Эритроцитарные и тромбоцитарные показатели периферической крови испытуемых в условиях, моделирующих микрогравитацию и гипокинезию
На правах рукописи
ЧАНИЕВА МАРЕМ ИСРОПИЛОВНА ЭРИТРОЦИТАРНЫЕ И ТРОМБОЦИТАРНЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ИСПЫТУЕМЫХ В УСЛОВИЯХ, МОДЕЛИРУЮЩИХ МИКРОГРАВИТАЦИЮ И ГИПОКИНЕЗИЮ 14.01.21 - гематология и переливание крови
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук
Москва 2012
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Гематологический научный центр» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации и в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Государственный научный центр РФ – Институт медико-биологических проблем Российской академии наук Научные руководители:
доктор медицинских наук, Погорелов Валерий Михайлович профессор кандидат медицинских наук Скедина Марина Анатольевна
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук Ковалева Лидия Григорьевна профессор главный научный сотрудник научно-поликлинического амбулаторно-клинического отделения ФГБУ ГНЦ МЗСР РФ доктор медицинских наук Чернов Вениамин Михайлович профессор зам. директора Федерального государственного бюджетного учреждения «Федеральный научно-клинический центр детской гематологии,онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева» Минздравсоцразвития России
Ведущая организация:
Филиал Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И. Пирогова МЗСР РФ «Научно-клинический центр геронтологии»
Защита диссертации состоится « » 2012 года в часов на заседании диссертационного совета Д 208.135.01 при ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздравсоцразвития России по адресу: 125167, Москва, Новый Зыковский проезд, дом
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «Гематологический научный центр» Минздравсоцразвития России Автореферат разослан «»_ 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук Зыбунова Е.Е.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы исследования Для оценки состояния здоровья космонавтов, совершающих длительные космические полеты, значительный интерес представляет исследование крови, как системы, объединяющей работу всех функциональных систем организма.
Длительные исследования морфологической картины крови в условиях космических полетов свидетельствуют о наличии некоторых отклонений в системе красной крови. Эти отклонения проявляются в уменьшении количества эритроцитов, ретикулоцитов, гемоглобина и величины гематокрита, изменении морфологических и морфометрических характеристик эритроцитов, восстановление которых после полета зависит от продолжительности космического полета.
Установленные закономерности «реагирования» на невесомость оказались настолько устойчивыми, что позволили в 1981 году ввести понятие «Адаптационный эритроцитопенический синдром невесомости» [В.И Легеньков и соавт., 1981]. В зарубежной литературе синдром известен как «Космическая анемия» [Planel, 2004]. Этиология снижения количества эритроцитов в организме многофакторна. Если причиной «Адаптационного эритроцитопенического синдрома невесомости» («Космической анемии») является невесомость, то его развитие может быть результатом увеличенной гибели эритроцитов, или результатом уменьшения их продукции. Проведение экспериментов с моделированием физиологических эффектов невесомости на земле несовершенно. Однако в экспериментах можно моделировать отдельные эффекты невесомости (ортостатическая неустойчивость, снижение физической работоспособности, уменьшение потока информации, общения и др.).
Проведенные модельные эксперименты и исследования в космосе демонстрируют, что анемия в условиях невесомости, скорее всего, возникает вследствие сниженной продукции эритроцитов костным мозгом космонавтов. Сверхчувствительные радиоиммунные методы определяют низкий уровень секреции эритропоэтина уже к 24 часу полета в космосе [П.А.
Коржуев, 1963;
В.И. Легеньков,1993]. Утрата гормональной стимуляции влечет за собой снижение пролиферативной активности в эритроне, гибели клеток и соответственно к редукции эритропоэза. В периферической крови космонавтов появляются эритроциты измененной формы – эхиноциты, сфероциты, мишеневидные эритроциты [В.И. Легеньков, 1975,1991;
В.В. Поляков, 1998].
Недавние исследования Alfrey и его исследовательской группы [2000г.] показали, что снижение количества эритроцитов при космической анемии происходит не только из-за уменьшения продукции эритроцитов, но также из-за повышенной деструкции молодых представителей этих клеток – неоцитолиза.
Считается, что гормональные факторы регуляции эритро- и тромбоцитопоэза – эритро- и тромбопоэтин, имеют сходную структуру. Однако, неизвестно, сопровождается ли адаптационный эритроцитопенический синдром невесомости изменениями тромбоцитов.
Следует отметить, что работ посвященных изучению тромбоцитов в модельных экспериментах и при проведении тренировок в ходе профессиональной подготовки космонавтов к космическому полету к настоящему времени немного. А данные о динамике тромбоцитарных параметров во время полетов отсутствуют, что связано с трудностью проведения исследований на борту космических станций.
Все это делает актуальным продолжение изучения количественного и качественного состояния показателей красной крови, а также тромбоцитарных параметров периферической крови при подготовке космонавтов к длительным межпланетным перелетам и позволяет обозначить цель и задачи настоящего исследования.
Цель исследования – определить особенности эритроцитов и тромбоцитов периферической крови у испытуемых в условиях, моделирующих микрогравитацию и гипокинезию.
Задачи исследования:
1. Оценить морфологические особенности эритроцитов, циркулирующих в периферической крови испытуемых, используя стандартную пробоподготовку и анализатор клеточного изображения.
2. На основе геометрических параметров клеток создать эритроцитограмму – современную систему учета нормальных и дегенеративных форм эритроцитов.
3. Провести сравнительный анализ гематологических показателей испытуемых на приборе SYSMEX XE 2100 в динамике модельных экспериментов.
4. Уточнить место тромбоцитарных параметров в комплексной оценке влияния микрогравитации и гипокинезии на организм испытуемых в модельных экспериментах.
Научная новизна Получены новые данные о вкладе изменений в периферическом отделе эритрона (количественная характеристика показателей красной крови, объективная оценка морфологии эритроцитов) и впервые изучены тромбоцитарные параметры периферической крови испытуемых в ходе экспериментов, моделирующих условия микрогравитации и гипокинезии и в периоде реадаптации.
