Окислительная модификация компонентов системы крови в норме и при эндогенной интоксикации (на примере хронических дерматозов)
На правах рукописи
ЩЕЛЧКОВА НАТАЛЬЯ АЛЕКСАНДРОВНА ОКИСЛИТЕЛЬНАЯ МОДИФИКАЦИЯ КОМПОНЕНТОВ СИСТЕМЫ КРОВИ В НОРМЕ И ПРИ ЭНДОГЕННОЙ ИНТОКСИКАЦИИ (на примере хронических дерматозов) 03.01.04 - биохимия 03.03.01 - физиология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Нижний Новгород 2011
Работа выполнена в биохимической лаборатории ФГБУ «Нижегородский научно-исследовательский кожно-венерологический институт», на кафедре мо лекулярной биологии и иммунологии ФГБОУ ВПО «Нижегородский Государ ственный университет им. Н.И. Лобачевского».
Национальный исследовательский университет.
Научные руководители:
доктор биологических наук Копытова Т. В.
доктор медицинских наук, профессор Добротина Н. А.
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук Обухова Л. М доктор медицинских наук Смирнов В. П.
Ведущее учреждение: ФГБОУ ВПО «Марийский государственный универси тет» г. Йошкар-Ола
Защита состоится « » декабря 2011 г. в часов на заседании диссер тационного совета Д.212.166.15 Нижегородского государственного университе та им. Н.И. Лобачевского по адресу: 603950, Нижний Новгород, пр. Гагарина, д. 23, корп. 1, биологический факультет.
Автореферат разослан «_» 2011г.
С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского по ад ресу: 603950, г. Нижний Новгород, пр. Гагарина, 23.
Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук, доцент Копылова Светлана Вячеславовна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. Актуальной проблемой современной био логии и медицины является изучение концепции эндогенной интоксикации (ЭИ) в патогенезе различных по этиологии заболеваний (Marshall J.C., 2003;
Афанасьева А.Н. и др., 2007;
Малахова М.Я., Петросян Л.Б., 2011). Большое внимание уделяется хронической патологии, снижающей качество жизни инди вида и определению преморбидных состояний (Малахова М.Я., Зубаткина О.В., 2006). Неоспорим тот факт, что система крови является первым защитным зве ном, активно реагирующим на компоненты ЭИ. Существенное значение в фор мировании ЭИ придается активации свободнорадикальных процессов в орга нах и тканях, индуцируемых патологией. Свободные радикалы способны ини циировать перекисное окисление жирнокислотных остатков в составе липидов (Бизенкова М.Н. и др., 2007) и эффективно окислять, тем самым менять актив ность и инактивировать различные белки (Dalle-Donne I., et. al., 2002;
Дубинина Е.Е. Пустыгина А.В., 2006;
Муравлева Л.Е. и др., 2010), разрушать некоторые полисахариды и стимулировать мутагенез за счет накопления окислительных повреждений ДНК (Finkel T., Holbrook N., 2000;
Barja G. Herrero A., 2000;
Дур нев А.Д. и др., 2002).
В настоящее время отмечается значительное увеличение хронических за болеваний кожи. При этом наиболее часто регистрируются состояния, ассоции рованные с аллергическим статусом: атопический дерматит;
патологией диф ференциации клеток кожи: псориаз. Единой точки зрения на причины возник новения, механизмы хронизации и снижение эффективности лекарственных воздействий при этих полигенных патологиях до настоящего времени нет (Ari ma M., 2005;
Finlay A., 2007;
Пазина М.В., 2009;
Владимирова И.С., 2010). При диагностированной ЭИ, концепция которой подразумевает мультифакториаль ность развивающейся патологии, кожа становится мишенью вторичного повре ждения, вызванного эндогенными токсическими соединениями, с комплексом морфофункциональных изменений. Несмотря на появление большого количе ства новых препаратов и значительный прогресс в области понимания патоге неза, дерматозы крайне трудно поддаются лечению. При этом причины недо статочной эффективности лекарственных воздействий до настоящего времени остаются не выясненными.
Знание механизмов токсического воздействия окислено модифицированных биомолекул на формирование ЭИ может явиться основой для обоснования разработки новых патогенетических схем лечения.
