Патоморфогенез экспериментального криптококкоза головного мозга

На правах рукописи

Майская Марина Юрьевна Патоморфогенез экспериментального криптококкоза головного мозга 14.00.15 – патологическая анатомия 03.00. 24 – микология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт – Петербург 2007 2

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении дополнительного профессионального образования « Санкт- Петербургская медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Насыров Руслан Абдуллаевич доктор биологических наук Васильева Наталья Всеволодовна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, член-корреспондент РАМН, профессор Аничков Николай Мильевич доктор медицинских наук, профессор Климко Николай Николаевич

Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский медицинский университет им акад. И.П.

Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Защита диссертации состоится «_» 2007 г. в _ часов на заседании диссертационного совета Д 208.089.04 при ГОУ ДПО «Санкт- Петербургская медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу: 191015, Санкт- Петербург, ул. Кирочная, д.

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке СПб МАПО Росздрава по адресу: 195196, Заневский пр., д. 1/82.

Автореферат разослан «_» _ 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук старший научный сотрудник А.В. Соболев

Общая характеристика работы

.

Актуальность темы. Криптококкоз – оппортунистический инвазивный микоз, наиболее тяжелым и жизнеугрожающим проявлением которого является поражение головного мозга. Возбудителем этого заболевания, которое без лечения, как правило, заканчивается летально, является дрожжеподобный гриб Cryptococcus neoformans. Криптококкоз развивается преимущественно на фоне иммунодефицитных состояний, причм у больных СПИД- это маркерная инфекция.

Несмотря на значительное число исследований, особенно в последние два десятилетия, посвященных морфологии и биологии криптококка, эпидемиологии, клинической картине, диагностике и лечению криптококкоза многие вопросы патоморфогенеза криптококковой нейроинфекции остаются не вполне ясными. [Kwon- Chung K.J.et al, 1995;

Mitchel T., Perfect J 1995;

Елинов Н.П., 2000;

Васильева Н.В., 2005;

Heitman J.,2006;

Casadeval A., 2006;

;

Cogliati M. et al, 2005;

Pirofski L-A, 2006].

Возбудитель проникает в организм, в основном, через дыхательные пути и значительно реже через кожные покровы, а затем происходит диссеминация C. neoformans в центральную нервную систему ( ЦНС).

Причина преимущественного поражения ЦНС криптококком остается неясной до сих пор. Так, установлено, что криптококк попадает туда гематогенно, однако пути проникновения С. neoformans из сосудистого русла в вещество мозга не до конца изучены и мнения по этому поводу противоречивы. Возможным местом первичного проникновения называют мягкую мозговую оболочку и пространства Вирхова- Робена, сосуды хориоидального сплетения и микрососуды вещества головного мозга [Ibrahim A. et al 1995, Lee S. et al, 1996;

Kovoor J.et al, 2002;

Chretien F. et al, 2002;

Chang G. et al, 2004;

Charlier C. et al, 2005]. В связи с этим, значительный интерес представляет изучение роли микрососудов и реакции астроцитарной глии, как составляющей гематоэнцефалического барьера.

Фрагментарны представления в научной литературе о нейрогистологических изменениях в головном мозге людей, умерших от данной инфекции. Отсутствуют морфологические критерии интерпретации острых, подострых и хронических процессов при криптококкозе. Известно, что патологические изменения при криптококкозе вариабельны, и до сих пор этому факту нет веских объяснений. Так, морфологические изменения при криптококкозе оценивают суммарно без учта вирулентности возбудителя и его морфологических особенностей. Практически отсутствуют сведения о характере нейроморфологических изменений в головном мозге на разных сроках экспериментального криптококкоза, вызванных различными по вирулентности штаммами С. neoformans. В свете вышеизложенного изучение патогенеза криптококкоза, в частности, патоморфологии криптококковой нейроинфекции приобретает особую актуальность.

Цель исследования: Оценить особенности и значимость патогистологических изменений в структурных элементах головного мозга при криптококкозе.

Задачи исследования:

1. Оценить роль каждого из структурных элементов, составляющих систему «кровеносный сосуд – глия – нейрон» в патоморфогенезе криптококкоза головного мозга.

