Возможности термолинзового детектирования в капиллярном электрофорезе

На правах рукописи

БЕНДРЫШЕВА СВЕТЛАНА НИКОЛАЕВНА ВОЗМОЖНОСТИ ТЕРМОЛИНЗОВОГО ДЕТЕКТИРОВАНИЯ В КАПИЛЛЯРНОМ ЭЛЕКТРОФОРЕЗЕ Специальность — 02.00.02 — аналитическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва – 2007

Работа выполнена в лаборатории спектральных методов анализа кафедры аналитической химии Химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Научный консультант: кандидат химических наук, доцент Проскурнин Михаил Алексеевич

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор кафедры аналитической химии и химической экологии Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского Штыков Сергей Николаевич кандидат химических наук, доцент кафедры лазерной химии Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова Горбатенко Александр Анатольевич

Ведущая организация: Институт геохимии и аналитической химии им. В.И. Вернадского РАН

Защита состоится 14 ноября 2007 г. в 16 ч. 15 мин. в аудитории 446 химического факультета на заседании Диссертационного совета Д 501.001.88. по химическим наукам в Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 12 октября 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук Торочешникова И.И.

Общая характеристика работы

Актуальность темы Капиллярный электрофорез является перспективным и интенсивно развивающимся методом разделения. В настоящее время его применяют для определения широкого круга соединений в различных биологических объектах, промышленной продукции и объектах окружающей среды. Капиллярный электрофорез хорошо зарекомендовал себя как высокоэффективный и экспрессный метод разделения, отличающийся малым объемом вводимого образца и расходом реагентов. Высокая эффективность разделения обусловлена преимущественно техникой проведения эксперимента: использованием капилляров с высоким значением соотношения «площадь поверхности к объему» (din =10 100 мкм), электромиграционной природой движения компонентов образца и жидкости в капилляре и детектированием непосредственно в капилляре. Условия работы и детектирования в капилляре, а также малый объем зоны определяемого компонента предъявляют дополнительные требования к системе детектирования, в первую очередь, к локальности и чувствительности метода детектирования. В настоящее время усовершенствование существующих и разработка новых методов детектирования и подходов к увеличению чувствительности в рамках уже существующих методов занимают важное место среди основных направлений развития капиллярного электрофореза.

Скрещенно-лучевая термолинзовая спектрометрия относится к методам молекулярной абсорбционной спектроскопии и благодаря своей высокой чувствительности, локальности и универсальности представляет большой интерес как перспективный метод детектирования в капиллярных электромиграционных методах. На настоящий момент существует ряд работ, иллюстрирующих успешное применение детектора данного типа в капиллярных электромиграционных методах для разделения аминокислот, пищевых консервантов, загрязнителей окружающей среды, а также лекарственных препаратов и их метаболитов. В подавляющем большинстве эти работы носят исключительно прикладной характер, тогда как важнейшие вопросы применения метода, в первую очередь, оптимальные рабочие параметры скрещенно-лучевого термолинзового детектора, обеспечивающие максимальную чувствительность определения, пока остаются нерешенными.

Цель работы Цель работы состояла в разработке подходов к увеличению чувствительности скрещенно-лучевого термолинзового детектирования в капиллярных электромиграцион ных методах. В рамках основной задачи работы планировалось:

1. провести оптимизацию геометрических параметров оптической схемы и рабочих параметров спектрометра с учетом условий детектирования в капилляре в режиме реального времени для обеспечения максимальной чувствительности измерений;

2. рассмотреть влияние факторов, сопутствующих электрофоретическому разделению, в первую очередь движения среды (электроосмотический поток) на чувствительность термолинзового детектирования;

3. исследовать влияние состава раствора фонового электролита на чувствительность термолинзового детектирования.

Научная новизна работы 1. Выведено выражение, описывающее зависимость величины аппаратного термолинзового сигнала от геометрических параметров оптической схемы спектрометра при регистрации зондирующего излучения в ближней зоне. Оно основано на дифракционной модели термолинзового эффекта и учитывает изменение суммарной интенсивности зондирующего излучения в плоскости фотодетектора при изменении геометрических параметров зондирующего луча (расстояние между перетяжкой зондирующего луча и образцом и расстояние между образцом и фотодетектором). Предложенное выражение дает возможность теоретически подобрать параметры зондирующего излучения, соответствующие максимальной чувствительности термолинзового детектирования в капиллярных электромиграционных методах.

2. Предложено объяснение зависимости чувствительности термолинзовых измерений от скорости среды в условиях электрофоретического разделения, учитывающее как изменение эффективной теплопроводности среды в условиях потока, так и остаточный нагрев в капилляре в конце цикла образования и диссипации термооптического элемента.

3. Показано, что в условиях электрофоретического разделения (наличие электроосмотического потока, формирование и диссипация термооптического элемента в условиях малых объемов жидкости) сила термооптического эффекта в различных водно–органических средах, используемых в качестве растворов фонового электролита в капиллярных электромиграционных методах, несмотря на усложнение условий, не отличается от силы термооптического эффекта, регистрируемого в этих средах в больших объемах и статических условиях.

Практическая значимость работы 1. Проведена оптимизация геометрических параметров оптической схемы скрещенно лучевого термолинзового детектора для капиллярного электрофореза, что позволяет проводить термолинзовое детектирование с высокой чувствительностью (Amin = 1 10–6) и воспроизводимостью (sr = 0.02–0.03) измерений.

2. Рассчитаны профили температуры, формирующиеся при образовании термооптического элемента в воде, ацетонитриле и метаноле при различных частотах прерывания индуцирующего излучения. Это позволило оценить размеры термооптического элемента в капилляре и подобрать диапазон частот прерывания индуцирующего излучения, соответствующий условиям детектирования в малом объеме в режиме реального времени и обеспечивающий максимальную чувствительность термолинзового детектирования.

3. На основе проведенных расчетов и экспериментов показано, что в случае термолинзового детектирования в капилляре (необходимость жесткой фокусировки индуцирующего луча в капилляре) можно использовать лазеры с многомодовым составом в качестве источников индуцирующего излучения, что позволяет расширить набор рабочих длин волн термолинзового детектора и, следовательно, круг определяемых соединений.

4. На основании исследований влияния электроосмотического потока на чувствительность термолинзового детектирования в капилляре определен диапазон скоростей потока, оптимальный для условий электрофоретического разделения (12 – 24 см/мин). Это обеспечивает выигрыш в чувствительности термолинзового детектирования по сравнению со статическими условиями более чем в два раза.

5. На примере разделения модельной смеси мононитрофенолов проведено сравнение чувствительности термолинзового и спектрофотометрического детектирования в капиллярном электрофорезе. Пределы обнаружения 2-, 3- и 4-нитрофенолов в водном растворе фонового электролита (фосфатный буферный раствор, pH 7.0, гидродинамический ввод пробы) при термолинзовом детектировании составляют 1 10–6 М, 1.6 10–6 М и 2.5 10–7 М, соответственно. Выигрыш в чувствительности по сравнению со спектрофотометрическим детектированием составляет 30 раз.

6. Предложены практические рекомендации по увеличению чувствительности термолинзового детектирования, которые включают в себя использование водно органических растворов фонового электролита вместо водной среды. Пределы обнаружения 2-, 3- и 4-нитрофенолов в водном растворе фонового электролита (фосфатный буферный раствор pH 6.5, электрокинетический ввод пробы) составляют 6.5 10–6 М, 6.6 10–6 М и 1.7 10–7 М, соответственно, а при замене растворителя на водно–ацетонитрильный раствор (3 : 7 об.) их значения снижены в 6.5 раз. Данный подход позволяет не только увеличить чувствительность детектирования, но и повысить эффективность электрофоретического разделения.

В работе защищаются следующие положения:

1. Выражение, описывающее зависимость аппаратного термолинзового сигнала от геометрических параметров оптической схемы спектрометра при регистрации зондирующего излучения в ближней зоне. Расчет оптимального размера зондирующего луча в капилляре на основе предложенного выражения и экспериментальные характеристики чувствительности и воспроизводимости термолинзовых измерений для оптимальной геометрии оптической схемы.

