Динамика образования и элиминации фосфорилированного гистона н2ах в клетках млекопитающих после рентгеновского облучения
На правах рукописи
ФИРСАНОВ Денис Владимирович ДИНАМИКА ОБРАЗОВАНИЯ И ЭЛИМИНАЦИИ ФОСФОРИЛИРОВАННОГО ГИСТОНА Н2АХ В КЛЕТКАХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ ПОСЛЕ РЕНТГЕНОВСКОГО ОБЛУЧЕНИЯ 03.03.04 — Клеточная биология, цитология, гистология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Санкт-Петербург 2012
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институт цитологии Российской академии наук Научные руководители: кандидат биологических наук Кропотов Андрей Владимирович Институт цитологии РАН доктор биологических наук, профессор Михайлов Вячеслав Михайлович Институт цитологии РАН
Официальные оппоненты: кандидат биологических наук, доцент Спивак Ирина Михайловна, Институт цитологии РАН доктор медицинских наук, профессор Александров Виктор Николаевич, Военно–медицинская академия им. С.М.Кирова
Ведущая организация: ФГБУ ПИЯФ им. Б.П. Константинова
Защита состоится «26» октября 2012 года в 13 часов на заседании Диссертационного совета Д002.230.01 на базе Института цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., д. 4. Сайт института: http://www.cytspb.rssi.ru;
адрес электронной почты института: [email protected];
факс института: (812) 297-03-
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН
Автореферат разослан «» сентября 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Е.В. Каминская
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Репарация ДНК является фундаментальным клеточным процессом, обеспечивающим стабильность генома. Считается, что ДР ДНК наиболее опасны для дальнейшей судьбы клеток, так как они могут привести к клеточной гибели или неопластической трансформации (Томилин, 2002).
Долгое время оставалось неясным, какие именно факторы обеспечивают правильность воссоединения ДР ДНК. В конце 20–го века было выяснено, что одним из ранних этапов ответа клетки на возникновение ДР после ИО является фосфорилирование гистона Н2АХ по серину 139, которое происходит в мегабазных доменах хроматина вокруг ДР ДНК. Такая фосфорилированная форма Н2АХ носит название Н2АХ, и образующиеся после облучения компактные скопления Н2АХ (фокусы) можно визуализировать в ядрах клеток с помощью специфических антител к фосфорилированному C–концу белка (Rogakou et al., 1998, 1999). Фокусы Н2АХ обнаруживаются также в клетках, обработанных радиомиметиком блеомицином, который используется в противоопухолевой терапии (Tomilin et al., 2001). Фокусы Н2АХ выявляются в клетках уже в первые минуты после ИО. Их количество достигает максимального значения через 30–60 мин и коррелирует с количеством ДР в геноме. Показано, что за фосфорилирование Н2АХ ответственны, по крайней мере, три протеинкиназы: АТМ, DNA–PK и ATR (Motoyama, Naka, 2004;
Stiff et al., 2004). Затем происходит медленная элиминация этих фокусов, коррелирующая с динамикой репарации ДР ДНК (Nazarov et al., 2003;
Svetlova et al., 2007). Время, в течение которого элиминируется 50 % фокусов Н2АХ, образовавшихся после воздействия ИО, прямо пропорционально радиочувствительности клеток, что говорит о возможности использования динамики появления и элиминации Н2АХ как маркера клеточной радиочувствительности (Olive, Banath, 2004). В литературе есть данные, что образование фокусов Н2АХ и их элиминация в клетках крови после прохождения человеком медицинских обследований с использованием рентгеновского излучения может являться полезным биомаркером в определении радиочувствительности пациентов после облучения в дозах порядка ~10 мЗв (Rothkam et al., 2007). При изучении фокусов Н2АХ в лимфоцитах человека после ИО ex vivo было показано, что динамика их элиминации не зависит от возраста испытуемых, что в целом Список основных сокращений ДР ДНК — двунитевой разрыв ДНК, РО — рентгеновское облучение, ИО — ионизирующее облучение, НАДФ — никотинамидадениндинуклеотид фосфат, BSA – бычий сывороточный альбумин, PARP — поли–АДФ–рибоза полимераза, PBS— фосфатно-солевой буфер, ХП — хромосомная перестройка, Гр — грэй, Зв — зиверт, ЭФЧ — эмбриональные фибробласты человека, КТ — комнатная температура.
говорит о стабильности кинетики репарации ДР ДНК (Sedelnikova et al., 2008). Однако динамика образования Н2АХ в начальные моменты времени после ИО ex vivo, которая может служить показателем эффективности клеточного ответа на повреждение генома у испытуемых, изучена не была.
В некоторых органах млекопитающих (тимус, семенники) наблюдается быстрое появление (через 1 ч) и исчезновение Н2АХ (через 24 ч), в других (например, в эпителиальных клетках тонкого кишечника) фосфорилирование проходит дольше, как предполагается из-за различной активности протеинкиназ (Yoshida et al., 2003). В исследованиях на клетках мозга эмбрионов мышей показано быстрое фосфорилирование Н2АХ через 1 ч после ИО, через 24 ч Н2АХ полностью исчезал в нейронах, одновременно наблюдалась апоптотическая гибель клеток–предшественников нейронов (Nowak et al., 2006).
У мышей были показаны различия в уровне образования Н2АХ после ИО между ухом, печенью и почкой, что говорит о тканеспецифичности ответа на повреждения ДНК (Koike et al., 2008). Однако в целом на фоне большого количества исследований образования и элиминации Н2АХ после ИО в клетках, растущих в культуре, данные о динамике Н2АХ в отдельных тканях млекопитающих не достаточно полны.
Известно, что в местах повреждений ДНК активируется PARP, которая рибозилирует белки хроматина вокруг повреждений, используя в качестве субстрата НАД+ (Surjyana et al., 2010). Гиперактивация PARP может привести к значительному уменьшению содержания внутриклеточного НАД+ и гибели клетки путем некроза (Carson et al., 1986), то есть энергетические процессы в клетках могут играть одну из ключевых ролей в ответе на повреждения ДНК и в репарации ДР.
Таким образом, изучение динамики образования и элиминации гистона Н2АХ после ИО в различных модельных системах (культуры клеток, не стимулированные к делению лимфоциты человека, различные органы грызунов) представляется актуальной задачей, как для фундаментальных исследований, так и для практической медицины.
