Изучение субстратной специфичности пени циллинацилазы методами молекулярного моде лирования

На правах рукописи

СТРОГАНОВ ОЛЕГ ВАЛЕНТИНОВИЧ ИЗУЧЕНИЕ СУБСТРАТНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ ПЕНИ ЦИЛЛИНАЦИЛАЗЫ МЕТОДАМИ МОЛЕКУЛЯРНОГО МОДЕ ЛИРОВАНИЯ 02.00.15 - катализ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва - 2007

Работа выполнена на факультете Биоинженерии и биоинформатики Московского государствен ного университета имени М.В.Ломоносова

Научный консультант:

доктор химических наук, профессор Швядас Витаутас Юозапас-Каятоно Научный консультант:

кандидат химических наук Чилов Гермес Григорьевич

Официальные оппоненты:

доктор химических наук, профессор Немухин Александр Владимирович доктор химических наук, профессор Чувылкин Николай Дмитриевич

Ведущая организация:

Институт физиологически активных веществ РАН

Защита состоится «13 » ноября 2007 года в 1600 час на заседании диссертационного со вета Д 501.001.59 по химическим наукам при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ, Химический факультет, ка федра химической энзимологии, аудитория 202.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Химического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова Автореферат разослан 12 октября 2007 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук Сакодынская И.К.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Пенициллинацилаза (ПА) известна как фермент, исполь зуемый в производстве -лактамных антибиотиков. Научный интерес к ПА обу словлен уникальными каталитическими свойствами и механизмом катализа. На примере ПА из Escherichia coli (E.coli) показано, что фермент обладает широкой субстратной специфичностью и может быть использован для решения задач тонко го органического синтеза. Однако несмотря на обилие экспериментальных данных, описывающих каталитические свойства фермента, надежное понимание молеку лярного механизма фермент-субстратной специфичности до сих пор отсутствует.

Изучение ПА методами теоретической химии представляет значительный интерес, так как, с одной стороны, может дать важную информацию о молекулярных осно вах механизма действия ПА, и, с другой стороны, позволит использовать эту ин формацию для рационального дизайна фермента.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось использование методов молекулярного моделирования для решения следующих задач:

изучения конформационной лабильности ПА из E.coli;

исследования связывания субстрата в реакции гидролиза -лактамных антибиоти ков;

характеристики механизма связывания нуклеофила в реакции ацильного переноса на -лактамные нуклеофилы;

исследования субстратной специфичности ПА из E.coli и механизма хиральной дискриминации в ряду N-фенилацетильных производных аминокислот и их моди фицированных аналогов.

Научная новизна. Методоми молекулярной динамики (МД) впервые охарактеризо ваны конформационные изменения ПА и их влияние на механизм связывания суб стратов и каталитические свойства фермента. С помощью молекулярной динамики и молекулярного докинга обнаружен и охарактеризован продуктивный сайт связы вания пенициллина и впервые проведен анализ вклада положительно заряженных аминокислотных остатков в связывание субстрата. Предложена модель фермента тивного гидролиза -лактамных антибиотиков, учитывающая непродуктивное свя зывание и конформационную лабильность фермента на кинетические параметры реакции. Исследован механизм ацильного переноса на -лактамные нуклеофилы, катализируемого пенициллинацилазой, и выявлены факторы, влияющие на эффек тивность связывания нуклеофила, скорость превращения ацилфермента и накопле ние продуктов ацильного переноса. Впервые изучены особенности связывания энантиомеров N-фенилацетильных производных аминокислот и их модифициро ванных аналогов пенициллинацилазой. Охарактеризована роль заряженной группы и гидрофобного радикала в хиральной дискриминации энантиомеров субстрата.

Показана важность упорядоченной структуры растворителя для связывания поляр ных групп субстратов и альтернативных центров связывания для хиральной дис криминации субстратов. Полученные результаты позволили количественно пред сказать соотношение констант Михаэлиса для ферментативной реакции гидролиза энантиомеров.

Практическая значимость работы. С помощью методов молекулярного моделиро вания впервые реконструированы детали каталитического механизма синтеза и гидролиза -лактамных антибиотиков, без которых описание кинетики действия такого промышленно важного фермента, как ПА, является неполным. На основе разработанных молекулярных моделей предложен способ расчета кинетических параметров ферментативной реакции, позволяющий предсказывать эффективность связывания субстрата и его каталитического превращения. Разработанная методо логия молекулярного моделирования представляет возможность изучения суб стратной специфичности ПА in silico и является основой для рационального ди зайна ПА и других промышленных гидролаз.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на международ ных конференциях: 8-ой Школе В.А.Фока по квантовой и вычислительной химии, г. Н.Новгород, 2004 г., “Ломоносов-2004”, г. Москва, 2004 г., «Biomedical Engineer ing», Мюнхен, Германия, 2005 г., «Biocatalysis-2005 и «Biocatalysis-2007», г. Санкт Петербург, 2005 и 2007 гг., “Biotrans-2005. The Key to Industrial Biotechnology”, г.

Делфт, Нидерланды, 2005 г., "Биотехнология и медицина", Москва, 2006 г., Науч но-практической конференции «Живые системы» в рамках ФЦНТП «Исследова ния и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники 2002 – 2006 гг.», г. Москва, 2006 г., “Environmental Biocatalysis. From remediation with en zymes to novel green processes”, Кордоба, Испания, 2006 г., Международной школе молодых ученых «Theoretical Modeling of Ligand Binding and Enzyme Catalysis», Тромсе, Норвегия, 2005 г., Симпозиуме по сотрудничеству Европейского Союза и России в области биотехнологии, г. Суздаль, 2007 г., обсуждены на заседаниях кафедры химической энзимологии Химического факультета, семинарах отдела биокинетики НИИ Физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского и Фа культета Биоинженерии и Биоинформатики МГУ.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов и протоколов расчетов, результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 153 страницах машинописно го текста, содержит 34 таблицы, 7 схем и 75 рисунков.

Содержание работы Роль конформационной лабильности фермента в катализе и связывании суб стратов Исторически кристаллические структуры комплексов ПА с ингибиторами были разделены на два подмножества по наличию или отсутствию конформацион ного перехода боковых цепей остатков aR145 и aF1461. В так называемой «закры той» конформации гуанидиновая группа остатка aR145 связана с карбонильным кислородом остатка bF24 и гидроксильным кислородом bY31, а в открытой кон Done S. H., Brannigan J. A., Moody P. C. E., Hubbard R. E. Ligand induced conformational change in penicillin acylase.

