Роль шаперона hsp70 в реакции опухолевых клеток с повышенной экспрессией протоонкогена myc на действие противоопухолевых препаратов
На правах рукописи
КОМАРОВА Елена Юрьевна Роль шаперона Hsp70 в реакции опухолевых клеток с повышенной экспрессией протоонкогена Myc на действие противоопухолевых препаратов 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Санкт-Петербург 2010 22
Работа выполнена в Лаборатории защитных механизмов клетки Института цитологии РАН, Санкт-Петербург
Научный консультант: доктор биологических наук Ирина Владимировна Гужова Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Валерий Анатольевич Поспелов Институт цитологии РАН, Санкт-Петербург доктор биологических наук, профессор Андрей Петрович Перевозчиков Институт экспериментальной медицины РАМНБ, Санкт-Петербург
Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук, Институт биоорганической химии им. акад. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова, Москва
Защита состоится «23» апреля 2010 года в 15 часов на заседании Диссертационного совета Д.002.230.01 при Институте цитологии РАН по адресу:
194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., 4.
Сайт института: http://www.cytspb.rssi.ru Адрес электронной почты института: cellbio@mail. cytspb.rssi.ru Факс института: (812)297-03-
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке или на сайте Института цитологии РАН
Автореферат разослан «22» марта 2010 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук Е.В.Каминская ОБШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. Изучение процессов инициации и прогрессии злокачественных новообразований является одной из важнейших задач современной клеточной биологии и медицины. Известно, что огромное разнообразие опухолевых клеток объединяет их повышенная способность к пролиферации. Эта способность обычно складывается из двух компонентов: из увеличенной способности к росту в конкретных условиях (уменьшенной потребности в ростовых факторах, сниженной зависимости от прикрепления и т.п.) и из способности расти неопределенно долгое время (клеточное бессмертие, иммортализация, способность к бесконечно долгой пролиферации).
Сегодня известно три основных, классических или традиционных метода лечения онкологических заболеваний: хирургический, лучевой и лекарственный (химиотерапия, гормонотерапия). Современная медицина, используя последние достижения науки, продолжает развивать наиболее значимые направления в лечении: гипертермия, гипергликемия, торможение роста опухоли, облегчение доставки лекарств, воздействие на мембраны опухолевых клеток. Существуют также экспериментальные методы, показавшие свою достаточную эффективность и готовые выйти из области научных исследований в широкую клиническую практику: аутопересадка красного костного мозга в сочетании с большими дозами цитостатиков, генная терапия, электрохимиотерапия, фокусированный ультразвук высоких энергий (выжигающая терапия опухолей), применение противоопухолевых вакцин. Разрабатываются и другие методы, которые находятся либо в начальной стадии изучения, либо эффективны лишь при лечении отдельных видов опухолей.
Целью противоопухолевой терапии является уничтожение раковых клеток без ущерба для окружающих нормальных тканей;
поэтому большинство химиотерапевтических препаратов задумано так, чтобы остановить пролиферацию опухолевых клеток и запустить процесс программируемой клеточной смерти (апоптоз).
Для многих спонтанных опухолей имеются серьезные доказательства вовлеченности определенных клеточных генов, и, прежде всего онкогенов, генов супрессоров и генов-регуляторов клеточного цикла в процесс канцерогенеза, но для подавляющего большинства опухолей молекулярные механизмы запуска "онкогенной" программы клетки остаются неизвестными. Интересно, что многие протоонкогены, в частности протоонкогены семейства Myc, запускающие клеточную пролиферацию, одновременно предрасполагают клетки к апоптозу (Reed, 2003). Генетические изменения протоонкогена Myc, ведущие к его нерегулируемой экспрессии, характерны для множества опухолей различного происхождения - лимфомы Беркитта, рака легкого и рака молочной железы (Amati et al., 2001). Белки семейства Myc являются транскрипционными факторами, и неизвестна ни одна мутация онкогенных представителей этого семейства (v-myc, c myc, N-myc и L-myc), которая бы инактивировала проапоптотическую функцию, не затронув их способность стимулировать пролиферацию. Было сделано предположение, что Myc влияет на высвобождение цитохрома с из митохондрий, тем самым предрасполагая клетки к митохондриальному пути реализации апоптоза (Juin et al., 1999).
В процессе канцерогенеза опухолевые клетки вырабатывают собственные защитные системы, вследствие чего они значительно отличаются от нормальных клеток организма, в том числе и по способности вступать в апоптоз. Одна из защитных систем основана на шапероне Hsp70. Этот белок обладает двумя очень важными свойствами: шаперонной активностью и способностью защищать клетки от разнообразных неблагоприятных факторов. Шаперонная активность – это способность белка связываться с поврежденными или вновь синтезированными полипептидами, транспортировать их через сеть внутриклеточных мембран и экспонировать их белок-модифицирующим системам (Morimoto et al., 1997).
Данные огромного числа экспериментов in vitro и in vivo убедительно свидетельствуют о том, что Hsp70 представляет собой наиболее эффективную и консервативную защитную систему клеток и целого организма (Jttel, 1999;
Маргулис, Гужова, 2009).
Высокий уровень экспрессии Hsp70, обнаруженный в опухолевых клетках, по-видимому, является препятствием для противоопухолевой терапии, и свидетельствует о неблагоприятном прогнозе для больного при некоторых видах новообразований (Ciocca et al., 1993;
Ricaniadis et al., 2001). Ранее было установлено, что Hsp70 спасает раковые клетки от действия многих факторов, вызывающих апоптоз, включая такие, как TNF-, стауроспорин, жесткий тепловой стресс и многие другие. (Samali, Orrenius, 1998;
Гужова и др., 2000). Более того, Hsp70 может тормозить процесс апоптоза на различных его фазах. Наиболее убедительное доказательство противоапоптозного действия Hsp70 было представлено в экспериментах на карциноме молочной железы MCH-7, в которых в клетки вводили анти-смысловую mRNA к Hsp70, в результате чего они погибали путем апоптоза (Nylandsted et al., 2000). Несмотря на интенсивные исследования, механизм защитной функции Hsp70 остается неясным. Однако большинство данных свидетельствует о превалирующей роли Hsp70 в ингибировании митохондриального пути апоптоза (Beere, Green, 2001). Исходя из вышеизложенных фактов, можно предположить, что Hsp70 также способен к кооперации с Mус в процессе канцерогенеза.