Цели и задачи исследования. Цель данной работы заключалась в изучении динамики образования и элиминации фосфорилированной формы гистона Н2АХ (Н2АХ) после рентгеновского облучения и способов регуляции этих процессов на моделях культивируемых клеток, лимфоцитов здоровых людей и терминально дифференцированных клетках мышей и сирийских хомячков. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
1. Исследовать динамику образования и элиминации Н2АХ в облученных клетках после рентгеновского облучения культуры клеток в дозе 1 Гр;
2. Изучить влияние на динамику образования и элиминации Н2АХ после рентгеновского облучения культуры клеток пищевой добавки форсколина, который активирует аденилатциклазу, приводя к увеличению внутриклеточного содержания цАМФ;
3. Изучить влияние возраста человека на динамику образования фокусов Н2АХ в начальные моменты времени после рентгеновского облучения ex vivo;
4. Исследовать динамику образования и элиминации Н2АХ в сердце, почке, печени и мозге взрослых мышей и сирийских хомячков после тотального рентгеновского облучения животных в дозах 3 и 5 Гр;
5. Изучить влияние на эффективность фосфорилирования гистона Н2АХ в сердце мышей внутрибрюшинного введения НАДФ+ (как одного из способов поддержания внутриклеточного содержания НАД+ после возникновения повреждений ДНК) сразу же после рентгеновского облучения животных в дозе 3 Гр.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Максимальный ответ различных популяций клеток на рентгеновское облучение, выраженный в образовании фосфорилированной формы гистона Н2АХ, происходит через 20–60 мин после воздействия как в системах in vitro и ex vivo, так и in vivo;
2. Предобработка культуры клеток форсколином приводит к снижению уровня фосфорилирования Н2АХ после рентгеновского облучения в дозах 1 и 10 Гр;
3. Между тканями млекопитающих, имеющих низкий уровень пролиферации (сердце, почка, печень, мозг), после рентгеновского облучения в дозах 3 и 5 Гр наблюдаются значимые различия как по уровню образования Н2АХ, так и по эффективности элиминации Н2АХ из хроматина.
Научная новизна работы. Впервые показано, что добавление к клеточной среде за несколько часов до рентгеновского облучения в дозе 1 и 10 Гр форсколина снижает количество фосфорилированного Н2АХ в культивируемых клетках, но не влияет на количество фокусов Н2АХ и частоту хромосомных аберраций, что свидетельствует о неизменности индукции и репарации двунитевых разрывов ДНК. Впервые показано, что возраст человека не влияет на динамику образования фокусов Н2АХ в лимфоцитах периферической крови в первый час после рентгеновского облучения. Впервые показано, что между различными тканями млекопитающих (сердце, почка, печень, мозг) после рентгеновского облучения в дозах 3 и 5 Гр существуют значимые различия как по количеству образованного Н2АХ, так и по эффективности элиминации Н2АХ из хроматина. Впервые НАДФ+ показано, что однократное внутрибрюшинное введение сразу же после рентгеновского облучения в дозе 3 Гр приводит к увеличению количества Н2АХ в сердце мышей. Таким образом, сердце как популяция клеток со сниженной реакцией на рентгеновское облучение может быть стимулировано к более эффективному ответу на облучение.
Личный вклад автора. Все экспериментальные процедуры, описанные в работе, были проведены автором лично. Материалы, вошедшие в представленную работу, обсуждались и публиковались совместно с соавторами и научными руководителями.
Финансовая поддержка работы. Работа проводилась при поддержке РФФИ (гранты № 07–04–00315–а по теме «Эпигенетические модификации гистонов и их роль в контроле репарации, транскрипции и репликации гетерохроматина в клетках млекопитающих», № 10– 04–00807–а по теме «Индуцированное ионизирующей радиацией фосфорилирование гистона Н2АХ в хроматине клеток млекопитающих и его функциональная роль в ответе клеток на повреждение ДНК») и Президиума РАН (Программа «Молекулярно-клеточная биология»).
Научно–практическое значение работы. Полученные результаты вносят вклад в понимание участия Н2АХ в ответе клеток на рентгеновское облучение. Данные о влиянии форсколина и НАДФ на уровень образования и элиминации Н2АХ могут служить платформой для дальнейших исследований, направленных на изучение уровня распределения Н2АХ в местах двунитевых разрывов ДНК, динамики восстановления структуры хроматина и репарации двунитевых разрывов ДНК. Эти процессы, безусловно, играют важную роль в реакции организма на противоопухолевую терапию. Данные о межтканевых вариациях в эффективности образования и элиминации Н2АХ в различных клеточных популяциях in vivo должны быть приняты во внимание при анализе ответа организма на облучение и могут служить основой для клинических исследований с прогностической целью перед проведением радиотерапии, а также для экспресс–скрининга клеточных популяций на радиорезистентность.
Апробация работы. Основные положения работы были представлены на II Съезде общества клеточной биологии совместно с юбилейной конференцией, посвященной 50– летию Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2007), на Всероссийском симпозиуме по биологии клетки в культуре «Культивируемые клетки как основа клеточных технологий» (Санкт-Петербург, 2009), на II Конференции молодых ученых Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2010), на Российско–Швейцарском симпозиуме «Регуляция стабильности генома с помощью репликации и репарации ДНК» (Санкт-Петербург, 2010), на Всероссийской научной конференции молодых ученых «Проблемы биомедицинской науки третьего тысячелетия», посвященной 120–летию со дня основания Института экспериментальной медицины (Санкт-Петербург, 2010), на Международном съезде Немецкого сообщества репарации ДНК (Германия, 2010), на III Конференции молодых ученых Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 2012). Материалы диссертации докладывались и обсуждались на научных семинарах лаборатории стабильности хромосом и клеточной инженерии и группы генетики клеточных популяций Института цитологии РАН.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего _ ссылок. Диссертация изложена на _ страницах и иллюстрирована _ рисунками и _ таблицами.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Линии клеток. Клетки ЭФЧ и фибробласты легких китайского хомячка линии V– были получены из Российской коллекции клеточных культур (Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург).
Клетки ЭФЧ выращивали в пластиковых флаконах при 37 C в среде MEM с добавлением 10 % эмбриональной бычьей сыворотки (FBS), клетки V–79 выращивали в пластиковых флаконах при 37 C в среде RPMI–1640 с 10 % FBS в атмосфере CO2. После образования монослоя во флаконах клетки пересевали в чашки Петри и выращивали на покровных стеклах 24х24 мм при 37 C в атмосфере CO2.
Пациенты. Забор крови из локтевой вены осуществляли у 12 здоровых доноров в возрасте 31–72 лет, проходивших диспансеризацию в Санкт-Петербургской клинической больнице РАН. Пациенты были разделены на две возрастные группы: группа 1 — пациенты в возрасте 31–45 лет (5 человек), группа 2 — пациенты в возрасте 50–72 лет (7 человек). Кровь помещали в пробирку с цитратом натрия.
Выделение лимфоцитов из периферической крови человека. Кровь в объеме 2 мл смешивали с равным объемом PBS и наслаивали на 2 мл фиколла (плотность 1.077) (Биолот, Россия). После этого центрифугировали при 400 g в течение 30–40 мин при 18–20 C. После центрифугирования сначала отбирали с помощью пипетки верхний слой (плазму), а затем новой пипеткой отбирали лимфоциты. К клеткам добавляли 3 объема PBS, после чего их ресуспендировали и осаждали центрифугированием при 100 g в течение 10 мин при 18– 20 оC. Такую отмывку клеток проводили дважды. После этого ресуспедировали лимфоциты в среде RPMI–1640 (со стрептомицином и L–глутамином) с 10 % эмбриональной бычьей сывороткой и инкубировали в CO2–термостате при 37 C.
