Оглы исследование молекулярно-генетических механизмов нейрогенеза неокортекса и сетчатки человека in vivo и in vitro
На правах рукописи
ВЕРДИЕВ БАХТИЯР ИСРАИЛ ОГЛЫ ИССЛЕДОВАНИЕ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕХАНИЗМОВ НЕЙРОГЕНЕЗА НЕОКОРТЕКСА И СЕТЧАТКИ ЧЕЛОВЕКА IN VIVO И IN VITRO 03.03.05 - биология развития, эмбриология 03.02.07 - генетика
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва - 2010 1
Работа выполнена в лаборатории экспериментальной нейробиологии Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К.
Кольцова РАН.
Научные руководители:
доктор биологических наук Александрова Мария Анатольевна доктор биологических наук Зиновьева Рина Дмитриевна
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук Шарова Наталия Петровна доктор биологических наук Гривенников Игорь Анатольевич
Ведущая организация:
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет, кафедра эмбриологии.
Защита диссертации состоится «08» декабря 2010 года в 1500 часов на заседании Диссертационного совета Д 002.238.01 в Учреждении Российской академии наук Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (119334, Москва, улица Вавилова, дом 26).
Сайт: http://idbras.comcor.ru/;
e-mail: [email protected].
С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К.
Кольцова РАН Автореферат разослан «8» ноября 2010 года.
Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Абрамова Е.Б.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Все типы нейральных клеток центральной нервной системы позвоночных животных являются производными нейральных стволовых клеток (НСК). НСК очень пластичны и демонстрируют в ходе развития разные морфо-функциональные свойства: в период эмбриогенеза они представлены клетками нейроэпителия и радиальной глии, а во взрослом мозге проявляют свойства астроцитов (Merkle et al., 2006). Фундаментальное свойство нейрогенеза - генерация из НСК разных типов клеток в строгой пространственно-временной последовательности: сначала нейроны, затем глия.
Во взрослом мозге НСК сохраняются в структурах переднего мозга – субвентрикулярной зоне (СВЗ) латеральных желудочков и субгранулярной зоне (СГЗ) зубчатой извилины гиппокампа (Colucci-D'Amato et al., 2008) в течение всей жизни, обеспечивая постоянный нейрогенез.
В развитии из нейроэпителиальных клеток переднего мозгового пузыря помимо неокортекса мозга формируется сетчатка глаза. Как и в неокортикальных отделах, НСК сетчатки в развитии генерируют клетки разных типов в строгой временной последовательности. Зоны постоянного нейрогенеза отсутствуют в сетчатке глаза взрослых млекопитающих, но ее клетки проявляют мультипотентные свойства при травме и in vitro (Klassen et al., 2004).
НСК и клетки-предшественники можно выделять из эмбрионального и взрослого мозга и сетчатки, размножать в культуре, где они способны спонтанно дифференцироваться во все типы нейральных клеток.
Важную роль в регуляции пластичности НСК в эмбриональном развитии играют гены, кодирующие специфические транскрипционные факторы (ТФ).
Для неокортикальных отделов мозга характерна экспрессия PAX6, PROX1, SIX3, SOX2, DLX2, EMX1, NKX2.1 и др.;
для сетчатки глаза PAX6, PROX1, SIX3, SOX2, RX1, OTX2, LHX2, SIX6 и др. Имеются данные, что на ранних этапах нейрогенеза экспрессируются гены OCT4, NANOG - маркеры плюрипотентных клеток. Транскрипционные механизмы, которые регулируют пластичность НСК, в развитии сетчатки глаза и неокортекса мозга схожи, что приводит к подобному морфогенезу этих слоистых структур ЦНС. В связи с этим появляется необходимость исследования активности общих для обеих структур генов в ходе развития.
У человека и грызунов НСК имеют значительные отличия по экспрессии ряда генов и по поведению клеток. В связи с чем изучение пролиферативного потенциала и дифференцировки НСК человека, как в организме, так и при культивировании имеет особое значение.
В нашем исследовании внимание уделено генам PAX6, PROX1, OCT4 и NANOG. Считается, что продукт гена PAX6 в неокортексе мозга и сетчатке глаза является маркером нейральных стволовых клеток. К таким маркерам может быть отнесён и ген PROX1, который экспрессируется в субпопуляции клеток-предшественников сетчатки глаза и мозга. Важно, что экспрессия этих транскрипционных факторов продолжается в нейрогенных зонах во взрослом мозге в СВЗ и СГЗ. Поскольку имеются данные об экспрессии генов OCT4 и NANOG в стволовых клетках ряда опухолей мозга (Du et al., 2009;
Heddleston et al., 2009), было важно определить их участие в поддержании пластичности НСК в развитии.
Цель и задачи исследования. Настоящая работа посвящена исследованию молекулярно-генетических механизмов нейрогенеза неокортекса и сетчатки человека in vivo и in vitro.
В работе были поставлены следующие задачи:
1. Провести анализ экспрессии генов PAX6, PROX1, OCT4, NANOG и белков-маркеров нейральной дифференцировки в неокортексе мозга и сетчатке глаза в развитии плодов человека.