Цели и задачи исследования. Цель работы состояла в изучении функции шаперона Hsp70 на клеточном и молекулярных уровнях в процессе апоптоза, стимулированном действием противоопухолевых препаратов, в раковых клетках с нормальной и повышенной экспрессией протоонкогена Myc. Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:
1. Выяснить, может ли повышенная экспрессия Hsp70 подавлять действие противоопухолевых препаратов, направленное на индукцию апоптоза в популяции опухолевых клеток.
2. Сравнить обусловленную Hsp70 устойчивость опухолевых клеток с нормальной и повышенной экспрессией Myc к действию противоопухолевых препаратов.
3. Используя модель на основе клеток U-937, выяснить механизм подавления Hsp70 апоптоза, управляемого v-Myc.
4. Выяснить, способен ли Hsp70 изменять кинетику активации эффекторных каспаз в клетках миелоидной лейкемии человека.
5. Проверить возможность взаимодействия Hsp70 с эффекторными каспазами в ходе апоптоза клеток миелоидной лейкемии человека, индуцированного противоопухолевыми препаратами.
Научная новизна работы. Впервые показано, что чувствительность опухолевых клеток к апоптозу, вызванная повышенной экспрессией протоонкогена Myc, подавляется Hsp70 в большей степени, чем в клетках с регулярной экспрессией онкогена. Найдены новые мишени для защитного действия Hsp70 в процессе апоптоза – эффекторные каспазы 3 и 7.
Теоретическая и практическая значимость работы. В работе показано, что повышенная экспрессия Hsp70, характерная для опухолевых клеток, делает их нечувствительными к действию противоопухолевых препаратов. Показан механизм, с помощью которого осуществляется защитная функция Hsp70.
Несмотря на то, что работа имеет фундаментальную направленность, полученные данные позволяют рекомендовать практикующим онкологам включать признак «содержание Hsp70» в набор диагностических факторов и учитывать в выработке противоопухолевой стратегии.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Hsp70 обладает сильным антиапоптотическим эффектом при действии на раковые клетки противоопухолевыми препаратами.
2. Защитный эффект Hsp70 наиболее выражен в опухолевых клетках с повышенной экспрессии протоонкогена Myc.
3. Противоапоптозное действие Hsp70 осуществляется ниже по течению, чем выброс цитохрома с из митохондрий.
4. Каспаза 3 и каспаза 7 – новые мишени для осуществления противоапоптозной функции Hsp70.
Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе 3 статьи и 6 тезисов. Материалы диссертации представлены на 13-м Всероссийском симпозиуме «Структура и функции клеточного ядра» (Санкт Петербург, 1999), Всероссийском совещании «Клеточная биология на пороге ХХI века» (Санкт-Петербург, 2000), 4-й Всероссийской медико-биологической конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье» (Санкт Петербург, 2001), 1-й конференции Международной сети NorFa «Клеточный стресс и апоптоз» (Копенгаген, Дания, 2001), 2-й конференции Международной сети NorFa «Клеточный стресс и апоптоз» (Санкт-Петербург, 2002), 2-м Международном симпозиуме «Стресс и экстремальные состояния» (Кара-Даг, Украина, 2003), 1-м Всемирном конгрессе по раку «От фундаментальной науки к терапии рака» (Шанхай, Китай, 2008), 4-м съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), 4-м Международном симпозиуме «Белки теплового шока в биологии и медицине» (Лаборатория морской биологии, Вудс Хол, США, 2008) и обсуждались на научных семинарах Лаборатории защитных механизмов клетки и Отдела клеточных культур Института цитологии РАН.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 102 страницах машинописного текста и состоит из введения, глав «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 186 ссылок. Иллюстративный материал представлен 15 рисунками и 1 таблицей.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Клеточные линии. В работе были использованы культуры клеток миелоидной лейкемии человека U-937, U-937-v-myc и клетки крысиных фибробластов Rat1MycER, любезно предоставленные профессором Л.-Г.
Ларссоном (Karolinska Institute, Швеция). Клетки линий U-937, U-937-v-myc культивировали на питательной среде RPMI 1640 ("Биолот", Россия) с добавлением L-глутамина в концентрации 2 мМ, 50 мкг/мл гентамицина и 10% эмбриональной сыворотки («ПанЭко», Россия). Клетки линий Rat1MycER (несущие генетическую конструкцию, которая содержит ген белка с-Myc, сшитый с геном эстрогенового рецептора, чья экспрессия регулируется 4-гидрокси-тамоксифеном (OHT), культивировались на питательной среде DMEM ("Биолот", Россия) с добавлением L-глутамина в концентрации 2 мМ, 50 мкг/мл гентамицина, 10% эмбриональной сыворотки («ПанЭко», Россия) и 5 мкг/мл пуромицина. Постоянный логарифмический рост клеток поддерживался их пересевом каждые 2–3 сут (клеток линии Rat1MycER – после предварительной трипсинизации смесью растворов Версена и трипсина (“Биолот”, Россия)). За 1 сут до опыта клетки высевали на новую среду. Клеточный рост оценивали в камере Ньюбауэра-Беркитта методом исключения красителя трипанового синего.
Тепловое воздействие и индукция синтеза Hsp70. Чтобы вызвать накопление Hsp70, клетки U-937, U-937-v-myc и Rat1MycER подвергали нелетальному тепловому шоку в течение 30 мин в водяном термостате при температуре 43 0С. После теплового воздействия, клетки культивировали при 37 0С в течение 6 ч, затем анализировали в них содержание белков теплового шока с помощью метода иммуноблоттинга и с использованием специфичных к Hsp антител.
Трансфекция клеток. Для трансфекции клеток использовали сконструированную О.Демидовым плазмиду pIRES, содержащую вставку Hsp70, плазмиду pZem и индуцируемую плазмиду pZ-Hsp70, имеющую ген устойчивости к геницитину (G418), полученную от д-ра М.Яаттела (Cancer Institute, Дания).
Трансфекцию клеток линий U-937, U-937-v-myc плазмидой pcDNA3Hsp70 и Rat1 MycER, индуцируемой плазмидой pZ-Hsp70 и pZem (в соотношении 1:10), осуществляли по протоколу фирмы «GibcoBRL» с помощью реагента DMRIE-С.
Для получения постоянных линий клетки культивировали в присутствии мкг/мл G418 в течение 14 сут. Островки роста трансфицированных клеток Rat1MycER, с высокой вероятностью представляющие собой клоны, разделяли и культивировали раздельно. Для U-937 и U-937-v-myc использовали в дальнейшем клоны с наиболее высоким уровнем синтеза Hsp70 в трансфицированных клетках.