Во всех моделирующих микрогравитацию и гипокинезию экспериментах показано, что параметры эритроцитов и тромбоцитов периферической крови испытуемых не выходят за пределы нормальных значений, а их изменения, отражая устойчивость гемопоэза в условиях имитации космического полета, носят адаптационный характер.
Научно-практическая ценность работы Результаты настоящего исследования могут быть использованы для разработки мер профилактики и коррекции функциональных сдвигов, развивающихся в организме во время космического полета.
Предложена эритроцитограмма для включения в число отборочных тестов модельных экспериментов невесомости и гипокинезии и оценки реакции реадаптации.
Оценены тромбоцитарные параметры, в том числе фракция незрелых тромбоцитов (IPF), которая, как показатель активности тромбоцитопоэза, может быть использована для мониторинга снижения количества тромбоцитов у космонавтов при подготовке к космическому полету.
Положения, выносимые на защиту:
1. В динамике экспериментов, моделирующих микрогравитацию и гипокинезию, уменьшается количество нормоцитов, при этом появляется морфологически измененные формы эритроцитов (микроциты, стоматоциты, мишеневидные).
2. Значения показателей периферического звена эритрона у испытуемых в условиях, моделирующих микрогравитацию и гипокинезию, снижаются.
3. При снижении общего количества тромбоцитов у испытуемых при имитации космического полета параллельно происходит увеличение количества незрелых и крупных форм тромбоцитов.
4. Наблюдаемые изменения эритроцитарных и тромбоцитарных параметров в условиях экспериментов, моделирующих полет на Марс, носят адаптационный характер.
Апробация работы Апробация работы состоялась 20 февраля 2012 г. на заседании проблемной комиссии ФГБУ «Гематологический научный центр» МЗСР РФ «Клинические исследования в гематологии (гемобластозы, депрессии кроветворения;
ТКМ;
миело- и лимфопролиферативные заболевания;
опухоли лимфатической системы;
патология красной крови;
ИТП;
порфирии)».
Материалы работы представлены на научно-практической конференции «Лабораторная диагностика-2009» (Москва, 30-31 марта 2009г.), II Московской региональной научно-практической конференции (с международным участием) «Цитоморфометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 28-29 мая 2009г.), научно-практической конференции «Достижения в гематологии и трансфузиологии» (Москва, 18 ноября 2009г), XV научно-практической конференции с международным участием «Лабораторное обеспечение стандартов медицинской помощи» (Москва, 29-30 марта 2010г.), III Всероссийской научно-практической конференции «Цитоморфометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва 13-14 мая 2010г.), XXXVIII Общественно-научных чтениях, посвящённых памяти Ю.А. Гагарина (г. Гагарин, 9-12 марта 2011г.), III съезде физиологов СНГ. Физиология и здоровье человека (Ялта, Украина, 1-6 октября 2011г.), международном научном симпозиуме Марс-500. Питание и метаболизм в условиях длительной изоляции (Москва, 23-25 апреля 2012г.).
Публикации По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе 2 в зарубежных изданиях.
Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, заключения, выводов и указателя литературы, включающего 136 работ, в том числе отечественных авторов. Работа иллюстрирована 17 таблицами и 46 рисунками.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования В настоящую работу включен 101 человек. Они были разделены на 6 групп.
Для получения референсных значений эритроцитарных параметров и построения эритроцитограмм (группа 1) использован материал девяти больных анемиями различного генеза (медиана возраста 34 года) и девяти практически здоровых людей (медиана возраста 36 лет);
для получения референсных значений тромбоцитарных параметров и оценки изменений фракции незрелых тромбоцитов при формировании относительной тромбоцитопении (группа 2) – материал 21 человека, отобранных на стадии селекции доноров (медиана возраста 30 лет) и 19 первичных доноров тромбоцитов (медиана возраста 26 лет), из лейкоцитарно-тромбоцитарного слоя периферической крови которых, впервые посредством поэтапного фракционирования трех доз крови с использованием центрифуги Sorval RS 3C (USA) получались пулированные монодонорские тромбоцитные концентраты.
Изменения эритроцитарных и тромбоцитарных параметров при дозированной физической нагрузке (отборочный тест) в условиях моделированной микрогравитации (велоэргометрия в положении лежа под углом наклона -3°) оценивались на материале человек (группа 3), средний возраст которых колебался от 19 до 50 лет (медиана возраста год). Забор капиллярной крови у испытуемых осуществлялся перед нагрузкой (фон) и после прекращения воздействия нагрузки (ранний период восстановления).
В эксперименте «21-часовая антиортостатическая гипокинезия под углом -15°» (рис.1), целью которого явилось моделирование микрогравитации и определение эффективности инфузионных сред для возмещения потери жидкости, в трех сериях исследований (с внутривенным введением 20 мг лазикса и 500 мл 10% коллоидного раствора «Инфукол ГЭК» или мл 5% кристаллоидного раствора глюкозы при контроле без введения инфузионных сред) гематокрит (%), концентрация гемоглобина (г/л) и эритроцитограммы анализировались (группа 4) у Рис. 1. Антиортостатическая испытуемых (медиана возраста 28 лет).
гипокинезия В соответствии с проектом «Марс-500» особенности эритроцитарных и тромбоцитарных параметров шести испытуемых (группа 5) в возрасте от 28 до 40 лет (медиана возраста 32 года) исследованы в эксперименте 105 суточной изоляции в гермообъеме. Периферическая кровь исследовалась 1 раз в 35 суток.