2. Определить характер патоморфологических изменений в головном мозге при экспериментальном криптококкозе, обусловленных воздействием различных штаммов криптококков.

3. Охарактеризовать патоморфологические изменения в головном мозге людей, умерших от криптококковой инфекции.

4. Определить особенности и динамику структурной реакции астроцитов при экспериментальном криптококкозе.

5. Изучить локализацию антигена криптококка в структурах головного мозга.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. По данным патоморфологического и иммуногистохимического исследования криптококкоза головного мозга в системе « кровеносный сосуд – глия – нейрон» выявлены характерные изменения, отражающие последовательность развития инфекционного процесса.

Стенка микрососудов является первичной, доминирующей 2.

«мишенью» патогенного воздействия при криптококовой нейроинфекции.

Степень е деструкции является одним из факторов, определяющих характер поражения головного мозга.

3. Существенные различия в характере нейрогистологических изменений в головном мозге обусловлены разными штаммами C. neoformans при экспериментальном криптококкозе и являются следствием различной патогенности возбудителя.

Научная новизна исследования. Обоснована роль микрососудов в патоморфогенезе криптококковой нейроинфекции. Представлена динамика патонейрогистологических изменений, вызванных различными по вирулентности (патогенности) штаммами криптококков в головном мозге при экспериментальном криптококкозе. Определена локализация антигена криптококков в структурах головного мозга в течение экспериментального криптококкоза. Выявлены различные типы патоморфологических изменений в головном мозге у людей, отражающие особенности течения криптококковой нейроинфекции. Впервые выявлен полиморфизм изменений астроцитов и нервных клеток на различных сроках криптококкоза головного мозга.

Теоретическая и практическая значимость работы 1. Выявленные закономерности изменений в системе « кровеносный сосуд – глия – нейрон» имеют существенное значение для изучения основ взаимодействия микро– и макроорганизма при криптококковой нейроинфекции.

2. Предлагаемый дифференцированный подход к оценке поражений головного мозга в зависимости от вирулентности штамма C. neoformans, длительности и стадии инфекционного процесса может представлять ценность для анализа течения криптококковой инфекции и клинико анатомических сопоставлений.

Результаты, полученные при использовании 3.

иммуногистохимического метода выявления капсульного полисахарида, служат основой для его применения в дифференциальной диагностике криптококкоза.

Апробация результатов и внедрение в практику. Основные положения работы доложены и обсуждены на VI, VII, IX Кашкинских чтениях (Санкт-Петербург, 2003, 2004, 2006 гг.), на расширенном заседании Санкт-Петербургской Ассоциации патологоанатомов с участием инфекционистов в 2003г. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 6 в журналах, рекомендованных ВАК РФ. Результаты научной работы внедрены в педагогический процесс кафедры патологической анатомии с курсом цитологии, на курсе лабораторной микологии ГОУ ДПО СПб МАПО Росздрава, а также в лаборатории патоморфологии ФГУ НИИ детских инфекций Росздрава, в практическую работу СПб ГУЗ «Городское патологоанатомическое бюро», СПб ГУЗ «Городская туберкулзная больница №2».

Личный вклад автора. Автор лично осуществлял гистологическое исследование с применением различных окрасок головного мозга мышей, аутопсийного и операционного материала. Автором самостоятельно проведено иммуногистохимическое окрашивание капсульного полисахарида и кислого фибриллярного белка астроцитов.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов работы и их обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы (240 наименований). Полный объем работы составляет страниц, включая 1 таблицу, 22 рисунка.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Работу проводили на белых беспородных мышах-самцах (всего мышей) массой 18-20г., которым в хвостовую вену вводили C. neoformans: в дозе 106 кл /мышь, первой серии (I) экспериментов в во второй (II) в сублетальной дозе. В I серии экспериментов использовали 4 штамма C.

neoformans Российской коллекции патогенных грибов (РКПГ) – 1178 (LD50 = 1х106 кл /мышь), 1165 (LD50 = 1х106 кл /мышь), 1090 (LD50 = 2х103 кл /мышь), 1096 (LD50 = 5х102 кл /мышь).

