Любовь сергеевна цитокины в регуляции окислительных и антиоксидантных процессов в структурах головного мозга у крыс при остром эмоциональном стрессе
На правах рукописи
УДК 591.1 КАЛИНИЧЕНКО ЛЮБОВЬ СЕРГЕЕВНА ЦИТОКИНЫ В РЕГУЛЯЦИИ ОКИСЛИТЕЛЬНЫХ И АНТИОКСИДАНТНЫХ ПРОЦЕССОВ В СТРУКТУРАХ ГОЛОВНОГО МОЗГА У КРЫС ПРИ ОСТРОМ ЭМОЦИОНАЛЬНОМ СТРЕССЕ 03.03.01 Физиология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва – 2012
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении "Научно исследовательский институт нормальной физиологии имени П.К. Анохина" РАМН.
Научный консультант:
Доктор медицинских наук Перцов Сергей Сергеевич
Официальные оппоненты:
Доктор медицинских наук, профессор Козловская Марина Михайловна Доктор биологических наук Башкатова Валентина Германовна
Ведущая организация:
Учреждение Российской академии наук Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН
Защита диссертации состоится «1» марта 2012 года в 10 часов на заседании Диссертационного совета Д 001.008.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении "Научно-исследовательский институт нормальной физиологии имени П.К. Анохина" РАМН по адресу: 125009, г. Москва, ул. Моховая, д. 11, стр. 4.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения "Научно-исследовательский институт нормальной физиологии имени П.К. Анохина" РАМН.
Автореферат разослан «30» января 2012 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат медицинских наук Захаров Н.Д.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования В современной медицине и биологии одной из наиболее актуальных является проблема эмоционального стресса. Стресс возникает в условиях острых или длительных конфликтных ситуаций, вызванных невозможностью человека или животных удовлетворить ведущие биологические и социальные потребности (Анохин П.К., 1965;
Судаков К.В., 1976). Следствием стрессорных воздействий являются нарушения сердечно-сосудистой деятельности, ишемия и инсульты головного мозга, изъязвление слизистых оболочек желудочно-кишечного тракта, неврозы, депрессии, злокачественные новообразования и другие патологические состояния (Судаков К.В., 1981;
Перцов С.С., 1995;
Schneiderman N. et al., 2005;
Montoro J. et al., 2009).
В экспериментальных исследованиях эмоционального стресса были выявлены индивидуальные различия чувствительности животных к развитию негативных последствий стрессорных воздействий (Юматов Е.А., Скоцеляс Ю.Г., 1979;
Судаков К.В., 1981;
Юматов Е.А., 1986;
Feder A. et al., 2009;
O'Machony C.M. et al., 2011).
Большое значение имеет возможность прогнозирования устойчивости или предрасположенности субъектов к стрессорным нагрузкам до возникновения конфликтных ситуаций. В опытах Е.В. Коплик (2002) было показано, что надежным прогностическим критерием чувствительности крыс к эмоциональному стрессу являются особенности их поведения в тесте «открытое поле». В частности, поведенчески активные животные оказались более устойчивыми к стрессорным воздействиям по сравнению с пассивными особями.
Известно, что патогенез постстрессорных нарушений у млекопитающих тесно связан с изменением баланса между окислительными и антиоксидантными процессами в тканях (Твердохлиб с соавт., 1988;
Гуляева Н.В., 1989;
Барабой В.А., 1992;
Sahin E, Gumuslu S., 2004;
Akpinar D. et al., 2008;
Goncharova N.D. et al., 2008;
Ahmad A. et al., 2010). Увеличение генерации активированных кислородных метаболитов, нарушение нормального соотношения про- и антиоксидантов и, как следствие, чрезмерная активация перекисного окисления липидов (ПОЛ) в клетках является универсальным механизмом повреждения биологических тканей при стрессе (Ланкин В.З. с соавт., 2001, Halliwell B., 2006;
Adibhatla R.M., Hatcher J.F., 2008).
Изменение оксидативного статуса клеток представляется наиболее значимым в структурах головного мозга (Сосновский А.С., Козлов А.В., 1992;
Halliwell B., 2011).
Это связано с избытком свободного кислорода и дефицитом антиоксидантных ферментов в нервных клетках, а также с высоким содержанием в них полиненасыщенных жирных кислот, являющихся мишенью для радикалов (Halliwell B., 2006;
Adibhatla R.M., Hatcher J.F., 2008). Значительная вариабельность окислительных процессов в головном мозге создает предпосылки для развития таких заболеваний, как шизофрения, болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона (Halliwell B., 2006;
Adibhatla R.M., Hatcher J.F., 2008) и синдром Дауна (Ishihara K. et al., 2009).
Одной из наиболее серьезных дисфункций, возникающих у млекопитающих при стрессорных воздействиях, является нарушение иммунного статуса организма (Корнева Е.А. с соавт., 1987;
Крыжановский Г.Н. с соавт., 2003;
Магаева С.В., Морозов С.Г., 2005;
Schneider R.H. et al., 2005;
Tausk F. et al., 2008). В частности, формирование отрицательных эмоциональных состояний сопровождается изменениями цитокинового профиля биологических сред у млекопитающих (Перцов С.С. с соавт., 2009;
Tausk F. et al., 2008;
Dhabhar F.S., 2009).
Цитокины – класс эндогенных полипептидных медиаторов межклеточных взаимодействий, регулирующих ряд физиологических функций клеток. Они обеспечивают поддержание клеточного и тканевого гомеостаза, способствуют формированию защитных реакций организма при воздействии чужеродных факторов и нарушении целостности тканей (Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., 2008).
Состояние иммунных функций организма во многом определяется соотношением провоспалительных (интерлейкин-1, интерлейкин-2, интерлейкин-6, интерферон-, фактор некроза опухоли- и др.) и противовоспалительных цитокинов (интерлейкин-4, интерлейкин-10, интерлейкин-13, трансформирующий фактор роста ). В настоящее время особое внимание исследователей привлекают интерлейкин- (ИЛ-1) и интерлейкин-4 (ИЛ-4), что связано с биологической ролью этих цитокинов у млекопитающих.
Провоспалительный цитокин ИЛ-1 запускает каскад секреции других цитокинов в организме, является одним из медиаторов острой фазы стрессорной реакции, оказывает активирующее влияние на гипоталамо-гипофизарно надпочечниковый комплекс (Gadek-Michalska A. et al., 2008). В отличие от ИЛ-1, ИЛ-4 снижает функциональную активность гипоталамо-гипофизарно надпочечниковой оси (Turnbull A.V., Rivier C.L., 1999). ИЛ-4 подавляет продукцию провоспалительных цитокинов, в частности ИЛ-1, и стимулирует образование его рецепторного антагониста (Кетлинский С.А., Симбирцев А.С., 2008;
Turnbull A.V., Rivier C.L., 1999;
Tausk F. et al., 2008;
Doi N. et al., 2008). Необходимо отметить, что эти цитокины участвуют в регуляции разных звеньев иммунного ответа:
провоспалительный ИЛ-1 преимущественно модулирует развитие неспецифических, а противовоспалительный ИЛ-4 – специфических иммунных реакций (Пальцев М.А., 1996;
Mayer-Barber K.D. et al., 2011;
Oliphant C.J. et al., 2011).
Несмотря на большое количество исследований, посвященных изучению механизмов психоэмоционального стресса, вопрос о наличии взаимосвязи между изменениями иммунных функций и свободнорадикальными процессами в тканях ЦНС у млекопитающих с разной прогностической устойчивостью к однотипным стрессорным нагрузкам остается открытым. Практически не изучен характер действия цитокинов на соотношение окислительных и антиоксидантных процессов в структурах головного мозга у животных с разными параметрами поведения как в исходном состоянии, так и при остром эмоциональном стрессе. Представленная работа посвящена решению указанных вопросов.
Цели и задачи исследования Основной целью работы явилось изучение роли цитокинов в регуляции соотношения между окислительными и антиоксидантными процессами в эмоциогенных структурах головного мозга у крыс с разными поведенческими характеристиками при остром эмоциональном стрессе.
Конкретными задачами исследования были:
1. Изучить интенсивность окислительных и антиоксидантных процессов в эмоциогенных структурах головного мозга – гипоталамусе, сенсомоторной коре и миндалине – у крыс с разными поведенческими характеристиками при острой эмоциональной стрессорной нагрузке.
2. Проанализировать изменения содержания продуктов ПОЛ (ТБК-реактивных продуктов) в эмоциогенных структурах головного мозга у крыс с разными поведенческими характеристиками в условиях острой эмоциональной стрессорной нагрузки на фоне введения провоспалительного цитокина ИЛ-1 или противовоспалительного цитокина ИЛ-4.