В рамках этого же проекта и моделирования гипокинезии в условиях длительного пребывания в замкнутом пространстве и микрогравитации при трех последовательных «выходах на поверхность Марса» в 520-суточном эксперименте, имитирующим космический полет на Красную планету на материале 6 испытуемых (группа 6) (рис.2), средний возраст которых колебался от 27 до 38 лет (медиана возраста 32 года) исследованы показатели красной крови, эритроцитограммы и процентное соотношение незрелых тромбоцитов к общему количеству этих клеток. Средняя повторяемость исследований составила 1 раз в суток. Отбор и допуск испытуемых к экспериментам выполнялся врачебно-экспертной комиссией ГНЦ РФ – ИМБП РАН. Всеми ими было подписано информированное согласие об участие в экспериментах.
Взятие венозной крови в объеме 5-7мл осуществляли по унифицированной методике в пробирки «Vacutainer» (Becton Dickinson, USA), Рис.2. Экипаж 520-суточной капиллярной крови в объеме 0,5 мл – в пробирки S- изоляции Monovette с встроенным капилляром с К2 ЭДТА. С помощью цитоцентрифуги DiffSpin 2 Slide Spinner (model M 701-22, StatSpin, USA) были приготовлены цитоцентрифугаты (ЦЦФ) – стандартные препараты периферической крови на обезжиренных фирменных тонких стеклах (SL72). Высушенные на воздухе препараты (ЦЦФ) фиксировались метанолом (10 минут) и в течение 20 минут окрашивались по Романовскому-Гимза. Для определения полисахаридов (гликоген) в тромбоцитах приготовлены мазки на обезжиренных предметных стеклах по общепринятой методике и высушены на воздухе. Мазки окрашены по методу Mc Manus (1946г.): фиксация в 10% спирт формалиновой смеси (1,0 мл 40% формалина и 9 мл 96% этилового спирта) – минут;
промывка проточной водой – 10 секунд;
окисление 1% йодной кислотой – 10 минут;
промывка дистиллированной водой и высушивание фильтровальной бумагой – 10 секунд;
окраска в реактиве Шиффа (хранить в бутылке из темного стекла, при t-4оС) – 30 минут;
промывка проточной водой – 5 минут;
докраска гематоксилином Майера – 15 минут;
промывка проточной водой – 10секунд. Образцы крови 1-й, 3-й и 5-й групп исследовались на автоматическом анализаторе «MYTHIC-18» компании (Франция).
Orphee Гематологические показатели остальных групп оценивались на анализаторе «SYSMEX» XE 2100 (Kobe, Japan).
Для компьютерной морфометрии эритроцитов и тромбоцитов использован прибор «Автоматический скрининг периферической крови» («АСПЕК») и программное обеспечение, разработанные совместно сотрудниками лаборатории гемоцитологии ГНЦ РАМН и Радиотехнического института имени академика А.Л. Минца (патенты:
№212171,1998;
№2147123, 2000;
№32279, 2003).
Анализ клеточных изображений, как эритроцитов, так и тромбоцитов проводился в режиме исследовательской версии «АСПЕК». Окрашенные стандартные препараты помещали на предметный столик микроскопа “Leica DMLS”(объектив CPLAN 100х 1,25 Oil) входящего в состав анализатора, 10 полей зрения (110-130 изображений эритроцитов) и полей зрения (50-100 изображений тромбоцитов при сплошной выборке) через C-mount 1.0:
Zoll 16 (Германия) вводили видеокамерой «Electrim EDS-2000E» (USA) в память компьютера. Сохраненные изображения эритроцитов и тромбоцитов затем сегментировали «вручную», т.е. путем обвода курсором на мониторе компьютера, или автоматически (процедура «волшебная палочка). Создавалась галерея клеток.
Автоматически вычислялись следующие геометрические параметры эритроцитов и ее центрального просветления (пеллора): площадь, периметр и факторы формы: FF1= 4**A/P2, где: А – площадь, Р – периметр клетки (FF1 характеризует округлость клетки и, чем ближе его значение к 1, тем форма клетки ближе к кругу);
FF2= A/(P*r1*r2), где: r1 – большой радиус, r2 – малый радиус клетки (фактор описывает изрезанность границы клетки и чем он ближе к 1, а форма клетки к эллипсу, тем более ровная граница клетки). Для расчета производных этих параметров с целью оценки двояковогнутого эритроцита использовались формулы Crosby (1952): h= MCV/r2;
S = 2r (h + r);
где: h – высота двояковогнутого эритроцита (близкого по форме к фигуре вращения, т.е. к тору), мкм;
MCV – средний корпускулярный объем эритроцита, fl;
r – поперечный диаметр эритроцита, мкм;
S – площадь поверхности, мкм2.
Статистическая обработка полученных результатов проводилась методом описательной статистики с использованием пакета SPSS (версия 10.0.5) для Windows (SPSS, Chicago, IL). Для сравнения значимости различий между средними значениями выборок использовали непараметрический критерий Вилкоксона. Статистически значимыми считали различия при р0,05. Во всех экспериментах оценивались различия по сравнению с фоновыми значениями.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1.Оценка геометрических параметров эритроцитов и тромбоцитов периферической крови.
Первоочередной задачей было создание эритроцитограммы, основанной на геометрических параметрах изображений нормоцитов, отобранных у здоровых людей и анизо- пойкилоцитов – у больных с анемией различного генеза. На анализаторе изображения «АСПЕК» с помощью описания набора признаков клеток в стандартных препаратах, как форма и размер, так и внутренняя структура, создавались обучающие выборки изображений эритроцитов для каждого класса, что позволило сформировать количественное описание класса объектов (эритроцитов). При экспертной классификации изображений нормоцитов (дискоцитов) и пойкилоцитов мы придерживались следующих общепринятых понятий и критериев световой микроскопии окрашенных мазков периферической крови:
нормоциты – эритроциты розовой окраски, при условии, что диаметр эритроцита (7,77 мкм) равен диаметру лимфоцита, а диаметр отчетливого пеллора – 1/ диаметра лимфоцита (двояковогнутый диск);
стоматоциты — эритроциты, пеллор которых, имея округлую или прямоугольную форму, своей изогнутостью напоминает форму рта;
эхиноциты (зубчатые клетки) — сферические эритроциты, на сохраняющей обычное отношение к объему клетки, поверхности которых достаточно регулярно располагается от 30 до 50 спикул (шипов);
мишеневидные клетки (target cells) — эритроциты с увеличенной площадью поверхности и с центральным расположением гемоглобина в виде мишени;
эллиптоциты (овалоциты) — эритроциты овальной формы;
микросфероциты — небольшие (диаметр от 5,7 до 6,9 мкм) эритроциты сферической формы с отсутствием пеллора.