2. Расчеты тепловых возмущений, индуцированых лазерами с одномодовым и многомодовым составом и теоретическое и экспериментальное обоснование использования многомодовых лазеров при термолинзовом детектировании в капилляре.

3. Выбор оптимальных условий термолинзового детектирования на основе расчета размеров термооптических элементов, формирующихся в воде, ацетонитриле и метаноле при различных частотах прерывания индуцирующего излучения и, оптимального размера зондирующего луча.

4. Объяснение влияния скорости движения среды на чувствительность термолинзовых измерений, учитывающее как изменение эффективной теплопроводности среды в условиях потока, так и остаточный нагрев в капилляре в конце цикла образования и диссипации термооптического элемента. Выбор диапазона скоростей потока, соответствующего максимальной чувствительности термолинзового детектирования в условиях электрофоретического разделения.

5. Результаты исследования влияния параметров растворителей, входящих в состав растворов фоновых электролитов, на метрологические характеристики термолинзового детектирования в капиллярном электрофорезе.

Апробация работы Основные результаты работы представлены на следующих конференциях:

Международная конференция “ANAKON 2003” (2–5 апреля 2003, Констанц, Германия);

17ый Международный симпозиум “17th International Symposium on Microscale Separations and Capillary Electrophoresis” (8–12 февраля 2004, Зальцбург, Австрия);

Всероссийский симпозиум «Хроматография и хроматографические приборы» (15-19 марта 2004, Москва, Россия);

Всероссийская конференция по аналитической химии «Аналитика России», ( сентября – 1 октября 2004, Москва, Россия);

Международная конференция “ANAKON 2005” (15–18 марта 2005, Регенсбург, Германия).

Работа поддержана Немецким научно-исследовательским обществом (Deutsche Forschungsgemeinschaft)) в рамках гранта PY 6/8-1 «Einsatz eines Nahfeld-Thermische-Linse Detektors zur empfindlichen Detektion in Verbindung mit kapillarelektroseparativen Methoden unter Beruecksichtigung von Matrixeffekten» (2002–2004).

Структура и объем работы Диссертация изложена на 158 страницах машинописного текста и включает 26 рисунков, 15 таблиц и список цитируемой литературы из 91 наименований.

Основное содержание работы

Теоретическая часть работы состоит из двух глав. Первая глава посвящена вопросам детектирования в капиллярном электрофорезе. В ней рассмотрены основные типы используемых детекторов, отмечены их основные характеристики:

чувствительность, универсальность и селективность, круг потенциально детектируемых соединений, а также отмечены детекторы, для которых существуют серийные приборы.

Наряду с широко распространенными в аналитической практике детекторами (спектрофотометрический, флуориметрический, масс-селективный, кондуктометриче ский) также рассмотрены недавно предложенные системы детектирования, к которым относится скрещенно-лучевой термолинзовый детектор. Этот тип детектора сочетает в себе преимущества спектрофотометрического детектора и в среднем на полтора порядка более чувствителен. Термолинзовое детектирование в капиллярных электромиграционных методах успешно использовано при определении аминокислот, пищевых консервантов, загрязнителей окружающей среды и лекарственных препаратов на уровне 10–8 – 10– моль/л. Однако, многие методологические вопросы, затрагивающих сочетание двух методов, остаются открытыми и требуют более детального рассмотрения при создании гибридного метода.

Во второй главе освещены существующие теоретические модели термолинзового эффекта (параболическая и дифракционная). Они описывают формирование термооптического элемента под действием индуцирующего излучения и изменения параметров зондирующего луча в присутствии термооптического элемента. Сравнение двух этих моделей показало, что в отличие от параболической модели, дифракционная модель позволяет в явном виде выразить зависимость измеряемого (аппаратного) термолинзового сигнала не только от концентрации поглощающего соединения и термооптических характеристик среды, но и от геометрических параметров оптической схемы спектрометра. Так, аппаратный термолинзовый сигнал (t) представляет собой относительное изменение интенсивности в центре зондирующего луча:

(t ) = I p (0) I p (t ) I p (t ), (1) где Ip(0) — интенсивность излучения в центре луча зондирующего лазера в отсутствие наведенного профиля показателя преломления и Ip(t) — интенсивность излучения в центре луча зондирующего лазера после прохождения термооптического элемента в момент времени t с начала его индуцирования. Так называемый аналитический термолинзовый сигнала, прямо пропорционально зависящий от концентрации определяемого компонента, из описания теплового профиля, индуцированного за счет температуропроводности, определяют как = 2.303E0 Pe lc = 2.303E0 Pe l, (2) где — молярный коэффициент поглощения определяемого соединения, l — длина оптического пути, с — молярная концентрация определяемого соединения, Pe — мощность индуцирующего излучения, — линейный коэффициент поглощения, E0 — термооптический коэффициент чувствительности термолинзовых измерений, который выражают как E0 = (– dn/dT) / (p k) (1/мВт), где (dn/dT) — температурный коэффициент показателя преломления, p — длина волны зондирующего излучения, k — коэффициент теплопроводности среды.

При регистрации зондирующего излучения в дальней зоне при малых значениях оптической плотности связь аппаратного термолинзового сигнала (t) с геометрическими параметрами оптической схемы и аналитическим термолинзовым сигналом имеет вид (t ) = B = 2.303 0 PA = Eth A, (3) где Eth = BE0P (1/мВт) — суммарный фактор увеличения чувствительности термолинзового детектирования по сравнению со спектрофотометрическим детектированием, а B — безразмерный геометрический параметр, рассчитываемый как ( }) { B = arctg 2mZ diff (1 + 2m) 2 + Z diff ( tc / 2t ) + 1 + 2m + Z diff.

2 (4) Здесь t — время облучения образца индуцирующим излучением, tc = e2/4DT — характеристическое время развития термолинзы, e — радиус луча индуцирующего лазера, DT — коэффициент температуропроводности среды. Коэффициент m рассчитывают как:

m = (1 p / 1e ) 2, (5) где 1p и 1e — радиусы лучей зондирующего и индуцирующего лазеров в образце, соответственно. Коэффициент Zdiff рассчитывают как:

Z diff = z1 zcp + zcp z2 1 + ( z1 zcp ), (6) где z1 — расстояние между образцом и перетяжкой зондирующего луча, z2 — расстояние zcp = 0p/p между образцом и фотодетектором, — конфокальное расстояние зондирующего луча, где 0p — радиус зондирующего луча в перетяжке.

Таким образом, дифракционная модель предоставляет более полную информацию о параметрах термолинзового спектрометра (детектора), которые необходимо оптимизировать в соответствии с условиями детектирования в капиллярном электрофорезе, и именно эта модель выбрана в качестве теоретической основы оптимизации геометрических параметров оптической схемы и рабочих параметров термолинзового детектора.

Кроме того, во второй главе отмечены факторы, сопутствующие электрофоретическому разделению, и способные влиять на формирование термооптического элемента и распространение зондирующего излучения в образце. К ним в первую очередь относятся условия детектирования в капилляре малого размера и цилиндрической формы, влияние состава раствора фонового электролита и скорости электроосмотического потока на чувствительность термолинзового детектирования.

Существующие данные свидетельствуют, что при термолинзовом детектировании в капилляре размером 50 – 100 мкм и цилиндрической формы наилучшие метрологические характеристики (предел обнаружения и относительное стандартное отклонение) достигаются при регистрации зондирующего излучения в ближней зоне (краевые эффекты, вызванные вкладом стенок капилляра, оказываются вне фотодетектора). Сделан вывод, что поскольку существующая дифракционная модель соответствует случаю регистрации зондирующего излучения в дальней зоне, ее необходимо расширить и на случай регистрации в ближней зоне.

При формировании термооптического элемента в условиях бесконечного объема, поток вносит вклад в процесс теплопереноса и увеличивает эффективную теплопроводность среды. За счет этого время формирования и диссипации термооптического элемента, а также (для случая непрерывного режима возбуждения) амплитуда термолинзового сигнала падают. Под действием потока термооптический элемент перемещается по потоку из зоны первоначального формирования и смещается относительно зондирующего луча, причем при больших значениях скорости потока возможно размывание и разрушение пространственного распределение показателя преломления в образце. В результате, термолинзовые измерения, проводимые в движущейся среде, характеризуются более низкой чувствительностью по сравнению с аналогичными измерениями в статических условиях. Однако при реализации термолинзового детектирования (непрерывный режим работы индуцирующего лазера) в капилляре отмечают не падение, а рост термолинзового сигнала при переходе от статических условий к динамическим, причины же такого поведения пока остаются не полностью выясненными и требуют дальнейшего изучения.