3. Определить активность антиоксидантных ферментов (Cu/Zn-супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы) в эмоциогенных структурах головного мозга у крыс с разными поведенческими характеристиками в условиях острой эмоциональной стрессорной нагрузки на фоне введения провоспалительного цитокина ИЛ-1 или противовоспалительного цитокина ИЛ-4.
4. Провести интегральную оценку соотношения ПОЛ и состояния ферментативного звена антиоксидантной защиты в тканях головного мозга у крыс с разными поведенческими характеристиками в условиях острой эмоциональной стрессорной нагрузки на фоне введения изучаемых цитокинов.
5. Выявить возможные особенности окислительных и антиоксидантных процессов в головном мозге у поведенчески пассивных и активных крыс.
Научная новизна работы В работе впервые показано, что провоспалительный цитокин ИЛ-1 и противовоспалительный цитокин ИЛ-4 оказывают сходное воздействие на оксидативный статус эмоциогенных структур головного мозга у крыс с разными поведенческими характеристиками. Выявлено, что введение этих цитокинов сопровождается преимущественно активацией ПОЛ в гипоталамусе и миндалине животных. ИЛ-1 и ИЛ-4 оказывают модулирующее влияние на активность антиоксидантных ферментов с последующим изменением интенсивности свободнорадикальных процессов в тканях головного мозга крыс.
Установлено, что острый эмоциональный стресс сопровождается изменениями активности ферментов антиоксидантной защиты в гипоталамусе крыс с разными параметрами поведения, что предупреждает возможную интенсификацию ПОЛ в указанных условиях. В сенсомоторной коре и миндалине пассивных животных, подвергнутых стрессорной нагрузке, отмечено увеличение интенсивности свободнорадикального окисления.
Продемонстрировано, что ИЛ-1 и ИЛ-4 предупреждают стресс индуцированные изменения соотношения окислительных и антиоксидантных процессов в сенсомоторной коре головного мозга у поведенчески пассивных крыс.
Научно-практическая значимость работы Полученные в ходе проведенного исследования данные расширяют представления о роли иммунных факторов в механизмах формирования отрицательных эмоциональных состояний. В работе показано участие про- и противовоспалительных цитокинов в регуляции окислительных и антиоксидантных процессов в тканях головного мозга у крыс с разными поведенческими характеристиками как в нормальных условиях, так и при острой стрессорной нагрузке.
Согласно полученным результатам, ИЛ-1 и ИЛ-4 оказывают протективное действие на ткани ЦНС, предупреждая постстрессорные изменения оксидативного баланса в сенсомоторной коре у пассивных крыс. Выявленные особенности действия про- и противовоспалительных цитокинов на соотношение окислительных и антиоксидантных процессов могут быть использованы в клинической фармакологии, в частности, при разработке рекомендаций по применению иммуноактивных соединений с целью коррекции оксидативного статуса организма в условиях патологии, в том числе при нейродегенеративных заболеваниях.
Положения, выносимые на защиту 1. Провоспалительный цитокин ИЛ-1 и противовоспалительный цитокин ИЛ- оказывают сходное модулирующее влияние на оксидативный статус тканей гипоталамуса, сенсомоторной коры и миндалины у крыс. Выявлены регионарные особенности окислительных и антиоксидантных процессов в головном мозге у животных с разной поведенческой активностью, получавших изученные цитокины.
2. Острый эмоциональный стресс сопровождается увеличением интенсивности ПОЛ в сенсомоторной коре и миндалине мозга у поведенчески пассивных крыс.
3. ИЛ-1 и ИЛ-4 предупреждают стресс-индуцированные изменения соотношения окислительных и антиоксидантных реакций в сенсомоторной коре поведенчески пассивных крыс.
Апробация работы Результаты исследований доложены на следующих научных мероприятиях:
XVIII Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2011» (Москва, 2011);
III Международный симпозиум «Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и патологии» (Санкт-Петербург, 2011);
Вторая конференция молодых ученых и студентов «Экспериментальная и прикладная физиология» (Москва, 2011);
итоговые сессии Научно-исследовательского института нормальной физиологии имени П.К. Анохина РАМН (Москва, 2010-2011);
конференции Отдела социальной физиологии Научно-исследовательского института нормальной физиологии имени П.К. Анохина РАМН (2009-2011).
Публикации Основное содержание диссертации отражено в 5 статьях и 5 тезисах.
Структура и объем диссертации Диссертационная работа изложена на 143 страницах машинописного текста, содержит 20 рисунков, 11 таблиц и состоит из введения, обзора литературы, описания методики экспериментов, изложения результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Библиографический указатель содержит 241 источник (74 на русском и 167 на иностранных языках).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Эксперименты выполнены на 246 крысах-самцах Вистар массой 265,0±2,4 г.
Исследования проведены в соответствии с "Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных" (этическая комиссия НИИ нормальной физиологии имени П.К. Анохина РАМН, протокол №1 от 03.09.2005г.), а также требованиями Всемирного общества защиты животных (WSPA) и Европейской конвенции по защите экспериментальных животных.
Крыс содержали в стандартных клетках (по 4-7 особей) при искусственном освещении (8.00-20.00 – свет, 20.00-8.00 – темнота), комнатной температуре (20-22°C) и свободном доступе к воде и пище. После доставки из питомника крысы адаптировались к условиям вивария в течение 5 дней.
Изучение поведенческих характеристик животных. Для определения исходных параметров поведения крыс тестировали в открытом поле в течение 3 минут. Индекс активности животных вычисляли по формуле: сумму пересеченных периферических и центральных секторов, периферических и центральных стоек, а также исследованных объектов делили на сумму латентных периодов первого движения и выхода в центр открытого поля (Коплик Е.В., 2002).
В соответствии с исходными параметрами поведения крысы были разделены на поведенчески активных (n=78, индекс активности – 3,49±0,49), пассивных (n=78, индекс активности – 0,51±0,03) и амбивалентных особей (n=90, индекс активности – 1,35±0,04). Дальнейшие опыты проведены на активных и пассивных крысах, характеризующихся крайними паттернами поведения.
Целью первой серии экспериментов явилась верификация развития стрессорного состояния у крыс, подвергнутых иммобилизации с одновременным нанесением электрокожного раздражения подпороговой силы.
Эксперименты проведены на 14 поведенчески активных и 14 пассивных крысах-самцах Вистар. Выделены 4 группы интактных и стрессированных особей, каждая из которых состояла из 7 животных.
Через одну неделю после формирования экспериментальных групп крыс подвергали стрессорному воздействию. В качестве модели острой эмоциональной стрессорной нагрузки использовали 1-часовую иммобилизацию крыс с одновременным нанесением электрокожного раздражения подпороговой силы в стохастическом режиме (Перцов С.С. с соавт., 2006, 2009, 2011;
Sudakov K.V., 1999;
Gorbunova A.V., 2000;
Gryzunov Y.A. et al., 2006). Животных иммобилизировали в пластиковых пеналах длиной 16,5 см и внутренним диаметром 5,5 см. На кожу спины крыс помещали металлические игольчатые электроды для нанесения раздражения переменным током. Силу тока подбирали индивидуально по порогу вокализации животного в ответ на стимуляцию. В таких условиях электрокожное раздражение является подпороговым. Используемая методика стрессорной нагрузки у крыс позволяет избежать воздействия болевого раздражителя с последующей ноцицептивной реакцией животных. Раздражение наносили по стохастической схеме:
длительность 1 мсек, напряжение 4-6 В, частота 50 Гц. В течение 1 часа животные получали 12 серий 30-сек стимуляции и 5 серий 60-сек стимуляции.
Указанная модель острого эмоционального стресса была выбрана в соответствии с общей целью исследования путем сравнения влияния разных типов стрессорных воздействий на свободнорадикальные процессы (Сосновский А.С., Козлов А.В., 1992;
Перцов С.С. с соавт., 1995;
Гончарова Н.Д. с соавт., 2008;
Alptekin N. et al., 1996;
Zaidi S.M. et al., 2005;
Sahin E., Gml S., 2007;
Atif F. et al., 2008;
Martnez-Smano J. et al., 2010). Контрольные крысы не были подвергнуты стрессорной нагрузке и в течение всего эксперимента находились в «домашних» клетках. Крыс всех групп декапитировали сразу после окончания опытов. Относительную массу органов маркеров стресса (тимуса, надпочечников и селезенки) рассчитывали на 100 г массы тела крыс. Концентрацию кортикостерона в сыворотке крови животных, полученной после их декапитации, измеряли методом иммуноферментного анализа (Reagents for rat corticosterone ELISA, Sigma, USA) и выражали в нмоль/мл.