2. Получить культуры клеток неокортекса мозга и сетчатки глаза плодов человека с целью определения потенций к дифференцировке стволовых клеток и клеток-предшественников.
3. Провести сравнительный анализ экспрессии генов PAX6, PROX1, OCT4, NANOG и белков-маркеров нейральной дифференцировки в неокортексе и сетчатке человека in vivo и in vitro.
Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые проведен комплексный анализ экспрессии PAX6 и PROX1, кодирующих транскрипционные факторы - маркеры НСК, и OCT4 и NANOG, кодирующих маркеры плюрипотентных клеток, в развитии неокортекса мозга и сетчатки глаза человека in vivo и in vitro.
Впервые проведено сравнение характера экспрессия OCT4 и NANOG в неокортексе мозга и в сетчатке глаза в ходе нейрогенеза на 8-12 и 18-20 нед.
развития. В культуре клетки сетчатки сохраняют сходство с нативной тканью по экспрессии OCT4 и NANOG, в то время как клетки неокортекса его теряют.
Впервые показано, что экспрессия PAX6 в исследованный период нейрогенеза находится на постоянном уровне, как в неокортексе, так и сетчатке глаза. Уровень экспрессии PAX6 в сетчатке значительно выше, чем в неокортексе. В клеточных культурах неокортекса мозга и сетчатки глаза при стандартных условиях культивирования уровень экспрессии PAX6 такой же, как в нативных тканях.
Впервые обнаружена экспрессия PROX1 в неокортексе мозга плода человека. В клеточной культуре сетчатки глаза экспрессия этого гена сохраняется, а в культуре неокортекса мозга отсутствует.
Проведенное исследование расширяет представления о молекулярных механизмах в развитии клеток неокортекса мозга и сетчатки глаза человека, что создает предпосылки для дальнейшего изучения биологии НСК. Полученные результаты могут применяться при разработке методов трансплантационной терапии нейродегенеративных заболеваний. Данные настоящего исследования могут быть использованы в курсе лекций по биологии развития и клеточной биологии.
Результаты диссертационной работы были Апробация работы.
представлены на V-ой Конференции молодых ученых России с международным участием (Москва, 2008), Четвертом международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, 2008), Российском медицинском форуме-2007 (Москва, 2007), Всероссийском симпозиуме «Культивируемые клетки как основа клеточных технологий» (Санкт-Петербург, 2009) и на конференциях молодых ученых ИБР РАН (2007, 2008, 2009).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 2 статьи в журналах из Перечня ВАК, тезисов докладов и материалов конференций – 7.
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на страницах и содержит 44 рисунка и 3 таблицы и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов, списка литературы, включающего цитируемых источников.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объекты исследования. Работа выполнена на тканях неокортекса мозга и сетчатки глаза, выделенных из нежизнеспособных плодов человека 8, 9, 11, 12, 18-20 и 24-26 нед. развития, полученных при прерывании беременности.
Плоды получены из лицензированных учреждений МЗ РФ в рамках законодательства Российской Федерации об охране здоровья граждан и в соответствии с утвержденным перечнем медицинских показаний. Возраст плодов устанавливался врачом-акушером. В работе были использованы ткани 84 плодов человека, не менее 3 образцов на каждый исследованный срок.
Эмбриональные стволовые клетки человека (ЭСК) линии hESMK-05 ( пассаж) предоставлены Лагарьковой М.А. (Лаборатория генетических основ клеточных технологий ИОГен им. Н.И. Вавилова РАН). Культура клеток амниотической жидкости человека и культура фетальных фибробластов человека 10 пассажа предоставлены Лабораторией проблем пролиферации ИБР им Н.К. Кольцова РАН.
Культивирование клеток. Для получения клеточных культур были использованы неокортекс мозга и сетчатка глаза от 26 плодов человека с 9 по 26 нед. развития. Выделение тканей проводили в среде DMEM/F12 с антибиотиками при 37°С и диссоциировали до клеточной суспензии, используя Accutaze (Sigma). Применяли два протокола культивирования: для получения нейросфер использовали среду DMEM/F12 с эпидермальным фактором роста и фактором роста фибробластов (основной);
для получения адгезивной культуры среду DMEM/F12 с 10% эмбриональной телячьей сыворотки. Клетки растили при 37°С в атмосфере с 5% СО2. В экспериментах использовали клетки 2- пассажей (20-30 суток культивирования).
Полимеразная цепная реакция. Были использованы образцы тканей глаза и головного мозга от 42 плодов человека. Выделение тотальной РНК из тканей и культуры клеток осуществляли с помощью TRI® Reagent. Синтез кДНК проводили с помощью набора RevertAid H Minus Kit (Fermentas) используя 1 мкг тотальной РНК, обработанной ДНКазой. ПЦР проводили на амплификаторе Eppendorf «Mastercycler personal» с помощью Taq ДНК полимеразы. Количество циклов варьировалось от 25 до 40. Нормирование проводили по кДНК рибосомального белка с молекулярной массой 19 кДa (RPL19). Праймеры сконструированы с помощью программы DNAStar: PAX6, PROX1, NANOG, OCT4, нестин, виментин, III-тубулин, GFAP, рековерин.