Во II серии экспериментов использовали штаммы C. neoformans РКПГ 1166 (LD50 = 1х104 кл/мышь) и 1067 (LD50 = 1х105 кл/мышь). В качестве контрольной группы использовали мышей, которым внутривенно вводили физиологический раствор в количестве 0,5 мл.

Исследование головного мозга проводили в I серии экспериментов на 1 е и 7-е сутки, во второй серии – на 3-и, 7-е, 14-е, 21-е сутки. Головной мозг фиксировали в 10% нейтральном формалине и заливали в парафин. В лаборатории патоморфологии НИИ медицинской микологии им.

П.Н.Кашкина СПб МАПО гистологические срезы тканей мозга окрашивали тионином по Нисслю, гематоксилином и эозином, проводили РАS-реакцию с докраской альциановым синим в модификации Моури.

Для сравнения полученных при экспериментальном криптококкозе данных исследовали материалы вскрытий четырех больных, умерших от криптококкового менингоэнцефалита без ВИЧ- инфекции. Также был исследован операционный материал от пациентки, оперированной по поводу глиобластомы головного мозга.

Первичное патоморфологическое исследование аутопсий и операционного материала было проведено проф. О.К. Хмельницким и патологоанатомами различных прозектур г. Санкт-Петербурга.

Иммуногистохимическое исследование проводили в лаборатории патоморфологии НИИ детских инфекций. Для выявления антигена криптококков (капсульного полисахарида) применяли иммуногистохимический (ИГХ) метод. Исследования проводили на парафиновых срезах головного мозга мышей, фиксированного в 10% нейтральном формалине. Использовали поликлональные антитела к антигену криптококков (NCL-CN) и авидин-биотиновую систему детекции, (Novocastra, Великобритания). После инкубации срезов с первичными антителами и соответствующей обработки наносили вторичные биотинилированные антитела, затем инкубировали с авидин-биотиновым комплексом. Продукт реакции выявляли по наличию светло- и темно коричневых гранул в структурах мягкой мозговой оболочки (ММО) и вещества головного мозга при световой микроскопии. Критериями оценки служили: интенсивность окраски (светло- и темно-коричневая);

размеры гранул (мелкие, крупные);

их локализация;

распространенность. Для оценки состояния астроцитов головного мозга мышей, наряду с анализом препаратов окрашенных по Нисслю, применяли иммуногистохимический метод, где в качестве первых антител использовали поликлональные антитела к кислому фибриллярному белку (КФБ) астроцитов (Z 0334, пр-во DAKO). При проведении иммуногистохимических исследований использовали негативный и положительный контроли.

Статистический анализ с учетом особенностей полученных данных проводили с помощью комплекса непараметрических методов исследования, используя программу Statistica for Windows 5.5. Рассчитывали частоты характеристики, а также комплекс описательных статистик (среднее, ошибка среднего, медиана, среднеквадратическое отклонение). Применяли критерии:

Манна – Уитни, Вальда, медианный Хи-квадрат, модуль ANOVA.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Для оценки патоморфологических изменений в головном мозге мы использовали модель экспериментального криптококкоза при внутривенном введении возбудителя мышам. Так, в серии экспериментов с I использованием 4-х штаммов криптококков (в дозе 1х10 6 кл/мышь), из которых штаммы 1178 и 1165 обладают слабой вирулентностью, а штаммы 1096 и 1090 - сильной вирулентностью, через сутки от начала опыта единичные криптококки обнаруживали во всех срезах у всех животных в просвете микрососудов или вблизи них, в то же время в мягкой мозговой оболочке микромицеты на этом сроке не были обнаружены. В другой серии опытов с использованием сильновирулентного штамма 1166 и менее вирулентного штамма 1067, (10 4 10 вводимых в сублетальной дозе кл/мышь и кл/мышь соответственно), на ранних сроках опыта мы также наблюдали изменения стенок микрососудов: расширение просветов артериол, капилляров, нарушение взаиморасположения эндотелия, частичную его десквамацию.