Обобщая существующую информацию о влиянии компонентов, входящих в состав раствора фонового электролита (электролиты, ПАВ, водно–органические смеси и органические растворители) и определяющих эффективность электрофоретического разделения, можно сделать вывод, что их присутствие, в целом положительно сказывается на чувствительности термолинзовых измерений. Кроме того, их можно использовать самостоятельно (без необходимости улучшения эффективности разделения, однако контролируя изменения, связанные с их появлением в растворе) для повышения чувствительности термолинзового детектирования. В данном случае наиболее рационально использовать органические и водно–органические растворы фонового электролита, так как они обеспечивают максимальный рост чувствительности.

Таким образом, из обобщения существующих данных вытекают следующие задачи:

(1) оптимизация геометрических параметров оптической схемы и рабочих параметров термолинзового детектора для достижения максимальной чувствительности, используя в качестве теоретической основы выражение зависимости термолинзового сигнала от параметров эксперимента, полученное в рамках дифракционной теории, расширенное на случай детектирования зондирующего излучения в ближней зоне;

2) изучение влияние скорости электроосмотического потока на чувствительность термолинзового детектирования;

3) на примере водно–ацетонитрильных и водно–метанольных растворов фонового электролита изучение влияния растворителя на чувствительность термолинзового детектирования. Основные результаты работы и их обсуждение представлены в главах 3–7.

В третьей главе перечислены реагенты и аппаратура, используемые в работе, а также описана техника эксперимента. В работе использовали скрещенно-лучевой термолинзовый детектор с регистрацией сигнала в ближней зоне для капиллярного электрофореза (ТЛС–1). Он представляет собой интегрированное устройство с размерами 182 мм 135 мм 181 мм (без юстировочных винтов), включающее в себя все основные элементы, необходимые для формирования, регистрации и обработки термолинзового сигнала. Исключение составляют индуцирующий лазер (гелий–кадмиевый лазер (IK 3552R-G Kimmon Electronic Co., Ltd., Япония) с е = 325.0 нм (многомодовый режим, ТЕМnm), который располагают рядом с модулем детектора, и зондирующий лазер (лазерный диод (Toshiba TOLD 1050, Schaeffer & Kirchhoff, Германия) с p = 681.9 нм (TEMnm)), луч которого подводят по световоду, соединенному с модулем детектора.

Параметры конфигурации детектора ТЛС–1 приведены в табл. 1. Управление процессами измерения и обработки сигнала осуществляют с помощью встроенного в детектор микроконтроллера, ключевым узлом которого является синхронный усилитель (временная константа 0.1 с). Регистрацию термолинзового сигнала, а также внешнюю настройку детектора осуществляют с помощью специального программного обеспечения.

Для сравнительных экспериментов использовали двухлазерный параллельно-лучевой термолинзовый спектрометр с детектированием в дальней зоне (ТЛС–2). Параметры конфигурации детектора ТЛС–2 приведены в табл. 1. В ТЛС–2 термолинзу индуцируют в спектрофотометрической кювете излучением аргонового ионного лазера Innova 90- (Coherent, США) с е = 514.5 нм (TEM00-мода) и зондируют с помощью гелий–неонового лазера SP-106-1 (Spectra Physics, США) с p = 632.8 нм (TEM00-мода). Синхронизацию процесса измерения осуществляют через компьютер при помощи специально разработанного программного обеспечения.

Таблица 1. Экспериментальные параметры конфигурации термолинзовых спектрометров для детектирования в капиллярном электрофорезе (ТЛС-1) и статических измерений в кювете (ТЛС-2) Параметр ТЛС-1 ТЛС- Длина волны e (нм) Индуцирующий 325.0 514. лазер Радиус перетяжки луча 0e (мкм) 3.88 ± 0.05 55 ± 0. Конфокальное расстояние zce (мм) 0.146 18. Фокусное расстояние фокусирующей 25 линзы fe (мм) Мощность излучения в образце Pe (мВт) 50 Длина волны p (нм) Зондирующий 681.9 632. лазер Радиус перетяжки луча, 0p (мкм) 7.0 ± 0.2 25.0 ± 0. 75.0 ± 0.5 109.0 ± 0. размер луча в образце 21p (мкм) Конфокальное расстояние zcp (мм) 0.23 3. Фокусное расстояние фокусирующей 20/20* линзы fр (мм) Мощность лазера в образце Pp (мВт) 3 Параметры Внутренний диаметр капилляра или 0.075 10. оптической длина оптического пути в кювете (мм) схемы установки Расстояние между образцом и 25.50 ± 0.05 1200 ± фотодетектором, z2 (мм) m (ур-ние (5)) 92.5 2. Zdiff (ур-ние (6)) 5.53 3. Диаметр диафрагмы зондирующего луча, 0.2 2R (мм) Частота прерывателя, (Гц) 40–95 * оптическая схема ТЛС-1 включает две фокусирующие линзы.

Для электрофоретического разделения использовали прибор SpectraPhoresis (ThermoQuest, Германия), совместимый как с детектором ТЛС-1, так и со стандартным спектрофотометрическим детектором Linear UVIS 200 (Spectra Physics, США).

Эксперименты проводили в кварцевых капиллярах (Polymicro Technologies LLC (Phoenix, AZ, США)) с внутренним диаметром 75 мкм и внешним диаметром 360 мкм. Для спектрофотометрических измерений использовали фотометр Philips PU 8720 UV/VIS (Philips, Голландия). Измерения проводили в кварцевых кюветах с длиной оптического пути 1 см. Для измерения значения рН среды использовали рН-метр inoLab pH Level (Германия).

В работе использовали неорганические и органические реагенты квалификации х.ч. и ч.д.а., в качестве растворителей использовали бидистиллированную деионизованную воду (установка очистки воды Milli-Q plus 185 (Millipore, Бедфорд, США);

омическое сопротивление не ниже 18.2 МОм), органические растворители квалификации «для градиентной ВЭЖХ». В главе 3 также приведены условия проведения различных экспериментов (методики).

В четвертой главе приведены уравнения, используемые в главах 5 – 7 для расчета профилей температуры, формирующихся за счет термооптического эффекта, и суммарного роста температуры в образце, а также уравнения для расчета оптимальных геометрических параметров оптической схемы термолинзового спектрометра (размера диафрагмы фотодетектора R, расстояния между перетяжкой зондирующего луча и образцом z1, размера зондирующего луча в образце 1p, рис. 1). Кроме того, здесь представлены уравнения, используемые при оценке влияния состава раствора фонового электролита на чувствительность термолинзового детектирования и общие характеристики сигналов при спектрофотометрическом и термолинзовом детектировании, рассчитываемые при обработке результатов экспериментов.

линза Рис. 1. Основные параметры зонди фотодетектор рующего луча при скрещено-луче капилляр вом термолинзовом детектировании Зондирующий 21p 20p 22p 2R в капилляре.

луч p Перетяжка диафрагма Поскольку для оптимизации зондирующего л уча геометрических параметров X z z оптической схемы Y термолинзового детектора для Z капиллярного электрофореза следует использовать уравнение, описывающее зависимость аппаратного термолинзового сигнала от геометрических параметров оптической схемы спектрометра при регистрации зондирующего излучения в ближней зоне, и которое отсутствует в литературе, в четвертой главе представлен вывод данного уравнения.

В случае регистрации излучения зондирующего луча в ближней зоне следует учесть тот факт, что при изменении положения перетяжки зондирующего луча изменяется и суммарная интенсивность зондирующего излучения, попадающего на фотодетектор с диафрагмой постоянного диаметра R. В результате, нами предложен модифицированный вариант ур-ния (3), учитывающий этот факт, где вместо параметра B (ур-ние (4)) следует использовать модифицированный параметр B :

)).