В результате проведенных исследований микроскопических изображений эритроцитов периферической крови здоровых людей и больных анемией были получены геометрические параметры нормоцитов, анизо- и пойкилоцитов, которые послужили основой формирования эритроцитограммы (табл.1).
Таблица 1. Геометрические и производные параметры изображений эритроцитов, отобранных из ЦЦФ венозной крови в контроле (n=1300) и при анемии (n =520).
клетки Площадь эритроцита, Производные параметры MCV, fl мкм (MSD) S, мкм разброс h, мкм MSD 45,09 3, Нормоциты 1,9 85,43,3 38,6- 47,9 8, Стоматоциты 1,9 142, 91 32,5-7, Эхиноциты 54,2 5,2 1,8 158, 96,6 42,7-65, Мишеневидные 1,7 149, 53,1 7, 92 36,3-74, Овалоциты 1,6 112, 63 39,5 7,0 22,9-56, Микросфероциты 3,0 124, 31,3 4,0 21,8-36, Примечание: против р 0,001;
1 - только для нормоцитов 10 доноров.
MCV, fl – средний корпускулярный объем, фемтолитр, М – среднее арифметическое значение, SD – стандартное отклонение, h – высота эритроцита, S – площадь поверхности клетки При оценке изображений тромбоцитов периферической крови от 21 здорового человека получены данные, свидетельствующие о гетерогенности популяции тромбоцитов.
По нашим данным среднее значение площади тромбоцитов общей популяции составило 5,36±3,79 (1,6-9,0), причем незрелые тромбоциты, содержащие более трех гранул ШИК положительного материала [Anderson et al.,1996], выявленные методом цитохимической реакцией были больше по значением площади 9,5±3,6 (7,6-13,7), чем зрелые ШИК негативные (до 2 гранул) клеток - 3,9±1,3 (3,1-4,4) р 0,001.
Полученные данные у первичных доноров выявили зависимость параметра «фракции незрелых тромбоцитов» от общего количества тромбоцитов, при уменьшении которого данный параметр увеличивался (табл.2).
Таблица 2. Результаты оценки параметров тромбоцитов первичных доноров (n=9) до и после поэтапного тромбоцитафереза (по данным АСПЕК” и“Sysmex XE 2100).
ШИК-позитив, % IPF, % PLTх10 /мкл до после до после до после M±SD 236,7/40 153,7/39,4 20,5±7,4 27,8±8,2 2,7±1,7 4,2±2, 185-301 145-276 10,6-32,0 17,1-39,2 1,2-6,4 1,9-7, разброс Примечание: PLT – тромбоциты, IPF – незрелые тромбоциты, ШИК – реакция «Шифф йодная кислота» Показатель IPF коррелировал с уровнем ШИК (+) тромбоцитов (r=0,63) у первичных, а также у кадровых доноров, что доказывает пригодность разработанной методологии компьютерного морфо-цитохимического исследования тромбоцитов в норме и при моделировании.
2.Отборочный тест (велоэргометрия) с физической нагрузкой.
Данное исследование проводилось с целью оценить толерантность организма человека к физической нагрузке с моделированием микрогравитации.
В работах ряда исследователей при изучении крови было показано, что физические упражнения повышают плотность крови из-за изменения деформабельности эритроцитов, их агрегации, скорости фильтрации и гематокрита [Gurcan, 1998]. Наблюдаемое во время физических нагрузок сокращение объема плазмы объясняется потерей жидкости, которая пропорциональна рабочей нагрузке. Авторы отмечают, что упражнения вызывают значительное повышение агрегации эритроцитов, степень которой зависела от уровня фибриногена перед началом упражнений [Varlet-Marie, 2003]. Другие исследователи в своих экспериментах отмечают, что физические упражнения приводят к сокращению жизни эритроцитов и появлению молодых клеток. Под влиянием катехоламинов при физических упражнениях селезенка выбрасывает в кровоток депонированные эритроциты [Ruckman et al., 1981;
Devi et al., 2005]. По мнению многих авторов увеличения гематокрита, деформабельности эритроцитов и вязкости крови – физиологические адаптационные изменения, которые происходят при многих видах упражнений и сами по себе не угрожают здоровью организма [Brun, 2002]. В нашей работе при сравнительном анализе эритроцитарных показателей 24 испытуемых в ходе проведения отборочного теста (пробы со ступенчато возрастающей дозированной физической нагрузкой до достижения субмаксимальной частоты сердечных сокращений) показано повышение концентрации гемоглобина и величины гематокрита после нагрузки. Количество эритроцитов и отличающихся по зрелости форм ретикулоцитов не изменялось.
Несмотря на то, что влияние физических упражнений, выполняемых человеком, на тромбоциты интенсивно изучается, полученные до сих пор результаты остаются слишком вариабельными [Lee, 2003]. Предполагается, что и длительные, и краткосрочные напряженные физические упражнения временно повышают количество тромбоцитов, а также агрегацию тромбоцитов, адгезивность и секреторную активность этих клеток. В настоящей работе было достоверно (р0,05) установлено увеличение количества незрелых тромбоцитов у большинства испытуемых после физической нагрузки в среднем с 5,4±1,9% (4,2-6,7) до 7,2±0,9% (5,1-9,2). Наряду с этим у этих испытуемых отмечалась общая тенденция к количества тромбоцитов с 209,7±41,4х103/мкл до 202,7±42,4х103/мкл.
