценить влияние повреждений остатков гуанина на функционирование М.SssI, было изучено метилирование МТазой полуметилированных ДНК-дуплексов, содержащих 8-oxoG или O6meG, в условиях стационарной кинетики. Из полученных линейных зависимостей степени метилирования ДНК от времени (рис. 5) были рассчитаны vо и значения vотн (табл. 1 и 2).

А Б Рис. 5. Метилирование M.SssI ДНК-дуплексов, содержащих 8-oxoG (А) или O6meG (Б), в стационарной кинетики ДНК. СДНК 0.5 мкM, СМ.SssI 20 нM, С [CH 3 3H ] AdoMet 1.2 мкM.

8-oxoG. Как видно из рис. 5А и табл. 1, присутствие 8-oxoG в участке узнавания с 3’-стороны от цитозина-мишени (GCNC/CGMG) приводило к блокированию метилирования. Скорость метилирования ДНК-дуплексов, содержащих 8-oxoG в других положениях, либо практически не изменялась (GCGCTC/CGMGAN), либо увеличивалась в 1.3–1.5 раза (NCGC/CGMG, GCGC/CGMN и GCGC/CNMG) по сравнению с неповреждённым GCGC/CGMG.

О6meG. Скорость метилирования дуплекса GCNC/CGMG, содержащего О6meG в участке узнавания рядом с цитозином-мишенью, была в 25 раз меньше по сравнению с vо для О6meG неповреждённого субстрата GCGC/CGMG. Замена на остатка гуанина, расположенного напротив цитозина-мишени (GCGC/CNMG), приводила к снижению степени метилирования в 1.5 раза (табл. 2). Введение О6meG вне участка узнавания (NCGC/CGMG и GCGCTC/CGMGAGAN) практически не оказывало влияния на скорость метилирования. Таким образом, степень воздействия 8-oxoG и О6meG на способность M.SssI метилированить ДНК зависит от локализации повреждённого остатка относительно участка узнавания и метилируемого цитозина. Можно также сказать, что M.SssI демонстрирует большую чувствительность к локализации 8-oxoG и О6meG, чем Dnmt3a-CD.

Молекулярные основы влияния 8-oxoG и О6meG на взаимодействие Dnmt3a-CD и M.SssI с ДНК. Согласно данным РСА комплекса прокариотической С5-МТазы М.HhaI с ДНК и AdoHcy, М.HhaI состоит из двух доменов — малого и большого, в полости между которыми связывается ДНК-субстрат (Klimasauskas et al., 1994). Малый домен МТазы, отвечающий за узнавание специфической последовательности (GCGC), образует контакты с ДНК со стороны большой бороздкой, а большой домен, содержащий каталитический центр, взаимодействует с ДНК со стороны малой бороздки. При формировании фермент субстратного комплекса цитозин-мишень выводится из состава двойной спирали («выпетливается») и попадает в активный центр М.HhaI для сближения с кофактором AdoMet. «Выпетливание» метилируемого цитозина сопровождается коформационными изменениями в самом ферменте, в котором каталитическая петля из большого домена сдвигается в сторону ДНК-связывающей полости и образует контакты с малой бороздкой ДНК (Youngblood et al., 2006), т.е. происходит переход каталитической петли из «открытой» конформации в «закрытую». Остаток гуанина, оставшийся неспаренным после «выпетливания» цитозина-мишени (гуанин-«сирота»), стабилизируется за счёт взаимодействия его функциональных групп с аминокислотными остатками М.HhaI.

Основываясь на высокой гомологии первичных структур С5-МТаз (Posfai et al., 1989;

Bujnicki & Radlinska, 1999) и данных компьютерного моделирования (Koudan et al., 2004), предполагается, что комплекс M.SssI•ДНК•AdoHcy имеет похожую структуру.