Целью второй серии экспериментов было изучение интенсивности ПОЛ в тканях ЦНС у крыс при острой стрессорной нагрузке на фоне предварительного введения провоспалительного цитокина ИЛ-1 или противовоспалительного цитокина ИЛ-4. Содержание ТБК-реактивных продуктов измеряли в эмоциогенных структурах головного мозга, играющих значимую роль в формировании отрицательных эмоциональный состояний: гипоталамусе, миндалине и сенсомоторной коре (Судаков К.В., 1997;
Симонов П.В., 2004;
Chowdhury G.M. et al., 2000;
Berretta S., 2005;
Baumann N., Turpin J.C., 2010).
Эксперименты проведены на 40 активных и 40 пассивных крысах-самцах Вистар. Животные с разной поведенческой активностью были разделены на 12 групп по 6-7 особей в каждой.
Крысиный ИЛ-4 (Sigma, USA) и рекомбинантный ИЛ-1 (активность 108 ед/мг, ФГУП "ГосНИИ особо чистых биопрепаратов" ФМБА России, Санкт-Петербург) в дозе 5 мкг/кг массы тела крысы или физиологический раствор (1 мл) вводили животным внутрибрюшинно за 1 час до стрессорной нагрузки. Контрольные (нестрессированные) крысы получали указанные инъекции за 2 часа до декапитации.
Дозы цитокинов, а также интервал времени между введением изучаемых веществ и началом стрессорной нагрузки были выбраны в соответствии с литературными данными (Симбирцев А.С., 2011;
Sanz M.J. et al., 1998;
Cook H.T. et al., 1999;
Boudry G. et al., 2004;
Cortijo J. et al., 2006;
Fan L.W. et al., 2009;
Zhuang J. et al., 2011).
После декапитации крыс извлекали головной мозг;
выделяли гипоталамус, сенсомоторную кору и миндалину. Указанные структуры замораживали в жидком азоте и хранили при -24-26 C. Содержание белка (мг) и ТБК-реактивных продуктов (нмоль/мг белка) в пробах ткани головного мозга животных определяли спектрофотометрическими методами (Lowry O.H. et al., 1951;
Sinnhuber R.O., Yu T.C., 1958;
Okhawa et al., 1979).
Целью третьей серии экспериментов было определение активности ключевых антиоксидантных ферментов Cu/Zn-супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы (Барабой В.А., 1991;
Halliwell B., 2006;
Yan F. et al., 2010) в эмоциогенных структурах головного мозга у крыс при острой стрессорной нагрузке на фоне предварительного введения ИЛ-1 или ИЛ-4.
Схема эксперимента была аналогична таковой во второй серии опытов.
Содержание белка (мг) и активность антиоксидантных ферментов (ед. активности на мг белка) в пробах тканей гипоталамуса, сенсомоторной коры и миндалины, полученных после декапитации крыс, определяли стандартными спектрофотометрическими методиками (Ланкин В.З. с соавт., 1981;
Lowry O.H. et al., 1951;
Paglia D.E., Valentine W.N., 1967;
Buetler E., 1969;
Beauchamp C., Fridovich I., 1971).
Расчет индекса окислительных и антиоксидантных процессов Для проведения комплексной оценки оксидативного статуса тканей головного мозга крыс в разных экспериментальных условиях рассчитывали индекс изменения интенсивности окислительных и антиоксидантных процессов. Среднюю концентрацию ТБК-реактивных продуктов у нестрессированных животных, получавших инъекции физиологического раствора (Ск), принимали за 100% (Хк, %).
Изменение уровня ТБК-реактивных продуктов (Хо, %) у нестрессированных крыс после введения ИЛ-1 и ИЛ-4, а также у особей, подвергнутых стрессорной нагрузке на фоне инъекции физиологического раствора или исследуемых цитокинов (Со), рассчитывали по следующей формуле: Хо=Со/Ск*100%. В дальнейшем определяли индекс окислительных процессов (И): И=Хо-Хк.
Индекс изменения интенсивности антиоксидантных процессов в структурах головного мозга крыс в разных экспериментальных условиях рассчитывали аналогично для всех изученных ферментов – Cu/Zn-супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы. Общий индекс антиоксидантных процессов вычисляли путем сложения полученных индексов.
Статистическая обработка Достоверность различий между группами крыс выявляли с помощью непараметрического критерия Mann-Whitney. Различия считались статистически значимыми при p0,05. Численные данные в тексте и таблицах приведены как среднее значение ± ошибка средней.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Верификация формирования отрицательного эмоционального состояния у крыс при остром стрессорном воздействии на модели 1-часовой иммобилизации с одновременным электрокожным раздражением Для подтверждения формирования отрицательного эмоционального состояния у крыс, подвергнутых иммобилизации с одновременным электрокожным раздражением подпороговой силы, определяли концентрацию кортикостерона в сыворотке крови животных и относительную массу органов-маркеров стресса (тимуса, надпочечников и селезенки).
Острое стрессорное воздействие у пассивных и активных крыс сопровождалось значительным увеличением концентрации кортикостерона в сыворотке крови (в 1, и 1,83 раза соответственно, p0,01 по сравнению с нестрессированными животными;
табл. 1). В этих условиях отмечено выраженное снижение относительной массы тимуса и селезенки у поведенчески пассивных особей (в 1,14 и 1,21 раза соответственно, p0,05). Выявленные изменения типичны для синдрома биологического стресса у млекопитающих (Selye H., 1946). Таким образом, используемая нами модель острого стрессорного воздействия у крыс сопровождается формированием состояния эмоционального стресса у животных.
Таблица 1. Относительная масса органов-маркеров стресса (мг/100 г массы тела) и концентрация кортикостерона в сыворотке крови (нг/мл) у нестрессированных крыс и животных, подвергнутых острой стрессорной нагрузке (M m) Активные крысы Пассивные крысы Контроль Стресс Контроль Стресс 178,74 17,75 146,98 11,98 177,69 8,45 155,91 7,00 * Тимус 9,91 1,12 10,85 0,36 11,65 1,13 11,67 1, Надпочечники 645,72 67,96 516,51 53,80 668,51 30,76 553,46 43,15 * Селезенка Кортикостерон 44,64±6,68 81,82±13,57** 43,95±8,94 76,87±11,95** Примечание. **p0,01 и *p0,05 по сравнению с нестрессированными крысами.
Окислительные и антиоксидантные процессы в головном мозге крыс при введении ИЛ-1 или ИЛ- В соответствии с общей целью работы мы изучили окислительные и антиоксидантные реакции в эмоциогенных структурах головного мозга у нестрессированных крыс при изменении иммунного статуса организма путем внутрибрюшинного введения провоспалительного цитокина ИЛ-1 или противовоспалительного цитокина ИЛ-4.
Введение ИЛ-1 сопровождалось интенсификацией ПОЛ в гипоталамусе поведенчески активных и пассивных крыс (в 1,67 и 1,47 раза соответственно, p0, по сравнению с крысами, получавшими физиологический раствор;
табл. 2). Эти изменения, вероятно, обусловлены снижением активности глутатионредуктазы в гипоталамусе животных в указанных условиях (в 1,32 [p0,01] и 1,22 раза соответственно). Полученные в нашей работе данные согласуются с результатами предыдущих исследований. В частности, в экспериментах С.С. Перцова (1995) было показано, что центральное введение ИЛ-1 в боковой желудочек головного мозга крыс Вистар, Вэг и Август приводит к накоплению продуктов ПОЛ в гипоталамусе.
Однако в отличие от эффектов, наблюдаемых нами при периферическом введении ИЛ 1, после внутрижелудочковой инъекции этого цитокина в гипоталамусе животных выявлено увеличение активности антиоксидантных ферментов (Перцов С.С., 1995).
Нами обнаружено, что внутрибрюшинное введение ИЛ-4 также вызывает увеличение концентрации ТБК-реактивных продуктов в гипоталамусе активных и пассивных крыс (в 3,27 [p0,01] и 1,47 [p0,05] раза соответственно по сравнению с физиологическим раствором;
табл. 2). Активация глутатионпероксидазы (в 1, [p0,01] и 1,66 раза соответственно) и Cu/Zn-супероксиддисмутазы (в 1,62 и 1,36 раза соответственно, p0,05) в гипоталамусе животных этих групп после инъекции ИЛ-4, по-видимому, являлась последствием интенсификации ПОЛ.