ПЦР в реальном времени проводили на приборе ABI Prizm 7500. В качестве эндогенного контроля использовали глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназу (GAPDH). Оценивался уровень экспрессии генов PAX6, PROX1, NANOG, OCT4. Положительный контроль: ЭСК человека линии hESMK-05 и культура клеток амниотической жидкости человека;
отрицательный контроль – культура фетальных фибробластов человека.
Иммуногистохимическое окрашивание Фиксирование материала для иммуногистохимии. Глаза и кусочки неокортекса от 7 плодов человека и культивированные клетки фиксировали 4% раствором параформальдегида на фосфатном солевом буфере (ФСБ).
Приготовление срезов глаза и мозга. Образцы помещали в раствор 30% сахарозы на ФСБ на 24 часа при +4С, заключали в среду OCT (Leica Microsystems) и замораживали при -80С. Образцы тканей резали на криостате фирмы Лейка. Толщина срезов 18 мкм.
В работе использовали Иммуногистохимическое окрашивание.
антитела к белкам: нестин – маркер НСК (Chemicon, Abcam);
PAX6 – маркер НСК (Chemicon);
BLBP – маркер радиальной глии (Abcam);
Lex/SSEA1 – маркер стволовых клеток (BioLegend);
н-кадгерин – белок межклеточных контактов (Abcam);
III-тубулин – маркер ранних нейробластов (Chemicon);
NeuN – маркер дифференцирующихся нейронов (Chemicon);
GFAP – маркер астроцитов (Chemicon);
S100 – маркер астроцитов (Abcam,);
рековерин – маркер фоторецепторов (любезно предоставлены проф. Филипповым П.П., МГУ);
тирозингидроксилаза – маркер нейронов (Sigma);
Ki67 – маркер клеточной пролиферации (Abcam);
нейрофиламенты 68 и 200 кДа – маркер нейронов (ICN);
кальбиндин – маркер нейронов (Chemicon).
Вестерн-блот. Были исследованы ткани неокортекса мозга и сетчатки глаза от 9 плодов 12 нед. развития. Положительным контролем служила культура клеток амниотической жидкости человека, отрицательным контролем - клеточная культура фетальных фибробластов человека. Цитоплазматическая и ядерная фракция белков выделялась с помощью набора ProteoJET (Fermentas).
Количество белка определяли по методу Лоури (Lowry et al., 1951).
Электрофорез проводили полиакриламидном геле (Laemmli, 1970) на приборе EI 9001 – XCELL II MINI CELL (NOVEX) с последующим переносом белков на нитроцеллюлозную мембрану (Schleicher and Schuell). Для иммуногибридизации использовали антитела против NANOG - масса фрагмента 34 кДа (Abcam, 1:150) и вторые антитела сконъюгированные с пероксидазой хрена (Chemicon, 1:1000).
Статистическая обработка результатов. Статистическая обработка данных проводилась в программе MS Exel. При оценке данных с нормальным распределением использовали t-критерий Стьюдента. Различия между показателями и степень влияния фактора считались достоверными при уровне значимости P0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Исследование молекулярно-генетических механизмов нейрогенеза неокортекса и сетчатки человека in vivo Иммуногистохимический анализ неокортекса мозга и сетчатки глаза человека в развитии показал, что НСК, представленные радиальной глией, сохраняются в обеих структурах с 9 по 20 нед. эмбриогенеза. Отростки радиальной глии, окрашенные антителами против нестина, тянутся через всю толщу неокортекса и сетчатки и демонстрируют сходство морфогенеза этих слоистых структур. III-тубулинпозитивные ранние нейробласты, мигрирующие по отросткам радиальной глии, наблюдались в обеих структурах ЦНС с 9 по 20 нед. развития. Их распределение в ткани маркировало первичные клеточные слои неокортекса и сетчатки. На 18-20 нед. развития обнаруживаются NeuN-положительные дифференцирующиеся нейроны (прошедшие терминальный митоз). В неокортексе они наблюдались во всех зонах, достигая наибольшей плотности за пределами субвентрикулярной зоны.
В сетчатке NeuN-позитивные нейроны обнаружены в слое ганглиозных клеток и близкой к нему области внутреннего ядерного слоя. На 18-20 нед. развития в неокортексе и сетчатке мы наблюдали GFAP-положительные волокна клеток, чего не наблюдалось на сроке 9 нед. В неокортексе этот белок экспрессируется в нестинпозитивных клетках радиальной глии. В сетчатке, клетки, содержащие GFAP, расположены в слое нервных волокон и являются астроцитами, мигрировавшими по глазному нерву из мозга.
В сетчатке на 20 нед. нормального развития наблюдаются четко сформированные клеточные слои, в которых идет дифференцировка в специфические типы нейронов. В неокортексе на этой стадии развития оформленные клеточные слои отсутствуют. Таким образом, морфогенез в сетчатке опережает этот процесс в неокортексе.