По данным ЯМР, РСА, кругового дихроизма и молекулярной динамики, введение 8-oxoG в ДНК не приводит к значительным нарушениям B-формы ДНК. Схема водородных связей, образуемых 8-oxoG с остатком цитозина, идентична схеме водородных связей в паре C·G (рис. 6А и Б). Возможны лишь незначительные изменения в конформации углеводофосфатного остова и угла поворота спирали вблизи повреждённого гуанина (Oda et al., 1991;

Ishida, 2002). Однако замена гуанина в паре C·G на 8-oxoG может привести к изменению рисунка водородных связей, образуемых остатком гуанина с ДНК связывающими ферментами при формировании фермент-субстратных комплексов. Так, в положении N7 остатка гуанина находится акцептор водородных связей (атом азота), а в положении N7 остатка 8-oxoG — донор (иминогруппа) (рис. 6А и Б). Кроме того, в положении C8 остатка гуанина слабый донор водородной связи заменяется на атом кислорода (сильный акцептор протонов) в 8-oxoG. Можно предположить, что уменьшение стабильности комплекса Dnmt3a-CD с 8-oxoG-ДНК и увеличение количества непродуктивного комплекса могут быть обусловлены нарушением «сети» правильных водородных связей МТазы с 8-oxoG-ДНК и образованием новых «неправильных» контактов.

А Б В CH H O H N NH O H N H NH O O N O 8 7 NH N N meG N CN G H N 8-oxo N CN H N R R G N N N R N N HN CN O R HN O HN R N H H H O R Рис. 6. Структуры нуклеотидных пар: C·G (А), C·8-oxoG (Б) и C·О6meG (B).

Функциональные группы в положениях N7 и C8 остатков гуанина и 8-oxoG, являющиеся донорами или акцепторами водородных связей, отмечены стрелками, направленными соответственно вверх или вниз.

Наибольшее снижение степени метилирования ДНК Dnmt3a-CD, как и в случае M.SssI, наблюдалось при введении 8-oxoG в участок узнавания рядом с цитозином-мишенью (GCNC/CGMG). В случае M.SssI методами компьютерного моделирования (Koudan et al., 2004) и мутационного анализа (М.В. Дарий, неопубликованные данные) показано, что при образовании фермент-субстратного комплекса Ser317 взаимодействует с атомом азота N остатка гуанина участка узнавания, расположенного рядом с метилируемым цитозином.

Поскольку при замене данного остатка гуанина на 8-oxoG в положении N7 вместо атома азота (акцептора водородных связей), располагается иминогруппа, являющаяся донором водородных связей (рис. 6А и Б), блокирование метилирования M.SssI дуплекса GCNC/CGMG, по-видимому, обусловлено нарушением этого контакта. Учитывая, что Dnmt3a-CD и M.SssI обладают одинаковой сиквенс-специфичностью, а также то, что в узнавании короткой CG-последовательности МТазами остаток гуанина играет особенно важную роль (Bolden et al., 1984), можно предположить, что ухудшение метилирования дуплекса GCNC/CGMG МТазой Dnmt3a-CD также обусловлено нарушением контакта фермента с атомом азота N7 остатка гуанина.

Замена остатка гуанина в С·G паре на O6meG приводит к нарушению структуры ДНК:

остатки цитозина и O6meG смещаются в малую и большую бороздки соответственно, изменяется структура углеводофосфатного остова, в паре С·O6meG между основаниями образуется только две водородные связи (рис. 6В) (Swann, 1990;

Spratt & Levy, 1997).

Известно, что М.SssI образует контакты с межнуклеотидными фосфатами участка узнавания и нуклеотидной последовательности с 5’-стороны от него (Renbaum & Razin, 1995;

Koudan et al., 2004). Также в нашей лаборатории Е.В. Кудан и М.В. Дарий было показано, что в комплексе М.SssI с ДНК гуанин-«сирота», располагающийся напротив «выпетленного» цитозина, стабилизируется за счёт взаимодействия его функциональных групп, в том числе атома кислорода О6 карбонильной группы, с аминокислотами МТазы. Снижение способности М.SssI метилировать дуплекс GCGC/CNMG, содержащий O6meG напротив цитозина-мишени, подтверждает участие атома кислорода О6 гуанина-«сироты» в стабилизации последнего. Значительное уменьшение степени метилирования МТазой SssI дуплекса GCNC/CGMG, содержащего O6meG в участке узнавания рядом с метилируемым цитозином, может быть связано с нарушением контактов М.SssI с атомом азота N7 остатка O6meG в результате изменения структуры двойной спирали и смещения повреждённого остатка гуанина в большую бороздку, а также с нарушением контактов МТазы с межнуклеотидными фосфатами.