Показано, что в сенсомоторной коре и миндалине пассивных крыс, получавших ИЛ-1, концентрация ТБК-реактивных продуктов повышалась в 1,54 и 1,72 раза соответственно (p0,05 по сравнению с крысами, которым вводили физиологический раствор;
табл. 3, 4). Наблюдающаяся в миндалине этих животных активация глутатионпероксидазы и Cu/Zn-супероксиддисмутазы (в 1,38 и 1,19 раза соответственно, p0,01), по-видимому, являлась вторичной компенсаторной реакцией на интенсификацию ПОЛ. В сенсомоторной коре пассивных особей, получавших ИЛ 1, накопление ТБК-реактивных продуктов, вероятно, обусловлено отсутствием изменений эффективности антиоксидантной защиты в указанных условиях (табл. 3).
В отличие от пассивных крыс, в сенсомоторной коре и миндалине активных особей содержание ТБК-реактивных продуктов снижалось после введения ИЛ-1 (в 1, [p0,05] и 1,23 раза соответственно по сравнению с физиологическим раствором;
табл. 3, 4). Выявленная в этих условиях активация Cu/Zn-супероксиддисмутазы в сенсомоторной коре (в 1,53 раза, p0,05) и глутатионпероксидазы в миндалине (в 1, раза, p0,01), по-видимому, вносила вклад в подавление свободнорадикального окисления.
В научной литературе имеются противоречивые данные о характере действия ИЛ-1 на свободнорадикальные процессы в коре головного мозга. Так, введение ИЛ 1 в боковой желудочек мозга у крыс Вистар не изменяет оксидативный статус сенсомоторной коры (Перцов С.С., 1995). Отсутствие изменений ПОЛ в этой структуре головного мозга у животных после внутрижелудочкового введения ИЛ- может быть связано с тем, что данные опыты были выполнены на общей популяции крыс, без их предварительного разделения на группы особей с разной поведенческой активностью. Напротив, по данным Ishizuka Y. с соавторами (2008), введение ИЛ- крысам в медиальную префронтальную кору сопровождается увеличением уровня гидроксильного радикала в этой структуре ЦНС. Однако периферическое введение животным этого цитокина не изменяло содержание гидроксильного радикала в указанной области головного мозга.
Таблица 2. Концентрация ТБК-реактивных продуктов (нм/мг белка) и активность антиоксидантных ферментов (ед. акт./мг белка) в гипоталамусе крыс разных экспериментальных групп (M±m) Активные крысы Пассивные крысы Контроль Стресс Контроль Стресс ТБК-реактивные продукты Физ. раствор 0.30 0.04 0.30 0.04 0.38 0.03 0.30 0. + + + 0.55 0.05 + ИЛ-1 0.50 0.09 0.53 0.08 0.56 0. 0.98 0.20++ О 0.56 0.05++ 0.56 0.08+ ИЛ-4 0.57 0. Глутатионпероксидаза ХХ Физ. раствор 34.9±4.4 31.1±3.7 23.0±3.8 29.6±5. ИЛ-1 29.8±1.9 28.8±1.5 30.5±4.0 26.3±2. О ++ Х+О ИЛ-4 52.2±6.1 56.3±9.2 38.2±8.2 32.6±3. Глутатионредуктаза Физ. раствор 30.0±3.3 17.0±1.6 * 35.2±6.8 24.2±3. ++ ХХ + ИЛ-1 22.7±1.9 24.4±2.0 28.9±1.9 30.9±4. ХХ + ИЛ-4 25.9±6.5 33.7±4.3 31.3±9.9 18.9±3. Cu/Zn-супероксиддисмутаза 388.2±30.0 ХХ 554.3±30.5 Х * Физ. раствор 478.0±28.8 377.7±26.9 ** ++ХХ ИЛ-1 447.1±29.0 465.2±20.0 427.9±34.9 397.8±19. +О ХХ О +О 498.5±22.4 + О* ИЛ-4 627.9±42.2 654.1±41.7 647.7±13. Примечание. *p0,05 и **p0,01 по сравнению с контрольными крысами;
+p0,05 и ++p0, по сравнению с крысами, получавшими физиологический раствор;
Оp0,05 по сравнению с крысами, получавшими ИЛ-1;
p0,05 и p0,01 по сравнению с пассивными крысами.
Интенсивность окислительных процессов в сенсомоторной коре поведенчески пассивных крыс практически не изменялась после инъекции ИЛ-4. Активация глутатионпероксидазы и Cu/Zn-супероксиддисмутазы у этих животных (в 1, [p0,05] и 1,11 раза соответственно;
табл. 3), вероятно, предупреждала изменения интенсивности ПОЛ на фоне введения ИЛ-4. Снижение концентрации ТБК реактивных продуктов в сенсомоторной коре активных животных после введения ИЛ 4 (в 2,20 раза, p0,05), по-видимому, обусловлено увеличением активности глутатионпероксидазы и Cu/Zn-супероксиддисмутазы в этих условиях (в 1,56 и 1, раза соответственно, p0,05).
Введение ИЛ-4 сопровождалось накоплением ТБК-реактивных продуктов в миндалине поведенчески активных и пассивных крыс (в 1,33 и 1,48 [p0,05] раза соответственно по сравнению с физиологическим раствором;
табл. 4).
Интенсификация свободнорадикального окисления в миндалине этих животных может быть обусловлена снижением активности глутатионпероксидазы (в 1, [p0,01] и 1,54 [p0,05] раза соответственно) и Cu/Zn-супероксиддисмутазы (в 1, [p0,05] и 1,10 [p0,01] раза соответственно).
Таблица 3. Концентрация ТБК-реактивных продуктов (нм/мг белка) и активность антиоксидантных ферментов (ед. акт./мг белка) в сенсомоторной коре крыс разных экспериментальных групп (M±m) Активные крысы Пассивные крысы Контроль Стресс Контроль Стресс ТБК-реактивные продукты Физ. раствор 2,22 0,25 2,05 0,18 1,53 0,19 2,19 0,27* + + 1,27 0,16 ** ++ ИЛ-1 1,38 0,21 1,88 0,22 2,36 0, 1,01 0,27+ 0,92 0,15++ ОО 0,85 0,15++ * ИЛ-4 1,29 0,18ОО Глутатионпероксидаза Физ. раствор 24.1±1.6 28.2±3.5 22.0±1.3 28.4±1.8* 19.3±0.8* + ИЛ-1 23.9±2.0 22.6±1.6 26.1±2. 37.7±2.7ХХ + О 27.8±1.8 * ХХ 31.5±0.4ОО + 22.3±1.2 ++ ОО * ИЛ- Глутатионредуктаза Физ. раствор 25.2±2.7 23.1±2.2 28.9±2.1 24.6±3. ++ ИЛ-1 25.5±2.3 34.2±4.7 31.6±4.6 30.6±2. ХХ ХХ ++ 23.6±2.0 ОО * ИЛ-4 28.8±5.1 30.8±4.2 41.8±3. Cu/Zn-супероксиддисмутаза 274.4±11.1 ХХ Физ. раствор 340.5±34.5 320.4±13.3 331.0±24. ХХ + ХХ ИЛ-1 420.0±29.7 316.8±17.5 ** 332.1±24.8 364.1±11. + ХХ 297.0±8.7 ** О ИЛ-4 327.9±22.7 319.6±8.4 355.3±18. Примечание. *p0,05 и **p0,01 по сравнению с контрольными крысами;
+p0,05 и ++p0, по сравнению с крысами, получавшими физиологический раствор;
Оp0,05 и ООp0,01 по сравнению с крысами, получавшими ИЛ-1;
p0,05 и p0,01 по сравнению с пассивными крысами.
Таким образом, введение изученных нами цитокинов сопровождается преимущественно активацией ПОЛ в эмоциогенных структурах головного мозга крыс. Инъекция ИЛ-1 приводит к накоплению продуктов ПОЛ во всех изученных структурах головного мозга поведенчески пассивных животных, а также в гипоталамусе активных особей. Полученные нами результаты согласуются с данными литературы. В экспериментах in vitro показано, что ИЛ-1 индуцирует продукцию активированных кислородных радикалов культивируемыми нейтрофильными гранулоцитами (Нестерова И.В., 1993), мезангиальными клетками (Bohler T. et al., 2000), сперматозоидами человека (Fraczek M. et al., 2008) и другими клетками.
Аналогичный эффект этого цитокина отмечен в экспериментах с клетками головного мозга млекопитающих. В частности, при инкубации культуры клеток гиппокампа 4- и 22-месячных крыс с ИЛ-1 выявлена активация ПОЛ (Murray C.A. et al., 1999).