С одной стороны, наши данные по пространственно-временной характеристике распределения в развивающемся неокортексе III тубулинпозитивных нейробластов, NeuN-позитивных нейронов и Ki67 позитивных пролиферирующих клеток согласуются с результатами других авторов (Zecevic et al., 2005;
Bayatti et al., 2008). С другой, показанное нами отсутствие экспрессии GFAP клетками радиальной глии неокортекса на 9 нед.
развития подтверждает результаты Баятти и др., но противоречит данным Цецевик и др.
Так как в некоторых нестинпозитивных отростках клеток радиальной глии неокортекса на 18-20 нед. развития наблюдалась экспрессия белка GFAP, мы полагаем, что субпопуляция клеток радиальной глии на данной стадии развития становится похожей на стволовые клетки взрослого мозга, имеющих также иммунофенотип астроцитов. Однако часть нестинпозитивных клеток радиальной глии не экспрессирует GFAP, что говорит о гетерогенности популяции и, вероятно, о присутствии пула НСК с более высокой пластичностью.
Методом ПЦР были подтверждены результаты иммуногистохимического анализа. В неокортексе мозга и сетчатке глаза человека на 9 нед. и 18-20 нед.
развития мы детектировали экспрессию генов нестина, виментина и III тубулина. На раннем сроке развития экспрессия GFAP не выявлялась. Однако транскрипты этого гена присутствовали на 18-20 нед. развития. В сетчатке глаза на 9 нед. развития обнаружена слабая экспрессия рековерина, хотя кодируемый им белок фоторецепторов методом иммуногистохимического окрашивания не выявлялся. Однако на 18-20 нед. наблюдалась интенсивная экспрессия этого гена и обнаружен белковый продукт.
На 9 нед. развития в неокортексе мозга и сетчатке глаза выявлена экспрессия генов PAX6 и PROX1. Экспрессия PROX1 в развивающемся неокортексе человека обнаружена впервые. PAX6 кодирует один из основных ТФ, который синтезируется в клетках радиальной глии неокортекса на исследуемых стадиях развития и также присутствует во всех пролиферирующих НСК сетчатки. Белок PROX1 маркирует поздние клетки-предшественники неокортекса мозга, а в сетчатке глаза он синтезируется в предшественниках, амакриновых, биполярных и горизонтальных клетках. В обеих структурах на 18 20 нед. развития экспрессия генов PAX6 и PROX1 сохраняется.
Впервые обнаружено, что в неокортексе мозга и сетчатке глаза человека на 9 нед. развития присутствует экспрессия генов OCT4 и NANOG, характерных для ЭСК, которая сохраняется в этих структурах на 18-20 нед. развития.
Для получения детальной картины профиля экспрессии генов PAX6, PROX1, OCT4 и NANOG, ассоциированных с НСК и клеточной пластичностью, мы использовали метод ПЦР в реальном времени.
ПЦР-анализ в реальном времени в клетках сетчатки глаза человека на 9, 11, 12 и 18 нед. развития показал высокий и практически стабильный уровень экспрессии PAX6 (рис. 1). Это позволяет предполагать, что доля клеток, экспрессирующих PAX6, в период активного нейрогенеза в сетчатке меняется слабо.
В неокортексе с 9 по 20 нед. развития уровень экспрессии PAX значительно ниже по сравнению с сетчаткой (рис. 1). Мы полагаем, это связано с тем, что в мозге он экспрессируется преимущественно клетками радиальной глии (НСК). Тогда как в сетчатке глаза белковый продукт этого гена присутствует не только в радиальной глие, но и в ганглиозных, амакриновых и горизонтальных клетках (Mo et al., 2008).
Экспрессия гена PROX1 в сетчатке глаза в развитии усиливается (рис. 1).
Мы полагаем, что такая динамика связана с дифференцировкой специфических типов нейронов, для которых характерна эндогенная экспрессия этого гена (амакриновые, биполярные и горизонтальные клетки).
В неокортексе мозга экспрессия PROX1 падает на поздних стадиях развития плода человека (рис. 1). Функции этого гена в мозге грызунов изучены слабо, относительно мозга человека есть только данные иммуногистохимического анализа. Считается, что белок PROX1 регулирует клеточный цикл поздних предшественников и направляет их дифференцировку по нейрональному или астроцитарному пути (Lavado et al., 2007). Мы полагаем, что спад уровня экспрессии гена PROX1 может быть связан как со снижением нейроногенеза и переходом к глиогенезу, так и с увеличением вклада клеток радиальной глии в генерацию нейробластов по сравнению с базальными клетками-предшественниками на поздних стадиях нейрогенеза.
Рис 1. ПЦР-анализ в реальном времени тканей неокортекса мозга (М) и сетчатки глаза (С) человека в развитии. АЖ – культура клеток амниотической жидкости человека;
ЭСК – культура эмбриональных стволовых клеток человека;
ОЕ - уровень экспрессии исследуемых генов по отношению к уровню их экспрессии в неокортексе человека на 9 нед.
развития.