Содержание Hsp70 в клетках определяли с помощью метода иммуноблоттинга и иммунофлюоресцентного анализа.
Анализ ядерной локализации MycER после индукции OHT. Клетки Rat1MycER индуцировали 20 нМ ОНТ в течение 2 ч, промывали ФСБ и выделяли ядерную фракцию с помощью рутинных процедур (Dignam et al., 1983). Детекцию Myc проводили с помощью иммуноблоттинга.
Индукция и оценка апоптоза. Апоптоз активировали введением в культуральную среду этопозида (ETO) в концентрации 6 мкг/мл или 20 мкг/мл, адриамицина (ADR) в концентрации 20 мкМ, камптотецина (CAMP) (Sigma, США) в концентрации 5 мкM или 40 мкM или бутирата натрия (SB) в концентрации 20 или 40 мМ. Количество апоптозных клеток и жизнеспособность клеточной популяции оценивали с помощью окраски DAPI на фиксированных 4% ным формальдегидом клетках или акридинового оранжевого и этидиум бромида на живых клетках, а также с помощью теста МТТ.
Анализ кинетики каспазной активности. Клетки индуцировали в апоптоз 20 мкМ ADR или 6 мкг/мл ETO;
через 15 мин, 0.5, 1, 2, 3, 6, 12, 18, 24 и 30 ч клетки собирали, трижды промывали в 10 мл холодного ФСБ, центрифугировали при g в течение 5 мин и лизировали в буфере RIPA (20 мМ Трис-HCl, рН 7.5, 150 мМ NaCl, 0.5% Тритон Х-100, 2мМ ЭДТА, 1мМ ДТТ, 1мМ ФМСФ). После электрофоретического разделения в трис-глициновой системе белки переносили на нитроцеллюлозную мембрану (Towbin et al., 1979). Иммунодетекцию проводили по общепринятой схеме (Towbin, Gordon, 1984) с использованием моноклональных или поликлональных антител к исследуемым белкам, коньюгированных с пероксидазой хрена вторичных антител и реакцией усиленной хемилюминесценции. Для контроля равного количества белка в пробах проводили окрашивание антителами против глицеральдегидфосфатдегидрогеназы.
Для торможения апоптоза использовали ингибиторы каспазы 3 и 7 (DEVD), каспазы 8 (IEVD) и каспазы 9 (LEDH) («Calbiochem», США), которые вводили в культуральную среду в концентрации 5 мкМ за 1 ч до индукции апоптоза.
Количество апоптозных клеток подсчитывали после 6 ч индукции с помощью методов, описанных выше.
Антитела. В работе были использованы первичные антитела против следующих белков: глицеральдегидфосфатдегидрогеназа (abcam, Великобритания), каспаза 3, каспаза 7, каспаза 8, каспаза 9, цитохром с (все – дар Ю.А. Лазебника, Cold Spring Harbor Laboratory), поли(АДФ-рибозил)полимераза («Novus Biologicals», Англия), Мус (поликлональные, IG-13 – дар Л.-Г. Ларссона (Karolinska Institute, Швеция)), Hsp70 (моноклональные, клон 3B5 и клон 2Н9, полученные в лаборатории).
Анализ транслокации цитохрома с. Для определения выхода цитохрома с из митохондрий проводили анализ цитозольной фракции методом иммуноблоттинга по М.Яаттела с соавторами с небольшими модификациями (Jttel, et al., 1998). Для этого контрольные и стимулированные к апоптозу клетки (0,5х106 клеток на каждую временную точку) промывали три раза холодным ФСБ и один раз буфером для цитозольной фракции следующего состава: 250 мM сахароза, 20 мM Трис- HCl, 10 мM KCl, 1.5 мM MgCl2, 1 мM ЭГTA, 1 мM ЭДTA, мM ДTT, 1 мM ФМСФ, pH 7.5. К полученным осадкам добавляли 300 мкл указанного буфера и 3 мкл смеси ингибиторов протеаз (Sigma, США) и оставляли на льду на 30 мин, перемешивая каждые 5 мин. Далее клетки лизировали 40 кратным пропусканием смеси через иглу и центрифугировали дважды при 800 g мин и один раз при 14000 g 20 мин. В полученных супернатантах белок осаждали ацетоном, готовили пробы, проводили ДСН-ПААГ электрофорез в 17%-ном разделяющем геле и иммуноблоттинг с использованием мышиных моноклональных антител к цитохрому с. Кроме того, мембраны были повторно проявлены с использованием антител к глицеральдегидфосфатдегидрогеназе (Sigma, США).
Коиммунопреципитация и лиганд-блоттинг. Для коиммунопреципитации использовали клеточные лизаты, приготовленные с применением TBS буфера для иммунопреципитации (20 мM Трис- HCl, 10 мM KCl, 1 мM ЭГTA, 1 мM ЭДTA, мM ДTT, 1 мM ФМСФ, pH 7.5, смесь ингибиторов протеаз). Объем аликвот, содержащих 500 мкг общего белка, доводили до 1000 мкл TBS и в течение 1 ч при 4 0С инкубировали с антителами к каспазе 3, к каспазе 7 или Hsp70 на роторной качалке, после чего к лизатам добавляли 20 мкл Белок А – Сефарозы или Белок G – Сефарозы, соответственно, и инкубировали 16 ч при 4 0С при постоянном покачивании. Затем гель осаждали центрифугированием при 200 g в течение 5 мин, а супернатант (при необходимости) отбирали для приготовления электрофорезных проб, после чего два раза отмывали гель лизирующим буфером и три раза — TBS.
Гель использовали для приготовления электрофорезных проб: к осадку добавляли четырехкратный буфер для образцов электрофореза и далее проводили определение Hsp70 и каспазы 3 и 7 с помощью метода иммуноблоттинга. Для контроля за неспецифическим связыванием готовили пробы из лизатов, проинкубированных с иммуноглобулинами сыворотки неиммунной мыши и Белок G – Сефарозой или иммуноглобулинами сыворотки неиммунного кролика и Белок А – Сефарозой. Для лиганд-блоттинга использовали клеточные лизаты, приготовленные на буфере для иммунопреципитации. Объем аликвот, содержащих 500 мкг общего белка, доводили до 500 мкл буфером для иммунопреципитации и в течение 1 ч инкубировали с антителами к каспазе 3 или 7 при 4 0С на роторном смесителе, после чего к лизатам добавляли 20 мкл Белок А – Сефарозы и инкубировали 16 ч при 4 0С при постоянном покачивании. Затем гель троекратно промывали буфером для иммунопреципитации. Готовили пробы по стандартному протоколу, описанному выше, и осуществляли ДСН-ПААГ электрофорез в 15% ном разделяющем геле и перенос белков на нитроцеллюлозу. После инактивации сайтов неспецифического связывания мембрану инкубировали с препаратом бычьего Hsp70/Hsc70 с конечной концентрацией 10 мкг/мл в течение 6 ч.