Выявленные изменения продукции свободнорадикальных молекул могут быть обусловлены модулирующим влиянием провоспалительных цитокинов на состояние микроглии в тканях ЦНС. ИЛ-1 активирует микроглию, стимулируя продукцию активированных кислородных метаболитов. Кроме этого, активированная микроглия продуцирует значительные количества индуцибельной NO-синтазы и, как следствие, окиси азота, что также ведет к повреждениям нейронов и гибели клеток (Duncan A.J., Heales S.J., 2005;
Halliwell B., 2006).
Необходимо отметить, что изменения оксидативного статуса биологических тканей млекопитающих, в свою очередь, сопровождаются накоплением провоспалительных цитокинов. В частности, одним из последствий повышенной генерации окиси азота и супероксид-аниона является увеличение продукции фактора некроза опухоли-, ИЛ-1, ИЛ-12 активированными астроцитами и микроглией (Crapo J.D., 2003;
Duncan A.J., Heales S.J., 2005). При этом введение антиоксидантов предупреждает изменения цитокинового статуса клеток млекопитающих (Crapo J.D., 2003). Важно, что цитокин-опосредованная активация ПОЛ является одним из механизмов, лежащих в основе изменений оксидативного баланса при различных воздействиях. Так, инъекция рецепторного антагониста ИЛ-1 снижает уровень ТБК реактивных продуктов в миокарде мышей, повышенный после введения доксорубицина (Zhu J. et al., 2010).
В наших экспериментах показано, что внутрибрюшинное введение ИЛ- приводит к активации ПОЛ в гипоталамусе крыс с разными типами поведения, а также в миндалине пассивных особей. Полученные данные согласуются с результатами работ других авторов. В ряде исследований in vitro и in vivo выявлено, что ИЛ-4 вызывает увеличение уровня активированных кислородных радикалов в клетках млекопитающих (Bober L.A. et al., 1995;
Lee Y.W., Hirani A.A., 2006;
Walch L.
et al., 2006;
Park K.W. et al., 2008;
Lee Y.W. et al., 2001;
Lee Y.W. et al., 2010). В частности, инкубация культур нейтрофилов и клеток эндотелия вен человека с ИЛ- приводит к накоплению кислородных метаболитов внеклеточного супероксид аниона и гидроксильного радикала (Bober L.A. et al., 1995;
Lee Y.W. et al., 2001;
Lee Y.W. et al., 2010). Введение в культуры клеток антиоксидантных соединений снижает индуцированную ИЛ-4 продукцию свободнорадикальных частиц (Walch L. et al., 2006;
Lee Y.W. et al., 2001;
Lee Y.W. et al., 2010). Инкубация клеток гиппокампа крыс с ИЛ-4 также сопровождается повышенным выделением активированных кислородных радикалов клетками микроглии и, как следствие, увеличением гибели нейронов. Введение антител к ИЛ-4 в культуру клеток предотвращает описанные выше эффекты цитокина (Park K.W. et al., 2008). Возможным механизмом ИЛ-4 зависимого увеличения продукции свободнорадикальных соединений в клетках млекопитающих является повышение экспрессии провоспалительного цитокина ИЛ- и молекул адгезии сосудистого эндотелия (VCAM-1), опосредующих накопление кислородных метаболитов и перекисей. Определенный вклад в наблюдающиеся под действием ИЛ-4 изменения вносит активация NADPH-оксидазы, циклооксигеназы и липооксигеназы, катализирующих образование супероксид-аниона и других токсичных форм кислорода. Введение ингибиторов этих ферментативных комплексов предупреждает накопление свободных радикалов (Park K.W. et al., 2008;
Lee Y.W. et al., 2001;
Lee Y.W. et al., 2010).
Таблица 4. Концентрация ТБК-реактивных продуктов (нм/мг белка) и активность антиоксидантных ферментов (ед. акт./мг белка) в миндалине крыс разных экспериментальных групп (M±m) Активные крысы Пассивные крысы Контроль Стресс Контроль Стресс ТБК-реактивные продукты Физ. раствор 3,19 0,56 3,68 0,41 2,36 0,26 3,42 0,36* + + ИЛ-1 2,60 0,16 2,38 0,15 4,05 0,60 3,38 0, ОО ОО + ИЛ-4 4,23 0,37 4,12 0,32 3,50 0,35 3,59 0, Глутатионпероксидаза Физ. раствор 33.7±3.3 32.7±2.7 33.5±5.2 39.1±4. ++ Х ++ ИЛ-1 45.2±3.2 33.8±2.3 * 46.3±4.7 45.6±1. ++ О ++ ОО Х +О 34.9±2.3 * О ИЛ-4 21.7±1.8 25.1±5.0 21.8±1. Глутатионредуктаза Физ. раствор 27.1±2.1 24.5±1.0 29.2±2.5 24.5±2. + 34.9±3.5 ++ ИЛ-1 30.0±2.1 34.5±2.2 29.4±2. 40.0±4.9 ++ ОО 35.7±3.2 + 35.0±3.8 ++ ИЛ-4 31.2±3. Cu/Zn-супероксиддисмутаза Физ. раствор 406.7±20.8 380.8±12.4 350.1±10.5 352.6±25. + ++ 288.6±8.5 ++ * ИЛ-1 358.2±16.8 260.8±13.8 * 417.2±22. 303.5±18.9 + ОО 302.0±11.3 + ОО 318.1±8.3 ++ О 282.6±8.7 ++ ** ИЛ- Примечание. *p0,05 и **p0,01 по сравнению с контрольными крысами;
+p0,05 и ++p0, по сравнению с крысами, получавшими физиологический раствор;
Оp0,05 и ООp0,01 по сравнению с крысами, получавшими ИЛ-1;
p0,05 по сравнению с пассивными крысами.
Наши опыты продемонстрировали, что как ИЛ-1, так и ИЛ-4 оказывают первичное воздействие преимущественно на антиоксидантную систему с последующими вторичными изменениями окислительного статуса тканей головного мозга у поведенчески пассивных и активных крыс. В работах ряда авторов описано регуляторное действие этих цитокинов на активность ферментов антиоксидантной защиты. В экспериментах in vitro выявлены разнонаправленные эффекты ИЛ-1 на активность Cu/Zn-cупероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы в культурах клеток (Borg L.A. et al., 1992;
Grzybowski A.E., 2000;
Catal M., Portols M.T., 2002;
Mathy Hartert M. et al., 2008). Показано, что ИЛ-4 увеличивает экспрессию соответствующих генов и активность липоксигеназы и глутатион-S-трансферазы (Lanquoet S. et al., 1995;
Kuhn H. et al., 1999;
Schnurr K. et al., 1999).
Необходимо отметить, что выявленная нами при введении ИЛ-1 и ИЛ- повышенная генерация свободнорадикальных соединений с последующей активацией ПОЛ могут играть важную роль в нормальной жизнедеятельности клеток. Так, активированные кислородные радикалы обеспечивают межклеточные взаимодействия, принимают участие в регуляции проницаемости клеточных мембран, проведении нервного импульса и транскрипции генов, активируют синтез простагландинов, лейкотриенов и дезоксирибонуклеотидов и т.д. (Мухутдинова Ф.И.
с соавт., 2009;
Jurnek I., Bezek., 2005;
Halliwell B., Chirico S., 1993). Кроме этого, процессы ПОЛ способствуют обновлению липидной части биологических мембран (Jurnek I., Bezek., 2005).
Окислительные и антиоксидантные процессы в головном мозге крыс после острой эмоциональной стрессорной нагрузки В дальнейших опытах мы исследовали соотношение окислительных и антиоксидантных процессов в структурах головного мозга крыс после острой стрессорной нагрузки на модели 1-часовой иммобилизации животных с одновременным нанесением электрокожного раздражения подпороговой силы в стохастическом режиме.
Показано, что острый эмоциональный стресс не оказывает значимого влияния на содержание ТБК-реактивных продуктов в гипоталамусе крыс с разной поведенческой активностью (табл. 2). В гипоталамусе поведенчески пассивных животных формирование отрицательного эмоционального состояния сопровождалось снижением активности глутатионредуктазы и Cu/Zn-супероксиддисмутазы (в 1,45 и 1,27 [p0,01] раза соответственно по сравнению с нестрессированными особями).