( ( B = B 1.009425erf 2 Rzcp 0p zcp + z12 + 2 z1 z2 + z 2 (7) При выборе оптимальных геометрических параметров зондирующего луча в термолинзовом детекторе для капиллярного электрофореза использовано ур-ние (7).

Термооптический элемент и его характеристики Оценка тепловых и геометрических характеристик формирующегося термооптического элемента является первым этапом, необходимым для выбора оптимальных условий работы термолинзового детектора. Поэтому в пятой главе рассмотрены характеристики термооптического элемента, формирующегося в образце под действием индуцирующего излучения. К первичным характеристикам термооптического элемента относят максимальный рост температуры в образце за счет термооптического эффекта после достижения теплового равновесия Tmax(r = 0, ), амплитуду колебания температуры в течение одного цикла после достижения теплового равновесия Tstead(r = 0, ) (рис. 2), радиус термооптического элемента rTL и его объем VTL. Значения этих характеристик для наиболее часто используемых в капиллярном электрофорезе растворителей (вода, ацетонитрил, метанол), рассчитанные на основе описания индуцированного теплового профиля за счет температуропроводности приведены в табл. 2 и 3.

T, 10 K Рис. 2. Схема роста температуры и дос 3, 1 тижения термического равновесия в тер молинзовых измерениях для статиче T stead ских условий (1) и некоторой ненулевой 2, скорости потока (2).

M- тый цикл модуляции 100 ms T max T diff Расчет максимального роста темпе 1, T heat ратуры в образце за счет термоопти ческого эффекта после достижения теплового равновесия Tmax(r = 0, ) 0, T cool t, мс и амплитуды колебания температуры в течение одного цикла после достижения теплового равновесия Tstead(r = 0, ) показал, что при значениях линейного коэффициента поглощения, соответствующих середине линейного динамического диапазона термолинзового спектрометра, рост температуры, генерируемый за счет термолинзового эффекта, не превышает нескольких кельвинов, и нагрев образца в общем случае не повлечет за собой побочных химических процессов и снижения эффективности разделения.

Таблица 2. Значения максимального нагрева образца за счет термолинзового эффекта после дости жения теплового равновесия Tmax(r = 0, ) (рис. 2) и амплитуды колебания температуры в образце за один цикл после достижения теплового равновесия Tstead(r = 0, ) (рис. 2) в воде, ацетонитриле и метаноле при некоторых значениях линейного коэффициента поглощения образца (для ТЛС– 1: индуцирующее излучение Pe = 50 мВт, 0e = 3.9 мкм и = 40 Гц) Tmax(r = 0, ), K Tstead(r = 0, ), K Среда = 2 10–4, = 4 10–2, = 2 10–4, = 4 10–2, = 2, = 2, 1/см 1/см 1/см 1/см 1/см 1/см 9 10–4 1 10– Вода 0.19 9.1 0.03 1. 2.8 10–3 4 10– ACN 0.6 27.8 0.09 4. –3 – MeOH 2.6 10 0.52 25.8 4 10 0.08 4. Таблица 3. Рассчитанные значения диаметра термооптического элемента dTL и его объема VTL в воде, ацетонитриле и метаноле при = 0.7 1/см, частотах прерывания индуцирующего излучения 40, 70 и 95 Гц, и индуцирующем излучении Pe = 50 мВт, 0e = 3.9 мкм. Указанные диапазоны обусловлены погрешностью расчетов = 40 Гц = 70 Гц = 95 Гц dTL±абс.погр., VTL±абс.погр, dTL±абс.погр., VTL±абс.погр, dTL±абс.погр., VTL±абс.погр, Среда мкм пл мкм пл мкм пл 90 ± 10 200 ± 20 70 ± 7 160 ± 20 60 ± 6 140 ± Вода 80 ± 8 180 ± 20 70 ± 7 140 ± 20 60 ± 6 130 ± ACN 80 ± 8 170 ± 20 60 ± 6 140 ± 20 60 ± 6 120 ± MeOH Для условий термолинзового детектирования в капилляре (размер образца мал, жесткая фокусировка индуцирующего излучения, время облучения образца n 100tc) рассмотрена возможность использования излучения с негауссовым распределением мощности в луче как индуцирующего излучения. Проведенные расчеты показали, что в случае жесткой фокусировки индуцирующего луча в капилляре профили роста температуры, формирующиеся при использовании индуцирующего луча с гауссовым (TEM00-мода) и негауссовым (ТЕМnm-мода) распределением интенсивности в луче, отличаются незначимо (рис. 3). В результате, оправдано использование лазеров с многомодовым составом в качестве источников индуцирующего излучения, что позволяет расширить набор рабочих длин волн термолинзового детектора и, следовательно, круг определяемых соединений.

Рис. 3. Профили роста температуры, формирующиеся в образце воды 8. ( = 2 10–4 1/см) при его облучении индуцирующим лазерным излучением 6. с гауссовым распределением интенсив ности в луче (TEM00-мода, сплошная 4. линия) и с многомодовым распределе нием интенсивности в луче (ТЕМnm-мо 2. да, пунктирная линия). Параметры ин 0e = 3.9 мкм, дуцирующего луча:

20 15 10 5 0 5 10 15 Pe = 50 мВт, = 40 Гц.

r Оптимизация параметров термолинзового спектрометра В шестой главе с позиции максимальной чувствительности термолинзового детектирования проведена оптимизация геометрических параметров оптической схемы термолинзового детектора и режима его работы с учетом специфических условий детектирования в капилляре в условиях потока. Рассмотрен общий подход к выбору параметров зондирующего луча: его размера в образце 1p, размера диафрагмы фотодетектора R, расстояния между его перетяжкой и образцом z1 и между образцом и диафрагмой фотодетектора z2 (рис. 1). С использованием предложенного в главе выражения зависимости аппаратного термолинзового сигнала от геометрических параметров оптической схемы (ур-ния (3) и (7)) рассчитаны расстояние между перетяжкой зондирующего луча и образцом z1 и соответствующий этому расстоянию размер зондирующего луча в образце 1p, при котором термолинзовый сигнал максимален. Для подтверждения правильности предложенного уравнения измерена зависимость амплитуды термолинзового сигнала от расстояния между перетяжкой зондирующего луча и образцом z1 (рис. 4). Полученная экспериментальная зависимость достаточно хорошо описывается с помощью предложенного уравнения, тогда как исходные уравнения (3)–(4) (регистрация в дальней зоне), дают завышенные значения сигнала.

Рис. 4. Зависимость термолинзового эксперимент сигнала от расстояния между капилля расчет (ближняя зона) ром и перетяжкой луча зондирующего расчет (дальняя зона) лазера z1. Пунктирная линия соответст вует теоретическим расчетам по ур-ни ям (3)–(4) (регистрация в дальней зоне), сплошная линия — по ур-ниям (3)–(7) (ближняя зона), точки — эксперимен тальные данные: водный раствор ализа 25 ринового желтого 8 10–5 М в буфер ном растворе (pH 7.0), 12.5 мМ e = Na2HPO4 + 12.5 мМ NaH2PO4, -1 0 1 2 3 4 5 6 z 1, мм 325 нм, Pe = 50 мВт, = 40 Гц.

Используя рассчитанные в главе 5 значения диаметров термооптического элемента, формирующегося под действием индуцирующего излучения в воде, ацетонитриле и метаноле (табл. 3), найден диапазон частот прерывания индуцирующего излучения, обеспечивающий максимальную чувствительность термолинзовых измерений, который составляет 40–95 Гц. Нижняя граница этого диапазона соответствует случаю, когда размер термооптического элемента равен или незначительно превышает диаметр капилляра, и дальнейшее снижение частоты прерывания нецелесообразно, так как не приводит к росту чувствительности из-за отвода тепла через стенки капилляра (рис. 5).

Верхняя граница диапазона частот соответствует случаю, когда потеря чувствительности термолинзовых измерений вследствие сокращения продолжительности цикла «нагрев – охлаждение» составляет около 50% от максимального, в результате дальнейшее увеличение частоты нецелесообразно из-за этой потери чувствительности (рис. 5).