В развитии сетчатки глаза и неокортекса мозга экспрессия гена OCT сохранялась на низком уровне, хотя и имела некоторую тенденцию к росту (рис. 1). Экспрессия этого гена была почти в 380 раз ниже, чем в ЭСК человека (положительный контроль) и сопоставима с уровнем его экспрессии в культуре клеток амниотической жидкости человека (положительный контроль (Tsai et al., 2006)) (рис. 1). Мы полагаем, что OCT4 в развивающемся неокортексе мозга и сетчатке глаза человека экспрессируется в малом числе клеток. Ранее было показано, что экспрессия этого гена сохраняется в вентрикулярной зоне мозга человека до 8 нед. развития (Thomas et al., 2008), тогда как по нашим данным экспрессия OCT4 в неокортикальных отделах мозга сохраняется до 20 нед.
развития. В литературе описана экспрессия OCT4 в глиомах мозга человека и культуре клеток глиомы (Du et al., 2009). Таким образом, можно полагать, что OCT4 принимает участие в обеспечении пластичности НСК человека в развитии ЦНС.
Уровень экспрессии гена NANOG в сетчатке и в неокортексе в развитии колеблется незначительно (рис. 1), оставаясь на одном уровне с культурой клеток амниотической жидкости человека (положительный контроль) и приблизительно в 30 раз ниже, чем в культуре ЭСК человека (положительный контроль). Наше предположение, что экспрессия NANOG в неокортексе мозга и сетчатке глаза свидетельствует о сохранении пула малодифференцированных поддерживают данные об экспрессии NANOG в клетках стволовых клеток, опухолей мозга и сетчатки глаза (Burnside et al., 2002;
Seigel et al., 2007).
Наличие белкового продукта, соответствующего NANOG, в неокортексе мозга и сетчатке глаза 12 нед. плодов человека было подтверждено нами методом вестерн-блоттинга.
Исследование молекулярно-генетических механизмов нейрогенеза неокортекса и сетчатки человека in vitro Характеристика клеточных культур. При культивировании клеток из неокортекса мозга плодов человека 8-9 и 26 нед. развития на среде для поддержания НСК (без сыворотки) через 14 сут. большинство клеток было включено в плавающие нейросферы разных размеров (рис. 2А). При длительном культивировании (115 сут., 8 пассажей) клеток из 9 нед. мозга плода человека количество нейросфер практически не изменилось. У нейросфер, помещенных в коллагеновый гель, наблюдался активный рост отростков.
На среде с сывороткой культивирование клеток неокортекса 20 нед.
плода человека в течение 30 сут. не приводило к образованию нейросфер.
Культура представляла собой монослой из крупных распластанных клеток.
В культуре клеток сетчатки глаза плодов человека 15-24 нед. развития на бессывороточной среде с факторами роста формировались плавающие сферические агрегаты – ретиносферы. Клетки сетчатки плодов 15 и 18 нед.
развития образовывали преимущественно крупные агрегаты, тогда как культуры сетчатки 22-24 нед. плодов - однородные небольшие сферы.
На среде с сывороткой культура клеток сетчатки человека 9-10 нед.
развития на 30 сут. представляет собой монослой из крупных распластанных клеток с редко расположенными поверх них компактными клетками (рис. 4Д, Е). Шаровидных агрегатов не наблюдали и все скопления клеток были сильно распластаны.
Иммунохимический анализ маркеров дифференцировки. Показано, что при культивировании клеток неокортекса мозга и сетчатки глаза происходит снижение количества Ki67-позитивных делящихся клеток как на среде с сывороткой, так и на бессывороточной среде с факторами роста.
Способность клеток сетчатки глаза к делению уменьшалась по мере увеличения возраста эмбрионов.
При культивировании на среде без сыворотки практически все клетки неокортекса мозга 9 и 26 нед. развития экспрессировали нестин (рис. 2Г, Ж). В культуре клеток неокортекса плода 26 нед. развития приблизительно треть экспрессирует маркер стволовых клеток – Lex/SSEA1. Некоторые Lex/SSEA1 позитивные клетки делились, что выявлено по окраске на Ki67 (рис. 2Д).
Клетки, содержавшие GFAP, в обеих культурах составляли подавляющее большинство (рис. 2З). У плодов 9 нед. развития в неокортексе GFAP отсутствует, однако в культуре обнаружен белок, выявляемый антителами к GFAP (рис. 2В). Колокализация Lex/SSEA1 и GFAP не наблюдалась (рис. 2Е).
Антитела против S100 – маркера субпопуляции астроцитов, выявили небольшое число клеток, в редких случаях также содержащих GFAP (рис. 2В).
В культуре клеток неокортекса 9 и 26 нед. развития присутствовали единичные кальбиндинположительные нейроны и содержащие III-тубулин нейробласты (рис. 2Г, З).
При длительном культивировании на бессывороточной среде клетки неокортекса мозга сохраняют пролиферативную активность как минимум в течение 115 сут. (8 пассажей), однако, число делящихся клеток постоянно снижается.
Рис 2. Культура клеток неокортекса мозга плода человека на среде без сыворотки. 9 нед. развития через 30 сут. культивирования - А, Б, В, Г;
26 нед. развития через 24 сут. культивирования - Д, Е, Ж, З.