Отсутствие изменений интенсивности ПОЛ на фоне снижения активности указанных ферментов в гипоталамусе пассивных крыс после стрессорной нагрузки свидетельствует о преимущественном участии в регуляции свободнорадикальных процессов в этих условиях других, не исследованных нами эндогенных соединений с антиоксидантными свойствами. Антиоксидантное действие могут оказывать, в частности, глюкокортикоиды, катехоламины и серотонин, продукция которых значительно возрастает при формировании стрессорной реакции (Белова Т.И., Кветнанский Р., 1987;
Барабой В.А., 1991;
Бурлакова Е.Б. с соавт., 1992;
Schneiderman N. et al., 2005). У поведенчески активных крыс разнонаправленные изменения активности ферментов антиоксидантной защиты в гипоталамусе, по-видимому, компенсировали возможные изменения ПОЛ при эмоциональной стрессорной нагрузке (табл. 2). После стрессорного воздействия в гипоталамусе этих животных отмечено снижение активности глутатионредуктазы (в 1,76 раза, p0,05 по сравнению с нестрессированными особями), но увеличение активности Cu/Zn супероксиддисмутазы (в 1,43 раза, p0,05).
Результаты наших опытов согласуются с данными, полученными другими исследователями. Показано, что 1-часовой иммобилизационный стресс не изменяет уровень продуктов ПОЛ в гипоталамусе крыс Вистар и Вэг, но увеличивает этот показатель у крыс Август (Сосновский А.С., Козлов А.В., 1992;
Перцов С.С. с соавт., 1995). Интенсивность окислительных процессов также не изменялась в гипоталамусе активных и пассивных крыс Вистар, подвернутых острому водно-иммерсионному стрессу (Перцов С.С., Пирогова Г.В., 2004), однако увеличивалась у животных после хронического водно-иммерсионного стресса (Haleagrahara N. et al., 2009).
Выявленные в нашей работе значимые изменения активности антиоксидантных ферментов в гипоталамусе крыс на фоне неизменного содержания ТБК-реактивных продуктов свидетельствуют о высокой функциональной активности антиоксидантной системы в указанной области головного мозга. Обнаруженные особенности, по видимому, обеспечивают относительное постоянство гомеостазиса этой пейсмекерной структуры мозга у млекопитающих при экстремальных воздействиях различного характера (Судаков К.В., 1981, 1997;
Fontes M.A. et al., 2011;
Koolhaas Y.M. et al., 2011).
В наших опытах установлено, что острая стрессорная нагрузка сопровождается однонаправленными изменениями ПОЛ в сенсомоторной коре и миндалине крыс с разными параметрами поведения. Эмоциональный стресс приводил к накоплению ТБК-реактивных продуктов в указанных структурах головного мозга у пассивных животных (в 1,43 и 1,45 раза соответственно, p0,05 по сравнению с нестрессированными особями;
табл. 3, 4). Наблюдающееся в сенсомоторной коре и миндалине этих крыс увеличение активности глутатионпероксидазы (в 1,29 [p0,05] и 1,17 раза соответственно), по-видимому, являлось вторичной компенсаторной реакцией на интенсификацию ПОЛ. В отличие от поведенчески пассивных особей, содержание ТБК-реактивных продуктов в сенсомоторной коре активных крыс практически не изменялось в условиях иммобилизации с одновременным электрокожным раздражением (табл. 3). Выявленная после острого стрессорного воздействия активация Cu/Zn-супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы (в 1,24 и 1,17 раза соответственно, статистически недостоверно) в сенсомоторной коре активных животных, вероятно, предупреждала интенсификацию ПОЛ в этих условиях. Полученные нами результаты подтверждаются данными других авторов. В экспериментах А.С. Сосновского (1992) было обнаружено, что при остром эмоциональном стрессе у крыс концентрация продуктов ПОЛ в затылочно-теменной, лимбической и сенсомоторной коре увеличивается. Показано, что чередование различных эмоциогенных и физических стрессоров разной силы, так называемый «непредсказуемый стресс», сопровождается интенсификацией ПОЛ с последующим увеличением активности глутатионпероксидазы во фронтальной коре крыс (Ahmad A.
et al., 2010). Острый стресс, вызванный нанесением электрического раздражения на лапы животных (foot-shock stress), не приводил к изменениям уровня ТБК-реактивных продуктов в префронтальной коре, но вызывал достоверное увеличение активности глутатионпероксидазы в этой структуре головного мозга (Uysal N. et al., 2005).
Выявленное нами избирательное увеличение активности глутатионпероксидазы в сенсомоторной коре и миндалине крыс, подвергнутых стрессорной нагрузке, позволяет предположить, что этот антиоксидантный фермент наиболее "чувствителен" к стресс-индуцированной интенсификации ПОЛ (Кулинский В.И., Колесниченко Л.С., 1993). Полученные данные указывают на то, что активация глутатионпероксидазы направлена на быстрое подавление окислительных процессов в головном мозге млекопитающих при отрицательных эмоциогенных воздействиях (Кулинский В.И., Колесниченко Л.С., 1993;
Sahin E., Gumuslu S., 2004;
Uysal N. et al., 2005;
Ahmad A. et al., 2010).
Окислительные и антиоксидантные процессы в головном мозге крыс при острой стрессорной нагрузке на фоне введения ИЛ-1 или ИЛ- На заключительном этапе экспериментального исследования мы изучили ПОЛ и активность антиоксидантных ферментов в эмоциогенных структурах головного мозга крыс при острой эмоциональной стрессорной нагрузке на фоне предварительного внутрибрюшинного введения провоспалительного цитокина ИЛ- или противовоспалительного цитокина ИЛ-4.
Острая стрессорная нагрузка после введения ИЛ-1 сопровождалась накоплением ТБК-реактивных продуктов в гипоталамусе поведенчески активных и пассивных крыс (в 1,77 и 1,83 раза соответственно, p0,05 по сравнению со стрессированными животными, получавшими физиологический раствор). Однако интенсивность ПОЛ в гипоталамусе крыс в указанных условиях не отличалась от таковой у нестрессированных особей, получавших ИЛ-1 (табл. 2). У поведенчески активных животных ИЛ-1 предупреждал изменения активности Cu/Zn супероксиддисмутазы и глутатионредуктазы в гипоталамусе, выявленные после стрессорного воздействия. В указанных условиях активность глутатионредуктазы увеличивалась в 1,44 раза (p0,05 по сравнению с физиологическим раствором), а Cu/Zn-супероксиддисмутазы снижалась в 1,19 раза (p0,01;
табл. 2).
Как и в опытах с ИЛ-1, предварительное введение ИЛ-4 сопровождалось накоплением ТБК-реактивных продуктов в гипоталамусе поведенчески активных и пассивных крыс, подвергнутых острой стрессорной нагрузке (в 1,87 [p0,01] и 1, раза соответственно по сравнению с животными, получавшими физиологический раствор;
табл. 2). Стрессорное воздействие после инъекции ИЛ-4 приводило к активации Cu/Zn-супероксиддисмутазы в гипоталамусе у пассивных животных (в 1, раза, p0,05), а также глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы у активных особей (в 1,81 и 1,98 раза соответственно, p0,05).
Предварительное введение ИЛ-1 или ИЛ-4 предупреждало стресс индуцированные изменения окислительных и антиоксидантных процессов в сенсомоторной коре поведенчески пассивных крыс. После инъекции изученных цитокинов отмечено снижение концентрации ТБК-реактивных продуктов и активности глутатионпероксидазы в сенсомоторной коре пассивных животных, подвергнутых стрессорному воздействию (в 1,72 [p0,01] и 1,47 раза [p0,05] соответственно – ИЛ-1;
в 2,58 и 1,27 раза соответственно (p0,01) – ИЛ-4;
табл. 3).
Следует отметить, что как изолированное воздействие стресса, так и введение ИЛ- или ИЛ-4 нестрессированным крысам приводят к активации глутатионпероксидазы в сенсомоторной коре пассивных особей. Вероятно, сочетанное воздействие этих двух факторов, каждый из которых активирует глутатионпероксидазу в сенсомоторной коре, приводит к истощению буферной емкости указанного фермента и уменьшению его активности. Снижение интенсивности ПОЛ в сенсомоторной коре животных в этих условиях может быть обусловлено действием не исследованных нами антиоксидантов, активно вовлекаемых в подавление свободнорадикальных реакций.
В сенсомоторной коре поведенчески активных крыс активация глутатионредуктазы, выявленная после стрессорной нагрузки на фоне введения ИЛ 1 (в 1,48 раза, p0,01 по сравнению со стрессированными особями, получавшими физиологический раствор), по-видимому, предупреждала возможные изменения ПОЛ в этой структуре мозга (табл. 3). Предварительная инъекция ИЛ-4 сопровождалась снижением концентрации ТБК-реактивных продуктов в сенсомоторной коре активных особей после острого стрессорного воздействия (в 2,23 раза, p0,01).
Активность изученных антиоксидантных ферментов в этих условиях не изменялась (табл. 3). Можно предположить, что уменьшение интенсивности ПОЛ в этой структуре головного мозга активных животных при острой стрессорной нагрузке на фоне введения ИЛ-4 связано с активацией неизученных нами антиоксидантов.