Рис. 5. Зависимость величины термо 1, () / (60 Гц) линзового сигнала в водной среде, нор эксперимент 1, расчет мированного на его значение при 1, = 60 Гц, ()/(60 Гц), от частоты прерывания индуцирующего излуче ния. Сплошная линия — рассчитан 0, ные значения термолинзового сигнала 0, (ур-ние (3)), штрихпунктирная линия — экспериментальные значения (вод 0, = 0.7 1/см, ный раствор, 0,, Гц 0e = 3.9 мкм, e = 325 нм, Pe = 50 мВт).

30 40 50 60 70 80 90 100 110 Влияние скорости потока на чувствительность термолинзовых измерений При исследовании влияния потока, расчеты и экспериментальные данные подтверждают существование остаточного нагрева Tcool(r, t) в конце полуцикла охлаждения (рис. 2). В условиях потока значения роста температуры в фазе нагрева Theat(r, t) и роста температуры в фазе охлаждения Tcool(r, t) уменьшаются из-за увеличения эффективной теплопроводности kef и смещения нагретой зоны в ходе формирования и диссипации термооптического элемента. Наличие второго фактора очевидно. Увеличение же эффективной теплопроводности kef иллюстрируют зависимости термолинзового сигнала от времени при различных скоростях потока, представленные на рис. 6. Так, при скорости потока 9 см/мин время достижения равновесного сигнала сокращается практически в 5 раз по сравнению со статическими условиями, что свидетельствует об уменьшении характеристического времени развития термолинзы tc и росте эффективной теплопроводности kef также в 5 раз. Оба фактора действуют совместно. В результате, амплитуда колебания температуры, наблюдаемая за М-ый цикл, Tdiff,M(r, t) = Theat(r, t) – Tcool(r, t) (рис. 2) может как увеличиваться, так и уменьшаться в зависимости от результирующего влияния обоих факторов на каждый из членов разности.

Рис. 6. Зависимость термолинзового сигнала ализаринового желтого от времени (1) в статических условиях и при скоростях потока (2) 3, (3) 6, (4) 7.5, (5) 9 см/мин;

(выбросы не удале 55000 ны). Условия: общая длина капилляра 71.6 см, эффективная длина капилляра 41.3 см, = 325 нм, мощность излуче 45000 ния индуцирующего лазера 50 мВт, t60s, 0 20 40 60 80 100 120 140 1t, с частота прерывателя 70 Гц.

На рис. 7 представлены экспериментальные зависимости амплитуды термолинзового сигнала от скорости электроосмотического потока при некоторых значениях частоты прерывания индуцирующего излучения (исследуемый диапазон рабочих значений скорости потока определяется техническими возможностями источника высокого напряжения, составом раствора фонового электролита и маркой капилляра и является типичным для капиллярного электрофореза). Они представляют собой кривые с максимумом, где можно выделить область роста значения термолинзового сигнала (область I), область максимума (область II) и область падения термолинзового сигнала (область III). В области I падение величины роста температуры в фазе нагрева Theat(r, t) меньше падения величины остаточного роста температуры в фазе охлаждения Tcool(r, t), так что результирующее значение изменения температуры Tdiff,M(r, t) растет, и, следовательно, растет термолинзовый сигнал (v) (рис. 2, пунктирная линия 2). Малое падение величины роста температуры в фазе нагрева Theat(r, t) в данной области в некоторой степени связано с тем, что собственная теплопроводность среды достаточно велика из-за влияния стенок капилляра, теплопроводность которых в несколько раз выше теплопроводности раствора фонового электролита, так что относительное изменение эффективной теплопроводности мало. В результате, при детектировании в капилляре при малых значениях скорости потока наблюдается рост термолинзового сигнала по сравнению со статическими условиями. Поведение термолинзового сигнала в области III аналогично поведению в случае бесконечного объема, то есть сигнал линейно зависит от скорости потока. Таким образом, в области высоких значений скорости электроосмотического потока характер зависимости термолинзового сигнала (v) определяется смещением из области детектирования и размыванием термооптического элемента. Для подтверждения этого предположения построены теоретические кривые (v) (рис. 7, пунктирные линии). В области III экспериментальные данные хорошо совпадают с рассчитанными значениями. Очевидно, что область максимума II является переходной, где выигрыш за счет снижения величины остаточного роста температуры в фазе охлаждения Tcool(r, t) компенсируется падением величины роста температуры в фазе нагрева Theat(r, t).

Рис. 7. Зависимость термолинзового сиг 40 Гц 110000 нала от скорости потока при разных зна 70 Гц 100000 90 Гц чениях частоты прерывания индуцирую I III щего излучения. Экспериментальные данные не сглажены. Раствор ализарино вого желтого 8 10–5 М в 12.5 мМ Na2HPO4 + 12.5 мМ NaH2PO4 (рН 7), об щая длина капилляра 71.6 см, эффектив II ная длина капилляра 41.3 см, = 325 нм, мощность излучения индуцирующего ла 0 5 10 15 20 зера 50 мВт.

v, см/мин Для оценки влияния скорости потока на чувствительность термолинзовых измерений рассмотрены зависимости шума базовой линии от скорости потока. В исследуемом диапазоне значений скорости потока (0 – 24 см/мин) величина относительного стандартного отклонения сигнала базовой линии (раствора фонового электролита) sr меняется незначимо. Следовательно, возникающий под действием электрического поля электроосмотический поток характеризуется высокой стабильностью и вклад потока в увеличение шума базовой линии минимален.

В результате, диапазон оптимальных значений скорости потока соответствует области максимума II (рис. 7). Если рассмотреть диапазон рабочих значений скорости потока (0 – 24 см/мин), то падение термолинзового сигнала при максимальной скорости потока относительно максимальной величины составляет не более 35%, то есть работа при максимальной скорости потока приемлема, если главной задачей является повышение экспрессности электрофоретического разделения. Таким образом, диапазон рабочих значений скоростей электроосмотического потока 12–24 см/мин является оптимальным для термолинзового детектирования в капиллярном электрофорезе, обеспечивая высокую чувствительность и воспроизводимость определения. В этом диапазоне амплитуда термолинзового сигнала возрастает в 1.5 – 2 раза по сравнению со статическими условиями в зависимости от частоты прерывания индуцирующего излучения.

Сравнение возможностей термолинзового детектора и спектрофотометрического УФ-детектора на примере модельной смеси нитрофенолов После оптимизации рабочих условий и геометрических параметров оптической схемы термолинзового детектора для капиллярного электрофореза проведено сравнение его аналитических возможностей со спектрофотометрическим детектором на примере разделения модельной смеси 2-, 3- и 4-нитрофенолов. Тестовые электрофореграммы разделения нитрофенолов в идентичных электрофоретических условиях при термолинзовом и спектрофотометрическом детектировании приведены на рис. 8.

3 A 60000 0, 40000 0, 20000 0, 0 0, t, са) t, c б) 0 100 200 300 0 100 200 Рис.8. Разделение 3-нитрофенола (1), 2-нитрофенола (2) и 4-нитрофенола (3) при (а) термолинзовом детектировании (каждый по 2 10–5М) и (б) спектрофотометрическом детектировании (каждый по 8 10–5М, = 325 нм). Водный раствор фонового электролита 12.5 мМ Na2HPO4 + 12.5 мМ NaH2PO4 (рН 7.0), 20 кВ, гидродинамический ввод пробы 1 с (200 мбар), din = 75 мкм, Ltot = 71.6 см, Leff = 41.3 см. Детектирование при e = 325 нм, Pe = 50 мВт, = 40 Гц.

На основании полученных данных рассчитаны пределы обнаружения 2-, 3- и 4 нитрофенолов при термолинзовом и спектрофотометрическом детектировании (табл. 4).

Выигрыш в чувствительности при переходе к термолинзовому детектированию составляет 30 раз и превышает теоретически ожидаемое значение (18.2) в 1.5 раза, при этом линейный динамический диапазон составляет три порядка. Дополнительное увеличение чувствительности связано с тем, что в области малых оптических плотностей воспроизводимость термолинзовых измерений выше спектрофотометрических. В результате, снижение предела обнаружения происходит не только благодаря увеличению коэффициента чувствительности, но и из-за снижения шума базовой линии.