Работа с материалом от экспериментальных животных. Эксперименты проводили на самцах мышей линии C57Bl/6 весом около 20 г, а также на самцах сирийских хомячков весом около 150 г. Криостатные срезы приготавливали на аппарате Bright Co LTD (Великобритания). Раствор кофермента НАДФ на PBS (концентрация 37.5;
3.8;
0.4;
0. мг/кг) готовили перед каждым экспериментом, разводя порошок НАДФ Na (Reanal, Венгрия) в PBS. Введение НАДФ животным осуществляли внутрибрюшинно сразу же после РО из расчета веса животного. Для каждой временной точки исследовали 3–5 животных.
Рентгеновское облучение. Рентгеновское облучение культивируемых клеток, лимфоцитов периферической крови и животных проводили на аппарате РУМ–17 (200 кВ, мА, фильтр 0.5 мм Cu + 1 мм Al, фокусное расстояние 50 см) при мощности дозы 0.45 Гр/мин.
Непрямой иммунофлуоресцентный анализ. Клетки, выращенные на покровных стеклах, дважды промывали в фосфатно-солевом буфере (PBS) и обрабатывали в течение 3 мин 0.1 %-ным Triton X–100 при КТ.
Лимфоциты смешивали с PBS 1:10 и центрифугировали половину этого объема на цитоспине, специально сконструированном нами на основе центрифуги К23, в течение 10 мин при 2500 об/мин, прикрепляя таким образом взвешенные клетки к предметному стеклу.
Далее препараты фиксировали 2 %–ным раствором формальдегида в PBS в течение 10 мин и инкубировали в 70 %–ном этаноле при +4 оС в течение ночи. Фиксированные клетки отмывали в PBS, обрабатывали 0.5 %-ным Triton X–100 в PBS в течение 15 мин и ополаскивали в PBS. Далее для блокирования неспецифического связывания антител покровные стекла инкубировали в 5 %–ном растворе BSA (Sigma, США) в PBS в течение 30 мин при 37 оС. Антитела растворяли в 1 %–ном растворе BSA, содержащий 0.1 %–ный Tween20. Инкубацию с антителами проводили при 37 оС, между инкубациями стекла отмывали в течение 30 мин в PBS, содержащий 0.1 %–ный Tween20. Клетки инкубировали в смеси мышиных моноклональных антител против Н2АХ (Abcam, США, 1:200) и кроличьих поликлональных антител против PCNA (Santa Cruz, США, 1:50) в течение 1 ч. Вторые поликлональные антитела (козьи против мыши, конъюгированные с Alexa Fluor–568 — Molecular Probes, США, 1:200) смешивали с поликлональными козьими антителами против кролика, конъюгированными с FITC (Molecular Probes, США, 1:200), и инкубировали с клетками в течение 40 мин. Ядра клеток визуализировали при помощи красителя DAPI (0.05 мкг/мл, 10 мин) или SybrGreen (1:500000, 5 мин).
Непрямой иммуногистохимический анализ. Криостатные срезы фиксировали в метанол–этаноле (1:1) в течение 3 мин при -20 оС и подсушивали их 5–15 мин при КТ.
Для перокисидазного–анти–пераксидазного метода стекла отмывали 3 раза по 5 мин в PBS. После этого стекла инкубировали в 30 %–ном метаноле, содержащем 0.03 %–ную Н2О2, в течение 30 мин при КТ. Далее стекла отмывали 3 раза по 5 мин в PBS и блокировали в 1 % ном бычьем сывороточном альбумине в течение 30 мин. После отмывки в PBS стекла инкубировали с первичными поликлональными кроличьими антителами против H2AX (1:200, Abcam, США) при +4 оС в течение ночи. Локализацию антител выявляли с помощью кроличьих антипероксидазных антител и пероксидазы (комплекс PAP, Sigma, США) по описанной ранее схеме (Полак, Ван Норден, 1987).
Для авидин–биотиновой системы стекла инкубировали в течение 5 мин в 1 %–ном растворе Тритон Х–100. Далее препараты отмывали 2 раза по 5 мин в PBS. После этого стекла инкубировали в 70 %–ном метаноле, содержащего 0.3 %–ную Н2О2, в течение 30 мин при КТ. Далее стекла отмывали 3 раза по 5 мин в PBS и блокировали в 8 %–ном бычьем сывороточном альбумине (Sigma, США) в течение 30 мин. Для уменьшения неспецифического связывания стрептоавидина с эндогенным биотином на срезы наносили реагенты Avidin/Biotin Blocking Kit (Zymed Laboratories Inc., Invitrogen, США) согласно предложенной фирмой прописи. После отмывки в PBS стекла инкубировали с первичными поликлональными кроличьими антителами против H2AX (1:200, Abcam, США) при +4 оС в течение ночи. Затем наносили вторичные анти–кроличьи антитела, меченные биотином в разведении 1:100 (Sigma, США), на 1 ч. На срезы наносили стрептоавидин, конъюгированный с пероксидазой, в разведении 1:50 (Sigma, США), на 30 мин. После каждого описанного этапа срезы промывали в PBS 3 раза по 5 мин.
Затем наносили диаминобензидин (10 мг диаминобензидина растворяли в 10 мл PBS и смешивали с 0.5 мл 0.1 %–ного раствора Н2О2 в PBS) на 5 мин. Затем промывали в проточной воде. При слабой реакции срезы дополнительно инкубировали в диаминобензидине с ацетатом кобальта в течение 5 мин и далее отмывали в проточной воде. Ядра докрашивали гематоксилином. Далее срезы обезвоживали в этаноле возрастающей концентрации, проводили через 3 порции ксилола и заключали в канадский бальзам.
Приготовление отпечатков тканей, фиксация и иммуногистохимия для конфокальной микроскопии. После забора органов (мозг и печень) с помощью острой бритвы производили срезы и на предметных стеклах, обработанных полилизином, получали отпечатки тканей. После этого препараты подсушивали 15 мин при КТ.
Далее препараты фиксировали раствором 2 %–ного формальдегида в PBS в течение 20 мин. Затем проводили пермеабилизацию клеток 70 %–ным этанолом, охлажденным до -20 C, в течение 5 мин. На этом этапе препараты помещали в 70 %–ный этанол на +4 C на несколько дней.
Криостатные срезы сердца фиксировали раствором 2 %–ого формальдегида в PBS в течение 20 мин. Затем проводили пермеабилизацию клеток 1 %–ным Triton X–100 в течение 5 мин при КТ.