Сравнивая действие повреждённых остатков на функционирование Dnmt3a-CD и М.SssI, можно сказать, что М.SssI более чувствительна к присутствию 8-охоG и O6meG в ДНК, а также к их локализации относительно участка узнавания и метилируемого цитозина.

Этот факт наталкивает на мысль, что активный центр Dnmt3a-CD обладает большей способностью «подстраиваться» к повреждённой ДНК, чем прокариотическая МТаза. В случае O6meG, такое «подстраивание» может реализовываться за счёт уменьшения стерического напряжения в активном центре Dnmt3a-CD вследствие изменения положения O6-метильной группы относительно связи N1–C6 повреждённого остатка гуанина.

Из представленных результатов также можно сделать вывод, что, несмотря на то, что O meG значительно в большей степени нарушает структуру ДНК, чем 8-охоG, последний вносит более серьёзные нарушения в процесс метилирования ДНК МТазами, чем O6meG.

2. Взаимодействие M.SssI с ДНК, содержащей (+)-цис-B[a]P-N2-dG Согласно данным ЯМР, структура ДНК-дуплексов, содержащих (+)-цис- и (+)-транс изомеры В[a]Р-N2-dG (рис. 7), сильно различается (Geacintov et al., 1997). В случае (+)-транс-изомера остаток B[a]P располагается в малой борозде ДНК, направлен в сторону 5’-конца повреждённой цепи и не нарушает уотсон-криковские взаимодействия между основаниями и В-форму двойной спирали (рис. 7Б) (Cosman et al, 1992). В случае (+)-цис изомера остаток B[a]P интеркалирует в ДНК, нарушая водородные связи между повреждённым остатком гуанина (смещается в малую бороздку) и комплементарным ему остатком цитозина (смещается в большую бороздку) (Cosman et al, 1993). В связи с этим, особый интерес представляет определение влияния стереохимии B[a]P-N2-dG-аддуктов на функционирование М.SssI. Для этого было изучено влияние (+)-цис-В[a]Р-N2-dG на функционирование М.SssI и проведено сравнение с данными для (+)-транс-В[a]Р-N2-dG, полученными в нашей лаборатории ранее (Subach et al., 2006).

O O N N NH NH N N NH N NH N А R HO R HO HO HO OH OH (+)-цис-B[a]P-N2-dG (+)-транс-B[a]P-N -dG Б (+)-транс-B[a]P-N2-dG (+)-цис-B[a]P-N2-dG Рис. 7. (А) Структурные формулы (+)-транс- и (+)-цис-B[a]P-N2-dG аддуктов. (Б) Пространственные структуры ДНК-дуплексов, содержащих (+)-транс- и (+)-цис-B[a]P-N2-dG-аддукты (данные ЯМР). Вид на малую бороздку.

В качестве аналогов субстрата были использованы B[a]P-содержащие производные 18-ти звенного неметилированного (GCG/CGC) и полуметилированного (GCG/CGM) ДНК дуплексов, содержащие один участок узнавания М.SssI (табл. 3). Повреждённый 2’-дезоксигуанозин вводился в одну из цепей либо в участок узнавания (GCG*/CGC и GCG*/CGM), либо с 5’-стороны от него (G*CG/CGC и G*CG/CGM).

Определение Kd фермент-субстратных комплексов проводили в присутствии аналога кофактора AdoHcy методом равновесного конкурентного связывания с МТазой B[a]P-ДНК и Р-меченного дуплекса GCGref/CGMref. B[a]P-содержащие дуплексы конкурировали с Р-меченным неповреждённым субстратом за центр связывания фермента, уменьшая тем самым количество комплекса M.SssI•32Р-ДНК•AdoHcy. Данный метод позволяет получить отношение констант диссоциации комплексов фермента с вытесняемым дуплексом (Kdr) и дуплексом-конкурентом (Kdc), k (k = Kdr/Kdc). В качестве вытесняемого был использован дуплекс GCGref/CGMref (табл. 3).