Цель работы: исследовать влияние продуктов окислительной модифика ции системы крови на формирование эндогенной интоксикации у больных хроническими распространенными дерматозами.
Задачи исследования:
1. Провести оценку интенсивности процессов липопероксидации. Изучить влияние показателей перекисного окисления липидов (ДК, МДА, ОШ), спектра липидов в сыворотке, эритроцитах крови и в пуле молекул сред ней массы на эндогенную интоксикацию при дерматозах.
2. Изучить окислительную модификацию белков системы крови при ЭИ у больных дерматозами.
3. Провести сравнительное изучение продукта окисления ДНК - 8-ОН-2 дезоксигуанозина в сыворотке крови в норме, в зависимости от ЭИ при различных альтерациях кожи.
4. Провести сравнительный анализ изученных показателей системы крови в группах больных с различной восприимчивостью к проводимой терапии.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Гиперактивность свободнорадикальных процессов при тяжелых хрониче ских дерматозах выражается увеличением содержания первичных и вто ричных продуктов ПОЛ в сыворотке крови, являясь пусковым механиз мом развития ЭИ. Нарастание количества МСМ приводит к снижению перекисного окисления на уровне оснований Шиффа, что повторно за пускает активацию окислительных процессов.
2. ЭИ при хронических дерматозах проявляется увеличением фрагментации белков и окисленности олигопептидов. Показатель - соотношение сум марного количества МСМ и окислительной модификации белков сыво ротки крови - с высокой степенью вероятности определяет резистент ность больных к проводимой терапии.
3. ЭИ у больных хроническими дерматозами сопровождается повышением содержания 8-ОН-2-дезоксигуанозина – продукта окислительной моди фикации ДНК в сыворотке крови.
Научная новизна. Впервые проведена биохимическая характеристика пула МСМ сыворотки крови и эритроцитов при хронической альтерации кожи.
Впервые комплексно исследованы соотношения липидов в пуле МСМ сыво ротки крови и эритроцитах в условиях ЭИ.
Впервые проведено изучение уровня различных карбонильных производ ных в сыворотке крови, пуле МСМ сыворотки и эритроцитов крови, показана их роль в формировании эндогенной интоксикации при различных дерматозах.
Впервые изучен основной маркер окисленной ДНК – 8-ОН-2 дезоксигуанозин в качестве характеристики глубины свободнорадикальных процессов организма при дерматозах с ЭИ.
Результаты проведенных исследований углубляют представление о пато генетической роли процессов свободнорадикального окисления в развитии хронической альтерации кожи.
Определены информативные тесты для выявления нарушения восприим чивости пациента к лекарственным препаратам.
Практическая значимость работы. Интегральные маркеры токсичности и показатели свободнорадикального окисления обладают информативностью для ранней и объективной лабораторно-функциональной диагностики эндоген ного токсикоза в организме пациентов с различными альтерациями кожи.
Апробирован и оформлен в виде заявки на изобретение показатель - отноше ние суммарного количества МСМ и ОМБ сыворотки крови, который с высокой степенью вероятности определял резистентность больных тяжелыми хрониче скими дерматозами к проводимой терапии.
Апробация и публикация материалов исследования. Материалы дис сертации докладывались на IV съезде Российского общества биохимиков и мо лекулярных биологов" г. Новосибирск, 2008, 14 – й Нижегородской сессии мо лодых ученых (естественнонаучные дисциплины) апрель 2009;
5-ой Общерос сийской научной конференции «Актуальные вопросы науки и образования» Москва, 11-13 мая 2009г;
3-й научно-практический симпозиуме «Свободнора дикальная медицина и антиоксидантная терапия» Волгоград, 12-14 мая, 2010г.;
3-й Общероссийской научной конференции «Актуальные вопросы науки и об разования», Москва, 11 – 13 мая 2010 г, VIII Международной конференции «Биоантиоксидант», Москва, 4 – 6 октября, 2010 г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 13 печатных ра бот, 4 из которых в изданиях, рекомендованных ВАК для публикации материа лов диссертаций, подана 1 заявка на изобретение.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 171 страни це основного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания лабо раторных методов исследования, 3 глав собственных исследований, обсужде ния результатов и выводов. Список литературы включает 325 источника, в том числе 230 отечественных и 95 зарубежных авторов. Диссертация содержит таблицы и 9 рисунков.