уменьшению Возможно, физическая нагрузка способствует выходу из депо в циркуляцию молодых тромбоцитов, которые функционально более активны (способность к агрегации) и содержат больше энергетического материала, чем зрелые [Bessis, 1972]. Количество крупных тромбоцитов до (38,1±7,6%) и после нагрузки (39±6%) практически не изменялось.
3. Эксперименты, моделирующие микрогравитацию и гипокинезию Изучение показателей красной крови периферической крови в динамике 3.1.
эксперимента с 21-часовой антиортостатической гипокинезией с углом наклона тела 15°(АНОГ -15°).
Эксперимент с 21-часовой АНОГ проводился в три серии, в каждой из которых участвовали все 6 испытуемых. Во всех трех сериях для усиления эффекта гипогидратации, в конце 13-го часа АНОГ, участникам внутривенно однократно вводили по 20 мг лазикса. В первой серии – вводили кровозамещающий коллоидный раствор «Инфукол ГЭК», 10% через 3 часа после введения лазикса (в течение 17-го часа АНОГ), 500 мл внутривенно, капельно;
во второй – раствор кристаллоидной группы - 5% раствор глюкозы, также через 3 часа после введения лазикса (в течение 17-го часа АНОГ), 500 мл, внутривенно, капельно. В третьей серии компенсации гипогидратации не производилось. Серии проводились последовательно.
Период восстановления обследуемого после каждого воздействия составлял 7 дней. Взятие биоматериала осуществлялось до начала гипокинезии, а также через 14 (после введения диуретика), 17 часов (после введения инфузионных сред) от начала эксперимента. У большинства испытуемых мочегонный эффект лазикса сопровождался незначительным увеличением концентрации гемоглобина (HGB) примерно на 3% от исходного уровня (исходный уровень 140±10г/л) (рис.3).
Нет инфузионных сред Рисунок 3. Концентрация гемоглобина (г/л) в периферической крови испытуемых (n= 6) в экспериментах обезвоживания (лазикс, 20 мг) и восполнения потери организмом жидкости (инфузии 500 мл 10% коллоидного раствора «Инфукол ГЭК» (1 ч.) или 500 мл кристаллоидного 5% раствора глюкозы (1ч.) на фоне моделируемой микрогравитации (21 ч.
– антиортостатическая гипокинезия, АНОГ).
Примечание: 1 – исходная точка, 2 – после в/в введения лазикса, 3 – после инфузии в двух сериях испытаний (a, b ) Гематокрит (HCT) практически не изменялся по сравнению с исходным (исходный средний уровень 40 ± 4%). Однако у одного испытуемого увеличение HCT было значительным (на 37% от исходного) (рис.4).
Нет инфузии Рисунок 4. Величина гематокрита (%) у испытуемых (n=6) в экспериментах обезвоживания (лазикс, 20 мг) и восполнения потери организмом жидкости (инфузии 500 мл 10% коллоидного раствора «Инфукол ГЭК» (1 ч.) или 500 мл кристаллоидного 5% раствора глюкозы (1ч.)) на фоне моделируемой микрогравитации (21 ч. – антиортостатическая гипокинезия, АНОГ).
Примечание: 1 – исходная точка, 2 – после в/в введения лазикса, 3 – после инфузии в двух сериях испытаний (a, b) Этот последний случай указывает на то, что внутривенное введение лазикса в дозах, не вызывающих у большинства сколько-нибудь существенного увеличения HCT, у кого-то может вызвать заметное его увеличение, а HCT, как известно, косвенно характеризует вязкость крови по эритроцитарной составляющей. После проведения инфузии коллоидного и кристаллоидного растворов концентрация гемоглобина уменьшалась статистически значимо (р=0,05) примерно на 15% от исходного значения (рис.3), величина гематокрита уменьшалась в пределах от 3 до 33% от исходного (р=0,05) (рис.4). Возможно, наблюдаемые эффекты после инфузии растворов обусловлены разбавлением периферической крови (относительная гемодилюция) а также изменением гемодинамических характеристик крови.
При исследовании содержания эритроцитов (эритроцитограмма) до начала эксперимента в фоновом периоде нормоциты составили – 59,8%, микроциты –13,6%, макроциты – 17,2%, стоматоциты – 5,5%, овалоциты – 0,8%, микросфероциты – 0,9%. В динамике эксперимента, после внутривенного введения лазикса, было установлено недостоверное уменьшение количества нормоцитов (дискоцитов) на фоне повышения числа микроцитов (25,7%). В последующем, после введения инфузионных сред, число нормоцитов приближалось к фоновому значению, обнаружена тенденция к снижению обратимых и необратимых форм эритроцитов.
3.2.Особенности эритроцитарных и тромбоцитарных параметров периферической крови испытуемых в динамике эксперимента 105-суточной изоляцией в гермообъеме.
Данное исследование проводилось с целью выявить влияние комплекса факторов гермообъема, связанного с пребыванием в условиях ограниченного пространства, а также компенсации относительной гиподинамии физическими нагрузками на показатели красной крови и количества тромбоцитов (табл.3).
Таблица 3. Динамика изменений показателей красной крови и количества тромбоцитов у участников 105-суточной изоляции в гермообъеме.
Значение (M±SD) Показатели Фоновое Эксперимент крови исследование 35 сутки 70 сутки 105 сутки RBCx106/мкл 5,2±0,3 5,0±0,4 3,8±0,4 4,9±0, HGB,г/л 152±9,7 143,5±12,3 139±9,2 138,8±9, HCT, % 45,7±2,9 45±3,8 34,4±4* 44,2± PLTx103/мкл 190,1±23,7 186,8±41,4 160,8±32,5 187,1±23, *различие достоверно р=0,0002;
RBС - эритроциты, HGB – гемоглобин, HCT – гематокрит, PLT – тромбоциты, M – среднее арифметическое значение, SD – стандартное отклонение Установлено снижение данных показателей в ходе эксперимента, однако выраженные изменения были отмечены на 70 сутки. Так, гематокрит снизился статистически значимо (р0,05). Сниженная концентрация гемоглобина сохранялась на всем протяжении эксперимента. Наблюдаемое снижение содержания количество эритроцитов, гемоглобина и гематокрита на 70 и 105 сутки эксперимента, возможно, связано с замедлением эритропоэза, что подтверждается низким уровнем эритропоэтина в периферической крови у этих же испытуемых на 70 и 105 сутки эксперимента в работе других исследователей [С.М. Иванова, 2010]. Следует отметить, что снижение уровня эритропоэтина клинически незначимо и соответственно испытуемые терапии эритропоэтином не нуждаются. Однако накоплен большой опыт, позволяющий сделать вывод о том, что терапия эритропоэтином является успешной в лечении больных хронической почечной недостаточностью и находящихся на гемодиализе [В.М. Чернов и соавт., 2001].