J. Mol. Biol., 1998, 284:463- формации боковой радикал аргинина повернут в раствор. Изучение конформаци онной динамики спирального региона a143-a146 в траекториях, где наблюдались переходы между двумя конформациями подтверждает, что смещения боковых це пей остатков aR145 и aF146 является лишь частью более сложных структурных пе рестроек в активном центре фермента (рисунок 1). Влияние перехода из закрытой в открытую конформацию на связывание субстратов обусловлено тем, что остаток aF146 образует одну из стенок «гидрофобного кармана» - компактной гидрофоб ной области активного центра, в которой связывается ацильная часть субстрата.

Эта гидрофобная область соединена с раствором узким горлышком, которое имеет эллиптическую форму. В закрытой конформации фермента горлышко гидрофобно го кармана слишком узко чтобы позволить связаться ацильной части субстрата, однако при переходе фермента в открытую конформацию и смещении бокового радикала остатка aF146 главный диаметр увеличивается до 9, что достаточно для проникновения субстрата в гидрофобный карман.

A. Закрытая конформация Б. Открытая конформация bN241 bN bF bF оксианионный aS aS149 оксианионный центр центр bS bS гидрофобный гидрофобный карман карман -спираль aD -спираль aM142 bF bF24 aT aF aD aF aR aR Рисунок 1. Открытая (А) и закрытая (Б) конформации пенициллинацилазы.

Влияние перехода из закрытой в открытую конформацию на каталитические свойства фермента связано с системой конформационных переходов остатков aD148, aS149, bF71 и bN241. Смещение C-атома aF146 приводит к изменениям положения основной цепи остатков aS147-aS149, наиболее важным из которых яв ляется изменения угла остатка aD148 с 75 до 120. Этот конформационный пе реход освобождает дополнительное место для бокового радикала bF71, который смещается как целое, более плотно прижимаясь к спирали, что приводит к увели чению сольватно-доступной площади остатка оксианионного центра bN241, что дестабилизирует оксианионный центр как за счет изменения энергии водородных связей с карбонильным кислородом субстрата, так и за счет уменьшения времени их жизни. Таким образом, переход из открытой в закрытую конформацию ПА ока зывает существенное влияние на механизм проникновения субстратов в активный центр фермента, эффективность связывания и каталитическую активность: в от крытой конформации облегчено проникновение субстрата в активный центра, а в закрытой облегчен катализ как за счет лучшего связывания, так и за счет благо приятной геометрии. Поэтому для корректного моделирования и описания кинети ки ферментативной реакции необходимо учитывать обе конформации.

Параметризация силового поля для -лактамных субстратов Для того, чтобы проводить МД расчеты комплексов фермента с лактамными субстратами и нуклеофилами (рисунок 2) для исследуемых соедине ний были определены молекулярно-механические (ММ) параметры, согласован ные с силовым полем OPLS-AA.

O H2 N H2 N NH S S S CH CH N CH3 N N CH CH O O O O O - O O O бензилпенициллин 6-АПК 7-АДЦК O Рисунок 2. -лактамные лиганды, для которых проводилась ММ параметризация.

Наибольший интерес представляло описание торсионных барьеров при вра щении аминогруппы нуклеофилов и связи C-N для БП. Профиль энергии опреде лялся методами квантовой механики (КМ), затем подбирались ММ параметры со ответствующих двугранных углов с тем, чтобы зависимость энергии от угла пово рота воспроизводилась наиболее точно.

H 12 CH N C Энергия, ккал/моль Энергия, ккал/моль 10 CH N C N H 6 H O 5 C N O 6 БП 6-АПК 2 7-АДЦК 0 -120 0 120 240 0 120 240 угол поворота, угол поворота, Рисунок 3. Профиль энергии при вращении амидной группы и аминогруппы нуклеофилов во круг связи, соединяющей их с четырехчленным циклом -лактамного ядра.

КМ расчеты показали, что аминогруппа нуклеофилов и амидная связь пени циллина не может свободно вращаться вокруг связи C-N, соединяющей их с лактамным кольцом: на профиле энергии имеется четко выраженный минимум энергии (рисунок 3), а барьер вращения составляет 11.2 ккал/моль для БП, 6. ккал/моль для 6-АПК и 7.7 ккал/моль для 7-АДЦК. Жесткая взаимная ориентация реагирующей группы и -лактамной части молекулы существенно ограничивает область возможного расположения карбоксильной группы субстрата.

Локализация продуктивного центра связывания пенициллина Для локализации продуктивного центра связывания БП с ПА были использо ваны имеющиеся рентгеноструктурные модели комплекса Михаэлиса (рисунок 3) – модель ES1 (комплекс БП с неактивным мутантом bN241A1), модель ES2 (ком плекс медленно гидролизуемого субстрата сульфоксипенициллина с нативным ферментом2). Помимо этого для моделирования комплекса Михаэлиса были ис пользованы результаты докинга БП в активный центр фермента (модель ES3). Ста бильность каждого вероятного положения связывания БП оценивалась с помощью молекулярно-динамических траекторий.

A Б aR bN aF146 bR bS bS БП (ES1, 1fxv) bQ bA bN БП bS bA БП (ES2, 1gm9) aR гидрофобный БП (ES3, докинг) карман aF bR bN Рисунок 3. Связывание БП в активном центре - стартовые структуры (А) и среднее положе ние (Б).

В структуре 1FXV (прототип системы ES1) уходящая группа субстрата кон тактировала с остатками aF146 и bF71, и опиралась на пару остатков – aR145 и aF146 – которые при связывании субстрата переключались в открытую конформа цию. После замены bA241 обратно на Asn и старта МД, уходящая группа субстрата сместилась к противоположной стороне активного центра и сформировала контак ты с остатками bR263 и bN388. Однако вместо карбонильного кислорода субстрата оксианионный центр оказался занят кислородом O каталитического серина. 10 нс МД траектории ES1 не хватило, чтобы субстрат вытеснил серин из оксианионного центра, поэтому получить полностью продуктивное состояние стартовав со струк туры 1FXV не удалось.