Мембрану троекратно промывали ФСБ/0,1% Твин–20 и проводили детекцию связавшегося Hsp70 при помощи моноклональных антител 3В5. Чтобы определить позицию каспазы 3 и 7 на блоте, вносили в тот же гель по 50 мкг клеточного лизата, затем переносили на нитроцеллюлозный фильтр и выявляли, используя соответствующие каспазам антитела.
Методы статистического анализа. Статистический анализ экспериментальных данных проводили с помощью программ Origin 7.0 и Statistica 6.0. Использовали двусторонний t-критерий Стьюдента (P 0.05). Полученные значения представлены в виде – среднего значения ± стандартная ошибка.
РЕЗУЛЬТАТЫ Тепловой шок снижает чувствительность опухолевых клеток с высоким содержанием Мус к действию противоопухолевых препаратов. Чтобы понять, может ли тепловой шок защитить клетки с повышенной экспрессией Myc от действия факторов, индуцирующих апоптоз, на первом этапе мы использовали клетки миелоидной лейкемии U-937-v-myc и родительские клетки U-937.
Вирусный белок v-Myc, который, по литературным данным, более активен, чем его клеточный аналог c-Myc (Larsson et al., 1988), в электрофорезном геле движется немного быстрее (рис. 1а). Контрольные клетки и клетки, предварительно подвергнутые мягкому тепловому шоку (43 oC, 30 мин), инкубировали с 20 мкг/мл ADR в течение 18 ч. Количество клеток, в которых наблюдались ядра с фрагментированным хроматином, было значительно выше у клеток с повышенной экспрессией v-Myc, чем в клетках родительской линии (рис.
1б). Тепловой шок, проведенный перед добавлением ADR, понизил количество апоптозных клеток в обеих клеточных линиях, однако у U 937-v-myc защитный эффект был выражен значительно сильнее, чем в клетках U-937. В родительской популяции снижение составило Рис. 1. Тепловой шок подавляет 22,1%, а у клеток U-937-v-myc число процесс апоптоза, сенсибилизированный v-Myc в клетках апоптозных клеток понизилось на U-937.
а – анализ экспрессии Myc в 54,8%. Количество Hsp70, родительских клетках U-937 и U-937-v – накопленное клетками после myc;
б – клетки U-937 и U-937-v-myc были подвергнуты кондиционирующему теплового шока, увеличивалось в тепловому шоку (43 оС, 30 мин) и через ч индуцированы к апоптозу с помощью обеих клеточных линиях в 8-10 раз ADR (18 ч). Показана доля клеток с уже через 3 ч и немного снижалось к фрагментированными ядрами;
в – иммуноблоттинг клеток U-937 и U-937-v 24 ч (рис. 1в). myc через 3, 6 и 24 ч после теплового шока.
Для того чтобы добиться регулируемой экспрессии гена Myc, мы использовали клетки крысиных фибробластов Rat1MycER, трансфицированные конструкцией, которая содержала ген химерного белка с-Myc/эстрогеновый рецептор (MycER), экспрессия которого индуцируется с помощью 4-гидрокси тамоксифена (OHT) (Eilers et al., 1989). Рис. 2а подтверждает перемещение белка MycER из цитоплазмы в ядро при действии OHT. Активация MycER перед добавлением противоопухолевого препарата этопозида (ETO) повышает чувствительность клеток к апоптозу дозазависимым образом (рис. 2б).
Когда клетки Rat1MycER активировали 25 нМ OHT (2 ч), подвергли тепловому шоку (44 oC, 30 мин) и через 3 ч индуцировали апоптоз с помощью ETO, подавление процесса апоптоза в активированных OHT клетках было выражено значительно сильнее (рис. 3а), количество апоптозных клеток понизилось примерно в 3 раза. Тепловой шок повышал уровень Hsp70 ожидаемым образом (рис. 3б).
Рис. 2. Индуцируемая тамоксифеном (OHT) транслокация MycER в ядро делает клетки Rat1MycER более чувствительными к апоптозу, вызванному этопозидом.
а – клетки Rat1MycER обрабатывали OHT, через 2 ч выделяли ядерную фракцию и подвергали иммуноблоттингу с пан-антителами к Myc;
б – клетки Rat1MycER обрабатывали OHT в указанных концентрациях и через 2 ч добавляли ETO. Через 18 ч подсчитывали долю апоптозных клеток.
Рис. 3. Тепловой шок отменяет вызванную тамоксифеном сенсибилизацию клеток Rat1MycER к апоптозу.
а – клетки Rat1ER подвергли кондиционирующему тепловому шоку, через 24 ч стимулировали активацию MycER с помощью OHT (50 нM) и через 2 ч добавили ETO;
б – иммуноблоттинг Rat1MycER после теплового шока при указанных температурах.
Таким образом, тепловой шок, вызывающий повышение уровня Hsp70 в двух клеточных линиях разного гистогенеза, снижал чувствительность клеток к апоптозу, обусловленному высоким содержанием v-Myc.
Hsp70 повышает устойчивость клеток с высокой экспрессией Myc к действию противоопухолевых препаратов. Поскольку защитный эффект при тепловом прекондиционировании может быть вызван действием других шаперонов (Hsp27, Hsp90), чья экспрессия тоже возрастает в ответ на тепловой шок, мы создали постоянную клеточную линию Rat1MycERHsp70 с помощью интеграции гена Hsp70 под контролем металлотионеинового промотора. Как показано на рис.
4а, сульфат цинка вызывает индукцию Hsp70 дозазависимым образом.
Введение ZnSO4 в среду даже в высоких концентрациях приводит лишь к слабому увеличению содержания эндогенного (“крысиного”) Hsp70 (в сравнении с количеством Hsp70 в клетках Rat1MycER, подвергнутых тепловой обработке). Таким образом, мы могли пренебречь влиянием эндогенного Hsp70 на уровень апоптоза клеток Rat1MycER и RatMycERHsp70 даже при использовании высоких концентраций сульфата цинка. Для индукции синтеза Hsp70 использовали ZnSO4 в концентрации 50 и 100 мкМ. Рис. 4. Дробное повышение Hsp70 в клетках Rat1MycER-Hsp70 приводит к Были использованы несколько дозазависимому понижению числа комбинаций предобработок OHT для апоптозных клеток при действии противоопухолевыми препаратами того, чтобы воссоздать ETO и CAMP.