Содержание продуктов ПОЛ в миндалине поведенчески пассивных крыс, подвергнутых стрессорному воздействию, не изменялось после внутрибрюшинного введения ИЛ-1 или ИЛ-4 (по сравнению со стрессированными животными, получавшими физиологический раствор;
табл. 4). Следует отметить, что уровень ТБК-реактивных продуктов в миндалине животных этих групп был ниже, чем у интактных крыс, получавших цитокины. Введение ИЛ-1 и ИЛ-4 до стрессорной нагрузки сопровождалось снижением активности Cu/Zn-супероксиддисмутазы (в 1, и 1,25 раза соответственно, p0,01 по сравнению с физиологическим раствором) и увеличением активности глутатионредуктазы (в 1,42 и 1,43 раза соответственно, p0,01;
табл. 4) в миндалине пассивных особей. Можно предположить, что разнонаправленные изменения активности Cu/Zn-супероксиддисмутазы и глутатионредуктазы в миндалине крыс этих групп предупреждают возможные изменения свободнорадикальных процессов. Таким образом, предварительное введение ИЛ-1 и ИЛ-4 вносит вклад в поддержание гомеостазиса тканей указанной структуры головного мозга при последующем воздействии стрессорных факторов.
Разнонаправленные изменения активности антиоксидантных ферментов в миндалине стрессированных активных крыс, получавших ИЛ-4 – снижение активности Cu/Zn-супероксиддисмутазы и глутатионпероксидазы (в 1,26 [p0,05] и 1,30 раза [p0,01] соответственно по сравнению со стрессированными особями, получавшими физиологический раствор) и повышение активности глутатионредуктазы (в 1,46 раза, p0,05) – предупреждали изменения ПОЛ в указанной области мозга этих животных (табл. 4). Как и в экспериментах с ИЛ-4, стрессорная нагрузка на фоне предварительного введения ИЛ-1 вызывала снижение активности Cu/Zn-супероксиддисмутазы и повышение активности глутатионредуктазы в миндалине активных особей (в 1,46 и 1,41 раза соответственно, p0,05). Выявленные изменения сопровождались снижением концентрации ТБК реактивных продуктов в миндалине животных (в 1,55 раза, p0,05;
табл. 4), что свидетельствует об участии неисследованных нами соединений с антиоксидантными свойствами в регуляции оксидативного баланса этой структуры головного мозга.
Относительные изменения окислительных и антиоксидантных процессов в головном мозге крыс в условиях острой стрессорной нагрузки и при введении ИЛ-1 или ИЛ-4.
Для обобщения полученных экспериментальных данных и комплексной оценки прооксидантно-антиоксидантного баланса в структурах головного мозга у крыс в разных экспериментальных условиях мы проанализировали индекс изменений интенсивности окислительных и антиоксидантных процессов.
Введение ИЛ-1 пассивным крысам сопровождалось увеличением интенсивности ПОЛ и активности ферментов антиоксидантной защиты во всех изученных структурах головного мозга (на 48,9 и 13,6% соответственно – в гипоталамусе;
на 53,9 и 31,6% соответственно – в сенсомоторной коре;
на 71,6 и 58,1% соответственно – в миндалине;
по сравнению с особями, получавшими физиологический раствор;
рис. 1-3). В гипоталамусе поведенчески активных животных ИЛ-1 вызывал интенсификацию свободнорадикального окисления (на 65,5%), но снижение активности антиоксидантных ферментов (на 23,8%, рис. 1А).
Напротив, в сенсомоторной коре и миндалине активных особей, получавших ИЛ-1, интенсивность ПОЛ снижалась (на 37,7 и 18,5% соответственно;
по сравнению с физиологическим раствором), а активность ферментов антиоксидантной защиты повышалась (на 53,4 и 32,9% соответственно;
рис. 2А, 3А).
Б А Рисунок 1. Индекс окислительных и антиоксидантных процессов в гипоталамусе у поведенчески активных (А) и пассивных крыс (Б, %).
Здесь и на рис. 2, 3. ФР, ИЛ-1, ИЛ-4 – нестрессированные крысы, получавшие физиологический раствор, ИЛ-1 и ИЛ-4 соответственно;
ФР+С, ИЛ-1+С, ИЛ-4+С – крысы, подвергнутые стрессорной нагрузке после введения физиологического раствора, ИЛ-1 и ИЛ-4 соответственно.
Инъекция ИЛ-4 сопровождалась интенсификацией окислительных процессов и увеличением активности антиоксидантных ферментов в гипоталамусе: у активных крыс – на 222,4 и 97,7% соответственно, у пассивных животных – на 48,4 и 90,5% соответственно (по сравнению физиологическим раствором;
рис. 1). В сенсомоторной коре этих животных интенсивность свободнорадикального окисления липидов снижалась (на 54,6 и 15,6% соответственно), а активность антиоксидантных ферментов увеличивалась (на 106,6 и 98,7% соответственно;
рис. 2). Напротив, в миндалине активных и пассивных крыс, получавших ИЛ-4, наблюдалось увеличение интенсивности ПОЛ (на 32,5 и 48,2% соответственно) и снижение активности антиоксидантных ферментов (на 13,4 и 37,2% соответственно;
рис. 3).
А Б Рисунок 2. Индекс окислительных и антиоксидантных процессов в сенсомоторной коре у поведенчески активных (А) и пассивных крыс (Б, %).
Острая стрессорная нагрузка у поведенчески пассивных крыс вызывала снижение интенсивности как окислительных процессов, так и степени антиоксидантной защиты в гипоталамусе (на 19,7 и 23,5% соответственно по сравнению с физиологическим раствором;
рис. 1Б). Напротив, в сенсомоторной коре этих животных отмечена интенсификация ПОЛ и увеличение активности антиоксидантных ферментов (на 42,7 и 17,5% соответственно;
рис. 2Б). В указанных условиях в миндалине у пассивных крыс наблюдалась активация свободнорадикальных процессов (на 44,7%).
Как и у пассивных особей, в сенсомоторной коре стрессированных активных крыс выявлено усиление антиоксидантной защиты на 32,8%. Активность ферментов антиоксидантной защиты в миндалине активных особей снижалась на 19,8% после стрессорной нагрузки (рис. 1А).
А Б Рисунок 3. Индекс окислительных и антиоксидантных процессов в миндалине у поведенчески активных (А) и пассивных крыс (Б, %).
Предварительное введение ИЛ-1 и ИЛ-4 предупреждало постстрессорные изменения окислительно-антиоксидантного баланса в сенсомоторной коре поведенчески пассивных крыс. У этих животных отмечено снижение интенсивности ПОЛ (на 59,8% и 86,6% соответственно;
рис. 2Б) и эффективности антиоксидантной защиты (на 10,3% и 41,8% соответственно).
В связи с выявленными в нашей работе сложными и подчас разнонаправленными изменениями оксидативного статуса эмоциогенных структур головного мозга крыс в разных экспериментальных условиях, возникла необходимость систематизации полученных данных путем создания общей схемы, иллюстрирующей соотношение окислительных и антиоксидантных процессов в тканях ЦНС (табл. 5). Известно, что в условиях физиологической нормы в тканях млекопитающих существует динамический баланс между свободнорадикальными реакциями и антиоксидантной защитой (Гуляева Н.В., 1989;
Барабой В.А., 1992;
Сазонова Т.Г., Архипенко Ю.В., 2007). При разработке указанной выше схемы мы исходили из того, что такой баланс характерен для крыс, получавших физиологический раствор. Нами обнаружено, что острое стрессорное воздействие и введение иммуномодуляторных цитокинов сопровождаются изменением интенсивности окислительных и антиоксидантных реакций в ткани головного мозга крыс. На схеме активация или подавление указанных процессов обозначены соответственно стрелками, направленными вверх или вниз (табл. 5). Эти изменения приводят к нарушению нормального соотношения прооксидантов и антиоксидантов, что, по данным ряда авторов (Jurnek I., Bezek., 2005;
Halliwell B., 2006), обуславливает развитие многих патологических состояний.
Таблица 5. Соотношение окислительных и антиоксидантных процессов в структурах головного мозга крыс в разных экспериментальных условиях Гипоталамус Сенсомоторная кора Миндалина Активные Пассивные Активные Пассивные Активные Пассивные крысы крысы крысы крысы крысы крысы ФР ФР+С* ИЛ-1* ИЛ-4* ИЛ-1+С# ИЛ-4+С# Примечание. – окислительные процессы;
– антиоксидантные процессы.