В траекториях ES2 и ES3 уходящая группа субстрата (тиазолидиновое коль цо и карбоксильная группа) приняла одно и то же положение, что подтверждает стационарную природу найденного сайта связывания. Ацильная часть субстрата в Alkema W. B. L., Hensgens C. M. H., Kroezinga E. H., De Vries E., Floris R., Van der Laan J. M., Dijkstra B. W., Janssen D. B. Characterization of the beta-lactam binding site of penicillin acylase by structural and site-directed mutagenesis studies. Protein Eng., 2000, 13: 857-863.

McVey C.E., Walsh M.A., Dodson G.G., Wilson K.S., Brannigan J.A. Crystal structure of penicillin acylase enzyme substrate complex: structural insights into the catalytic mechanism. J. Mol. Biol., 2001, 313: 139-150.

моделях ES2 и ES3 удовлетворяла всем критериям предреакционного состояния.

Водородные связи карбонильного кислорода субстрата с остатками оксианионного центра присутствовали с заселенностями близкими к единице, карбонильный угле род субстрата и гидроксильная группа каталитического остатка bS1 находились в плотном Ван-дер-Ваальсовом контакте, и их взаимная ориентация подходила для нуклеофильной атаки в течение всей траектории. Аминогруппа bS1 удерживалась в состоянии благоприятном для переноса протона с помощью водородных связей с кислородами основной цепи остатков bN241 и bQ23.

В связывании уходящей группы субстрата заметную роль играют остаток bS386, который образует водородную связь с карбонильным кислородом четырех членного цикла, и остатки bR263, bN388, взаимодействующие с карбоксильной группой субстрата. Другой положительно заряженный остаток – aR145 – взаимо действует с БП опосредованно, через мостиковые молекулы воды.

Механизм связывания -лактамных антибиотиков и их производных Экспериментальное исследование роли положительного заряда в связывании -лактамных антибиотиков показало, что при удалении отрицательного заряда с БП (переходе от БП к его метиловому эфиру, БПMe) связывание субстрата ухудша ется. Аналогичное ухудшение связывания происходит при замене положительно заряженного aR145 на лейцин. Однако одновременное удаление зарядов с суб страта и фермента не приводит к существенному ухудшению связывания субстрата (таблица 1).

Таблица 1. Экспериментальные определенные значения кинетических параметров гидролиза -лактамных антибиотиков.

kcat, с- Субстрат KM, мкМ WT R145L WT R145L БП 4.0 17 42 БПМе 12 4.2 12 Молекулярно-динамическое исследование комплексов Михаэлиса для сис тем WT-БП, WT-БПМе, R145L-БП, R145L-БПМе показало, что удаление положи тельно заряженного остатка или замена карбоксильной группы на ее метиловый эфир не приводит к существенному изменению положения связывания субстрата.

Расчет свободной энергии связывания субстрата с ферментом с использованием эмпирической функции свободной энергии подтвердил, что учет только продук тивного связывания субстрата с закрытой конформацией фермента не позволяет объяснить экспериментальные соотношения энергий связывания субстратов.

Для учета влияния открытой конформации фермента на связывание субстра та были рассчитаны траектории продуктивных комплексов открытой конформации фермента с субстратом для систем WT-БП, WT-БПМе, R145L-БП, R145L-БПМе.

Сравнение траекторий закрытой и открытой конформаций фермент-субстратных комплексов показывает, что существенных различий в положениях субстрата и рассчитанных свободных энергиях связывания не наблюдается (таблица 2).

Таблица 2. Рассчитанные значения свободных энергий связывания БП и БПМе для открытой и закрытой конформаций нативного фермента и мутанта aR145L.

Субстрат Gbind, закрытая конформация, Gbind, открытая конформация, ккал/моль ккал/моль WT R145L WT R145L БП -7.3 -6.8 -7.9 -7. БПМе -7.2 -7.2 -7.5 -7. Для объяснения экспериментальных значений констант Михаэлиса кинети ческая схема ферментативной реакции была расширена за счет включения альтер нативных фермент-субстратных комплексов. Поиск альтернативных комплексов осуществлялся с помощью молекулярного докинга, отбирались те конформации, в которых положение молекулы субстрата существенно перекрывалось с положени ем субстрата в продуктивном центре связывания. Было обнаружено два типа аль тернативных комплексов: непродуктивные (рисунок 4Б) и предпродуктивные. Не продуктивные комплексы характеризовались связыванием карбоксильной группы субстрата или метилового эфира вблизи остатка a145, при этом бензольное кольцо субстрата связывалось в гидрофобной полости вблизи остатка bN388. В предпро дуктивных комплексах молекула субстрата связывалась в обратном положении:

бензольное кольцо контактировало с остатком a145, а метильная группа распола галась вблизи остатка bN388 (рисунок 4В).

А Б В Рисунок 4. Продуктивное (А), непродуктивное (Б) и предпродуктивное (В) связывание субст рата в активном центре ПА. Более темные области поверхности представляют положительно за ряженные остатки.

Включение в рассмотрение предпродуктивных и непродуктивных комплексов расширяет кинетическую схему ферментативной реакции:

KS,NP KS,PP KP kcat Схема 1. Кинетическая схема ESNP Eзакрытая + S ESPP ES EP ферментативного гидролиза лактамных антибиотиков, учиты KE вающая альтернативные сайты ' ' ' ' KS,PP KP kcat KS,NP связывания субстрата и конфор ' ' ' ES' ESNP Eоткрытая + S ESPP EP мацонные переходы ПА.

Исследование альтернативных центров связывания -лактамных субстратов показало, что наиболее стабильны непродуктивные комплексы WT-БП (поскольку в этом случае карбоксильная группа субстрата контактирует с положительно заря женным aR145) и предпродуктивные комплексы aR145L-БПМЕ (образование этого комплекса выгодно из-за взаимодействий метильной группы сложного эфира с гидрофобным участком поверхности фермента вблизи остатка N388 и гидрофоб ных взаимодействий бензольного кольца с остатком aL145). Молекулярно динамические расчеты позволяют также дать оценку отношения каталитических констант для исследованных систем. Для этой цели была использована статистика предреакционных состояний: рассчитывалось время жизни конформаций субстра та, удовлетворявших критериям предреакционного состояния. Критерии включали в себя наличие обеих водородных связей оксианионного центра, плотный Ван-дер Ваальсов контакт между атакующим и атакуемым атомами (гидроксильный кисло род O bS1 и карбонильный углерод амидной группы субстрата), близость угла нуклеофильной атаки к 90 (рисунок 5).