последовательное включение Myc и а – клетки Rat1MycER трансфицировали плазмидой, содержащей ген Hsp70 под Hsp70 в процесс апоптоза (рис. 4б).
индуцибельным металотионеиновым Предварительная индукция промотором. Экспрессию Hsp вызывали ZnSO4 в указанных экспрессии Hsp70 сульфатом цинка концентрациях. Показан иммуноблот снижала уровень апоптоза в клетках индуцированных ZnSO4 родительских клеток Rat1MycER и трансфицированных Rat1MycERHsp70 при действии всех – Rat1MycER-Hsp70;
б – клетки трех лекарств. Как и следовало Rat1MycER-Hsp70 были обработаны ZnSO4 и(или) OHT в указанных ожидать, активация MycER повышала концентрациях в течение 24 ч и чувствительность клеток стимулированы к апоптозу противоопухолевыми препаратами ETO и Rat1MycERHsp70 к последующей CAMP, количество апоптозных клеток обработке лекарствами;
значительные оценивали через 6 ч различия между показателями апоптоза клеток с активным и неактивным MycER наблюдались в случае обработки клеток этопозидом и камптотецином.
В другой модельной клеточной системе клеткам U-937 и U-937-v-myc ген Hsp70 человека был введен под контролем цитомегаловирусного промотора, и полученные клоны, которые были использованы в работе, получили название U8 и M5 соответственно. Постоянно высокий уровень синтеза Hsp70 в клетках этих клонов был подтвержден с помощью метода иммуноблоттинга (рис 5а). Мы оценили чувствительность всех четырех линий к ETO и CAMP в указанных на рис.
5б концентрациях, используя окрашивание DAPI. Результаты подсчета фрагментированных и конденсированных ядер показали, что наибольшую способность ингибировать апоптоз, вызванный ETO и CAMP, Hsp демонстрирует в клетках клона M5.
Рис. 5. Повышенная экспрессия Hsp70 делает клетки M5 более резистентными к действию противоопухолевых препаратов.
а – иммуноблоттинг клеток клонов U8 и M5 и родительских линий U-937 и U-937-v-myc;
б – количество апоптозных клеток после воздействия противоопухолевыми препаратами ETO и CAMP.
В целом, результаты дали нам право утверждать, что эктопический Hsp обладает сильными защитными свойствами в клетках, экспрессирующих v-myc (клон M5), тогда как в клетках клона U8 он подавляет апоптоз в меньшей степени.
Молекулярные механизмы подавления Myc-опосредованного апоптоза.
Следующей задачей нашего исследования было выяснить механизмы влияния Myc и Hsp70 на апоптоз, вызванный действием противоопухолевых препаратов. Клетки миелоидной лейкемии U-937 и U-937-v-myc были выбраны нами для исследования молекулярных механизмов, поскольку апоптоз, вызванный действием противоопухолевыми препаратами, протекает в них со всеми классическими атрибутами. ETO, ADR и CAMP вызывали фрагментацию ядер, которую наблюдали в клетках, окрашенных акридиновым оранжевым или DAPI (рис.6а).
Рис. 6. Апоптоз, вызванный действием противоопухолевых препаратов, в клетках U 937 сопровождается типичными проявлениями: фрагментацией ядра, олигонуклеосомной диссоциацией ДНК и активацией каспаз.
а – микрофотография клеток U-937 после 18-часовой инкубации с ADR;
б – олигосомная фрагментация («лесенка») ДНК;
в – иммуноблоттинг экстрактов, полученных из контрольных (С) клеток и из клеток, которые были обработаны ADR или ETO с антителами к каспазе 3 и 7 и их субстрату, белку PARP.
Олигосомная фрагментация хроматина подтверждалась с помощью электрофореза ДНК (рис. 6б). Наконец, процесс апоптоза проходит с активацией двух эффекторных каспаз: 3 и 7 (рис. 6в). Вместе взятые эти данные подтверждают, что и ETO, и ADR индуцируют апоптоз, который сопровождается типичными проявлениями: фрагментацией ядра, олигонуклеосомной диссоциацией ДНК и активацией каспаз.
Процесс апоптоза, индуцированный v-Myc, специфически подавляется ингибитором каспазы 9. Чтобы проанализировать роль каспаз, мы использовали специфические ингибиторы DEVD FMK, IEID-FMK и LEHD-FMK, подавляющие активности каспазы 3/7, 8 и 9 соответственно.
Ингибиторы каспазы 3/7 и 8 понижали число апоптозных клеток у клеток U 937 и U-937-v-myc с одинаковой эффективностью. Однако ингибитор каспазы 9, не повлиявший на уровень апоптоза в клетках родительской линии, значительно подавил его Рис. 7. Апоптоз, стимулированный v уровень в клетках U-937-v-myc (рис. Myc, специфически подавляется ингибитором каспазы 9. Ингибиторы 7). Это означает, что Myc запускает каспаз DEVD (каспаза 3 и 7), IEVD апоптозный каскад через (каспаза 8) и LEHD (каспаза 9) добавляли к клеткам за 1 ч до внесения ETO.
митохондриальный путь при вовлечении в процесс каспазы 9.
Hsp70 регулирует активность эффекторных каспаз, но не влияет на высвобождение цитохрома с из митохондрий. Следующий вопрос, на который мы попытались ответить, какой механизм использует шаперон Hsp70, чтобы защитить клетки от Myc-опосредованного апоптоза? Данные, которые можно найти в литературе, противоречивы;
согласно сведениям разных авторов действие шаперона может осуществляться ниже или выше митохондрии (Beere et al., 2000;
Saleh et al., 2000;
Steel et al., 2004;
Clemons et al., 2005;
). Первое, на чем мы сосредоточили наше внимание, был выход цитохрома с в цитозоль в клетках U- и U-937-v-myc и их клонах с постоянно высокой экспрессией Hsp70 - U8 и М5. На рис. 8 показана кинетика высвобождения цитохрома с после индукции клеток к апоптозу с помощью 6 мкг/мл ETO. Повышение уровня содержания Hsp70 в клетках не влияет на выход цитохрома с. Кинетика, показанная для клеток U-937 и U8, одинакова, так же, как и для клеток U-937-v-myc и М5, однако в клетках с повышенным содержанием v-Myc цитохром с появлялся в цитозоле через 3 ч после индукции апоптоза, а в клетках U-937 и U8 его выход задерживался до 18 ч.