Пролиферация клеток в нейросфере: А - Ki67 (зеленый), Б – ядра клеток окрашены;
В – маркеры субпопуляции астроглии GFAP (красный) и S100 (зеленый);
Г – малодифференцированные нестин+-клетки (зеленый) и кальбиндин+-нейроны (красный);
Д – пролиферерация (Ki67, красный) Lex/SSEA1-позитивных НСК (зеленый);
Е – Lex/SSEA1+ НСК (зеленый) и GFAP+-астроциты (красный);
Ж – нестин+-клетки (зеленый);
З – GFAP+ клетки (красный) и III-тубулин+-нейробласты (зеленый). Ядра клеток на всех снимках окрашены Хехст 33342 (синий). Масштаб:. А, Б, Ж, З - 40 мкм;
В, Г, Д, Е – 20 мкм.
На среде с сывороткой большинство клеток неокортекса мозга плода нед. развития через 24 сут. культивирования экспрессируют маркер малодифференцированных клеток – нестин, в то время как позитивных по астроглиальному маркеру GFAP меньше половины (рис. 3А, Б). Антителами к маркеру стволовых клеток Lex/SSEA1 выявлены единичные клетки, часть которых также экспрессировала GFAP (рис. 3Б). Пролиферация отдельных Lex/SSEA1-позитивных клеток обнаружена антителами к Ki67 (рис. 3В).
Маркер ранних нейробластов III-тубулин присутствовал в небольших клетках с тонкими отростками и крупных распластанных клетках с окрашиванием в виде фибрилл. Редко клетки одновременно экспрессировали III-тубулин и GFAP (рис. 3Г). Небольшое количество клеток различной морфологии экспрессирует маркер астроцитов S100.
Через 40 сут. на среде с сывороткой в культуре клеток неокортекса мозга значительно снижается число делящихся и нестинпозитивных клеток.
Иммуноспецифическая реакция на Lex/SSEA1 отсутствовала.
Рис 3. Культура клеток неокортекса мозга плода человека 20 нед. развития на среде с сывороткой через 24 сут. культивирования. А – нестин+-клетки (зеленый);
Б – Lex/SSEA1+-НСК (желто-зеленый) и GFAP+-астроциты (красный);
В – пролиферация (Ki67, красный) Lex/SSEA1-позитивных НСК (зеленый);
Г - экспрессия III-тубулина (зеленый) и GFAP (красный). Ядра клеток на всех снимках окрашены Хехст 33342 (синий). Масштаб мкм.
Клетки сетчатки глаза через 30 сут. культивирования на среде без сыворотки экспрессировали маркеры малодифференцированных клеток нестин и виментин. На поверхности ретиносфер, полученных из сетчаток глаза плодов 20-24 нед., наблюдались GFAP-позитивные астроциты. Во всех культурах были выявлены нейробласты с экспрессией III-тубулина и множество рековеринположительных фоторецепторных клеток. Для этих клеточных культур было характерно образование розеточных структур, состоявших из радиально расположенных клеток, экспрессирующих нестин и виментин, а также из фоторецепторов и нейробластов.
На среде с сывороткой клетки сетчатки глаза плодов 9 и 20 нед. развития формируют монослой с редкими плотными скоплениями. PAX6-позитивные клетки располагались в области монослоя диффузно, а в плотных скоплениях составляли большую часть клеток (рис. 4А, Б). Клетки с экспрессией BLBP (маркер радиальной глии) составляли небольшую популяцию, причем большая часть из них коэкспрессировала PAX6 (рис. 4В). Подавляющее число клеток нестинположительны. В монослое встречаются единичные III тубулинпозитивные нейробласты, но в плотных скоплениях они присутствуют в большом количестве (рис. 4Д). Антителами к тирозингидроксилазе выявлены единичные нейроны, в некоторых обнаружена коэкспрессия нестина (рис. 4Г) или PAX6. Фоторецепторные клетки, содержащие рековерин, были диффузно распределены в клеточном монослое (рис. 4Е).
Рис 4. Культура клеток сетчатки глаза эмбриона человека 9 нед. развития на сывороточной среде через 30 сут. культивирования. А, Б – PAX6+-клетки;
В – BLBP+ клетки радиальной глии (красный) коэкспрессируют PAX6 (зеленый);
Г – коэкспрессия нестина (зеленый) тирозингидроксилаза+-нейронами (красный);
Д – III-тубулин+ нейробласты (зеленый);
Е – рековерин+-фоторецепторы (красный). Ядра клеток на всех снимках окрашены Хехст 33342 (синий). Масштаб: А, Б – 40 мкм;
В - 20 мкм;
Г, Д – 25 мкм;
Е – 30 мкм.
Можно заключить, что при сравнении с нативными тканями клетки сетчатки в культуре более консервативны и лучше сохраняют свои потенции, чем клетки мозга.
Методом ПЦР во всех исследованных культурах клеток сетчатки глаза и неокортекса мозга была обнаружена экспрессия генов PAX6, нестина и виментина, что свидетельствовало о сохранении пула НСК. Экспрессия OCT4 и NANOG в культурах клеток мозга не выявлена, тогда как в единичных случаях в культурах сетчатки она присутствовала.