H Рисунок 5. Структурные критерии предреак bS1 O ционного состояния для фермент-субстратных 3.5 комплексов: наличие водородных связей ок сианионного центра, расстояние атаки 3.5, H-bN R угол нуклеофильной атаки 20.

O N H-bA Таблица 3. Рассчитанные и экспериментальные значения кинетических параметров фермента тивного гидролиза -лактамных антибиотиков.

kcat, с- Система KM, мкМ расчет эксперимент расчет эксперимент WT БП 4.1 4.0 35 R145L БП 16.3 17 20 WT БПМе 12 12 14 R145L БПМе 4.8 4.2 9.1 Результаты расчетов константы Михаэлиса согласуются с эксперименталь ными значениями (см. таблицу 3), что свидетельствует об адекватности предло женной модели связывания -лактамных субстратов с ферментом.

Изучение МД траекторий предпродуктивных фермент-субстратных комплек сов позволило предложить механизм проникновения субстрата в активный центр фермента. Представляется, что связывание субстрата проходит в несколько стадий.

На первом этапе субстрат связывается в предпродуктивном центре в открытой конформации фермента, при этом его карбоксильная группа образует водородную связь с остатком bN388, а карбонильный кислород четырехчленного цикла – с ос татком bR263 (рисунок 6А).

А Б В Рисунок 6. Последовательные стадии проникновения субстрата в активный центр фермента: об разование предпродуктивного комплекса (А) и переход в продуктивный комплекс (Б-В).

Через некоторое время происходит смещение боковых радикалов остатков bN388 и bR263, что, в свою очередь, приводит к смещению субстрата из предпродуктивно го центра связывания, причем фенилацетильная часть входит в гидрофобный кар ман. Далее происходит обратное смещение боковых радикалов остатков bN388 и bR263, при этом субстрат опускается в гидрофобный карман, заканчивая переход в продуктивный центр связывания (рисунок 6Б). Затем, по-видимому, происходит переход фермента в закрытую конформацию (рисунок 6В), так как именно в за крытой конформации облегчен каталитический акт.

Изучение связывания -лактамных нуклеофилов в активном центре пени циллинацилазы и влияния природы ацильной группы на нуклеофильность Был исследован механизм реакции ацильного переноса на -лактамные нук леофилы, катализируемой пенициллинацилазой (схема 2) P Схема 2. Кинетическая схема реакции k2 k Ks ацильного переноса, катализируемой ES EA E + P E+S + пенициллинацилазой. P – целевой про Nu дукт, P2 – продукт побочного гидролиза k ацилфермента, EA – ацилфермент, Nu – Kn нуклеофил, EANu – ацилфермент k4 Kp нуклеофильный комплекс EP EANu E+P k- Выход целевого продукта – -лактамного антибиотика – определяется соот ношением скоростей аминолиза и гидролиза ацилфермента, которые, в свою оче редь, зависят от константы связывания нуклеофила и констант скоростей гидроли за и аминолиза:

Vs = 0 n, где параметр нуклеофильности определяется как = k V 1 + 0 n h init k3 K n Методами молекулярного докинга и динамики были исследованы комплексы ацилфермент-нуклеофил, в которых нуклеофил – 6-АПК или 7-АДЦК продуктивно связывался с ацилированным ферментом, содержащим фенилацетилсерин (PAS) или фенилглицилсерин (PGS). Во всех изученных комплексах ацилфермент нуклеофил аминогруппа нуклеофила занимала строго определенное положение, образуя две водородные связи: одна из них с терминальным азотом ацилированно го серина, вторая – с карбонильным кислородом остатка bQ23. Эти водородные связи фиксировали аминогруппу нуклеофила в строго определенном положении, благоприятном для нуклеофильной атаки: неподеленная пара электронов амино группы обращена к атакуемому карбонильному углероду PAS или PGS, а водород ная связь аминогруппы остатка b1 делает возможным перенос протона от нуклео фила на терминальную аминогруппу b-цепи фермента (рисунок 7).

bR bS bQ Рисунок 7. Продуктивное связывание нуклеофи лов в активном центре ПА (на примере PAS). Мо PAS лекула 6-АПК показана светлым, 7-АДЦК – тем ным цветом.

7-АДЦК 6-АПК Жесткое закрепление аминогруппы двумя водородными связями накладыва ет ограничение на подвижность -лактамной части субстрата, поскольку КМ расчеты показали наличие ярко выраженного энергетического минимума на про филе энергии при повороте вокруг связи, соединяющей аминогруппу с 4-х член ным -лактамным кольцом в структуре нуклеофилов. Ограничение выражается в том, что продуктивной конформации соответствует только одно положение лактамного кольца и в этом положении карбонильный кислород -лактамного ядра нуклеофилов взаимодействует с bR263, а карбоксильная группа связывается с ос татком bS386.

Сравнение сайтов связывания -лактамного ядра в ацилфермент нуклеофильных комплексах 6-АПК и 7-АДЦК показывает, что молекула 7-АДЦК более комплементарна поверхности фермента: водородные связи карбоксильной группы 7-АДЦК с bS386 более прочны и стабильны, чем соответствующие водо родные связи 6-АПК, а карбоксильная группа располагалась значительно ближе к bR263 (таблица 3). Причиной этому является различие в ориентации карбоксиль ной группы относительно четырехчленного -лактамного кольца и аминогруппы: в молекуле 6-АПК карбоксильная группа расположена перпендикулярно плоскости четырехчленного кольца, а в молекуле 7-АДЦК карбоксильная группа лежит прак тически в плоскости кольца и поэтому может образовывать выгодные контакты с ферментом.

Таблица 4. Свободная энергия связывания и время жизни водородных связей нуклеофилов с ферментов в продуктивных комплексах ацилфермент-нуклеофил.