Вблизи микрососудов или в их расширенных просветах можно было видеть немногочисленные криптококки. Микроскопическую картину преимущественного поражения микрососудов наблюдали и другие исследователи [Olszevski M. et al. 2004г]. Авторы также отмечали скопление дрожжевых клеток в капиллярах, повреждение стенок микрососудов с формированием «слизистых кист» вблизи разрушенных капилляров и отсутствие воспалительного ответа. При анализе научной литературы, посвященной патоморфологии криптококковых менингитов, нам удалось обнаружить лишь немногочисленные работы, где была бы представлена характеристика структурных изменений в головном мозге на разных сроках развития криптоккового мениногэнцефалита. При морфологическом исследовании головного мозга мышей на различных сроках эксперимента нами определена последовательность изменений, отражающих различные стадии инфекционного процесса. Так, в опыте с использованием 2-х штаммов разной вирулентности (1166 и 1067) на 3-и сутки в мягкой мозговой оболочке у всех подопытных животных наблюдали незначительную воспалительную инфильтрацию лимфоцитами и единичными нейтрофильными лейкоцитами.

Наряду с этим в микрососудах мягкой мозговой оболочки и веществе мозга – расширение просветов, гомогенизация стенки, набухание и десквамация эндотелия. В коре мозга обнаруживались зоны опустошения, иногда довольно значительные. Преобладал гипоксический тип изменений, однако наряду с этим в наружных слоях коры отмечались тяжлые изменения клеток, сопровождавшиеся вакуолизацией цитоплазмы, рексисом ядер, а так же появлением «тающих» клеток, «клеток – теней». На 7-е сутки в мягкой мозговой оболочке нарастала воспалительная инфильтрация, увеличилось количество нейтрофильных лейкоцитов, в оболочке и веществе головного мозга появились мелкие скопления криптококков, часто наблюдаемые вблизи микрососудов с фрагментированными стенками. На этом же сроке в веществе мозга выявляли характерные для криптококкового поражения очаги «лизиса» содержащие криптококки. Деструктивные изменения (микрокисты), нейронов на 7-е сутки оказались явно более выражены, чем на 3-и сутки.

Слои коры головного мозга часто не определялись, в базальных отделах повсеместно наблюдались тяжлые изменения нейронов вплоть до образования клеток – теней. На 14-е сутки в мягкой мозговой оболочке у большинства животных наблюдали большое число криптококков, обильную воспалительную инфильтрацию. В веществе мозга у всех животных встречались разных размеров очаги «лизиса», содержащие криптококки, вокруг которых были видны сдавленные, вытянутой формы нервные клетки.

Значительные зоны опустошения с лизисом нервных клеток отмечались в базальных отделах и подкорковых ядрах. К 21-м суткам в группе мышей, заражнной высоковирулентным штаммом, деструктивные изменения в мозге продолжали нарастать, в то время как в другой группе, инфицированной менее вирулентным штаммом, наметилась тенденция к уменьшению числа криптококков как в оболочке, так и в веществе мозга, сочетавшаяся с меньшими деструктивными изменениями нервных клеток и более выраженной астроцитарной реакцией. В связи с этим, на основании анализа патоморфологических изменений в головном мозге мышей, мы выделили следующие периоды развития инфекционного процесса и морфологические критерии их оценки: а) ранний (3 сутки), характеризующийся расширением просвета микрососудов, гомогенизацией и набуханием стенки, десквамацией эндотелия, появлением небольших зон опустошения в коре головного мозга, преимущественно гипоксическим типом изменения нервных клеток, б) острый период (7, 14 сутки), в который отмечены деструктивные изменения сосудистой стенки, некрозы эндотелиоцитов, нарастание тяжелых изменений нервных клеток, обширные очаги выпадения в коре головного мозга и в) подострый период (21-е сутки), в который распространенные деструктивные изменения сосудов сочетались с пролиферацией их по периферии очагов поражения и заместительной глиальной реакцией.

Для сопоставления наблюдаемых нейрогистологических изменений в эксперименте было предпринято изучение головного мозга у 4-х умерших от криптококкоза людей. В первом случае (у пациента, перенсшего трансплантацию почки) немногочисленные криптококки и воспалительную инфильтрацию наблюдали в ММО, но не обнаруживали их в веществе мозга.

Артериолы и капилляры часто принимали причудливую, угловатую форму, стенки сосудов были гомогенизированы, эндотелий частично десквамирован, вблизи сосуда и на отдалении - сливающиеся очаги коагуляционного некроза.