Таблица 4. Пределы обнаружения ( 107 М) 2-, 3- и 4-нитрофенолов при термолинзовом (ТЛС) и спектрофотометрическом (СФ) детектировании, а также значения теоретического Eth (ур-ние (3)) и экспериментального Eexp = сmin,СФ/cmin,ТЛ факторов чувствительности термолинзового детектирования. Условия разделения аналогичны перечисленным в рис. 8.

Соединение ТЛС детектор СФ детектор Еexp Eth 2-нитрофенол 10 300 30.0 18. 3-нитрофенол 16 500 31.3 18. 4-нитрофенол 2.5 80 32.0 18. Использование водно–органических сред для термолинзового детектирования в капиллярном электрофорезе Седьмая глава посвящена исследованию влияния состава раствора фонового электролита на чувствительность термолинзового детектирования. Принимая во внимание тот факт, что состав раствора фонового электролита в первую очередь определяет условия электрофоретического разделения, целесообразно изучить особенности термолинзового детектирования на примере водно–метанольных и водно–ацетонитрильных растворов фонового электролита. В качестве основных критериев, характеризующих исследуемый водно–органический раствор, выбраны следующие параметры: (1) увеличение термооптического коэффициента чувствительности термолинзовых измерений в данном растворителе относительно водной среды, характеризующее изменение сигнала:

REF = Emix Eaq = mix aq, (8) где Eaq и Emix — термооптические коэффициенты чувствительности термолинзовых измерений в водном и водно–органическом растворах, соответственно.

(2) Отношение значений относительного стандартного отклонения сигнала раствора фонового электролита в данном растворителе и в водной среде:

NF = sr,mix sr,aq, (9) (3) Суммарное (результирующее) увеличение чувствительности термолинзовых измерений в данном растворителе относительно водной среды SE = REF/NF, отражающее общее увеличение чувствительности, соответственно.

Исследование проведено в два этапа. Сначала выполнены «ступенчатые измерения» (капилляр сначала заполняли раствором фонового электролита, вход капилляра помещали в сосуд с модельным раствором и прикладывали рабочее напряжение, в результате регистрировали термолинзовые сигналы раствора фонового электролита buf и модельного раствора mod, время миграции поглощающего соединения tmig). В этом случае минимизируются сопутствующие смене растворителя процессы (изменение вязкости, условий диссоциации силанольных групп на стенках капилляра, степени диссоциации анализируемых соединений и преобразование их сольватной оболочки), вносящие вклад в результирующее значение термолинзового сигнала, и, следовательно, создаются условия наиболее близкие к измерениям в кювете, что позволяет отметить общие закономерности.

Затем рассмотрено «электрофоретическое разделение» (регистрация электрофореграммы) модельной смеси веществ, дающее возможность оценить результирующее увеличение чувствительности для электрофоретического измерения с термолинзовым детектированием.

Экспериментальные значения увеличения термооптического коэффициента чувствительности термолинзовых измерений в данном растворителе относительно водной среды REFst = mix/aq, полученные в режиме «ступенчатые измерения», для выбранных модельных систем (табл. 5), а также экспериментальные значения, полученные в кювете REFcell, и в результате теоретических расчетов REFth приведены на рис. 9. Из полученных данных можно сделать следующие заключения:

• Значения параметра REFst для различных поглощающих соединений и растворов фонового электролита при фиксированном содержании органического растворителя в растворе отличаются незначимо друг от друга, то есть рост амплитуды термолинзового сигнала, как и ожидалось, обусловлен присутствием в растворе органического растворителя.

• Несмотря на то, что амплитуда термолинзового сигнала зависит от скорости движения среды в капилляре, значение параметра REFst (отношение сигналов) не зависит от скорости потока (IA, 8.9 см/мин;

IIA, 15.2 см/мин;

IM, 6.4 см/мин;

и IIM, 6.6 см/мин);

• Значения параметра REF, полученные в капилляре REFst (ТЛС-1), в кювете REFcell (ТЛС-2) и в результате теоретических расчетов REFth, находятся в хорошем соответствии друг с другом (рис. 9).

Таким образом, теоретический подход (расчет параметра REFth) эффективен для оценки ожидаемого роста амплитуды термолинзового сигнала в случае термолинзового детектирования в капиллярном электрофорезе вне зависимости от скорости электроосмотического потока и используемого фонового электролита.

Таблица 5. Модельные системы, исследованные в ходе «ступенчатых измерений» Обозначение Поглощающее Фоновый электролит Органический Диапазон, соединение растворитель % об.

IА 3-нитрофенол 7.5 мМ NaH2PO4 + 2.5 мМ Na2HPO4, ACN 0– pH 6. IМ MeOH 0– IIА Ализариновый 10 мМ (C2H5)3N + 9.6 мМ CH3COOH ACN 0– желтый pH 9. IIМ MeOH 0– 6 REF REF (1) REF st IM (2) REF st IIM (1) REFst IA (2) REFst IIA 5 (1) кювета расчет (3) кювета (4) расчет 2 0 20 40 60 80 0 10 20 30 40 50 ACN, % об. б) а) MeOH, % об.

Рис. 9. Значения параметра REF для водно-метанольных (а) и водно-ацетонитрильных (б) растворов, полученные в капилляре REFst (серии 1 и 2) (ур-ние (8)), в кювете REFcell (серия 3) (ур-ние (8)), и рассчитанные значения REFth (ур-ние (8), сплошная линия).

В случае увеличения доли органического растворителя в растворе фонового электролита наблюдается рост не только амплитуды термолинзового сигнала, но и шума базовой линии (табл. 6). Видно, что значение относительного стандартного отклонения сигнала водно-органического раствора фонового электролита sr,mix больше аналогичной величины для водного раствора sr,aq, при этом sr,mix принимает максимальные значения при средних значениях объемной доли органического растворителя в растворе (40 – 60% об.).

Значения параметра NF зависят не только от природы и объемной доли органического растворителя в растворе фонового электролита, но также и от его природы (табл. 6). Так, шум базовой линии при использовании фосфатного буферного раствора ниже величины, наблюдаемой при использовании буферного раствора триэтиламин – уксусная кислота с той же объемной долей органического растворителя.

Таблица 6. Значения параметра NF (ур-ние (9)), полученные для исследуемых модельных систем (состав приведен в табл. 5) при различном содержании ацетонитрила и метанола (n = 10, P = 0.95) Орг. растворитель, % об. IA IIA IM IIM 0 1 1 1 1.0 ± 0.1 1.0 ± 0. 10 – – 1.1 ± 0.1 1.3 ± 0.3 1.2 ± 0.1 1.3 ± 0. 1.1 ± 0.1 1.3 ± 0. 30 – – 1.2 ± 0.2 1.6 ± 0.3 1.3 ± 0.2 1.9 ± 0. 1.3 ± 0.2 1.4 ± 0. 50 – – 1.3 ± 0.2 1.7 ± 0.4 1.6 ± 0. 60 – 1.3 ± 0. 70 – – – 1.1 ± 0. 80 – – – 1.2 ± 0. 100 – – – Статистическая обработка двух выборок (n = 5), полученных в результате экспериментов, проводимых в разные дни, показала (F- и t-критерии), что их можно объединить в единую выборку с n =10.

Измерения в режиме «электрофоретическое разделение» проводили на примере разделения модельной смеси мононитрофенолов в водно–ацетонитрильном фосфатном буферном растворе. Электрофореграммы разделения модельной смеси в растворах фонового электролита с содержанием ацетонитрила 0, 40 и 70% об. приведены на рис. (на рис. 10, в представлены все 3 электрофореграммы в одном масштабе).

Так как задача исследования заключалась в изучении модельных растворов фонового электролита с точки зрения чувствительности термолинзового детектирования, параметры разделения модельной смеси подробно не рассматривали. Тем не менее, эффективность разделения в водных и водно–ацетонитрильных растворах существенно не отличается (220000 – 240000 теоретических тарелок на метр в зависимости от компонента), а разрешение пиков 2- и 4-нитрофенолов даже возрастает от Rs = 1.08 в водном растворе до Rs 1.5 в растворах, содержащих 30 – 70% об. ACN (для других пар пиков Rs 1.5 как в водном, так и в водно–ацетонитрильных растворах). Следовательно, в случае выбранной модельной смеси мононитрофенолов использование водно–ацетонитрильных смесей не только допустимо (не ухудшает характеристик разделения), но и предпочтительно (увеличивает разрешение пиков).