После этанола или Triton X–100 препараты дважды промывали в PBS по 5 мин. После отмывок, для предотвращения неспецифического связывания антител, препараты инкубировали в 8 %–ном растворе бычьего альбумина (BSA) в PBS в течение 30 мин при 37 C. Далее препараты отмывали 5 мин в PBS. Затем клетки инкубировали с первичными поликлональными кроличьими антителами против H2AX, растворенными в 1 %–ном растворе BSA (1:200) 1 ч при 37 C. После этого препараты дважды промывали в PBS по 5 мин. Далее клетки инкубировали с козьими антителами против кролика, конъюгированными с FITC (1:200), или с козьими антителами против кролика, конъюгированными с Cy2 (1:400), растворенными в 1 %–ном растворе BSA в течение 40 мин при 37 C. После этого препараты трижды промывали в PBS по 5 мин. Ядра клеток окрашивали DAPI (0.05 мкг/мл). Далее клетки заключали в среду CITIFLUOR, препятствующую выгоранию флуоресценции (glycerol/PBS solution, UKS Chemical Laboratories, UK).
Иммуноблоттинг. Органы животных помещали в керамическую ступку и заливали жидким азотом для гомогенизации. После гомогенизации к 5 мг ткани добавляли 300 мкл 4– кратного буфера для электрофореза и кипятили 10 мин при 95 оС.
К культивируемым клеткам добавляли 200 мкл двухкратного буфера для электрофореза и инкубировали в нем клетки 10 мин при 95 оС.
Лимфоциты лизировали в буферном растворе RIPA (20 мМ Трис, рН 7.8, 150 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТА, 0.5 % Triton X–100). Измерения концентрации белка осуществляли методом Брэдфорда.
После центрифугирования пробы разделяли в 15 %–ном полиакриламидном геле (ПААГ) и осуществляли перенос белков на мембраны Hybond–C (Amersham, Швеция) с помощью электроблоттинга. Неспецифическое связывание антител блокировали 5 %–ным сухим молоком в течение ночи при +4 oС. Далее мембраны отмывали в PBS, содержащем 0.1 % Tween–20 (PBST), 2 раза по 10 мин. После этого мембраны инкубировали с первичными моноклональными мышиными антителами против Н2АХ (1:1500, Abcam, США) или первичными поликлональными кроличьими антителами против бета–актина (1:4000, Abcam, США), разведенными в PBST, в течение 2 ч при комнатной температуре.
После трех отмывок по 10 мин в PBST мембраны инкубировали с соответствующими вторичными антителами против IgG мыши или кролика, конъюгированными с пероксидазой (1:15000, Zymax, США), в течение 1 ч при комнатной температуре. Далее мембраны отмывали 3 раза в PBST по10 мин и инкубировали с хемилюминесцентным субстратом (Millipore, США). Интенсивность свечения полос Н2АХ количественно оценивали на иммуноблотах с помощью программы ImageJ.
Приготовление метафазных пластинок хромосом. К культуральной среде добавляли демиколцин в концентрации 1 мкг/мл (Sigma) на 3 ч, после чего клетки снимали 0.25 %–ным раствором трипсин/ЭДТА (Life Technologies). Далее клетки обрабатывали гипотоническим раствором в течение 22 мин (0.075 M KCl/1 % цитрат Na, 1:1) при 37 оС и фиксировали охлажденной до -20 оС смесью метанол/уксусная кислота (3:1) в течение 40 мин при +4 оС. После этого клетки раскапывали на чистые предметные стекла и высушивали.
Метафазные пластинки окрашивали раствором Гимза (Merck) в PBS. Для каждой временной точки анализировали не менее 100 пластинок.
ПЦР в реальном времени. Реакцию ПЦР в реальном времени проводили на аппаратуре Applied Biosystems 7500. РНК органов сердца, печени и почки мышей выделяли с помощью набора реагентов РИБОЗОЛЬ (AmpliSens, Москва). Обратную транскрипцию проводили при помощи набора Fermentas (K1621) с использованием Oligo–dT праймера в соответствии с инструкцией производителя. Амплификацию мышиной кДНК на Н2АХ проводили с использованием праймеров 5’–TGCTTCAGCTTGGTGCTTAG–3’ и 5’– CGACAGGGTCAACTGGTATG–3’, мышиной кДНК на DNA–PK с использованием праймеров 5’–CTTGCCTCCCGATGTTCTC–3’ и 5’–TCCCAAAACTCCTTCTCAGC–3’, мышиной кДНК на АТМ с использованием праймеров 5’–GGAATTTCTGAGTGGCATTTGG– 3’ и 5’–ACCTTCACCGCCTTTTCTAG –3’, контрольная кДНК на бета–актин с использованием праймеров 5’–CATCCGTAAAGACCTCTATGCC–3’ и 5’– GACTCATCGTACTCCTGCTTG–3’ кДНК на GAPDH 5’–TGTGTCCGTCGTGGATCTGA–3’ и 5’–CTCCTGCGACTTCAACAGCAA–3’. Амплификацию в реальном времени проводили с использованием набора фирмы Syntol, содержащего SYBR Green и ROX. Концентрации праймеров были оптимизированы для получения высокой эффективности реакции (наклон кривой для всех праймеров в пределах –3.3 и –3.6, значение R2 более 0.98) и исключения амплификации димеров праймеров.
Микроскопический анализ. Конфокальные изображения клеток получали с помощью конфокальной лазерной сканирующей системы LSM 5 Pascal и Leica SP5. На каждом препарате анализировали 100 ядер клеток. Подсчет фокусов H2AX и определение средней площади, занимаемой фокусом в ядре, осуществляли с помощью программы IpLab (Scananalytics, Inc.) Статистическую обработку (вычисление среднего значения, стандартного отклонения, ошибки среднего, t–тест) проводили с помощью программы Excel и Statistica 6.0.
Принят 5 %–ный уровень значимости.
РЕЗУЛЬТАТЫ Исследование фокусов H2AX в клеточных культурах после рентгеновского облучения. С помощью специфических антител была исследована динамика образования и элиминации фокусов H2AX в различных клеточных культурах. В клетках ЭФЧ и линии V–79 фокусы H2AX можно было обнаружить уже через 10 мин после облучения в дозе 1 Гр;
количество фокусов, а также площадь, занимаемая фокусами, и средняя интенсивность свечения фокусов возрастали в период от 15 до 60 мин;
после чего начиналась их элиминация (рис.1). Максимум числа фокусов был зафиксирован через 1 ч после облучения. Фокусы были обнаружены и через 5 ч после облучения, и их количество оставалось выше, чем в необлученных клетках. В клетках обеих линий элиминация половины фокусов H2AX происходит через 3 ч после достижения их максимального значения, как это видно на рис. 1.
Среднее число фокусов H2AX на ядро ± стандартная ошибка Рис.1. Зависимость количества фокусов H2AX от времени после Клетки линии V- Клетки ЭФЧ рентгеновского облучения в клетках линии V–79 и ЭФЧ.
0 10 15 30 60 120 180 240 Время после рентгеновского облучения (1 Гр), мин Форсколин снижает уровень фосфорилирования гистона Н2АХ в клетках человека после ионизирующего облучения. После обсчета изображений клеток ЭФЧ после РО в программе ImageJ мы обнаружили, что добавление форсколина в концентрации 10-4 М перед РО в дозе 1 Гр приводит к уменьшению интенсивности свечения Н2АХ через 1 ч после облучения, однако не изменяет ее относительное уменьшение к 3 ч после облучения (рис.2).