В 2-х случаях (криптококковый менингоэнцефалит у женщины на фоне длительной гормональной терапии и у женщины на фоне ожирения и герпетической инфекции) в ММО и в веществе головного мозга обнаруживали скопления криптококков. Характерная локализация, выявляемые фрагменты сосудистой стенки по периферии скоплений криптококков указывали, что эти колонии возбудителей образовались на месте разрушенных микрососудов. В четвртом случае (криптококкоз у мужчины на фоне хронического вирусного гепатита В) выявлены немногочисленные криптококки в оболочке и веществе мозга и морфологические изменения продуктивного характера с наличием гигантских клеток в ММО. В веществе мозга отмечалось интенсивное новообразование сосудов и пролиферация глии. Таким образом, обнаружен широкий спектр патоморфологических изменений в головном мозге, отражающих, вероятно, различные особенности течения криптококковой нейроинфекции, сопоставимых с результатами экспериментальных исследований. Так, поражение стенки микрососудов, обнаружение гипоксического типа изменений нервных клеток могут свидетельствовать о сосудистом генезе некрозов в веществе головного мозга при криптококкозе.

Характер и сроки появления воспалительных инфильтратов в мягкой мозговой оболочке и микрокист в веществе головного мозга во многом совпадают с данными других авторов [Maffei C. et al, 2004;

Chretien F. et al, 2004]. В научной литературе мы практически не нашли данных о динамике и характере поражения нервных клеток на разных этапах криптококковой инфекции за исключением сведений о появлении темных, «сморщенных» клеток в коре головного мозга на ранних сроках криптококкового менингоэнцефалита [Fries B. et al, 2004].

Учитывая выраженные изменения микроциркуляторного русла, а также значительные зоны опустошения в коре головного мозга и тяжлые изменения нервных клеток, часто не связанные с непосредственным присутствием криптококков в веществе мозга, безусловный интерес представляет оценка роли астроцитарной глии – составляющей гематоэнцефалического барьера. С помощью иммуногистохимического окрашивания КФБ мы проследили в динамике изменения астроцитарной глии при криптококкозе в группах мышей, заражнных штаммами 1166 и 1067 на 3-и, 14-е и 21-е сутки. При этом на 3-и сутки можно было наблюдать очаговые скопления астроцитов как в коре, так и в белом веществе головного мозга. В глубоких слоях коры были видны обширные поля с выраженной экспрессией КФБ в набухших и утолщенных отростках астроцитов вокруг капилляров. Вокруг микрососудов как в коре, так и белом веществе хорошо окрашивались не только утолщенные сосудистые ножки, но и их тела и многочисленные ветвящиеся отростки, выявляя очаговые скопления астроцитов. Таким образом, на 3-и сутки мы наблюдали прогрессивные изменения астроцитов, утолщение перикапиллярных отростков вокруг капилляров, что можно расценить как ответную реакцию астроцитов, направленную на укрепление гематоэнцефалического барьера. Подобные изменения астроцитов описаны и другими авторами [Насыров Р.А., 1995, Matsumoto S. et al, 2003;

Li J. et al 2005;

]. На 14-е и 21-е сутки в базальных отделах, в коре головного мозга можно было наблюдать очаговую и диффузную пролиферацию астроцитов, причем как вблизи фокусов лизиса, содержащих криптококки, так и на отдалении;

при этом крупные астроциты с многочисленными ветвящимися утолщенными отростками образовывали значительные скопления. Внутри очагов, содержащих криптококки, можно было видеть крупные астроциты с немногочисленными утолщенными отростками. Наблюдалось некоторое отличие в проявлении астроцитарной активности в головном мозге мышей, зараженных штаммами разной вирулентности. На 14-е и, особенно на 21-е сутки в группе, инфицированной менее вирулентным штаммом 1067, в сравнении с более вирулентным 1166, преобладали прогрессивные изменения астроглии с замещением очагов, содержащих криптококки? астроцитами. (Рис. 1). Криптококки в очагах часто имели признаки дегенеративных изменений – вытянутые, лимонообразные дрожжевые клетки. В то же время в группе, зараженной более вирулентным штаммом 1166 чаще наблюдали их регрессивные формы астроцитов, фрагментацию и распад отростков (клазматодендроз).