Система Gbind, Водородные связи -лактамной части субстрата COO- – bS386:Hg COO- – bS386:H ккал/моль C=O – bR 6-АПК, PAS -4.6 58 10 6-АПК, PAS -4.9 7-АДЦК, PAS -5.7 67 90 7-АДЦК, PAS -5.8 97 86 Для изучения влияния ацильной группы на нуклеофильность были рассчита ны траектории свободных ацилферментов PAS и PGS в воде. Молекулярная дина мика показала, что введение дополнительного заместителя при переходе от PAS к PGS приводит к дестабилизации закрытой конформации фермента. При переходе к открытой конформации сольватно-доступная площадь остатка bN241, входящего в оксианионный центр ПА, увеличивается. В случае комплексов ацилфермент нуклеофил или фермент-субстрат увеличение сольватно-доступной площади не приводит к значительным последствиям, поскольку молекула лиганда, связанная в продуктивном сайте, экранирует оксианионный центр от растворителя. Однако в свободном ацилферменте увеличение доступности bN241 приводит к ослаблению водородных связей с bR263, удерживающий bN241 в оксианионном центре из-за конкуренции со стороны молекул воды. Поэтому в траектории PGS из-за открытия конформации фермента оксианионный центр был дестабилизирован и периодиче ски обратимо разрушался (рисунок 6).

bF71 bF aF146 aF bA69 bA bN241 bN PAS PAS PGS PGS bQ23 bQ bQ23 bQ Рисунок 6. Стереоизображение конформаций PGS и PAS ацилфермента.

H NH2 Рисунок 7. Критерии предреакционной конформации для H O нуклеофильной атаки молекулы воды: наличие водородных bS 3.5 связей оксианионного центра и водородной связи молекулы воды с аминогруппой bS1, расстояние атаки 3.5, угол H-bN R нуклеофильной атаки O N H-bA Можно предположить, что именно дестабилизация оксианионного центра свободного ацилфермента ответственна за увеличения соотношения амино лиз/гидролиз при переходе от PAS к PGS: разрушение оксианионного центра ведет к уменьшению времени жизни предреакционных конформаций молекул воды (ри сунок с водой) и, следовательно, к уменьшению скорости гидролиза ацилфермента.

Расчетные значения параметра нуклеофильности 0 для систем PAS, PGS и 6-АПК, 7-АДЦК, основанные на статистическом анализе near attack conformation (NAC), показали хорошее согласование с экспериментальными величинами (таблица 5).

G EAN k4 0 = ;

k4 = constEANNACEAN;

k3 = constEANACEA;

K n = e RT k3 K n Таблица 5. Свободная энергия связывания и статистика предреакционных состояний для иссле дованных систем. Сравнение экспериментальных и расчетных значений параметра 0.

нуклеофильность 0, M- ацильный Gbind, нуклеофил NACEAN, % NACEA, % донор ккал/моль расчет эксперимент 6-АПК -4.6 38 - PAS 7-АДЦК -5.7 24 58 6-АПК -4.9 42 69 PGS 7-АДЦК -5.7 45 300 Изучение субстратной специфичности и хиральной дискриминации в реак циях гидролиза N-фенилацетильных производных аминокислот и их модифи цированных аналогов Способность энантиоселективно гидролизовать N-фенилацетильные произ водные аминокислот и их модифицированных аналогов является одним из наибо лее интересных и практически важных каталитических свойств фермента. В зави симости от наличия или отсутствия отрицательно заряженной группы в субстра тах, а также от природы бокового радикала энантиоселективность и связывание может меняться в широких пределах. В работе было проведено молекулярное мо делирование связывания энантиомерных субстратов в активном центре фермента, которое позволило выяснить роль бокового радикала и полярной группы в хираль ной дискриминации. Простейшая схема реакции без учета конформационной ла бильности фермента и непродуктивного связывания субстратов подразумевает, что константа Михаэлиса непосредственно связана с константой диссоциации продук тивных комплексов:

Gbind KM KS = e RT Различия в связывании L- и D-энантиомеров субстратов обусловлены тремя факторами:

- различием в положении ацильной части и гидролизуемой амидной группы - различным положением бокового радикала субстратов, - различиями в положении карбоксильной группы субстратов.

Анализ молекулярно-динамических траекторий взаимодействия N фенилацетильных производных аминокислот и их модифицированных аналогов с ферментом показал, что ацильная часть субстрата связывается в гидрофобном кар мане одинаково прочно как для L- так и для D-энантиомеров. Для изучения влия ния карбоксильной группы на энантиоселективность ПА был исследован механизм связывания в активном центре ряда модифицированных аналогов N-Phac-Ala, в ко торых карбоксильная группа заменена на гидроксильную (N-Phac-AlaOH), метило вый эфир (N-Phac-AlaOMe) и фосфоновую группу (N-Phac-AlaPO3).

При изучении продуктивной конформации L-энантиомера N-Phac-Ala выяс нилось, что карбоксильная группа субстрата непосредственно не контактирует ни с одним положительно заряженным остатком активного центра. Сравнение ком плексов Михаэлиса L- и D-энантиомеров показывает, что положение карбоксиль ной группы D- и L-энантиомеров N-Phac-Ala отличается незначительно. Карбок сильная группа D-энантиомера расположена на расстоянии 7.4 от bR263, и 7. от aR145;

для L-энантиомера эти расстояния равны 6.7 и 8.2, соответственно (ри сунок 8).

bN bN241 bR bR bF71 bF N-Phac-L-Ala N-Phac-D-Ala bS bS aR145 aR Рисунок 8. Продуктивные конформации комплексов L- и D-энантиомеров N-Phac-Ala с ПА Столь малое различие в положении карбоксильной группы L- и D энантиомеров N-Phac-Ala относительно aR145 и aR263 приводит к тому, что элек тростатическое взаимодействие карбоксильной группы -аминокислот с положи тельно заряженными остатками пенициллинацилазы не играет существенной роли в хиральной дискриминации субстратов. Этот вывод косвенно подтверждается экспериментальными данными по энантиоселективности гидролиза N-Phac производных фосфонового аналога аланина1, соотношение констант Михаэлиса D и L-энантиомеров которого (KM,D/KM,L = 72) не сильно отличается от соотношения для N-Phac-Ala (KM,D/KM,L = 70), хотя при pH 7.5 значительная часть N-Phac-AlaPO должна находиться в полностью ионизированном состоянии с зарядом -2. Таким образом, наличие отрицательно заряженной группы в субстрате само по себе вно сит значительный вклад в соотношение констант связывания энантиомеров, кото Мироненко Д.А., Козлова Е.В., Швядас В.К., Солоденко В.А., Кашева Т.Н., Кухарь В.П. Кинетические закономер ности и энантиоселективность действия пенициллинацилазы в реакциях гидролиза N-фенилацетильных производ ных 1-аминоэтилфосфоновой кислоты и ее эфиров. Биохимия. 1990, 55(6), 1124-1131.