А Б Рис 2. Фокусы Н2АХ в облученных клетках ЭФЧ через 1 и 3ч после облучения в дозе 1 Гр А: без обработки форсколином;
Б: обработка 10-4 М форсколином за 3 ч до облучения. Масштабная линейка 15 мкм.
Для подтверждения этих данных мы изучили формирование Н2АХ в клетках ЭФЧ с помощью методики иммуноблоттинга. Обработка клеток форсколином за 24 ч до облучения проводила к заметному подавлению образования Н2АХ. Такой же эффект, хотя и в меньшей степени, наблюдали при обработке форсколином за 3 ч до облучения (рис.3).
Рис.3. Индукция Н2АХ в клетках ЭФЧ после облучения в дозе 5 Гр и обработки форсколином. Форсколин (Ф) добавляли в среду с клетками в концентрации 10-4 М за 3 ч (А) или за 24 ч (Б) до облучения, и оставляли их в той же среде после облучения. Клетки инкубировали в течение 1 ч (А— 3,4;
Б — 2,3) или 3 ч после облучения (А— 5, 6). Необлученный контроль показан на полосах А— 1,2 и Б — 1.
На рис.4 представлены данные анализа площади, занимаемой фокусами Н2АХ, и их количества через 1 и 3 ч после облучения. Видно, что предобработка клеток форсколином приводит к уменьшению площади, занимаемой фокусами Н2АХ, однако не влияет на количество фокусов. Эти наблюдения говорят о том, что форсколин, вероятно, влияет на количество молекул Н2АХ фосфорилированного вокруг ДР, но не влияет на изменение количества ДР.
Рис.4. Количество H2AX в клетках ЭФЧ через 1 и 3 ч после РО при добавлении к клеточной среде форсколина (Ф) в концентрации 10-4 М.
Мы предположили, что интенсивность фосфорилирования Н2АХ вокруг каждого ДР может влиять на точность репарации ДР. Однако мы обнаружили, что форсколин не влияет на количество хромосомных аберраций, вызванных радиацией (табл.1).
Таблица 1. Частота хромосомных аберраций в облученных клетках ЭФЧ Клетки с аберрациями, % Изучаемая группа Среднее число хромосомных разрывов на метафазу ± стандартное отклонение Необлученный контроль 3 0.04 ± 0. Необлученный 2 0.02 ± 0. контроль+Форсколин Облучение 1 Гр 19 0.24 ± 0. Облучение 1 Гр + Форсколин 20 0.27 ± 0. В каждом варианте было проанализировано 100 метафазных пластинок. Различия между контролем (без предварительной обработки форсколином) и опытом (предобработка форсколином) статистически не достоверны.
Форсколин активирует протеинкиназу А (РКА), которая в свою очередь может фосфорилировать и активировать протеинфосфатазу 2А (РР2А) (Ahn et al., 2007). Эта фосфатаза колокализуется с фокусами Н2АХ и вовлечена в дефосфорилирование Н2АХ (Chowdhury et al., 2005). Стимулирование форсколином РР2А может увеличивать уровень дефосфорилирования Н2АХ после репарации ДР и, следовательно, уменьшать количество Н2АХ в ядрах.
Фосфорилирование гистона Н2АХ в лимфоцитах человека. Методом иммунофлуоресценции мы исследовали динамику образования фокусов Н2АХ в лимфоцитах, выделенных из периферической крови доноров, после облучения in vitro в дозе 1 Гр. Количество фокусов Н2АХ через 15, 60 и 120 мин после РО в обеих возрастных группах не различалось. Максимальное количество фокусов Н2АХ наблюдали через 1 ч после облучения в обеих группах (рис. 5).
Среднее количество фокусов Рис.5. Фокусы Н2АХ после 14, Н2АХ+/- станд.ошибка 12, рентгеновского облучения в дозе 1 Гр в 10, Возраст 30- лимфоцитах доноров двух различных 8,00 лет Возраст 50 лет 6, возрастных групп.
4, 2, 0, 0 0,25 1 Время после облучения, часы При исследовании количества фосфорилированного гистона Н2АХ, наблюдаемого после облучения лимфоцитов в дозе 10 Гр, с помощью иммуноблоттинга было обнаружено, что максимальное его количество фиксировалось через 1 ч и не зависело от возраста доноров (рис. 6). Однако через 15 мин после РО интенсивность полос Н2АХ, относящихся к донорам разного возраста (2 и 6), сильно различалась.
Рис.6. Н2АХ в лимфоцитах индивидуумов различного возраста через 15 (2,6), (3,7) и 120 (4,8) мин после РО Донор А, 31 год (дорожки 1–4) и донор В, 68 лет (дорожки 5–8).
В настоящее время многие исследователи связывают радиоустойчивость клеток с динамикой элиминации Н2АХ, но мы полагаем, что не менее важным критерием в определении радиочувствительности является скорость ответа клетки на возникновение ДР ДНК — активность фосфорилирования Н2АХ после воздействий, повреждающих ДНК.
Межтканевые вариации в эффективности фосфорилирования гистона Н2АХ у мышей C57Bl после рентгеновского облучения. В нашей работе мы сравнивали динамику образования и исчезновения фосфорилированного гистона H2AX после РО в ядрах терминально дифференцированных клеток животных, перенесших РО в дозе 3 Гр (табл. 2).
Было обнаружено, что клетки миокарда левого желудочка по сравнению с клетками эпителия извитых почечных канальцев характеризуются как более интенсивным уровнем образования Н2АХ, так и более медленным процессом элиминации гистона Н2АХ после РО.
Таблица 2. Динамика образования и исчезновения Н2АХ после РО в ядрах терминально дифференцированных клеток мышей, перенесших РО в дозе 3 Гр Тип клеток Количество клеток, % Время после облучения контроль 20’ 40’ 60’ 6ч 23 ч Клетки 3.1±0.7 47.1±4.6* 42.6±3.9* 30.5±7.0* 29.0±3.4* 24.8±1.5* миокарда Эпителий 5.3±0.8 15.3±4.6* 34.6±2.3* 27.3±4.0* 22.4±4.4* 4.3±2. извитых почечных канальцев Приведены средние результаты по 5 опытам, ± ошибка средней;
* — статистически значимые различия в сравнении с контролем (P0.05).
Так как популяция клеток сердца гетерогенна и кроме кардиомиоцитов в ней содержатся и другие типы клеток, возникла необходимость дифференцировать мышечные клетки миокарда от немышечных, чтобы определить, в каких именно клетках наблюдается медленная элиминация Н2АХ. Для дискриминации мышечных и немышечных клеток была применена одновременная окраска срезов антителами против Н2АХ и –актина. Результаты показали, что через 23 ч после облучения в 86 % Н2АХ–позитивных клеток выявились и белки сократительного аппарата, т.е. они являлись кардиомиоцитами (рис. 7).