В культурах неокортекса мозга плодов человека 8-10 нед. развития экспрессия III-тубулина сохраняется до 30 сут. in vitro, и экспрессируется GFAP, который в нативной ткани на этих сроках развития отсутствует.
Экспрессия генов-маркеров НСК PAX6 и нестина сохранялась и при длительном культивировании (115 сут.) на среде без сыворотки клеток неокортекса плода человека 9 нед. развития. В культуре также наблюдалась, экспрессия GFAP, что характерно как для астроцитов, так и для НСК на продвинутых стадиях нейрогенеза. Экспрессия III-тубулина отсутствовала.
По-видимому, через 115 сут. в условиях культуры сохраняются в основном клетки глиального ряда, часть из которых имеет свойства стволовых.
В культурах сетчатки глаза плодов человека 16-23 нед. развития на сут. экспрессируются гены PAX6, нестина и виментина, что говорит о присутствии НСК. Во всех культурах наблюдается экспрессия рековерина, маркера фоторецепторов. В культурах сетчатки на среде без сыворотки на сут. детектировалась экспрессия III-тубулина, тогда как при культивировании на среде с сывороткой экспрессия этого гена не обнаружена, что говорит о снижении нейрогенного потенциала клеток сетчатки при данных условиях.
ПЦР-анализ в реальном времени культивированных клеток сетчатки глаза и неокортекса мозга плодов человека 10 нед. развития на среде без сыворотки (30 сут.) показал, что уровень экспрессии гена PAX6 в сетчатке выше, чем в неокортексе, что соответствовало нашим результатам, полученным на нативных тканях (рис. 5). Это говорит не только о сохранении пула НСК, но и о сохранении их специфических для каждой ткани характеристик в наших условиях культивирования. Наши данные поддерживают результаты последних работ в том, что PAX6 работает по автономному клеточному механизму и его определенный уровень необходим для баланса между самоподдержанием НСК и нейрогенезом (Quinn et al., 2007;
Sansom et al., 2009).
Экспрессия гена PROX1 в культуре клеток сетчатки глаза сохраняется на сравнимом с интактной сетчаткой уровне, тогда как в культуре клеток неокортекса мозга практически отсутствует (рис. 5). Мы полагаем, что использованные условия культивирования позволяют клеткам сетчатки сохранить потенции к дифференцировке сходные с нативной тканью в течение срока культивирования. Клетки неокортекса в этих же условиях быстрее меняют свойства и потенции к дифференцировке.
Рис 5. ПЦР-анализ в реальном времени культуры клеток сетчатки глаза (КС) и неокортекса мозга (КМ) плодов человека 10 нед. развития на среде без сыворотки. ОЕ уровень экспрессии исследуемых генов по отношению к уровню их экспрессии в неокортексе человека на 9 нед. развития.
Ген OCT4 экспрессируется в культуре клеток сетчатки глаза и неокортекса мозга (рис. 5). Уровень экспрессии в культуре неокортекса не выше, чем в интактной ткани. В культуре сетчатки, напротив, выявлено возрастание экспрессии OCT4. Его экспрессия в культивированных клетках мозга крысы обнаружена ранее в некоторых исследованиях, тогда как в нативном мозге крысы экспрессия не выявлена (Okuda et al., 2004;
Du et al., 2009).
NANOG Экспрессия гена в культуре клеток неокортекса мозга практически отсутствует (рис. 5), тогда как в культуре клеток сетчатки глаза она сравнима с нативной тканью.
На основании полученных данных, можно сделать вывод, что клетки сетчатки в культуре лучше сохраняют свои исходные потенции к дифференцировке, чем клетки мозга.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Изучение ряда молекулярно-генетических механизмов НСК человека, их пролиферативного потенциала и дифференцировки в организме и при культивировании позволило получить новые принципиальные результаты.
Иммуногистохимический анализ выявил сходство морфогенеза неокортекса и сетчатки и показал, что развитие сетчатки опережает неокортекс.
НСК (радиальная глия) в этих структурах присутствовали на всех исследованных стадиях развития. В позднем нейрогенезе неокортекса НСК гетерогенны, что, вероятно, свидетельствует о появлении клеток, подобных НСК взрослого мозга.
Как в неокортексе, так и сетчатке ген PAX6 на исследованных стадиях нейрогенеза экспрессируется на постоянном уровне (хотя в сетчатке уровень экспрессии выше). По профилю экспрессии PAX6 культуры подобны нативным эмбриональным тканям, что говорит о сохранении клеток, для которых этот ген является специфичным регулятором.
Впервые в неокортексе плода человека обнаружена экспрессия гена PROX1. В культуре клеток сетчатки экспрессия PROX1 сохраняется, тогда как в культуре неокортекса мозга она отсутствует. Эти данные свидетельствуют о поддержании дифференцировочных потенций НСК в культуре клеток сетчатки и их нарушении в культуре клеток неокортекса.
Впервые показана динамика экспрессии генов OCT4 и NANOG в ходе нейрогенеза в неокортексе и сетчатке глаза плода человека, которая отражает наличие пула клеток с высокой пластичностью. В культуре клеток неокортекса экспрессия этих генов слабая, тогда, как в культуре клеток сетчатки она сохраняется на высоком уровне.