Криптококки в очагах «лизиса» были морфологически сохранными с отчтливой капсулой.

Рис.1 Пролиферация астроцитов в головном мозге мышей, инфицированных штамм сутки опыта.

C. neoformans, 1067, 14-е Иммуногистохимическое выявление КФБ. Объектив х40. – астроциты, Таким образом, на основании полученных результатов можно заключить, что в более поздние сроки наряду с барьерной и заместительной функцией, выполняемой астроцитами, наблюдались регрессивные формы, свидетельствующие о срыве протективного эффекта астроцитов.

Несмотря на возросший в последние годы интерес к проблеме патогенеза криптококкоза, в литературе встречаются лишь единичные работы, посвященные сравнительной морфологии при менингитах, вызванных различными по вирулентности штаммами криптококков.

Однако известно, что возбудители криптококкоза значительно различаются по вирулентности и доказано, что патогенность штаммов криптококков зависит от комбинации следующих факторов: способности 37о С, к росту при капсулообразованию, меланинобразованию, фосфолипазной и уреазной активности [Васильева Н.В., 2005]. Данные нашего эксперимента с использованием 4-х штаммов, обладающих различной вирулентностью продемонстрировали, что на 7-е сутки после заражения в группах мышей, инфицированных сильновирулентными штаммами 1090 и 1096, в мягкой мозговой оболочке обнаруживалось большое количество морфологически сохранных криптококков, более выражена оказалась воспалительная инфильтрация;

в двух других группах мышей, инфицированных слабовирулентными штаммами в оболочке были обнаружены единичные дрожжевые клетки. У всех животных в веществе головного мозга наблюдались очаги «лизиса» (микрокисты). Их количество были достоверно больше у мышей, инфицированных (P0,05) сильновирулентными штаммами – 1096 и 1090 (Рис. 2). В головном мозге мышей, инфицированных слабовирулентными штаммами 1178 и вокруг криптококков наблюдалась отчтливая глиальная реакция с частичным замещением очагов поражения. Клетки грибов часто были деформированы, с явными признаками дегенерации.

Известно, что в тканях макроорганизма C. neoformans не только образует полисахаридную капсулу, состоящую, в основном из кислого глюкуроноксиломаннана, но и продуцирует значительное его количество, а возможно, и другие биологически активные вещества. Нет сомнений, что этот биополимер углеводной природы, наряду с другими проявлениями своей биологической активности, обладающий способностью взаимодействовать с лектиновыми рецепторами клеток, может вносить свой вклад в события, которые разворачиваются в ходе инфекционного процесса.

В связи с этим, одной из задач нашего исследования было изучение локализации антигена криптококка с помощью ИГХ метода.

К-во очагов лизиса 25 ±Std. Dev.

±Std. Err.

Высокая Низкая Mean Вирулентность Рис 2. Количество очагов лизиса в головном мозге мышей в зависимости от вирулентности штаммов криптококков.

. Результаты проведнного ИГХ определения капсульного полисахарида в головном мозге показали, что на 3-и сутки после заражения была видна отчтливая экспрессия капсульного антигена криптококка на эндотелии сосудов ММО, микрососудов вещества мозга;

иногда антиген криптококка обнаруживался также в периваскулярной зоне вещества головного мозга (на сосудистых ножках астроцитов). На 7-е сутки отмечено усиление экспрессии исследуемого антигена на эндотелии сосудов мягкой мозговой оболочки и периваскулярно. В веществе мозга антиген также обнаруживался в тесной связи с микрососудами – на эндотелии и в просвете, а также выявлялся в капсуле криптококков. На 14-е сутки помимо нарастания экспрессии антигена в ММО, в микрососудах и периваскулярно, в веществе мозга появилось диффузное пылевидное окрашивание вокруг очагов с криптококками. Такое же распределение антигена сохранялось и на 21-е сутки. Суммируя представленные данные о локализации капсульного антигена, можно отметить, что наибольшая плотность его была выявлена в эндотелии микрососудов ММО, вещества головного мозга, периваскулярной зоне независимо от вирулентности штамма (Рис. 3).