У пяти из шести испытуемых количество тромбоцитов статистически достоверно (р0,05) снизилось по сравнению с фоновым значением.
В этой же группе была проведена морфометрия эритроцитов. В начале эксперимента получена следующая эритроцитограмма: нормоциты - 61,7%, микроциты - 11%, макроциты 4,4%, стоматоциты - 12,7%, эхиноциты - 3,5%, овалоциты - 1,5%, сфероциты - 0,3%, микросфероциты - 2,8%, макросфероциты - 0,3%, анулоциты - 1,5%, мишеневидные эритроциты - 0,3% (рис.5).
70,0% 61,7% 60,0% 50,0% 40,0% 30,0% 20,0% 12,7% 11,0% 10,0% 4,4% 3,5% 2,8% 1,5% 1,5% 0,3% 0,3% 0,3% 0,0% Рисунок 5. Эритроцитограмма испытуемых (n=6) в фоне 105-суточной изоляции в гермообъеме.
На 35 сутки эксперимента количество нормоцитов недостоверно снизилось до 44,6% за счет увеличения других форм эритроцитов: микроцитов и мишеневидных эритроцитов стало 21,6% и 2,7%, соответственно.
Дальнейшее увеличение доли микроцитов (33,4%) по сравнению с исходным уровнем (11%) было отмечено к 105 суткам эксперимента. Количество нормоцитов составило 41%.
Во время изоляции применялось дополнительное воздействие в виде комплекса физических нагрузок. Как известно, действие физической нагрузки значительно увеличивает скорость кровотока, при котором имеет место повреждение форменных элементов крови, повышение их агрегации, деформируемости [Brun, 2002], что возможно способствует изменению клеточной мембраны и появлению измененных форм эритроцитов.
Таким образом, 105-суточная изоляция сопровождается замедлением эритропоэза на всем протяжении эксперимента, что подтверждается снижением показателей красной крови, значимые изменения которых отмечены к концу эксперимента. Возможно, обнаруженные эффекты связаны с низкой продукцией эритропоэтина в ответ на пониженную потребность организма в кислороде за счет снижения интенсивности обменных процессов, а также изменение режима двигательной активности в условиях длительной гипокинезии.
3.3.Оценка эритроцитарных и тромбоцитарных параметров периферической крови участников в эксперименте со 520-суточной изоляцией в условиях имитации полета на Марс.
При наблюдении за показателями красной крови у испытуемых более длительной изоляции отмечается тенденция к снижению количества эритроцитов;
также отмечено снижение содержания гемоглобина и величины гематокрита. Обращает внимание то, что перечисленные изменения отмечены после 244-272 суток - периода, когда выполнялась имитация трех «выходов на поверхность Марса». Перед каждым выходом моделировалось перераспределение жидкостных сред организма как при воздействии микрогравитации путем АНОГ -12° в течение трех дней 12 –часовой продолжительностью (табл. 4).
Таблица 4. Динамика изменения показателей красной крови у испытателей 520-суточного эксперимента (n=6).
Значение (M±SD) Показатели Фон Эксперимент, сутки Реадаптация, сутки 60 120 180 240 300 360 510 2-е 8-е RBCх106/ 5,3 5,1 5,1 5,3 5,1 4,9 5 4,9 4,7 4, мкл 0,3 0,2 0,2 0,1 0,2 0,2 0,2 0,4 0,2 0, HGB г/л 156 153 153 157 154 147 147 148 140 9,8 7,3 6,5 6,4 8,3 8,4 8,2 12,4 9,2 7, HCT % 47 45 44,9 45,5 45 43 43,4 43 40,6 40, 2,7 1,9 1,5 1,5 2,5 2,8 2 3,4 1,9 2, Примечание: RBС - эритроциты, HGB – гемоглобин, HCT – гематокрит, M –среднее арифметическое значение, SD – стандартное отклонение Кроме того, отмечено увеличение количества ретикулоцитов (р=0,007) на 60 сутки эксперимента, возможно, связанное с активацией эритропоэза под воздействием усиленных физических нагрузок на организм испытуемых в периоде 39-66 суток эксперимента, так как при интенсивной нагрузке уровень доставки кислорода тканям значительно увеличен [Meerson,1993]. В то же время достоверно (p=0,04, 95% CI) установлено увеличение количества ретикулоцитов (10,9±3,8) после периода имитации высадки членов экипажей на «поверхность Марса» (на 300сутки эксперимента) по сравнению с фоновым значением (8,6±2,4). Аналогично отмечено увеличение их незрелых форм (рис.6).
Рисунок 6. Динамика незрелых ретикулоцитов периферической крови 6 членов экипажа 520 суточного эксперимента.
Примечание: RET – ретикулоциты, временные точки соответствуют суткам эксперимента (1 8) и периоду реадаптации (9-10).
В целом наблюдаемые изменения не расходятся с полученными ранее результатами в длительных космических полетах человека (до года). Снижение количества эритроцитов, гемоглобина в ранний период реадаптации (2-е сутки) и последующее развитие ретикулоцитарной реакции (8-е сутки), как было аналогично отмечено при исследовании крови экипажей длительных космических полетов, косвенно свидетельствуют о возрастании скорости эритропоэза, обусловленного увеличенной потребностью организма в кислороде [В.И. Гудим и соавт., 1982] Проведен анализ эритроцитограмм испытуемых в ходе эксперимента. По полученным данным при фоновом исследовании в «формуле» эритроцитов, как это показано на рис. 7, преобладали нормоциты - 67,3%.