На следующем этапе с помощью иммуноблоттинга мы проанализировали активацию каспазы 3, 7, 8, и 9 в клетках, экспрессирующих Hsp70 на высоком уровне, U8 и М5, и клетках родительских линий, U-937 и U-937-v myc. На рис. 9 показано, что динамика протеолиза каспазы 8 у всех клеточных линий идентична, протеолиз начинается одновременно, через 3 ч после индукции ETO.
Однако активация каспазы 9 у клеток клона M5 начинается значительно раньше по сравнению с клетками U 937. Зона белка с молекулярным весом 35 кДа, соответствующая Рис. 8. Hsp70 не подавляет активной каспазе 9, появляется в высвобождение цитохрома с из митохондрий в клетках U-937. клетках U-937-v-myc уже через 3 ч, в Иммуноблоттинг белков цитозольной то время как у клеток U-937 – только фракции проводили последовательно с антителами против цитохрома с и против через 6 ч, т.е. раньше, чем происходит глицеральдегидфосфатдегидрогеназы высвобождение цитохрома с.
(GAPDH) для подтверждения равномерной нагрузки общего белка на дорожку.
Это означает, что у клеток с регулярной экспрессией Myc, U-937, в реализации апоптоза митохондриальный путь не является основным, т.е. по видимому, апоптозный каскад в этих клетках развивается преимущественно по прямому пути, благодаря активации каспазой 8 эффекторных каспаз. У клеток M зона белка, соответствующая активной каспазе 9, в исследуемый временной промежуток выявлена не была. Интересно, что, несмотря на то, что повышение уровня содержания Hsp70 не повлияло на выход цитохрома с, протеолиз каспазы был значительно подавлен в клетках М5. Каспаза 3 активируется через 18 ч после индукции в клетках U-937, что подтверждает появление активной каспазы с молекулярным весом 20 кДа (р20), в то время как в клетках U-937-v-myc р появляется уже через 3 ч после индукции. В клетках М5 активный фрагмент каспазы 3 в исследованный промежуток времени не появился. Каспаза 7 в клетках U-937 активируется через 6 ч после индукции, в клетках U-937-v-myc – через 1 ч, а в клетках М5 в течение 18 ч она остается не активной.
Рис. 9. Эктопическая экспрессия гена Hsp70 подавляет и (или) задерживает активацию каспазы 3, 7, 9, но не влияет на активацию каспазы 8.
Клетки U-937, U-937-v-myc и M5 индуцировали к апоптозу с помощью ETO в указанные промежутки времени и анализировали с помощью иммуноблоттинга с антителами к каспазе 8, 9, 3 и 7.
Эти данные заставляют нас предположить, что Hsp70 не влияет на выход цитохрома с из митохондрий или активацию инициаторной каспазы 8, но подавляет протеолиз каспазы 3, 7 и 9 в клетках U-937 с высокой экспрессией v Myc.
Hsp70 физически взаимодействует с каспазой 3 и с каспазой 7. Мы предположили, что запаздывание протеолиза эффекторных каспаз у клеток с повышенной экспрессией Hsp70 cвязано с тем, что шаперон образует комплексы с этими ферментами. Чтобы проверить это предположение, мы использовали метод иммунопреципитации. Моноклональные антитела к Hsp70 (Клон 2Н9) были пришиты к гелю циан-бромированной сефарозы. В реципрокной системе применяли антитела к каспазе 3 и 7, которые осаждали с помощью Protein G сефарозы. Лизаты контрольных и стимулированных к апоптозу клеток U пропускали через колонку 2Н9, и белки, связавшиеся с гелем, анализировали с помощью иммуноблоттинга с антителами к каспазе 3 и 7. Иммунопреципитацию в реципрокной системе проводили с антителами против эффекторных каспаз и связавшиеся с ними белки анализировали с помощью антител к Hsp70 (рис. 10а).
Для того чтобы доказать, что каспазы специфически связываются с Hsp70, а не с гелем циан-бромированной сефарозы, мы использовали лизат клеток миеломы мыши NS0/1, которые, как известно, не экспрессируют Hsp70 (Aujame and Firko, 1988), в результате чего становятся чувствительными к условиям культивирования.
Сывороточное голодание при отсутствии смены культуральной среды в течение сут приводит к тому, что примерно 50% клеточной популяции погибает по механизму апоптоза. Такие клетки использовали для иммунопреципитации с помощью сефарозы-2Н9, но белковых зон, соответствующих каспазе 3 или 7, выявлено не было (рис. 10б), что подтверждает наше предположение о том, что обе каспазы взаимодействуют именно с Hsp70. Следует заметить, что в клетках U8, индуцированных к апоптозу с помощью ADR, Hsp70 был связан с прокаспазой (32 кДа) и с прокаспазой 7 (34 кДа) и с ее компонентом 32 кДа, т.е. молекулой фермента, потерявшей продомен. Были выявлены также формы активной каспазы 17 кДа (для каспазы 3) и 19 кДа (для каспазы 7). В реципрокной иммунопреципитации было обнаружено взаимодействие обеих каспаз с Hsp70 (рис.
10а).
Рис. 10. Hsp70 связывается с каспазой 3 и с каспазой 7 в клетках U-937-Hsp70 (U8).
а – реципрокная иммунопреципитация. Наверху – иммунопреципитация лизата клеток U с антителами против каспазы, иммуноблоттинг с антителами против Hsp70, внизу – иммунопреципитация с антителами против Hsp70, иммуноблоттинг – с антителами против каспазы 7 и 3;
б – иммунопреципитация лизата клеток NS0/1, не синтезирующих Hsp70, с антителами против шаперона, иммуноблоттинг – с антителами против каспазы и 3.
Для того чтобы показать, что обе каспазы формируют с Hsp70 прямой межмолекулярный комплекс, мы использовали лиганд-блоттинг (Far-Western assay). Экстракты контрольных клеток U8 использовали для иммунопреципитации с антителами против каспазы 3 и 7, как описано выше, и после электрофореза и переноса белков иммунопреципитата на нитроцеллюлозную мембрану последнюю инкубировали с препаратом Hsp70, выделенным из мышцы быка. После тщательной отмывки часть мембраны инкубировали с антителами 2Н9 (рис. 11), другая часть мембраны с преципитированными каспазами также инкубировали с теми же антителами, но предварительной инкубации с Hsp70 не проводили.