Рис.7. Н2АХ и –актин–положительные клетки в миокарде мышей через 24 ч после РО.
Объектив 60х.
Методом иммуноблоттинга тотальных лизатов белков из сердца, мозга, печени и почки мы показали, что через 1, 3 и 5 ч после облучения животных в дозе 3 Гр уровень сигнала Н2АХ в сердце и мозге был значительно меньше, чем в почке (рис.8).
Рис.8. Н2АХ в органах мыши после рентгеновского облучения. В качестве контроля (кон) нанесения тотальных лизатов белков использовался бета–актин.
Для определения причины этих различий методом ПЦР в реальном времени был определен уровень экспрессии Н2АХ, киназ АТМ, и DNA–PK и показано, что у необлученных мышей в почке уровень экспрессии киназ достоверно выше, чем в сердце и мозге (рис.9). Интересно, что в печени уровень экспрессии киназ сильно понижен, что может указывать на альтернативный механизм фосфорилирования Н2АХ в печени (рис.9).
Рис.9. Экспрессия генов Н2АХ, DNA–PK и АТМ в тканях сердца, почки, мозге и печени определенная методом ПЦР в реальном времени.
В каждом случае уровень экспрессии соответствующего гена был нормирован к *— уровню экспрессии в сердце.
статистически значимые различия в сравнении с контролем сердца (P0.05).
По всей видимости, различные типы клеток, представленные в одном органе, по– разному отвечают на РО. С помощью иммуноблоттинга мы наблюдаем общий ответ органа от всех типов клеток, не дифференцируя клеточную популяцию. Можно предположить, что в сердце такой ответ отражает неэффективное образование Н2АХ в местах ДР. Однако по данным иммуногистохимического анализа в миокарде процент Н2АХ–положительных клеток значительно выше, чем в клетках извитых канальцев через 20 мин после РО, что указывает на эффективный ответ клеток миокарда на образование ДР ДНК. Тем не менее нельзя исключить, что количество молекул Н2АХ, образующихся в местах ДР в клетках миокарда значительно меньше в связи с низкой активностью ферментов. Исходя из наших данных, можно предположить, что заниженный уровень экспрессии киназы DNA–PK в сердце может быть причиной как неэффективного образования Н2АХ, так и его замедленной элиминации в миокарде после РО, что коррелирует с данными литературы (Koike et al., 2008).
Динамика образования и элиминации Н2АХ в тканях сирийского хомячка после рентгеновского облучения. Мы определяли динамику элиминации фокусов Н2АХ в сердце, мозге и печени, анализируя долю ядер, содержащих фокусы Н2АХ, на модели сирийских хомячков (табл. 3). В клетках миокарда хомячков элиминация фокусов Н2АХ была сильно замедленной по сравнению с клетками печени и в меньшей мере с клетками головного мозга.
Таблица 3. Динамика образования и исчезновения Н2АХ после РО в ядрах терминально дифференцированных клеток хомячков, перенесших РО в дозе 5 Гр Тип клеток Количество клеток, % Время после облучения, часы контроль 1 Клетки миокарда 5.2 %±0.7 46%±3.3* 23.8%±1.4* Клетки мозга 2.2 %±0.6 34.1%±3.7* 7.4%±0.5* Клетки печени 4.6 %±0.9 25.8%±4.1* 4.7% ±0. Приведены средние результаты по 3 опытам, ± ошибка средней;
* — статистически значимые различия в сравнении с контролем (P0.05).
При одновременной окраске антителами против Н2АХ и 53ВР1 было показано, что в миокарде хомячков через 24 ч после РО в дозе 5 Гр фокусы Н2АХ колокализуются с репарационным белком 53ВР1, что подтверждает представление о том, что остаточные фокусы Н2АХ в клетках сердца через 24 ч после облучения локализуются в местах персистирующих ДР ДНК (рис.10).
А Б В Рис.10. Н2АХ и 53BP1 на срезах сердца сирийских хомячков. Необлученный контроль (А), через 1 ч (Б) и 24 ч (В) после РО в дозе 5 Гр соответственно. Н2АХ — зеленый, 53ВР1— красный, ядра окрашены DAPI (синий). Стрелками показана колокализация двух белков. Масштабная линейка 2.5 мкм.
Непролиферирующие ткани (сердце и мозг) содержат клетки (кардиомиоциты и нейроны), которые не вступают в митоз в постнатальном периоде. Митотическое деление кардиомиоцитов также не реактивируется при регенерации (Rumyantsev, 1963).
Пролиферация кардиомиоцитов мышей постепенно снижается во время позднего пренатального развития и в конце концов останавливается через 3 нед после рождения (Ерохина, 1968). Клетки почки и печени также имеют низкий уровень пролиферации, однако клетки этих тканей способны к делению при регенерации. Показано, что клетки эпителия почечных канальцев здоровых крыс могут вступать в пролиферацию (Vogetseder et al., 2005).
Была также показана высокая пролиферативная активность гепатоцитов после гепатэктомии у крыс (Fabrikant, 1968). По нашим данным, наиболее выраженный ответ на РО наблюдается в печени и почке, где гистон H2АХ фосфорилируется (а H2AX дефосфорилируется) более эффективно, чем в сердце и мозге. Наши результаты позволяют предположить, что эффективность образования и элиминации H2AX в тканях млекопитающих коррелирует с их пролиферативным потенциалом. Точность репарации ДР очень важна, так как неправильная репарация может привести к генетическим дефектам или гибели клетки (Lobrich et al., 2000). Возможно, что медленная репарация ДР в клетках сердца и мозга отражает точность репаративных процессов. Радиорезистентность этих органов согласуется с этой точкой зрения. Однако для подтверждения этой гипотезы требуются дополнительные исследования.
НАДФ+ Однократное внутрибрюшинное введение мышам приводит к увеличению уровня Н2АХ в сердце после рентгеновского облучения животных. Было обнаружено, что однократное внутрибрюшинное введение НАДФ+ в дозе 37.5 мг/кг сразу же после РО в дозе 3 Гр приводит через 20 мин к достоверному увеличению количества Н2АХ в сердце (~ в 2.3 раза) по сравнению с контрольной группой облученных мышей (рис.11).
Доза 0.4 мг/кг достоверно увеличивала количество Н2АХ ~ в 2 раза. Исследовав дозу 0.04 мг/кг, мы не получили сколь–либо значимых изменений в уровне фосфорилирования гистона Н2АХ в сердце мышей после РО.
Рис.11. Уровень накопления Н2АХ в сердце мышей через 20 мин после РО при введении НАДФ+ в дозе 37.5 мг/кг сразу же после РО.
На рис. 11 видно, что введение НАДФ+ в дозе 37.5 мг/кг приводит к увеличению уровня Н2АХ в сердце мышей через 20 мин после РО в сравнении с контрольными.
Окрашивание криостатных срезов сердец мышей показало, что после РО и введения НАДФ+ в дозе 37.5 мг/кг сразу же после РО в дозе 3 Гр через 20 мин после воздействия наблюдается образование ~82 % Н2АХ–положительных ядер, в облученном контроле ~42 %.