рый, однако, практически не связан с электростатическим взаимодействием с близлежащими положительно заряженными остатками фермента.

Детальное изучение молекулярно-динамической траектории N-Phac-Ala по казало, что карбоксильная группа связана с полярными остатками фермента систе мой консервативных мостиковых молекул воды (рисунок 9). Эти молекулы воды осуществляют эстафетную передачу водородных связей с bR263, bS386 и bQ23 на карбоксильную группу субстрата и обладают чрезвычайно низкой скоростью об мена с окружающим раствором: в среднем один обмен происходит за 300-1000 пс.

bR bN Рисунок 9. Система консервативных мостико вых молекул воды между L-энантиомером N bS Phac-Ala и ферментом.

N-Phac-L-Ala bQ В отличие от L-энантиомера, D-энантиомер не взаимодействовал с фермен том с помощью эстафетной передачи водородных связей: образованию стабильных водяных мостиков не происходило из-за того, что между полярными остатками фермента и карбоксильной группой располагался боковой радикал. Сравнение свя зывания модифицированных аналогов аланина показало, что при удалении отрица тельного заряда, во-первых, исчезают мостиковые молекулы воды, и, во-вторых, меняется положение полярной группы D-энантиомеров, которая начинает связы ваться вблизи остатка bF71, реализуя тем самым классическую трехточечную мо дель связывания энантиомерных субстратов. Комплексы Михаэлиса для фосфоно вого аналога аланина, напротив, не сильно отличались от продуктивных комплек сов N-Phac-Ala.

Таким образом, роль карбоксильной группы в хиральной дискриминации энантиомеров N-фенилацетильных производных -аминокислот на этапе связыва ния заключается в организации системы из консервативных мостиковых молекул воды, эстафетно передающих водородные связи на субстрат.

Для изучения специфичности участка связывания бокового радикала в ак тивном центре фермента были рассчитаны траектории комплексов Михаэлиса L- и D-энантиомеров N-фенилацетильных производных лейцина, изолейцина, валина, фенилаланина и фенилглицина. Во всех исследованных комплексах боковой ради кал L-энантиомера связывается в гидрофобной области, образованной остатками bF71 и bF256. Позиция карбоксильной группы для L-энантиомеров зависит от объ ема и разветвленности бокового радикала. Если боковой радикал не имеет разветв лений при C-атоме (N-Phac-Phe, N-Phac-Leu) карбоксильная группа взаимодейст вует с ферментом через систему мостиковых молекул воды. В тех случаях, когда боковой радикал имеет разветвление при C-атоме (N-Phac-Phg, N-Phac-Ile, N-Phac Val), карбоксильная группа образует непосредственную водородную связь с bR (рисунок 10), поскольку иное положение привело бы к перекрыванию C-атомов бокового радикала субстрата с бензольным кольцом bF71.

bF bF71 bR bR N-Phac-D-Leu N-Phac-L-Leu bF71 bF bR263 bR N-Phac-L-Phg N-Phac-D-Phg Рисунок 10. Продуктивное связывание L- и D-энантиомеров N-Phac-Leu и N-Phac-Phg.

Объем бокового радикала важен и для связывания D-энантиомеров N фенилацетильных производных аминокислот. Гидрофобный боковой радикал D энантиомеров контактирует с остатками bR263, bN388 и bS386. Для N-Phac-D-Phe и N-Phac-D-Val связывание происходит без стерических затруднений, и карбок сильная группа занимает то же положение, что и в случае N-Phac-D-Ala. Однако уже для N-Phac-Leu боковой радикал субстрата периодически выталкивает амид ную группу из оксианионного центра, при этом карбоксильная группа разворачи вается в сторону bF71. Размещение бокового радикала N-Phac-D-Ile еще более не выгодно и приводит к искажению взаимной ориентации взаимодействующих ато мов субстрата и фермента. N-Phac-Phg является самым неудобным в исследован ном ряду: в ходе МД траектории субстрат практически полностью покинул про дуктивную конформацию, карбонильный кислород амидной группы вышел из ок сианионного центра, а карбонильный углерод большую часть времени проводил на расстоянии, значительно превышающем пороговое значение для нуклеофильной атаки.

Удаление карбоксильной группы на одно метиленовое звено при переходе от L-Phg к L--Phe ведет к тому, что карбоксильная группа начинает взаимодейство вать непосредственно с положительно заряженным bR263. Вероятно, такое взаи модействие имеет место для всех L-форм -аминокислот, поскольку в большинстве изученных продуктивных конформаций L-энантиомеров -аминокислот карбок сильная группа располагалась на расстоянии 5-6 от bR263. Переход от - к аминокислотам в корне меняет связывание D-энантиомера субстрата, карбоксиль ная группа которого теперь также способна образовывать солевой мостик с bR (рисунок 11). Сравнение продуктивных конформаций L- и D--Phe показывает, что у обоих энантиомеров сайты связывания бокового радикала и карбоксильной группы схожи. Различие в сайтах связывания двух энантиомеров заключается в том, что гидролизуемая амидная группа D-энантиомера выходит из оксианионного центра, что ведет к значительному ухудшению предреакционных статистик. Кроме того, в МД траектории L-энантиомера присутствовали водяные мостики с bQ23. В траектории N-Phac-D--Phe эти водяные мостики образоваться не могли, так как вода была вытеснена C-атомом -Phe.

bF71 bR bF bR N-Phac-D--Phe N-Phac-L--Phe Рисунок 11. Продуктивное связывание L- и D-энантиомеров N-Phac--Phe.

bF71 bR bR bF N-Phac-L-Asp N-Phac-D-Asp Рисунок 12. Продуктивное связывание L- и D-энантиомеров N-Phac--Asp.