При длительном культивировании клеток обеих тканей происходит замещение нейроногенеза глиогенезом, однако, клетки сетчатки сохраняют большее сходство с нативной тканью, по сравнению с неокортексом. Сетчатка эволюционно более консервативна, и мы полагаем, что механизмы регуляции ее развития сильнее ограничивают потенции НСК, чем в неокортикальных отделах мозга, что говорит о пластичности НСК последнего.
ВЫВОДЫ 1. Впервые выявленные значительные различия в уровне экспрессии PAX6 в неокортексе и сетчатке глаза человека в развитии отражают специфику их клеточной дифференцировки.
2. Впервые выявлена экспрессия PROX1 в ходе нейрогенеза неокортекса мозга человека. Сравнение динамики экспрессии PROX1 в развитии неокортекса и сетчатки говорит о сходстве регуляторных механизмов на ранних стадиях их формирования и о нарастании различий в дальнейшем.
3. Впервые показана динамика экспрессии генов OCT4 и NANOG в ходе нейрогенеза в неокортексе и сетчатке эмбриона человека, которая отражает наличие пула клеток с высокой пластичностью.
4. При культивировании клетки сетчатки проявляют большую консервативность экспрессии изученных генов-маркеров клеточной дифференцировки, чем клетки неокортекса.
Работа выполнена при использовании оборудования Центра коллективного пользования «По биологии развития на основе использования клеточных технологий и оптических методов» ОБН РАН при ИБР РАН.
Работа поддержана грантами РФФИ №08-04-00081 и №08-04-00462.
Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Вердиев Б.И., Полтавцева Р.А., Подгорный О.В., Марей М.В., Зиновьева Р.Д., Сухих Г.Т., Александрова М.А. Молекулярно-генетический и иммунофенотипический анализ транскрипционного фактора Pax6 и маркеров нейральной дифференцировки в неокортексе и сетчатке плодов человека in vivo и in vitro // Клеточные технологии в биологии и медицине. 2009. №4. С. 206 213.
2. Панова И.Г., Подгорный О.В., Вердиев Б., Смирнова Ю.А., Полтавцева Р.А., Григорян Э.Н., Зиновьева Р.Д., Александрова М.А., Сухих Г.Т., Миташов В.И.
Пролиферативные и дифференцировочные потенции клеток сетчатки плода человека in vitro и in vivo // Клеточные технологии в биологии и медицине.
2005. №2. С. 103-109.
3. Вердиев Б.И. Анализ экспрессии Oct-4, Nanog, Pax6, Prox1 и белков маркеров дифференцировки в нативном мозге и в нейральных стволовых/прогениторных клетках человека in vitro // Сб. тезисов Y Конференции молодых ученых России с международным участием "Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины ". Москва. 19- мая 2008.
4. Вердиев Б.И., Подгорный О.В., Полтавцева Р.А., Сухих Г.Т., Александрова М.А. Прогениторные клетки мозга человека in vivo и in vitro // Сб. тезисов Четвертого Международного Междисциплинарного Конгресса "Нейронаука для медицины и психологии". Судак. 10-20 июня 2008. С. 80.
5. Вердиев Б.И., Полтавцева Р.А., Марей М.В., Подгорный О.В., Сухих Г.Т., Зиновьева Р.Д., Александрова М.А. Анализ экспрессии транскрипционного фактора Рах6 и маркеров нейральной дифференциовки в неокортексе и сетчатке плодов человека in vivo и in vitro // Цитология. Тезисы докладов Всероссийского симпозиума "Культивируемые клетки как основа клеточных технологий". 12-14 октября 2009 г. Санкт-Петербург. Том 51. N 9. С. 757-758.
6. Вердиев Б.И. Сравнение экспрессии тканеспецифических и регуляторых генов в мозге и сетчатке человека в развитии и культуре клеток // Сб. тезисов XYI Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых Ломоносов-2009. Москва. С. 296-297.
7. Вердиев Б.И., Подгорный О.В., Полтавцева Р.А., Зиновьева Р.Д., Марей М.В., Сухих Г.Т., Миташов В.И., Александрова М.А. Сравнительный анализ дифференцировки нейральных стволовых клеток из мозга и сетчатки в культуре ткани // Цитология. Тезисы докладов и сообщений II съезда Общества клеточной биологии совместно с юбилейной конференцией. 2007. Том 49. N 9.
С. 725-726.
8. Подгорный О.В., Вердиев Б.И., Полтавцева Р.А., Зиновьева Р.Д., Марей М.В., Сухих Г.Т., Миташов В.И., Александрова М.А. Нейральные стволовые/прогениторные клетки мозга и сетчатки в культуре ткани // Сб.
тезисов II конгресса «Российский медицинский форум-2007» 17-19 октября 2007. С. 146-147.
9. Вердиев Б.И. Сравнение экспрессии тканеспецифических и регуляторных генов в клетках переднего мозга и сетчатке глаза человека в развитии и культуре ткани // Онтогенез. Тезисы докладов Конференции молодых ученых Института биологии развития. Москва. 2008. Том 39. №4. С. 311-312.