Сопоставляя данные, полученные разными методами, можно предположить, что однократное внутрибрюшинное введение НАДФ+ в широком диапазоне доз сразу же после РО приводит к повышенному уровню фосфорилирования гистона Н2АХ в клетках миокарда мышей в местах ДР ДНК.
Можно предположить, что увеличение уровня Н2АХ происходит из–за повышенной активности участвующей в репарации ДР протеинкиназы DNA–PK, которая образует макромолекулярный комплекс с сиртуином SIRT6, принимающим активное участие в репарации ДНК и использующий НАД+ в качестве субстрата (McCord et al., 2009). Для уточнения механизма действия НАДФ+ на уровень образования Н2АХ необходимы дальнейшие исследования. Остается пока не ясным, влияет ли повышение уровня Н2АХ на эффективность репарации ДР ДНК в кардиомиоцитах и связан ли уровень Н2АХ с их гибелью после облучения.
По результатам вышеизложенного можно сделать заключение, что между тканями млекопитающих, имеющих низкий уровень пролиферации (сердце, почка, печень, мозг), после рентгеновского облучения в дозах 3 и 5 Гр наблюдаются значимые различия как по уровню образования Н2АХ, так и по эффективности элиминации Н2АХ из хроматина.
Элиминация фокусов Н2АХ в клетках миокарда сильно замедлена по сравнению с клетками других органов. Максимум фосфорилирования гистона Н2АХ в ответ на рентгеновское облучение в различных популяциях клеток отмечается в пределах 1 ч после воздействия.
Предобработка культуры клеток форсколином приводит к снижению уровня фосфорилирования Н2АХ после рентгеновского облучения в дозах 1 и 10 Гр.
ВЫВОДЫ 1. Максимальный ответ различных популяций клеток на рентгеновское облучение, выраженный в образовании фосфорилированной формы гистона Н2АХ (Н2АХ), наблюдается через 20–60 мин после воздействия как в системах in vitro и ex vivo, так и in vivo.
2. Предобработка культуры клеток форсколином приводит к снижению уровня фосфорилирования Н2АХ после рентгеновского облучения в дозах 1 и 10 Гр.
3. Добавление к клеткам форсколина до облучения не влияет на количество фокусов Н2АХ и частоту хромосомных аберраций после рентгеновского облучения в дозе 1 Гр.
4. Возраст доноров, не влияет на динамику образования фокусов Н2АХ в лимфоцитах, облученных ex vivo.
5. Между различными тканями млекопитающих (сердце, почка, печень, мозг) после рентгеновского облучения в дозах 3 и 5 Гр наблюдаются значимые различия как по уровню образования Н2АХ, так и по эффективности элиминации Н2АХ из хроматина;
6. При однократном внутрибрюшинном введении мышам НАДФ+ после облучения в дозе 3 Гр наблюдается увеличение уровня Н2АХ в сердце.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Фирсанов Д.В., Гаврилов Б.А. 2006. Динамика фосфорилирования гистона Н2АХ как ответ клеток на ионизирующее облучение. XXXIV неделя науки СПбГПУ 28 ноября – декабря 2005 года. Материалы Всероссийской межвузовой научно-технической конференции студентов и аспирантов. 16–17.
2. Gavrilov B., Vezhenkova I., Firsanov D., Solovjeva L., Svetlova M., Mikhailov V., Tomilin N. 2006. Slow elimination of phosphorylated histone gamma-H2AX from DNA of terminally differentiated mouse heart cells in situ. Biochem. Biophys. Res. Commun. 347(4): 1048– 1052.
3. Гаврилов Б.А., Фирсанов Д.В., Веженкова И.В., Соловьева Л.В., Михайлов В.М., Томилин Н.В. 2007. Выявление фосфорилированного гистона Н2АХ в дифференцированных клетках после рентгеновского облучения. Доклады Академии наук. 414(1): 123–125.
4. Фирсанов Д.В., Гаврилов Б.А., Михайлов В.М., Томилин Н.В. 2007. Динамика элиминации фосфорилированного гистона –Н2АХ из ДНК в дифференцированных клетках мозга и печени золотистого хомячка in situ. Тезисы докладов II Cъезда Общества клеточной биологии совместно с Юбилейной конференцией, посвященной 50–летию Института цитологии РАН, 17–19 октября. Цитология. 49(9): 801.
5. Svetlova M.P., Solovyeva L.V., Firsanov D.V., Tomilin N.V. 2008. –H2AX foci do not colocalize with repressive histone modifications and transcription sites in X-irradiated mammalian cells. DNA Repair 2008 10th Biennial Meeting of the DGDR September 2–5, Berlin, Germany.
Abstract
Book. 100.
6. Solovjeva L.V., Pleskach N.M., Firsanov D.V., Svetlova M.P., Serikov V.B., Tomilin N.V.
2009. Forskolin decreases phosphorylation of histone H2AX in human cells induced by ionizing radiation. Radiat. Res. 171(4): 419–424.
7. Svetlova M.P., Solovyeva L.V., Pleskach N.M., Firsanov D.V., Serikov V.B., Tomilin N.V. 2009. Forskolin affects -H2AX foci formation after the action of ionizing radiation on mammalian cells. International Simposium «DNA Damage Response and Repair Mechanism» April 20–23, Crete, Greece. Abstract Book. 46.
8. Фирсанов Д.В., Михайлов В.М., Томилин Н.В. 2009. Межтканевые вариации в эффективности элиминации гистона гамма-Н2АХ в тканях после рентгеновского облучения.
Тезисы докладов Всероссийского симпозиума «Культивируемые клетки как основа клеточных технологий» 12–14 октября. Цитология 51 (9): 789.
9. Фирсанов Д.В., Михайлов В.М. Возможное участие никотинамидаадениндинуклеотида (НАД) в репарации ДНК. 2010. Тезисы докладов и сообщений, представленных на II Конференцию молодых ученых Института цитологии РАН 15–16 февраля. Цитология. 52(6): 510.
10. Firsanov D.V., Mikhailov V.M. 2010. Exogenous injection of nicotinamidadenindinucleotide changes the levels of histone H2AX phosphorylation/dephosphorylation in mouse heart cells after ionizing radiation. Russian-Swish Workshop «Regulation of genome stability by DNA replication and repair» July 5–9, Saint Petersburg. 50.
11. Firsanov D., Kropotov A., Mikhailov V. 2010. Exogenous nicotinamide adenine dinucleotide changes the kinetics of histone H2AX phosphorylation in mouse heart cells after ionizing radiation. 11th biannual international meeting of DGDR September 7–10, Jena, Germany.
Abstract book.
12. Фирсанов Д.В., Михайлов В.М. Никотинамид аденин динуклеотид как возможный регулятор репарации ДНК. 2010. Медицинский Академический журнал. 10 (5): 221.
13. Фирсанов Д.В., Кропотов А.В., Михайлов В.М. 2011. НАДФ увеличивает уровень фосфорилированного гистона Н2АХ в сердце мышей после рентгеновского облучения.