N-фенилацетил-аспарагиновая кислота является интересным примером для исследования механизма хиральной дискриминации фенилацетильных производ ных -аминокислот, поскольку химическое строение этого субстрата таково, что его D-энантиомер напоминает -аминокислоту, и, вероятнее всего, должен связы ваться в активном центре схожим образом. Экспериментальные данные говорят о том, что соотношение KM,D/KM,L обращено по сравнению с остальными исследо ванными -аминокислотами и составляет 0.36. Однако обращения суммарного зна чения энантиоселективности не наблюдается, поскольку соотношение каталитиче ских констант необычайно высоко (300). Молекулярная динамика показала, что в продуктивных комплексах N-Phac-Asp реализуется классическая трехточечная мо дель связывания энантиомеров субстратов (рисунок 12). Карбоксильная группа L энантиомера связывается в том же месте, что и N-Phac-L-Ala, и взаимодействует с полярными остатками активного центра фермента посредством водяных мостиков.

Карбоксильная группа бокового радикала N-Phаc-L-Asp контактирует с остатком bF71, но в большей степени экспонирована в раствор. Комплекс Михаэлиса D энантиомера действительно напоминает сайт связывания N-Phac-L--Phe: карбок сильная группа бокового радикала N-Phac-D-Asp образовывает водородные связи с bR263 и bS386. Прочный солевой мостик с bR263 по всей видимости является ос новной причиной столь прочного связывания D-энантиомера и обращения отно шений констант Михаэлиса D- и L-энантиомеров. Однако такое размещение боко вого радикала D-энантиомера N-Phac-Asp приводит к тому, что карбонильный ки слород гидролизуемой амидной связи ослабляет взаимодействие с оксианионным центром, и ориентация взаимодействующих атомов искажается, что ведет к значи тельному ухудшению статистики предреакционных состояний по сравнению с L энантиомером.

Построенная модель связывания энантиомеров N-фенилацетильных произ водных аминокислот и их модифицированных аналогов позволяет объяснить каче ственные закономерности хиральной дискриминации субстратов и предсказать от ношения констант Михаэлиса L- и D-энантиомеров. Однако некоторые экспери ментальные данные по связыванию хиральных субстратов нуждаются в дополни тельном анализе. Наиболее резкие расхождения рассчитанных и эксперименталь ных отношений констант Михаэлиса наблюдались для N-Phac-Phg: молекулярно динамическое изучение продуктивного связывания и расчет свободной энергии с помощью эмпирической скоринговой функции показали, что D-форма N-Phac-Phg связывается почти на 2 ккал/моль хуже, чем L-энантиомер. Однако эксперимен тальные данные свидетельствуют, что отношение констант Михаэлиса D- и L энантиомеров является самым низким в ряду N-фенилацетильных производных аминокислот и составляет 1.9.

Объяснение недооценки энергии связывания D-энантиомера появляется при рассмотрении альтернативных сайтов связывания N-фенилацетильных производ ных аминокислот. Связывание субстратов за пределами активного центра ПА ха рактерно для всего ряда исследованных соединений. Однако непродуктивные и предпродуктивные конформации, найденные в ходе исчерпывающего докинга N фенилацетильных производных гидрофобных алифатических аминокислот харак теризовались низкими энергиями связывания и не могли существенно повлиять на хиральную дискриминацию энантиомерных субстратов. Ситуация радикально ме няется при переходе от разветвленных алифатических аминокислот к аминокисло там с ароматическим боковым радикалом (N-Phac-Phe, N-Phac-Phg, N-Phac--Phe).

Анализ результатов докинга показывает, что помимо продуктивной конформации субстрата в активном центре значительной энергией обладают так называемые «обращенные» непродуктивные конформации, в которых боковой радикал амино кислоты погружен в гидрофобный карман ПА, а карбоксильная группа занимает место в оксианионном центре (рисунок 13).

N-Phac-L-Phg N-Phac-D-Phg Рисунок 13. Обращенная непродуктивная конформация L- и D-энантиомеров N-Phac-Phg Таблица 6. Рассчитанные и экспериментальные значения констант Михаэлиса для энантиомеров N-фенилацетильных производных аминокислот и их модифицированных аналогов.

расчет эксперимент K M,D K M,D Система Gbind lg KM KM, M lg KM K M,L K M,L L -4.8 -3.47 13 -4. 5.7 Ala D -3.8 -2.72 910 -3. L -4.2 -3. 4. Ala-OMe D -3.3 -2. L -3.4 -2. 1. Ala-OH D -3.2 -2. L -4.2 -3.02 37.5 -4. 0.94 Ala-PO D -4.2 -3.05 2700 -2. L -6.5 -4.68 1.5 -5. 3.9 Phe D -5.6 -4.08 340 -3. -6. L (-4.7) -4.74 17 -4. 12.8 1. Phg D -3.7 -3.63 33 -4. (-5.1) L -6.2 -4.50 14 -4. 1.6 -Phe D -5.9 -4.29 280 -3. L -3.2 -2. 0. PEA D -3.4 -2.44 54 -4. L -7.1 -5. Ile D -4.6 -3. L -6.9 -4.99 12 -4. 95 Val D -4.2 -3.01 2700 -2. L -6.0 -4.31 31 -4. 44 Leu D -3.7 -2.67 4600 -2. L -7.6 -5.52 110 -3. 58.3 Arg D -5.2 -3.75 3400 -2. L -5.5 -3.97 230 -3. 0.07 0. Asp D -7.1 -5.11 83 -4. В скобках даны энергии связывания в обращенной конформации 1. Arg log(KM,D/KM,L), расчет Phg Val Leu Ala Phe Рисунок 14. Сравнение рассчитанных и экс AlaPO 0. -Phe периментальных соотношений KM,D/KM,L.

Сплошная линия соответствует прямой y=x.