ФР, ИЛ-1, ИЛ-4 – нестрессированные крысы, получавшие физиологический раствор, ИЛ- и ИЛ-4 соответственно;
ФР+С, ИЛ-1+С, ИЛ-4+С – крысы, подвергнутых стрессорной нагрузка после введения физиологического раствора, ИЛ-1 и ИЛ-4 соответственно. * – по сравнению с ФР;
# – по сравнению с ФР+С.
Проведенные нами исследования позволили прийти к следующему заключению. Провоспалительный цитокин ИЛ-1 и противовоспалительный цитокин ИЛ-4 оказывают сходное влияние на оксидативный статус тканей гипоталамуса, миндалины и сенсомоторной коры мозга у крыс с разными поведенческими характеристиками как в исходном состоянии, так и при острой эмоциональной стрессорной нагрузке. Описанные данные согласуются с результатами, полученными в наших предыдущих исследованиях. Установлено, что ИЛ-1 и ИЛ-4 оказывают однонаправленное действие на массу органов-маркеров стресса (тимуса, надпочечников и селезенки), массовую концентрацию альбумина в сыворотке крови и его связывающую способность, клеточный состав крови, содержание глюкозы в крови крыс (Перцов С.С. с соавт., 2010, 2011;
Коплик Е.В. с соавт., 2011;
Калиниченко Л.С. с соавт., 2011). Сходные эффекты указанных цитокинов, по видимому, обусловлены наличием у ИЛ-4 двойственных свойств. Показано, что ИЛ- может оказывать как провоспалительное, так и противовоспалительное воздействие на биологические ткани млекопитающих. Ингибирующее влияние ИЛ-4 на экспрессию генов ИЛ-1, продукцию и эффекты этого цитокина было документировано во многих экспериментальных исследованиях (Cunha F.Q. et al., 1999;
Opal S.M., DePalo V.A., 2000;
Nolan Y. et al., 2005;
Tausk F. et al., 2008;
Doi H. et al., 2008). Показано, что ИЛ-4 блокирует рецепторы ИЛ-1, а также увеличивает синтез его рецепторного антагониста. С другой стороны, ИЛ-4 увеличивает продукцию провоспалительного цитокина ИЛ-6 (Steinke J.W., Borish L., 2001;
Lee Y.W. et al., 2010). В соответствии со свойствами противовоспалительных соединений, предварительное центральное введение крысам ИЛ-4 предупреждает увеличение продукции провоспалительных медиаторов в ответ на инъекцию липополисахарида.
Однако в условиях совместного действия ИЛ-4 потенцирует эффекты липополисахарида, что свидетельствует о наличии у этого цитокина провоспалительных свойств (Bluthe R.M. et al., 2002). По мнению S.M. Opal и V.A.
DePalo (2000), все противовоспалительные цитокины оказывают двойственные – как противо-, так и провоспалительные – эффекты. Очевидно, что характер действия цитокинов у млекопитающих во многом определяется физиологическим состоянием организма, наличием синергистов или антагонистов, а также плотностью и аффинностью рецепторов к иммуномодуляторным соединениям.
Нами обнаружены регионарные особенности действия ИЛ-1 и ИЛ-4 на свободнорадикальные процессы в тканях ЦНС у крыс, что указывает на специфику вовлечения эмоциогенных структур мозга в системную организацию физиологических функций млекопитающих в нормальных условиях и при формировании отрицательных эмоциональных состояний. В наших экспериментах установлено, что изученные цитокины предупреждают стресс-индуцированные изменения свободнорадикальных процессов и антиоксидантной защиты в сенсомоторной коре поведенчески пассивных животных. Показано, что изменения оксидативного статуса гипоталамуса и сенсомоторной коры крыс, получавших инъекции ИЛ-1 или ИЛ-4 в исходном состоянии и при остром стрессорном воздействии, более выражены у поведенчески активных животных, чем у пассивных особей.
ВЫВОДЫ 1. Провоспалительный цитокин интерлейкин-1 и противовоспалительный цитокин интерлейкин-4 оказывают сходное воздействие на соотношение окислительных и антиоксидантных процессов в гипоталамусе, сенсомоторной коре и миндалине у крыс с разной поведенческой активностью.
2. Внутрибрюшинное введение интерлейкина-1 и интерлейкина-4 оказывает модулирующее влияние на активность антиоксидантных ферментов – глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы и Cu/Zn-супероксиддисмутазы – с последующим изменением окислительного статуса тканей головного мозга крыс.
Воздействие изученных цитокинов сопровождается преимущественно интенсификацией перекисного окисления липидов в гипоталамусе и миндалине животных.
3. Острый эмоциональный стресс у крыс на модели иммобилизации с одновременным электрокожным раздражением приводит к увеличению интенсивности свободнорадикальных процессов в миндалине и сенсомоторной коре поведенчески пассивных животных. В гипоталамусе крыс с разными параметрами поведения, а также в сенсомоторной коре активных особей, подвергнутых стрессорному воздействию, изменения эффективности антиоксидантной защиты предотвращают возможные изменения перекисного окисления липидов.
4. Предварительное внутрибрюшинное введение интерлейкина-1 и интерлейкина- предупреждает постстрессорную активацию свободнорадикальных процессов и изменения антиоксидантной защиты в сенсомоторной коре поведенчески пассивных крыс.
5. Изменения оксидативного статуса гипоталамуса и сенсомоторной коры крыс, выявленные при введении интерлейкина-1 или интерлейкина-4 как в исходном состоянии, так и при острой эмоциональной стрессорной нагрузке, более выражены у поведенчески активных животных, чем у пассивных особей.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 1. Перцов С.С., Коплик Е.В., Калиниченко Л.С., Симбирцев А.С. Влияние интерлейкина-1 на перекисное окисление липидов в эмоциогенных структурах головного мозга крыс при острой стрессорной нагрузке // Бюл. экспер. биол. мед.
– 2010. – т. 150, №7. – с. 13-16.
2. Перцов С.С., Коплик Е.В., Калиниченко Л.С. Сравнительный анализ действия цитокинов на состояние тимуса, надпочечников и селезенки у крыс с разными поведенческими характеристиками // Бюл. экспер. биол. мед. – 2010. – т. 150, №9.
– с. 244-247.
3. Перцов С.С., Калиниченко Е.В., Коплик Е.В. Прооксидантно-антиоксидантный баланс головного мозга крыс при изменении иммунного статуса // Российский аллергологический журнал. – 2011. – №4, вып.1. – с. 288-290.
4. Перцов С.С., Коплик Е.В., Калиниченко Л.С. Модулирующее влияние интерлейкина-4 на свободнорадикальные процессы в головном мозге крыс при эмоциональном стрессе // Бюл. экспер. биол. мед. – 2011. – т. 151, №4. – с. 376 380.
5. Перцов С.С., Коплик Е.В., Калиниченко Л.С. Интенсивность окислительных и антиоксидантных процессов в головном мозге крыс с разными параметрами поведения при острой стрессорной нагрузке // Бюл. экспер. биол. мед. – 2011. – т.
152, №7. – с. 4-8.
6. Калиниченко Л.С., Перцов С.С. Действие про- и противоспалительных цитокинов на состояние органов-маркеров стресса у крыс с разной эмоциональной реактивностью // Тезисы Шестого Международного Междисциплинарного конгресса «Нейронаука для медицины и психологии», Судак, Крым, Украина, 5 15 июня 2010, с. 149-150.
7. Калиниченко Л.С. Оксидативный статус эмоциогенных структур головного мозга у крыс с разной устойчивостью к стрессорным нагрузкам при введении интерлейкина-4 // Материалы XVIII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «ЛОМОНОСОВ-2011» [Электронный ресурс] — М.: МАКС Пресс, 2011. – с. 25.
8. Калиниченко Л.С., Перцов С.С., Коплик Е.В. Сравнительный анализ влияния про и противовоспалительных цитокинов на перекисное окисление липидов в головном мозге крыс с разной устойчивостью к эмоциональному стрессу // Тезисы Седьмого Международного Междисциплинарного конгресса «Нейронаука для медицины и психологии», Судак, Крым, Украина, 3-13 июня 2010, с. 203-204.
9. Калиниченко Л.С. Действие интерлейкина-4 на антиоксидантную защиту головного мозга у крыс при эмоциональном стрессе // Тезисы II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Медико биологические аспекты мультифакторной патологии», Курск, 17-19 мая 2011г., с.
189-190.
10. Калиниченко Л.С. Соотношение окислительных и антиоксидантных процессов в головном мозге крыс при остром эмоциональном стрессе: влияние интерлейкина 4 // Тезисы III Международного симпозиума «Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и патологии», Санкт-Петербург, 7-10 июня 2011г., с.
25, 101-102.