Анализ образования комплексов при постепенном увеличении концентраций ДНК конкурентов проводили в неденатурирующем 8%-ом ПААГ (рис. 8).

Рис. 8. Равновесное конкурентное связывание 32Р-меченного дуплекса GCGref/CGMref (100 нМ) и немеченого дуплекса G*CG/CGC с M.SssI (50 нМ) в присутствии AdoHcy (0.1 мМ).

Радиоавтограф 8%-ного ПААГ. СДНК (G*CG/CGC) 0, 10, 20, 50, 100, 200, 300, 400, 500 нМ в дорожках 1– соответственно.

Далее строили зависимость степени образования комплекса M.SssI•32Р-ДНК•AdoHcy от концентрации ДНК-конкурента (рис. 9) и определяли значение k. С помощью полученной методом прямого титрования Kd комплекса M.SssI с дуплексом GCGref/CGMref (Subach et al., 2006) были рассчитаны Kd комплексов МТазы с B[a]P-ДНК (табл. 3).

Рис. 9. Кривые равновесного конкурентного связывания Р ref ref меченного GCG /CGM (100 нМ) и дуплексов GCG/CGC, G*CG/CGC, GCG*/CGС, GCG/CGM, G*CG/CGМ и GCG*/CGM с М.SssI (50 нМ) в присутствии AdoHcy (0.1 мМ). — отношение степени связывания P-меченного дуплекса GCGref/CGMref в присутствии ДНК-конкурента к степени связывания P-меченного ref ref дуплекса GCG /CGM в отсутствие ДНК-конкурента.

Таблица 3. Параметры взаимодействия М.SssI с ДНК-дуплексами, содержащими (+)-цис-B[a]P-N2-dG ДНК-дуплекс a kcat (мин-1) Обозначение Kd (нМ) 5’-CACAATTGCGCTCTCTCA GCG/CGC 6.8 ± 1.2 0.9 ± 0. 3’-GTGTTAACGCGAGAGAGT 5’-CACAATTG*CGCTCTCTCA G*CG/CGC 3.0 ± 0.3 0.7 ± 0. 3’-GTGTTAAC GCGAGAGAGT 5’-CACAATTGCG*CTCTCTCA GCG*/CGC 3.8 ± 0.6 0.7 ± 0. 3’-GTGTTAACGC GAGAGAGT 5’-CACAATTGCGCTCTCTCA GCG/CGM 4.1 ± 0.8 0.4 ± 0. 3’-GTGTTAACGMGAGAGAGT 5’-CACAATTG*CGCTCTCTCA G*CG/CGM 4.2 ± 0.5 0.13 ± 0. 3’-GTGTTAAC GMGAGAGAGT 5’-CACAATTGCG*CTCTCTCA GCG*/CGM 1.9 ± 0.2 0.5 ± 0. 3’-GTGTTAACGM GAGAGAGT 5’-GAGCCAAGCGCACTCTGA GCGref/CGMref 5.3 ± 0.3б 3’-CTCGGTTCGMGTGAGACT a G* — (+)-цис-B[a]P-N2-dG. б Значение Kd определено методом прямого титрования ДНК МТазой SssI (Subach et al., 2006).

Как видно из табл. 3, M.SssI практически одинаково связывается с неповреждёнными и B[a]P-содержащими ДНК-дуплексами.

В условиях стационарной кинетики были получены зависимости степени метилирования ДНК-дуплексов от времени (рис. 10) и определены значения vo и каталитических констант (kcat) (табл. 3). Как видно из табл. 3, степень метилирования полуметилированных и неметилированных B[a]P-содержащих дуплексов и соответствующих неповреждённых субстратов отличалась незначительно: значение kcat уменьшалось не более, чем в 3 раза.

Рис. 10. Метилирование М.SssI (17 нМ) ДНК-дуплексов, содержащих (+)-цис B[a]P-N -dG, в условиях стационарной кинетики. СДНК (GCG/CGC, G*CG/CGC, GCG*/CGС и GCG/CGM) 250 нМ, СДНК (G*CG/CGМ и GCG*/CGM) 350 нМ, С [CH 3 3H ] AdoMet 1.3 мкM.