3 12 6000 0 20 40 60 80 100 120 140 160 0 50 100 150 200 t, c t, c а) б) 0 50 100 150 200 250 300 350 t, c в) Рис. 10.Электрофореграммы разделения смеси (1) 3-нитрофенола, (2) 2-нитрофенола и (3) 4 нитрофенола (210–5 M каждый) в а) водном, б) 40%-ном об. AСN и в) 0, 40, 70%-ных об.

AСN (наложение 3-х электрофореграмм) растворах фонового электролита 2.5 мМ Na2HPO4 + 7.5 мМ NaH2PO4 (pH 6.5), 30 кВ, ввод пробы при 5 кВ, время вода 5 с при 0% об. AСN, 7.7 с при 40% об. ACN и 12.3 с при 70% об. ACN (количество вводимых компонентов в долях концентрации введенной при 0% AСN: 3-нитрофенол 1;

2 нитрофенол: 0.99 при 40% об. ACN, 1.02 при 70% об. ACN;

4-нитрофенол: 0.95 при 40% об. ACN, 0.97 при 70% об. ACN), din = 75 мкм, Ltot = 71.6 см, Leff = 41.3 см, = 325 нм, = 95 Гц.

Численные значения параметра увеличения термооптического коэффициента чувствительности термолинзовых измерений в растворах фонового электролита с различным содержанием ацетонитрила (0 – 70% об. AСN, рис. 11, а) REFpk, для 2-, 3- и 4 мононитрофенолов рассчитывали как REFpk = Scorr,mix Scorr,aq, (10) где Scorr = Speak/efftinjtmig — исправленное значение площади пика, Speak — площадь пика, eff — среднее значение эффективной электрофоретической подвижности иона, рассчитанное из всех повторяющихся измерений в данном растворе фонового электролита (n = 10), tinj — продолжительность ввода пробы, tmig — время миграции иона).

Экспериментальные значения параметра REFpk в целом близки к теоретическим значениям, однако для растворов фонового электролита с содержанием ацетонитрила 30 – 70% об. экспериментальные величины несколько выше теоретически рассчитанных.

Наблюдаемое отклонение вызвано тем, что скорость движения жидкости в капилляре влияет на амплитуду термолинзового сигнала. Так, значения скорости электроосмотического потока, генерируемые в выбранных условиях разделения, лежат в диапазоне от 8.9 см/мин (70% об. ACN) до 21.8 см/мин (водный раствор). Из экспериментальной зависимости амплитуды термолинзового сигнала от скорости электроосмотического потока (рис. 7, 0 – 24 см/мин) видно, что при скоростях электроосмотического потока 8.9 – 21.8 см/мин амплитуда термолинзового сигнала сначала растет, затем проходит через продолжительный максимум и затем начинает падать. Следовательно, можно ожидать, что для промежуточных значений доли ацетонитрила в растворе фонового электролита значения параметра REFpk будут выше теоретических из-за дополнительного вклада движения среды в величину термолинзового сигнала. Для проверки этого предположения проведены эксперименты при постоянной скорости электроосмотического потока (рис. 11, б). Значения параметра REFpk, рассчитанные из этих данных, значительно лучше коррелируют с теоретическими расчетами. Таким образом, теоретический подход (расчет параметра REFth, ур-ние (8)) эффективен для оценки ожидаемого роста амплитуды термолинзового сигнала в случае термолинзового детектирования в капиллярном электрофорезе также и в режиме «электрофоретическое разделение».

Одной из основных характеристик чувствительности методики является предел обнаружения компонента cmin, поэтому суммарное (результирующее) увеличение чувствительности термолинзового детектирования при переходе от водного раствора фонового электролита к водно–ацетонитрильному оценивали как SE pk = cmin,aq cmin,mix, (11) 10 2-нитрофенол 2-нитрофенол REFpk REFpk 3-нитрофенол 3-нитрофенол 8 4-нитрофенол 8 4-нитрофенол расчет расчет 6 4 0 10 20 30 40 50 60 0 10 20 30 40 50 60 ACN, % об.

ACN, % об.

а) б) Рис. 11. Значения параметра REFpk (ур-ние (10)) для водно-ацетонитрильных растворов фонового электролита (2.5 мМ Na2HPO4 + 7.5 мМ NaH2PO4, pH 6.5) для 2-, 3- и 4-нитрофенолов. Рабочее напряжение (а) 30 кВ (переменная скорость) и (б) варьируют так, что скорость электроосмотического потока постоянна (v = 8.9 см/мин), ввод пробы при 5 кВ, время ввода пробы 5–12.3 с (количество вводимой пробы постоянно), din = 75 мкм, Ltot = 71.6 см, Leff = 41.3 см, = 325 нм, = 95 Гц. Сплошная линия соответствует рассчитанным значениям REFth.

Пределы обнаружения мононитрофенолов и параметры SEpk для растворов фонового электролита с различным содержанием ацетонитрила в растворе представлены в табл. 7.

Выигрыш в чувствительности при термолинзовом детектировании для водно– ацетонитрильного раствора (70% об. ACN) относительно водного раствора фонового электролита составляет 6.5 раз, что является хорошей иллюстрацией предложенного подхода. Таким образом, использование водно–ацетонитрильных растворов фонового электролита вместо водных является эффективным способом повышения чувствительности термолинзового детектирования, так как несмотря на сопутствующий рост шума базовой линии, снижение пределов обнаружения составляет более чем полпорядка (70% об. ACN).

Таблица 7. Пределы обнаружения мононитрофенолов (107 М) и суммарное увеличение чувствительности термолинзовых измерений SEpk (ур-ние (11)) в растворах фонового электролита с различным содержанием ацетонитрила в растворе. Экспериментальные условия:

7.5 мМ NaH2PO4 + 2.5 мМ Na2HPO4 (pH 6.5), скорость потока 8.9 см/мин, ввод пробы при 5 кВ, время ввода 5–12.3 с (количество вводимых компонентов пробы постоянно), din = 75 мкм, Ltot = 71.6 см, Leff = 41.3 см, = 325 нм, = 95 Гц, n = 5, P = 0. 2-нитрофенол 3-нитрофенол 4-нитрофенол Ацетонитрил, % об.

cmin, M SEpk cmin, M SEpk cmin, M SEpk 0 65 1 66 1 17 10 52 1.3 45 1.5 12 1. 20 65 1 45 1 13 1. 30 35 1.9 27 2.4 8 2. 40 19 3.3 17 3.8 5 3. 50 16 4.0 17 3.8 4 4. 60 12 5.4 14 4.7 3.5 4. 70 10 6.5 10 6.6 2.7 6. Выводы 1. Предложено выражение, описывающее зависимость аппаратного сигнала от геометрических параметров оптической схемы термолинзового спектрометра (расстояния между перетяжкой зондирующего луча и центром капилляра, расстояния между капилляром и диафрагмой фотодетектора, конфокального расстояния зондирующего луча, размера диафрагмы фотодетектора, соотношения радиусов зондирующего и индуцирующего лучей в образце) при регистрации зондирующего излучения в ближней зоне и хорошо согласующееся с экспериментальными результатами для компактного прототипа термолинзового детектора для капиллярного электрофореза. Это выражение дает возможность теоретически подобрать параметры зондирующего излучения, соответствующие максимальной чувствительности скрещенно-лучевого термолинзового детектирования в капиллярах.

2. Рассчитаны характеристики термооптических элементов, формирующихся в воде, метаноле и ацетонитриле при использовании индуцирующего излучения с мощностью 50 мВт, размером луча, соответствующем измерениям в капилляре и частотой его прерывания 10 – 200 Гц. Полученные значения максимального роста температуры в образце за счет термооптического эффекта и амплитуды термооптически индуцированных колебаний температуры после достижения теплового равновесия свидетельствуют, что при значениях линейного коэффициента поглощения до 0.5 см–1 рост температуры за счет термолинзового эффекта не превышает нескольких кельвинов, и нагрев образца в общем случае не влечет за собой побочных химических процессов и снижения эффективности электрофоретического разделения. На основе этих расчетов выбран диапазон частот прерывания индуцирующего излучения 40 – 95 Гц, обеспечивающий максимальную чувствительность термолинзового детектирования в малом объеме в режиме реального времени.