Z1 Z2 Z3 Z4 Z5 Z6 Z нет + ++ +++ Рис. 3 Распределение антигена капсульного полисахарида в структурах головного мозга. Z1 – микрососуды ММО, Z2 – периваскулярное пространство ММО, Z3 – микрососуды головного мозга, Z4 – сосудистые ножки астроцитов, Z5 – нервные клетки, Z6 – капсула криптококков, Z7 – перифокальная экспрессия (вокруг очагов лизиса).

Таким образом, с одной стороны можно отметить преимущественное распространение антигена криптококка в микроциркуляторном русле, а также вокруг очагов лизиса с криптококками, с другой - отчтливые изменения сосудистой стенки как на ранних сроках инфекции (3-и сутки), так и на более поздних сроках (21-е сутки). Основываясь на этих результатах, можно предположить, что капсульный полисахарид вносит свой вклад в патологические изменения микроциркуляторного русла. Аутопсийный материал также был подвергнут иммуногистохимическому исследованию для выявления капсульного полисахарида. Отмечено наличие антигена криптококка не только в капсуле криптококков, но и на стенках микрососудов ММО и вещества головного мозга, а также вокруг очагов лизиса и среди глиальных клеток. Эти данные согласуются с наблюдениями других исследователей, отметивших преимущественную экспрессию антигена криптококка в капиллярах в головном мозге больных с диссеминированным криптококкозом [Lee S. et al, 1995, Chretien F. et al 2004].

Особую ценность представляло применение ИГХ метода выявления капсульного полисахарида при исследовании операционного материала, который представлял собой удалнную опухоль головного мозга у женщины 69 лет, расцененную при гистологическом исследовании как мультиформная глиобластома. Примечательно, что в нескольких срезах, среди некротических масс имелись скопления округлых и овальных клеток, слабо окрашивающихся по Моури в синий цвет. Слабо выраженная капсула, дегенеративные изменения большинства клеток гриба вызывали некоторые сомнения в правильности диагноза криптококкоза. Точный диагноз криптококкоза был поставлен только после применения ИГХ метода, позволившего выявить интенсивную экспрессию антигена криптококка в капсуле, стенке микрососудов, периваскулярно, в строме опухолевой ткани.

Как видно из представленных материалов, для характеристики патогенетических изменений структурных элементов головного мозга при криптококкозе необходим комплексный подход, охватывающий оценку морфологических изменений в системе « кровеносный сосуд-глия-нейрон» с учтом вирулентности криптококков, как одного из факторов, определяющих характер этих изменений.

ВЫВОДЫ 1. При экспериментальном криптококкозе в головном мозге мышей выявлены изменения в каждом из структурных элементов, составляющих систему «сосуд–глия–нейрон», которые характеризуются определнной последовательностью:

а) первичной, наиболее ранней мишенью патогенного воздействия криптококков является эндотелий микрососудов. Деструкция стенки сосуда является основным фактором проникновения криптококков в вещество мозга, нарушения микроциркуляции и развития очагов некроза (инфаркта) головного мозга.

б) набухание перикапиллярных отростков астроцитов, увеличение их числа, гиперплазия тел астроцитов вокруг микрососудов в ранний период криптококковой инфекции, является их протективной реакцией, направленной на укрепление гематоэнцефалического барьера. В подострый период защитная реакция астроглии направлена на замещение очагов поражения.

в) на ранней стадии криптококковой нейроинфекции наблюдались преимущественно дистрофические изменения нейронов, в острый и подострый периоды нарастали тяжлые изменения с необратимыми изменениями ядер. Отмечалась гибель нервных клеток, не имеющих непосредственного контакта с возбудителем.

2. При криптококкозе, вызванном сильно- и слабовирулентными штаммами, обнаружены существенные различия в патоморфологической картине.. При заражении сильновирулентными штаммами в веществе мозга определялось большее число микрокист, заполненных криптококками, в тоже время при заражении слабовирулентными штаммами отмечена более выраженная заместительная глиальная реакция.

3. В головном мозге людей, умерших от криптококковй нейроинфекции выявлен широкий диапазон патоморфологических изменений, отражающих различные варианты развития инфекционного процесса, сопоставимые с экспериментальным криптококкозом.