Таким образом, можно сделать вывод, что введение (+)-цис-B[a]P-N2-dG в ДНК практически не влияет на способность М.SssI связывать и метилировать ДНК, независимо от локализации (+)-цис-изомера относительно участка узнавания и метилируемого цитозина.

Сравнение влияния (+)-цис- и (+)-транс-В[a]Р-N2-dG-аддуктов на функционирование M.SssI и Dnmt3a-CD. Введение в ДНК (+)-транс-B[a]P-N2-dG (Subach et al., 2006), так же как и введение (+)-цис-B[a]P-N2-dG, не оказывает значительного влияния на сродство М.SssI к ДНК. Однако влияние (+)-транс- и (+)-цис-изомеров на метилирование ДНК этим ферментом значительно различается. Так, расположение с 5’-стороны от участка узнавания (+)-транс-В[a]Р-N2-dG приводит к блокированию метилирования, тогда как расположение (+)-цис-B[a]P-N2-dG практически не влияет на эффективность метилирования ДНК. Таким образом, стереохимия B[a]P-N2-dG-аддуктов определяет степень нарушения метилирования ДНК М.SssI и практически не влияет на прочность образуемых ферментом комплексов с B[a]P-повреждённой ДНК.

Таким образом, в случае (+)-транс-изомера остаток B[a]P, расположенный в малой бороздке, по-видимому, препятствует образованию контактов каталитической петли М.SssI с малой бороздкой ДНК, а в случае (+)-цис-изомера остаток B[a]P интеркалирует в двойную спираль и практически не нарушает контакты МТазы с ДНК. Однако небольшое снижение степени метилирования, наблюдаемое при введении (+)-цис-B[a]P-N2-dG с 5’-стороны от участка узнавания (табл. 2), может быть обусловлено смещением повреждённого остатка гуанина в малую бороздку (рис. 10Б).

Недавно в нашей лаборатории было показано (В.Б. Баскунов и Е.Л. Тамьяр), что, в отличие от М.SssI, степень воздействия (+)-цис- и (+)-транс-изомеров на метилирование ДНК Dnmt3a-CD практически одинакова, при этом блокирования метилирования не происходит, и наблюдается лишь уменьшение скорости метилирования в 2–5 раз. По данным РСА (Jia et al., 2007), структура Dnmt3a-CD в комплексе с регуляторным фактором Dnmt3L (комплекс без ДНК) очень похожа на структуру М.HhaI в комплексе с ДНК и AdoHcy. При моделировании комплекса ДНК с Dnmt3a-CD и Dnmt3L было показано, что каталитическая петля Dnmt3a-CD, так же как и каталитическая петля М.HhaI, сближенна с «выпетленным» цитозином со стороны малой бороздки (находится в «закрытой» конформации) (Jia et al., 2007;

Cheng & Blumenthal, 2008). В отсутствие Dnmt3L каталитическая петля Dnmt3a-CD может быть более лабильной и обуславливать меньшую чувствительность Dnmt3a-CD к присутствию объёмного остатка B[a]P в малой бороздке по сравнению с М.SssI. Как было показано нами в предыдущих разделах, М.SssI оказывается более чувствительной к присутствию и других повреждённых остатков гуанина в ДНК (8-oxoG и O6meG), что подтверждает данное предположение.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Суммируя все данные, можно заключить, что повреждение остатков гуанина оказывает существенное влияние на функционирование CG-узнающих МТаз SssI и Dnmt3a-CD. Для обеих МТаз более критичной является замена остатков гуанина в ДНК на 8-oxoG, обуславливающая значительное снижение степени метилирования ДНК или его блокирование. Введение (+)-цис-B[a]P-N2-dG в участок узнавания и рядом с ним практически не влияет на способность М.SssI связывать и метилировать ДНК. Сравнение данных для (+)-цис-B[a]P-N2-dG (+)-транс-B[a]P-N2-dG и показало, что степень воздействия повреждений гуанина бензоа[a]пиреном на эффективность метилирования ДНК МТазой SssI зависит от стереоизомерии B[a]P-N2-dG-аддуктов. Замена гуанина на O6meG значительно снижает способность М.SssI метилировать цитозин, примыкающий к повреждённому гуанину, тогда как для Dnmt3a-CD наблюдается небольшое уменьшение, а в некоторых случаях и увеличение в 2–3 раза скорости метилирования ДНК, содержащей O6meG.