Позицию белковых зон, соответствующих обеим эффекторным каспазам, подтверждали с помощью иммуноблоттинга с каспазой 3 и 7 полных клеточных лизатов клеток U8. Результаты этих опытов с очищенными белками показали, что Hsp70 непосредственно связывается с каспазой 3 и 7 как в контрольных клетках U8, так и в стимулированных к апоптозу.
Рис. 11. Hsp70 и каспаза 3 и 7 непосредственно связываются друг с другом.
Представлены данные лиганд-блоттинга (Far-Western assay). См. объяснения в тексте.
ОБСУЖДЕНИЕ Генетические изменения клеток прогрессирующих опухолей, которые с одной стороны приводят к неограниченной пролиферации, а с другой – делают клетки более чувствительными к апоптозу, характерны для таких онкогенов, как Myc и E1A (Green, Evan, 2002;
Nilsson, Cleveland, 2003). В этой работе нам удалось показать, что Hsp70, который вовлечен в процесс опухолевого роста, подавляет апоптоз, сенсибилизированный Myc.
Наши результаты демонстрируют, что повышенная экспрессия Myc делает опухолевые клетки U-937 и Rat1 более чувствительными к действию противоопухолевых препаратов, таких как адриамицин (ADR), этопозид (ETO) и камптотецин (CAMP), эти результаты подтверждают более ранние работы (Hoffman, Liebermann, 1998). Изучая возможную роль шаперона Hsp70 в этом процессе, нам удалось показать, что повышенная экспрессия шаперона подавляет развитие апоптоза, вызванного действием противоопухолевых препаратов в обеих клеточных линиях. Удивительно, но процесс подавления апоптоза в клетках, подвергнутых тепловому прекондиционированию, был наиболее выражен в клетках обеих линий с высоким содержанием Myc. Более того, нам удалось показать, что при дробном повышении активности Myc в клетках Rat1MycER, c одной стороны, и экспрессии Hsp70 – с другой, уменьшение количества апоптозных клеток в ответ на действие ETO и CAMP носит дозазависимый характер. На основании этих данных мы сделали вывод о существенном вмешательстве Hsp70 в сигнальные пути апоптоза, сенсибилизированном повышенной экспрессией Myc.
Что является мишенями для Hsp70 и Myc в этом процессе? Наши результаты показывают, что в процессе апоптоза в клетках U-937, вызванного действием ETO, происходит активация «верхней» каспазы 8 и эффекторной каспазы 9, 3 и 7 и происходит высвобождение цитохрома с из митохондрий. Активация каспазы происходит независимо от уровня экспрессии Myc или Hsp70, но на более нижних ступенях каскада можно заметить существенную разницу, обусловленную повышенной экспрессией Myc и (или) Hsp70. Существенно, что протеолиз каспазы 9 коррелирует с повышенной экспрессией Myc. Специфический ингибитор каспазы 9 не подавлял развитие апоптоза в клетках U-937, однако был эффективен в клетках U-937-v-myc, что подчеркивает селективную роль каспазы 9 в процессе апоптоза, индуцированного ETO в клетках с повышенной экспрессией Myc. Анализ кинетики протеолиза каспаз и выхода цитохрома с из митохондрий показал, что в клетках с регулярной экспрессией Myc протеолиз каспаз запускается значительно раньше, чем выход цитохрома с, что говорит о том, что в этих клетках задействован прямой путь апоптоза, в то время как в клетках U-937-v-myc более существенную роль играет митохондриальный путь, что соответствует ранее опубликованным работам (Juin et al., 1999).
В литературе не прекращается дискуссия о том, на каких этапах апоптозного каскада играет роль Hsp70. Две группы исследователей (Beere et al., 2000;
Saleh et al., 2000) одновременно предположили, что Hsp70 связывает APAF-1, препятствуя его олигомеризации и последующей активации каспазы 9. Другая группа ученых (Li et al., 2000) утверждала, что Hsp70 подавляет апоптоз ниже по течению, чем высвобождение цитохрома с, но выше, чем протеолиз каспазы 3. С другой стороны, несколько групп исследователей сообщали о том, что Hsp70 подавляет процесс апоптоза на домитохондриальных этапах, (Steel et al., 2004;
Mosser et al., 2000;
Stankiewitch et al., 2005), подавляя выход цитохрома с, прямо или косвенно понижая олигомеризацию или транслокацию белка Bax к митохондрии (Gotoh et al., 2004;
Stankiewitch et al., 2005). Мы не наблюдали изменения динамики выхода цитохрома с в клетках с повышенной экспрессией Hsp70;
напротив, нам удалось показать прямое взаимодействие шаперона и эффекторной каспазы 3 и 7, и таким образом, наши данные подтверждают первую из представленных гипотез. Однако нельзя отрицать роль шаперона на более ранних этапах каскада в других клеточных системах при использовании иных индукторов апоптоза.
Мы показали, что апоптоз, вызванный действием противоопухолевых препаратов и сенсибилизированный Myc, подавляется Hsp70. Селективное подавление синтеза и (или) функции Hsp70 в опухолевых клетках может позволить Myc реализовать свой проапотозный потенциал, предполагая, что Hsp70 является адекватной мишенью для противоопухолевой терапии.
ВЫВОДЫ 1. Hsp70 обладает сильным противоапоптотическим эффектом при действии на раковые клетки противоопухолевыми препаратами - адриамицином, этопозидом и камптотецином.
2. Защитный эффект Hsp70 наиболее выражен в опухолевых клетках с повышенной экспрессией протоонкогена Myc. B клетках крысиных фибробластов Rat1MycERHsp70, в которых можно дробно повышать экспрессию Hsp70, защитный эффект шаперона носит дозазависимый характер.
3. В клетках U-937 с постоянной экспрессией Myc апоптоз протекает преимущественно по прямому пути от каспазы 8 к эффекторным каспазам, в то время как в клетках с повышенной экспрессией Myc основным путем апоптоза является митохондриальный с вовлечением активации каспазы 9.
4. Антиапоптозное действие Hsp70 в клетках U-937 как с повышенной, так и c постоянной экспрессией протоонкогена Myc осуществляется после выброса цитохрома с из митохондрий.
5. Каспаза 3 и каспаза 7 – новые мишени для осуществления антиапоптозной функции Hsp70.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Комарова Е.Ю., Маргулис Б.А., Гужова И.В. 2004. Роль шаперона Hsp70 в реакции клеток лейкемии человека на противоопухолевые препараты.