80,0% 67,3% 70,0% 60,0% 50,0% 40,0% 30,0% 20,0% 12,2% 14,1% 10,0% 2,6% 1,2% 0,8% 0,5% 0,4% 0,4% 0,0% Рисунок 7. Эритроцитограмма испытуемых (n=6) до начала 520-суточного эксперимента.
На 120 сутки эксперимента количество микроцитов достоверно (р0,05) увеличилось (26,1%) по сравнению с фоновыми данными (12,2%) (рис. 8).
50,0% 44,0% 45,0% 40,0% 35,0% 30,0% 26,1% 25,0% 18,8% 20,0% 15,0% 10,0% 4,9% 3,8% 5,0% 0,6% 0,5% 0,3% 0,3% 0,2% 0,0% Рисунок 8. Эритроцитограмма периферической крови 6 испытуемых на 120 сутки 520 суточного эксперимента.
Количество микроцитов (28,5%) оставалось увеличенным и на 180 сутки эксперимента. В то же время отмечено увеличение числа как обратимых, так и необратимых форм эритроцитов (стоматоциты, сфероциты, микросфероциты), а на 360-е сутки эксперимента доля микроцитов составила уже 10% (рис. 9).
50,0% 43,1% 45,0% 40,0% 35,0% 30,0% 25,0% 21,2% 20,0% 15,0% 10,0% 9,2% 10,0% 6,1% 3,0% 2,9% 2,8% 5,0% 0,7% 0,8% 0,0% т ит т ид т т т ит т ит ер ер и и и и и ци оц ц оц оц оц ев оц оц оц сф ф то ро ос ин ен ат ал ул кр ер рм ро ан к кр ом ов эх ш сф ан ма ми к но ак ми ми ма ст Рисунок 9. Эритроцитограмма периферической крови 6 испытуемых на 360 сутки 520 суточного эксперимента.
Данные исследователей говорят о том, что уменьшение значений средней площади эритроцитов в ходе длительных модельных экспериментов наблюдается вследствие адаптивного торможения активности эритропоэза [Ю.К. Новодержкина, 1998]. Было также обнаружено отрицательное влияние условий космического полета на продолжительность жизненного цикла эритроцитов. Выявлены изменения их форм и размеров в условиях реальной и моделированной невесомости у человека и животных [В.И. Легеньков и соавт., 1981;
А.С.Ушаков и соавт., 1981], показателей внутриклеточного метаболизма и структурно функционального состояния мембран [Т.И. Торховская, 1983;
А.С. Ушаков и соавт., 1985].
В то же время обнаруженное изменение формы эритроцитов может быть следствием удаления части эритроцитов из кровяного русла. Последнее может быть обусловлено сдвигами в метаболическом статусе и в состоянии клеточной мембраны эритроцитов, что приводит к изменению ее вязкости и способности деформируемости [А.С.Ушаков и соавт., 1981;
С.М. Иванова и соавт., 1997, 1998]. Нарушение поверхностной архитектоники клеток и увеличение числа патологических форм эритроцитов также отмечено при заболеваниях системы крови, например при эритремии. При анализе морфологии эритроцитов при эритремии было выявлено до лечения снижение количества дискоцитов (52,62±16%) при норме 85,05±10,1% (p0,001), а также наличие 10-12% дегенеративных форм эритроцитов, количество которых увеличивалось в зависимости от длительности заболевания. Лечебный эффект при эритремии сопутствовал увеличением количества дискоцитов по сравнению с исходным, снижением уровня дегенеративных клеток [Л.Г. Ковалева и соавт., 1998].
При анализе тромбоцитарных параметров крови в ходе эксперимента были выявлены их следующие изменения. У 5 из 6 испытуемых на протяжении эксперимента и в периоде реадаптации наблюдалась тенденция к снижению количества тромбоцитов в периферической крови. Увеличение незрелых форм тромбоцитов отмечено на 60-е и 300-е сутки эксперимента у 4 из 6 участников. Однако при выходе из эксперимента, в ранний период восстановления (вторые сутки), в периферической крови всех участников было выявлено значительное увеличение данного показателя. Считается, что регуляция эритро- и тромбоцитопоэза, эритро- и тромбопоэтином, схожи. В нашей работе увеличение количества незрелых форм ретикулоцитов совпадало с увеличением числа незрелых тромбоцитов у большинства испытуемых в одни и те же сутки эксперимента. При исследовании крупных тромбоцитов отмечена тенденция их увеличения. Число макроформ тромбоцитов начинала увеличиваться по сравнению с исходными данными с 60 суток эксперимента (рис.10).
100% 90% 80% 70% 60% макроформы 50% микроформы 40% 30% мезоформы 20% 10% 0% фон 60сутки 120сутки 180сутки 240сутки 300сутки 360сутки эксперимент Рисунок 10. Соотношение форм тромбоцитов по площади у 6 участников 520-суточного эксперимента.
Аналогичная картина наблюдалась в динамике эксперимента при исследовании крупных тромбоцитов на гематологическом анализаторе SYSMEX XE 2100. Так, количество крупных тромбоцитов на 360 сутки эксперимента увеличилось до 41,5±6,0% по сравнению с исходным значением - 33,4±4%. Более того, увеличение частоты крупных тромбоцитов по времени совпало с выходом в кровь их незрелых представителей. Фракция незрелых тромбоцитов увеличилась до 4,3±1,1 (исходно 2,9±1,3).
Таким образом, представленные данные показывают, что в условиях пребывания человека в герметично замкнутом пространстве, автономного существования, гиподинамии, а также дополнительное воздействие в виде комплекса физических нагрузок, изменения показателей эритроцитов и тромбоцитов носят приспособительный характер к этим измененным условиям среды.