Выявленные различия, по-видимому, обусловлены особенностями структуры активного центра М.SssI и Dnmt3a-CD.

Из представленных данных также можно сделать вывод, что канцерогенное действие повреждений остатка гуанина в ДНК может быть обусловлено не только их известным мутагенным действием, но и эпигенетическими изменениями (изменением степени метилирования ДНК).

ВЫВОДЫ 1. Впервые показано, что связывание ДНК-метилтрансферазы Dnmt3a-CD с ДНК имеет кооперативный характер. Замена остатка гуанина в метилируемой цепи в участке узнавания или рядом с ним на 8-oxoG или O6meG вызывает снижение сродства Dnmt3a-CD к ДНК и увеличение кооперативности связывания.

2. Скорость метилирования ДНК МТазой Dnmt3a-CD зависит от локализации и характера повреждения остатка гуанина: в случае 8-oxoG наблюдается значительное замедление метилирования, а в случае O6meG — незначительное замедление или даже ускорение.

3. Dnmt3a-CD образует с ДНК как продуктивный, так и непродуктивный комплексы.

Введение 8-oxoG и O6meG в ДНК практически не влияет на константу скорости реакции метилирования в условиях «одного оборота», однако приводит к изменению соотношения продуктивного и непродуктивного комплексов, что и объясняет наблюдаемое влияние повреждений на метилирование ДНК МТазой Dnmt3a-CD.

4. Замена остатка гуанина в участке узнавания на 8-oxoG или O6meG приводит к замедлению или блокированию метилирования ДНК МТазой SssI.

5. Влияние повреждений остатков гуанина в ДНК бензо[a]пиреном на функционирование М.SssI определяется стереохимией В[a]P-N2-dG-аддуктов. В случае (+)-цис-изомера, когда остаток В[a]P интреркалирует в двойную спираль, способность МТазы SssI связывать и метилировать ДНК практически не изменяется, тогда как в случае (+)-транс-изомера, когда остаток В[a]P расположен в малой бороздке, наблюдается блокирование метилирования.

Основные результаты работы изложены в следующих публикациях:

1. Subach O.M., Baskunov V.B., Darii M.V., Maltseva D.V., Alexandrov D.A., Kirsanova O.V., Kolbanovskiy А., Kolbanovskiy M., Johnson F., Bonala R., Geacintov N.E., Gromova E.S. (2006) Impact of benzo[a]pyrene-2'-deoxyguanosine lesions on methylation of DNA by SssI and HhaI DNA methyltransferases, Biochemistry, 45, 6142-6159.

2. Subach O.M., Maltseva D.V., Shastry A., Kolbanovskiy A., Klimasauskas S., Geacintov N.E., Gromova E.S. (2007) The stereochemistry of benzo[a]pyrene-2' deoxyguanosine adducts affects DNA methylation by SssI and HhaI DNA methyltransferases. FEBS J., 274, 2121-2134.

3. Maltseva D.V., Baykov A.A., Jeltsch A., Gromova E.S. (2009) Impact of 7,8-dihydro-8 oxoguanine on methylation of the CpG site by Dnmt3a. Biochemistry, 48, 1361–1368.

4. Мальцева Д.В., Субач О.М., Громова Е.С. (2005) Введение цис-анти-бензо[а]пирен dG в ДНК не влияет на её связывание с ДНК-метилтрасферазами SssI и HhaI.

Материалы международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2005», Москва, т. 1, стр. 87.

Maltseva D.V., Subach O.M., Kolbanovskiy A., Shastry A., Geacintov N.E., Gromova E.S.

5.

(2007) Comparison of effects of (+)-cis- and (+)-trans-benzo[a]pyrene-dG adducts on DNA methylation by M.SssI and M.HhaI. FEBS-CNRS Workshop. DNA and RNA Modification enzymes: comparative structure, mechanism, function and evolution. Aussois, France,

Abstract

book, p.90.