3. Оптимизация геометрических параметров оптической схемы скрещенно-лучевого термолинзового детектора для капиллярного электрофореза позволила достичь пределов обнаружения модельных соединений (2-, 3- и 4-нитрофенолы) в водном растворе фонового электролита (фосфатный буферный раствор, pH 7.0, гидродинамический ввод пробы) 1 10–6 М, 1.6 10–6 М и 2.5 10–7 М, соответственно. Выигрыш в чувствительности по сравнению со спектрофотометрическим детектированием в аналогичных условиях разделения составляет 30 раз.

4. Показано, что в случае термолинзового детектирования в капилляре необходимость жесткой фокусировки лучей (до 10 мкм) позволяет использовать лазеры с мультимодовым составом в качестве источников индуцирующего излучения без потери точности измерений, что обеспечивает широкий набор рабочих длин волн термолинзового детектора и, следовательно, расширяет круг определяемых соединений.

5. Предложено объяснение зависимости чувствительности термолинзовых измерений от скорости среды в условиях электрофоретического разделения, учитывающее как изменение эффективной теплопроводности среды в условиях потока, так и остаточный нагрев в капилляре в конце цикла образования и диссипации термооптического элемента. На основе проведенных исследований определен диапазон скоростей потока, оптимальный для условий электрофоретического разделения (12 – 24 см/мин). Это обеспечивает выигрыш в чувствительности термолинзового детектирования по сравнению со статическими условиями более чем в два раза.

6. Показано, что в условиях электрофоретического разделения (наличие электроосмотического потока и формирование и диссипация термооптического элемента в условиях малого объема) изменение силы термооптического эффекта в средах, используемых в качестве растворов фонового электролита в капиллярных электромиграционных методах, несмотря на усложнение условий, не отличается от изменения силы термооптического эффекта, регистрируемого в больших объемах и статических условиях, при этом экспериментальные результаты хорошо согласуются с теоретическими расчетами. Это обеспечивает широкий выбор сред для термооптического детектирования в электромиграционных методах разделения, особенно в гибридных методах.

7. Предложены практические рекомендации по увеличению чувствительности термолинзового определения и эффективности электрофоретического разделения, которые включают использование водно–органических растворов фонового электролита вместо водной среды. Пределы обнаружения 2-, 3- и 4-нитрофенолов в водном растворе фонового электролита (фосфатный буферный раствор pH 6.5, электрокинетический ввод пробы) составляют 6.5 10–6 М, 6.6 10–6 М и 1.7 10– М, соответственно, а при замене растворителя на водно–ацетонитрильный раствор (3 : 7 об.) их значения снижены в 6.5 раз.

Основные результаты диссертации изложены в следующих работах:

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ в виде статей и тезисов докладов.

Статьи:

1. Бендрышева С.Н. Оптимизация инструментальных параметров термолинзового детектирования в капиллярном электрофорезе / С.Н. Бендрышева, Н.Ю. Рагозина, Д.А.

Недосекин, М.А. Проскурнин, У. Пюэль // Вестн. Моск. Ун-та. Сер. 2. Химия. – 2005. – Т. 46, № 6. – С. 411–417.

2. Proskurnin M.A. Optimization of instrumental parameters of a near-field thermal-lens detector for capillary electrophoresis / M.A. Proskurnin, S.N. Bendrysheva, N. Ragozina, S.

Heissler, W. Faubel, U. Pyell // Appl. Spectrosc. – 2005. – V. 59, N. 12. – P. 1470–1479.

3. Bendrysheva S.N. Sensitivity improvement in capillary electrophoresis using organo-aqueous separation buffers and thermal lens detection / S.N. Bendrysheva, M.A. Proskurnin, U. Pyell, W. Faubel // Anal. Bioanal. Chem. – 2006. – V. 385 – P. 1492–1503.

Тезисы докладов:

4. Bendrysheva S.N. Optimization of instrumental parameters of a near-field thermal-lens detector for capillary electrophoresis / S.N. Bendrysheva, S. Heissler, W. Faubel, U. Pyell, M.A. Proskurnin // “ANAKON 2003”, 2 – 5 April, 2003, Konstanz, Germany, Kurzreferate.

– S. 75.

5. Bendrysheva S. Sensitive detection in small volumes by near-field thermal lens detection: an alternative to LIF-detection for solutes with low fluorescence quantum yield / S.

Bendrysheva, W. Faubel, S. Heissler, M.A. Proskurnin, U. Pyell, N.Y. Ragozina // 17th International Symposium on Microscale Separations and Capillary Electrophoresis, February 8 – 12, 2004, Salzburg, Austria, Final Program & Book of Abstracts – P. 44 –45.

6. Proskurnin M.A. Photothermal detection strategies in HPLC and HPCE / M.A. Proskurnin, A.V. Pirogov, S.N. Bendrysheva, O.A. Shpigun // 17th International Symposium on Microscale Separations and Capillary Electrophoresis, February 8 – 12, 2004, Salzburg, Austria, Final Program & Book of Abstracts – P. 154–155.

7. Bendrysheva S.N. Optimization of instrumental parameters of a near-field thermal-lens detector for capillary electrophoresis / S.N. Bendrysheva, N.Y. Ragozina, S. Heissler, W. Faubel, U. Pyell, M.A. Proskurnin // 17th International Symposium on Microscale Separations and Capillary Electrophoresis, February 8 – 12, 2004, Salzburg, Austria, Final Program & Book of Abstracts – P. 157.

8. Bendrysheva S.N. The influence of the running buffer composition on the sensitivity of the thermal lens detection for capillary electrophoresis / S.N. Bendrysheva, W. Faubel, U. Pyell, M.A. Proskurnin // 17th International Symposium on Microscale Separations and Capillary Electrophoresis, February 8 – 12, 2004, Salzburg, Austria, Final Program & Book of Abstracts – P. 157–158.

9. Проскурнин М.А. Фотометрическое детектирование в ВЭЖХ и капиллярном электрофорезе / М.А. Проскурнин, С.Н. Бендрышева, А.В. Пирогов, О.А. Шпигун // Всероссийский симпозиум «Хроматография и хроматографические приборы», 15 – марта 2004, Москва, Тезисы докладов, С. 176.

10. Бендрышева С.Н. Оптимизация параметров термолинзового детектора для капиллярного электрофореза / С.Н. Бендрышева, Н.Ю. Рагозина, В. Фаубель, У. Пюэль, М.А. Проскурнин // Всероссийская конференция по аналитической химии "Аналитика России", 27.09 – 01.10 2004, Москва, Россия, Тезисы докладов, С. 283–284.

11. Бендрышева С.Н. Влияние состава буферного раствора на чувствительность термолинзового детектирования в капиллярном электрофорезе / С.Н. Бендрышева, В. Фаубель, У. Пюэль, М.А. Проскурнин // Всероссийская конференция по аналитической химии "Аналитика России", 27.09 – 01.10 2004, Москва, Россия, Тезисы докладов, С. 284–285.

12. Bendrysheva S.N. The specific features of the coupling of the capillary electrophoresis with thermal lens detector / S.N. Bendrysheva, W. Faubel, S. Heissler, D.A. Nedosekin, M.A.

Proskurnin, U. Pyell, N.Y. Ragozina // “ANAKON 2005”, 15 – 18 Mrz, 2005, Regensburg, Germany, Kurzreferate. – S. 78.

Бендрышева Светлана Николаевна Возможности термолинзового детектирования в капиллярном электрофорезе Автореф. дисс. на соискание учёной степени кандидата хим. наук.

Подписано в печать 10 октября 2007 г. Заказ № Формат 6090/16. Усл. печ. л. 1. Тираж 100 экз.

Копировальный центр ООО "Цифровичок" Москва, 101000, Большой Чудов пер. д. (495) 797-75-76, (495) 778-22-20;

http://www.cfr.ru/