Цитология. 53(4): 355–358.
14. Фирсанов Д.В., Кропотов А.В., Томилин Н.В. 2011. Фосфорилирование гистона Н2АХ в лимфоцитах человека как возможный показатель эффективности клеточного ответа на радиационное повреждение генома. Цитология. 53(7): 586–590.
15. Firsanov D.V., Solovjeva L.V., Svetlova M.P. 2011. H2AX phosphorylation at the sites of DNA double-strand breaks in cultivated mammalian cells and tissues. Clinical Epigenetics. 2:
283–297.
16. Фирсанов Д.В., Кропотов А.В., Михайлов В.М. 2012. Динамика образования и элиминации гистона –Н2АХ в клетках млекопитающих после рентгеновского облучения.
Тезисы докладов и сообщений, представленных на III Конференцию молодых ученых Института цитологии РАН 15-16 мая. Цитология. 54(4): 360–361.
17. Firsanov D., Vasilishina A., Kropotov A., Mikhailov V. 2012. Dynamics of Н2АХ formation and elimination in mammalian cells after X–irradiation. Biochimie. 94: 2415–2421.
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ Ерохина И.Л. 1968. Динамика пролиферации клеточных элементов дифференцируещегося миокарда мыши. Цитология 10 (11): 1391–1409.
Полак Д., Ван Норден С. 1987. Введение в иммуноцитохимию: современные методы и проблемы. М., Мир, 78 с.
Томилин Н.В. 2002. Репарация двунитевых разрывов ДНК и стабильность хромосом в клетках высших эукариот. В кн.: Бреслеровские чтения. СПб: Наука. 70–84.
Ahn J.H., McAvoy T., Rakhilin S.V., Nishi A., Greengard P., Nairn A.C. 2007. Protein kinase A activates protein phosphatase 2A by phosphorylation of the B56delta subunit. Proc. Natl.
Acad. Sci. U S A. 104(8): 2979–2984.
Carson D.A., Seto S., Wasson D.B., Carrera C.J. 1986. DNA strand beaks, NAD metabolism, and programmed cell death. Exp. Cell Res.164: 273–281.
Chowdhury D., Keogh M.C., Ishii H., Peterson C.L., Buratowski S., Lieberman J. 2005.
gamma–H2AX dephosphorylation by protein phosphatase 2A facilitates DNA double–strand break repair. Mol. Cell 20(5): 801–809.
Fabrikant J.I. 1968. The kinetics of cellular proliferation in regenerating liver. J. Cell Biol.
36(3): 551–565.
Koike M., Mashino M., Sugasawa J., Koike A. 2008. Histone H2AX phosphorylation independent of ATM after X–irradiation in mouse liver and kidney in situ. J. Radiat. Res. (Tokyo) 49(4): 445–449.
Lbrich M., Khne K., Rothkamm K. 2000. Joining of correct and incorrect DNA double strand break ends in normal human and ataxia telangiectasia fibroblasts. Genes. Chromosomes and Cancer 27: 59–68.
McCord R.A., Michishita E., Hong T., Berber E., Boxer L.D., Kusumoto R., Guan S., Shi X., Gozani O., Burlingame A.L., Bohr V.A., Chua K.F. 2009. SIRT6 stabilizes DNA–dependent protein kinase at chromatin for DNA double–strand break repair. Aging (Albany NY), 1, 109–121.
Motoyama N. and Naka K. 2004. DNA damage tumor suppressor genes and genomic instability. Curr. Opin. Genet. Dev. 14: 11–16.
Nazarov I.B., Smirnova A.N., Krutilina R.I., Svetlova M.P., Solovjeva L.V., Nikiforov A.A., Oei S.L., Zalenskaya I.A., Yau P.M. and Tomilin N.V. 2003. Dephosphorylation of histone gamma– H2AX during repair of DNA double–strand breaks in mammalian cells and its inhibition by calyculin A. Radiat. Res. 160, 309–317.
Nowak E., Etienne O., Millet P., Lages C.S., Mathieu C., Mouthon M.A., Boussin F.D.
2006. Radiation–induced H2AX phosphorylation and neural precursor apoptosis in the developing brain of mice. Radiat. Res. 165(2): 155–164.
Olive P.G. and Banath J.P. 2004. Phosphorylation of histone H2AX as a measure of radiosensitivity. Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys., 58 (2): 331–335.
Rogakou E.P., Boon C., Redon C., Bonner W.M. 1999. Megabase chromatin domains involved in DNA double–strand breaks in vivo. J. Cell Biol. 146(5):905–916.
Rogakou E.P., Pilch D.R., Orr A.H., Ivanova V.S., Bonner W.M. 1998. DNA double– stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J. Biol. Chem. 273(10):
5858–5868.
Rothkamm K., Balroop S., Shekhdar J., Fernie P., Goh V. 2007. Leukocyte DNA damage after multi-detector row CT: a quantitative biomarker of low–level radiation exposure. Radiology.
242(1): 244–251.
Rumyantsev P.P. 1963. A morphological and autoradiographical study of the peculiarities of differentiation rate, DNA synthesis and nuclear division in the embryonal and postnatal histogenesis of cardiac muscles of white rats. Folia Histochem. Cytochem. 1: 463.
Sedelnikova O.A., Horikawa I., Redon C., Nakamura A., Zimonjic D.B., Popescu N.C., Bonner W.M. 2008. Delayed kinetics of DNA double–strand break processing in normal and pathological aging. Aging Cell 7(1):89-100.
Stiff, T., O’Driscoll, M., Rief, N., Iwabuchi, K., Lobrich, M., and Jeggo, P. A. 2004. ATM and DNA-PK function redundantly to phosphorylate H2AX after exposure to ionizing radiation.
Cancer Res. 64: 2390–2396.
Surjana D., Halliday G.M., Damian D.L. 2010. Role of nicotinamide in DNA damage, mutagenesis, and DNA repair. J. Nucleic Acids. 1–13.
Svetlova M., Solovjeva L., Nishi K., Nazarov I., Siino J., Tomilin N. 2007. Elimination of radiation–induced gamma–H2AX foci in mammalian nucleus can occur by histone exchange.
Biochem. Biophys. Res. Commun. 358(2): 650–654.
Tomilin N.V., Solovjeva L.V., Svetlova M.P., Pleskach N.M., Zalenskaya I.A., Yau P.M., Bradbury E.M. 2001. Visualization of focal nuclear sites of DNA repair synthesis induced by bleomycin in human cells. Radiat. Res. 156(4): 347–354.
Vogetseder A., Karadeniz A., Kaissling B., Le Hir M. 2005. Tubular cell proliferation in the healthy rat kidney. Histochem. Cell Biol. 124 (2): 97–104.
Yoshida K., Yoshida S.H., Shimoda C., Morita T. 2003. Expression and radiation–induced phosphorylation of histone H2AX in mammalian cells. J. Radiat. Res. (Tokyo) 44(1): 47–51.