4. При иммуногистохимическом изучении локализации антигена криптококка выявлена его наибольшая плотность в эндотелии микрососудов мягкой мозговой оболочки, вещества головного мозга, периваскулярной зоне независимо от вирулентности штамма. Капсульный полисахарид на всех сроках опыта не обнаруживался в нервных клетках.

5. Иммуногистохимический метод выявления капсульного антигена является высокоспецифическим и надежным способом диагностики криптококкоза особенно в случаях, обусловленных слабокапсульными штаммами.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ:

1. Диагностический поиск возбудителя в веществе мозга следует проводить с учетом преимущественного поражения криптококком определнных структур и отделов головного мозга: микрососуды мягкой мозговой оболочки, вещества мозга преимущественно базальных отделов.

При длительном течении криптококковой нейроинфекции возбудитель может обнаруживаться внутри гигантских клеток или скоплений астроцитов.

3. Результаты исследования, выявившие важную роль микрососудов в развитии криптококковой нейроинфекции, могут быть приняты во внимание при разработке способов терапии данной патологии.

2. В качестве специфического и надежного способа прижизненной и постмортальной диагностики криптококкоза целесообразно использовать иммуногистохимический метод выявления капсульного полисахарида.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Васильева Н.В. Патоморфологические изменения в головном мозге у мышей, обусловленные воздействием различных штаммов криптококка / Н.В. Васильева, О.К. Хмельницкий, М.Ю. Майская, Е.А. Тилева // Проблемы медицинской микологии. – 2003. – Т 5, № 2. – С. 30-31.

2. Васильева Н.В. Влияние капсульных полисахаридов криптококков на характер патоморфологических изменений в головном мозге мышей, инфицированных С.neoformans / Н.В. Васильева, О.К. Хмельницкий, М.Ю Майская, И.В. Выборнова, Р.А. Насыров // Проблемы медицинской микологии. – 2003. – Т 6, № 2. – С. 66-67.

3. Майская М.Ю. Сравнительная характеристика морфологических изменений в головном мозге мышей, инфицированных различными штаммами С. neoformans / М.Ю.Майская, Н.В.Васильева, О.К.Хмельницкий, Р.А. Насыров // Труды Санкт-Петербургской ассоциации патологоанатомов.

– СПб, 2004. – Вып. 45. – № 2. – С. 41-42.

4. Хмельницкий О.К. Патоморфология криптококкоза головного мозга при иммунодефицитных состояниях различного генеза / О.К. Хмельницкий, Р.А. Насыров, Н.В. Васильева, М.Ю. Майская // Архив патологии. – 2005. – Т. 67. – С. 10-13.

5. Насыров Р.А. Роль астроцитов в патогенезе криптококкоза головного мозга / Р.А. Насыров, М.Ю. Майская // Проблемы медицинской микологии. – 2005. – Т. 7, № 2. – С.107.

Майская М.Ю. Исследование астроцитарной глии при 6.

экспериментальном криптококкозе головного мозга / М.Ю. Майская, Р.А.

Насыров // Терапия инфекционных заболеваний у детей: современные представления и нерешнные вопросы. 11-13 окт. 2005 года. Материалы конференции. – СПб, 2005. – С. 81.

7. Майская М.Ю. Характер патоморфологических изменений в головном мозге мышей под влиянием высоковирулентных и слабовирулентных штаммов Cryptococcus neoformans (Sanfelice) Vuellemin, 1901 / М.Ю.Майская // Проблемы медицинской микологии. – 2006. – Т. 8, № 1. – С. 46-48.

8. Майская М.Ю. Иммуногистохимический метод в диагностике криптококкоза головного мозга / М.Ю. Майская // Проблемы медицинской микологии. – 2006. – Т.8, № 2. – С. 60-61.

9. Майская М.Ю. Сочетание криптококкоза и глиобластомы головного мозга / М.Ю. Майская, Р.А.Насыров, Д.В. Семенихин, Г.В. Мохова // II съезд Российского общества патологоанатомов. Труды, 11-14 апр. 2006 г., Москва.

– М, 2006. – Т. 1. – С. 261-264.