-1 -0.5 0 1 2 Asp -1. log(KM,D/KM,L), эксперимент Наиболее высокие энергии связывания, предсказанные для обращенных комплексов в ходе докинга, наблюдались в случае N-Phac-Phg, поскольку в этом соединении карбоксильная группа способна связываться в оксианионном центре, не создавая стерических затруднений для размещения бензольного кольца боково го радикала в гидрофобном кармане. Для L- и D-энантиомеров N-Phac-Phg были рассчитаны траектории обращенных комплексов в открытой и закрытой конфор мациях фермента. Обращенное связывание L-энантиомера фенилглицина ослож нено стерически: размещение карбоксильной группы в оксианионном центре ведет к перекрыванию алифатического атома ацильной группы с остатком aF146. Поэто му обращенная конформация N-Phac-L-Phg гораздо менее выгодна по сравнению с комплексом Михаэлиса. Обращенные комплексы D-энантиомера N-Phac-Phg ока зались более прочны, поскольку перекрывание бокового радикала субстрата с ос татком aF146 не происходит. Для размещения бокового радикала N-Phac-D-Phg необходимо, чтобы aR145 перестал контактировать с bF24, поэтому прочное не продуктивное связывание D-энантиомеров возможно только в открытой конфор мации фермента. Расчеты свободной энергии связывания показали, что обращен ная конформация D-Phg превосходит по прочности продуктивный комплекс и по этому вносит основной вклад в величину константы Михаэлиса. Учет обращенных конформаций субстратов позволил улучшить согласование рассчитанных значений констант Михаэлиса с экспериментальными значениями (таблица 6, рисунок 14).

Выводы 1. Установлена роль открытой и закрытой конформаций ПА из E.coli в каталити ческом механизме фермента: в открытой конформации фермента облегчено связывание субстрата, в закрытой – протекание реакции.

2. В образование продуктивного комплекса ПА с БП и БПМЕ основной вклад вносят взаимодействия с остатками гидрофобного кармана, водородные связи амидной группы субстрата с остатками оксианионного центра, а также водо родные связи карбонильного кислорода -лактамного кольца с bR263 и bN388.

3. Обнаружены предпродуктивный и непродуктивный сайты связывания БП и БПМe, находящиеся за пределами активного центра ПА;

энергия связывания субстрата в этих сайтах сопоставимыма с энергией продуктивного связывания.

Учет этих комплексов необходим для количественного описания кинетики ферментативного гидролиза -лактамных антибиотиков.

4. Основной вклад в продуктивное связывание нуклеофилов с ацилферментом вносят взаимодействия с остатками bR263 и bS386. Повышенная нуклеофиль ность 7-АДЦК по сравнению с 6-АПК достигается за счет энергетически более выгодного взаимодействия с ферментом.

5. Изменение реакционной способности нуклеофилов в реакциях ацильного пе реноса от различных доноров ацильной группы (D-фенилглицинамида и фе нилацетамида) обусловлено конформационным равновесием между открытой и закрытой формами ацилфермента: в открытой форме оксианионный центр менее устойчив, что приводит к снижению вероятности гидролиза при исполь зовании D-фенилглицинамида как донора ацильной части.

6. Карбоксильная группа L-стереоизомеров N-фенилацетильных производных аминокислот образует прочные контакты с остатками bR263 и bQ23 посредст вом мостиковых молекул воды, которые играют определяющую роль в хи ральной дискриминации отрицательно заряженных субстратов.

7. В связывание бокового радикала L-энантиомера субстрата основной вклад вносят остатки bF71 и aF146;

мутации по данным остаткам наиболее перспек тивны для получения новых стереоселективных биокатализаторов. Связыва ние бокового радикала D-энантиомеров происходит менее специфично.

8. Для количественной интерпретации стереоселективности ПА в отношении N-фенилацетильных производных ароматических аминокислот необходим учет непродуктивного связывания субстратов.

Список публикаций по теме диссертации 1. Stroganov O.V., Chilov G.G., vedas V.K. Force field parametrization for 6-aminopenicillanic acid. J. Mol.Structure:THEOCHEM, 2003, V. 631. p. 117-125.

2. Г.Г. Чилов, О.В. Строганов, В.К. Швядас. Изучение связывания субстратов в активном центре пенициллинацилазы методами молекулярного моделирова ния. Биохимия, 2007, BM 07-204, опубликовано на сайте журнала 17 октября 2007 г. http://protein.bio.msu.ru/biokhimiya/inpress/index.html 3. Чилов Г.Г., Строганов О.В., Новиков Ф.Н., Стройлов В.С., Швядас В.К. Ра циональный дизайн биокатализаторов для фармацевтики и биотехнологии.

Международная конференция «Биологические мишени для действия лекарст венных препаратов нового поколения. Перспективы интеграции российских ученых в международную кооперацию», Москва, 28-30 марта 2006 г., стр. 66- 4. Chilov G.G., Stroganov O.V., vedas V.K. Combined molecular docking and molecular dynamical studies of the substrate binding in the active site of penicillin acylase, Materials of International Conference “Biotrans-2005. The Key to Industrial Biotechnology”, Delft, The Netherlands, 2005, p. 5. Chilov G.G., Stroganov O.V., vedas V.K. Combined molecular docking and molecular dynamical studies of the substrate binding in the active site of penicillin acylase. Abstracts of International Conference «Biocatalysis 2005. Fundamentals and Applications», St.Petersburg, Russian Federation, 2005, p. 6. Строганов О.В., Чилов Г.Г., Швядас В.К. Изучение участка связывания нук леофила в активном центре пенициллинацилазы из E.coli методами молеку лярного моделирования. Материалы XI международной конференции студен тов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2004», издательство Москов ского университета, Москва, 2004, т. 1, стр. 7. Chilov G.G., Stroganov O.V., vedas V.K. Substrate binding in the active site of penicillin acylase: molecular dynamical studies. 8-th Session of the V.A.Fock School on Quantum and Computational Chemistry, 2004, V.Novgorod, Russia,

Abstract

1021.

8. Шошина Н.В. Новиков Ф.Н., Строганов О.В. Молекулярное моделирование энантиоселективности пенициллинацилазы в реакциях гидролиза ацильных производных аминокислот. Материалы международной конференции студен тов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007», издательство Москов ского университета, Москва, 2007, т. 1, стр. 9. Stroganov O.V., Novikov F.N., Shoshina N.V., Chilov G.G., vedas V.K.. Molecu lar modeling of enantioselectivity of penicillin acylase. Abstacts of International Conference “Biocatalysis 2007. Fundamentals and Applications”, Moscow St.Petersburg, Russian Federation, p.130-131.

Список сокращений и обозначений пенициллинацилаза ПА бензилпенициллин БП Ме метиловый эфир бензилпенициллина БП 6-АПК 6-аминопенициллановая кислота 7-АДЦК 7-аминодезацетоксицефалоспорановая кислота фенилацетилсерин PAS фенилглицилсерин PGS N-Phac- N-фенилацетил фенилглицин Phg молекулярная динамика МД молекулярная механика ММ квантовая механика КМ