ВЫВОДЫ 1. Изменения параметров эритроцитов и тромбоцитов периферической крови испытуемых во всех экспериментах, моделирующих микрогравитацию и гипокинезию, не выходят за пределы нормальных значений и, отражая устойчивость гемопоэза в условиях имитации космического полета, носят адаптационный характер.
2. Методология компьютерного распознавания и классификации эритроцитов в стандартных препаратах крови является средством описания изображений клеток с помощью формальных признаков, по набору которых система автоматически принимает решение об их принадлежности к тому или иному классу, т.е. формирует эритроцитограмму.
3. При анализе эритроцитограмм практически здоровых людей и больных анемиями различного генеза показано, что, утрачивая форму двояковогнутого диска и превращаясь за счет изменения геометрии торообразующих областей в пойкилоциты, эритроциты могут или истончаться или разбухать вплоть до образования сферы.
4. Результаты сравнительной оценки содержания незрелых тромбоцитов доноров позволяют рассматривать их выход в периферическую кровь как свидетельство регенераторного ответа костного мозга, способного компенсировать изъятые тромбоциты.
5. Анализ микроскопических изображений (площадь и форма клеток) окрашенных эритроцитов периферической крови испытуемых при моделировании микрогравитации выявил преобладание (57,3±10,9 %) нормоцитов;
тенденция к анизоцитозу (микроциты) или пойкилоцитозу (сфероциты, мишеневидные эритроциты) недостоверна.
6. Во всех сериях экспериментов моделируемой микрогравитации и перераспределения жидкости (антиортостатическая гипокинезия) эритроцитарные параметры (количество эритроцитов, концентрация гемоглобина, величина гематокрита и средняя площадь эритроцитов) испытуемых варьировали в пределах нормальных значений.
7. Увеличение числа незрелых тромбоцитов вследствие снижения количества тромбоцитов у испытуемых как при физической нагрузке (велоэргометрия) и моделировании невесомости, так и при гипокинезии в ходе выполнения 105-ти и 520 ти суточного эксперимента («Марс-500») представляет собой адаптацию системы крови человека к измененным условиям среды.
Список опубликованных научных работ по теме диссертации:
1. Погорелов В.М., Краснова Л.С., Наумова И.Н., Дягилева О.А., Чаниева М.И., Красников А.В. Необратимые дегенеративные изменения эритроцитов в стандартных цитоцентрифугатах периферической крови. // Клиническая лабораторная диагностика. Медицина, Москва, 2008.-№9.-С.72.
2. Погорелов В.М., Краснова Л.С., Чаниева М.И., Красников А.В., Козинец Г.И.
Геометрия прегемолитических пойкилоцитов в стандартных цитоцентрифугатах крови на предметных стеклах. // Гематология и трансфузиология. Медицина, Москва, 2008.-Т.53.- №6.- C.22-26.
3. Pogorelov V.M., Krasnova L. S. Krasnikov A.V. and Chanieva M.I. Erythrogramma in anemia patients. / Abstacts of the XXIst International Symposium on Technological Innovations in Laboratory Hematology. // International Journal of Laboratory Hematology.
Sydney, Australia, June, 2008.-Vol.30.-Supp.1.-P.93.
4. Чаниева М.И., Иванова И.А., Верденская Н.В., Погорелов В.М. Морфометрический анализ эритроцитов и их изменений при анемиях различного генеза. // Материалы II московской региональной научно-практической конференции (с международным участием) «Цитоморфометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты». Москва, 2009.- С.95-97.
5. Чаниева М.И., Иванова И.А., Верденская Н.В., Погорелов В.М., Козинец Г.И.
Морфометрический анализ тромбоцитов практически здоровых людей. // Материалы III Всероссийской научно-практической конференции «Цитоморфометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты». Москва, 2010.-С.71-72.
6. Чаниева М.И., Погорелов В.М., Иванова И.А., Верденская Н.В., Скедина М.А., Бескоровайнова В.Ю., Козинец Г.И. Автоматическое распознавание микроскопических изображений тромбоцитов на анализаторе АСПЕК. // Гематология и трансфузиология. Москва, 2010.- Т. 55.- № 5.- C.51-52.
7. Погорелов В.М., Чаниева М.И., Скедина М.А., Степанова Г.П., Гемджян Э.Г., Козинец Г.И. Адаптация тромбоцитопоэза к микрогравитации. // Научные труды III съезда физиологов СНГ. Ялта, Украина, 2011.-C.196-197.
8. Чаниева М.И., Погорелов В.М., Скедина М.А. Морфология эритроцитов и тромбоцитов испытуемых в условиях, моделирующих невесомость и гипокинезию. // Депонирование во Всероссийский институт научной и технической информации (ВИНИТИ), Москва, 13.07.2011 № 341-В2011 - 21с. - Библиография: 66 назв.
9. Погорелов В.М., Чаниева М.И., Скедина М.А., Степанова Г.П., Гемджян Э.Г., Козинец Г.И. Реакция системы крови на физическую нагрузку при моделировании факторов невесомости. // Ежегодный Гагаринский сборник, Воронеж, 2011.-С.233-243.
10. Pogorelov V.M., Beskorovainova V.Ju., Chanieva M.I., Dyagileva O.A., Naumova I.N., Skedina M.A. Periodic acid-Schiff (PAS) staining of immature platelets in donors. // Platelets, 2012.-Vol.23.-№1.-P.51-59.
Автор приносит искреннюю благодарность за помощь и совместную работу:
Г.И. Козинцу, В.М. Погорелову, М.А. Скединой, Г.П. Степановой, О.А. Дягилевой, И.Н.
Наумовой, Т.Г. Сарычевой, В.С. Каталиной, А.В. Красникову, Д.А. Шмарову, сотрудникам лаборатории гемоцитологии, а также сотрудникам клинического корпуса Государственного научного центра Российской Федерации - Института медико-биологических проблем Российской Академии наук.