Цитология. 46: 550-556.
2. Komarova E.Yu., Afanasyeva E.A., Bulatova M.M., Cheetham M.E., Margulis B.A., Guzhova I.V. 2004. Downstream caspases are novel targets for the antiapoptotic activity of the molecular chaperone Hsp70. Cell Stress and Chaperones. 9 (3): 265 275.
3. Afanasyeva E.A., Komarova E.Yu., Larsson L.-G., Bahram F., Margulis B.A., Guzhova I.V. 2007. Drug-induced Myc-mediated apoptosis of cancer cells is inhibited by stress protein Hsp70. Int. J. Cancer 121 (12): 2615-2621.
Тезисы сообщений на конференциях 4. Комарова Е.Ю., Демидов О.Н., Маргулис Б.А., Гужова И.В. 2000. Влияние конститутивной экспрессии онкогена v-myc в клетках миелоидной лейкемии человека на реализацию апоптического сигнала в этих клетках. Цитология. 42:
286.
5. Комарова Е.Ю., Гужова И.В., Маргулис Б.А.2001. Роль БТШ70 в реакции клеток миелоидной лейкемии человека на противоопухолевые препараты.
Материалы 4-й Всероссийской медико-биологической Конференции молодых исследователей «Человек и его здоровье», Санкт-Петербург. с. 136.
6. Гужова И.В., Комарова Е.Ю., Афанасьева Е.А., Маргулис Б.А. 2003.
Противоопухолевая терапия и клеточная функция основного белка стресса Hsp70. Материалы 2-го Международного симпозиума «Стресс и экстремальные состояния», Кара-Даг, Украина. с. 175.
7. Margulis B.A., Afanasyeva E.A., Komarova E.Y., Larsson L.-G., Guzhova I.V. 2008.
Anti-apoptotic activity of Hsp70 stress protein in leukemia cells. BIT Life Sciences’ Abstracts of 1st Annual World Cancer Congress-2008. From Basic Research to Therapeutics, Shanghai, China. р. 84.
8. Гужова И.В., Комарова Е.Ю. 2008. Антагонизм между белками Hsp70 и Мус в регуляции процесса апоптоза в раковых клетках. Материалы 4-го Съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, Новосибирск. с.
182.
9. Margulis B.A., Afanasyeva E.A., Komarova E.Yu., Larsson L.-G., Guzhova I.V. 2008.
The antagonism between Hsp70 and Myc in the performing of apoptosis program in U-937 leukemia cells. Abstracts of IVth International Symposium on Heat Shock Proteins in Biology & Medicine, USA. р. 37.
СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ Гужова И.В., Маргулис Б.А. 2000. Цитология. 42: 647-652.
Маргулис Б.А., Гужова И.В. 2009. Цитология. 51: 219-228.
Amati B., Frank S.R., Donjerkovic D., Taubert S. 2001. Biochim. Biophys. Acta.
1471: 135-145.
Aujame L., Firko H. 1988. Mol. Cell Biol. 8: 5486-5494.
Beere H.M., Wolf B.B., Caint K., Mosser D.D., Mahboubi A., KuwanaT., Tailor P., Morimoto R.I., Cohen G.M., Green D.R. 2000. Nat. Cell Biol. 2: 469-475.
Beere H.M, Green D.R. 2001. Trends. Cell Biol. 11: 6-10.
Ciocca D.R., Clark G.M., Tandon A.K., Fuqua S.A., Welch W.J., McGuire W.L. 1993. J.
Natl. Cancer Inst. 85: 570-574.
Clemons N.J., Buzzard K., Steel R., Anderson R.L. 2005. J. Biol. Chem. 280: 9005-9012.
Dignam J.D., Lebovitz R.M., Roeder R.G. 1983. Nucleic Acids Res. 11: 1475-1489.
Eilers M., Picard D., Yamamoto K.R., Bishop J.M. 1989. Nature. 340: 66-68.
Gotoh T., Terada K., Oyadomari S., Mori M. 2004. Cell Death Differ. 11: 390-402.
Green D.R., Evan G.I. 2002. Cancer Cell. 1: 19-30.
Hoffman B., Lieberman D.A. 1998. Oncogene. 17: 3351-3357.
Jttel M., Wissing D., Kokholm K., Kuallunki T., Egeblad M. 1998. EMBO J. 17:
6124-6134.
Jttel M. 1999. Ann. Med. 31: 261-271.
Juin P., Hueber A.O., Littlewood T., Evan G. 1999. Genes Dev. 13: 1367-1381.
Larsson L., Ivhed I., Gidlung M., Petterson U., Vennstrom B., Nilsson K. 1988. Proc.
Natl. Acad. Sci. USA. 85: 2638-2642.
Li C.Y., Lee J.S., Ko Y.G., Kim J.I., Seo J.S. 2000. J. Biol. Chem. 275: 25665-25671.
Morimoto R.I., Kline M.P., Bimston D.N., Cotto J.J. 1997. Essays Biochem. 32: 17-29.
Mosser D.D., Caron A.W., Bourget L., Meriin A.B., Sherman M.Y., Morimoto R.I., Massie B.
2000. Mol. Cell Biol. 20: 7146-7159.
Nilsson J. A., Cleveland J. L. 2003. Oncogene. 22: 9007 – 9021.
Nylandsted J., Rohde M., Brand K., Bastholm L., Elling F., Jttela M. 2000. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA. 97: 7871-7876.
Reed J. C. 2003. Cancer Cell. 3: 17 – 22.
Ricaniadis N., Kataki A., Agnantis N., Androulakis G., Karakousis C.P. 2001. Eur. J.
Surg. Oncol. 27: 88-93.
Saleh A., Srinivasula S.M., Balkir L., Robbins P.D., Alnemri E.S. 2000. Nature Cell Biol.
2: 476-483.
Samali A., Orrenius S. 1998. Cell Stress Chaper. 3: 228-236.
Stankiewitch A.R.,Lachapelle G., Foo C.P., Radicioni S.M., Mosser D.D. 2005 J. Biol.
Chem. 280: 38729-38739.
Steel R., Doherty J.P., Buzzard K., Clemons N., Hawkins C.J, Anderson R.L. 2004. J.
Biol. Chem. 279: 51490-51499.
Towbin H., Staeheln T., Gordon J. 1979. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. PNAS. 7:
4350-4354.
Towbin H., Gordon J., 1984. J. Immunol. Methods. 72: 313-340.