Содержание работы Материалы и методы исследования.
Объектом для исследования служили сыворотка и эритроциты больных тяжелыми хроническими дерматозами: псориаз, атопический дерматит, пузыр ные дерматозы. Проведено клинико-лабораторное обследование 165 пациентов:
45 – атопическим дерматитом, 70 – псориатической болезнью, 50 - пузырными дерматозами в возрасте от 19до 75 лет. Из всех обследованных мужчин - 49% (81 человека), женщины - 51%(84 человека).
Контрольную группу составили от 20 до 45 человек без видимых прояв лений кожной патологии, заболеваний сердечно-сосудистой системы и желу дочно-кишечного тракта, репрезентативных по полу и возрасту.
Лабораторное обследование включало:
- выделение молекул средней массы - МСМ (Малахова М.Я., 1995;
Нико лайчик В.В. и др., 1991) с определением в их составе содержания ОП (диагно стическими наборами фирмы «Синтакон»), мочевины (диагностическими набо рами фирмы «Абрис»), гидрофобной составляющей (Николайчик В.В. и др., 1991).
- оценку состояния прооксидантной системы крови и пула МСМ по ко личеству продуктов липопероксидации – первичных – ДК (Гончаренко М.С., 1985);
вторичных - МДА, по реакции с тиобарбитуровой кислотой (Гончаренко М.С., 1988;
Орехович В.А., 1977 с нашими модификациями);
и оснований Шиффа (Волчегорский И.А., 1989;
Львовская Е.И. и соавт.,1991). Окислитель ная модификация белков и эритроцитов крови, а также пула МСМ крови оце нивалась спектрофотометрически по методу Е.Е. Дубининой (1995).
- фракционирование липидов крови и пула МСМ выполнялось методом одномерной тонкослойной хроматографии в тонком слое силикагеля при по следовательном применении двух систем растворителей (Творогова М.Г. с со авт., 1998).
- окислительная модификация нуклеиновых кислот оценивалась методом твердофазного иммуноферментного анализа набором Assay Desings DNA Dam age ELISA (Кат. № EKS-350), содержащим моноклональные антитела на мик ропланшетном фотометре Multiscan EX (ThermoLabSistems, Финляндия).
Всего выполнено 783 анализа в сыворотке крови, 635 в эритроцитах, а также 434 и 250 анализов в пуле МСМ сыворотки и эритроцитов крови.
Характеристика и сравнительный анализ лабораторных тестов проводи лись в зависимости от формы альтерации кожи (атопический дерматит, псори аз, пузырные дерматозы), выраженности эндогенной интоксикации и воспри имчивости к проводимой терапии дерматоза.
Статистический анализ проводили с использованием пакета программ Microsoft Excel и Satistica 6.0. При сравнении средних значений изучаемых групп процент возможной ошибки находили по таблице t-критерия Стью дента для парных сравнений (при нормальном распределении), выражаемый в виде значений достоверности различия - «р».
Результаты исследования и их обсуждение В настоящее время можно считать установленным фактом, что наиболее информативным критерием интегральной оценки изменений метаболического статуса при ЭИ на уровне организма является изучение спектра МСМ (Малахо ва М.Я., Петросян Л.Б., 2010;
Федорова О.В. и др., 2011). В ходе проведенных нами исследований показано, что у половины больных хроническими дермато зами вне зависимости от вида альтерации кожи определяется манифестное ста тистически значимое (р0,05) увеличение количества МСМ в сыворотке крови и эритроцитах по сравнению с группой практически здоровых лиц. Такая ча стота выявления ЭИ позволила нам разделить общую группу обследованных на больных с ЭИ и без нее по уровню МСМ сыворотки крови, для обнаружения специфических изменений в метаболическом статусе пациентов на фоне эндо токсикоза. Группа с ЭИ имела достоверно высокие значения МСМ по сравне нию с контролем и группой без ЭИ (р0,05) как в сыворотке крови (23,46±1,39;
12,81±0,38 и 12,59±0,3 опт.ед., соответственно), так и в эритроцитах (21,87±0,8;
16,0±1,2 и 16,85±1,25 опт. ед., соответственно).
Влияние различных метаболитов прооксидантной системы на формиро вание ЭИ при тяжелых хронических альтерациях кожи.
Изучение выраженности процессов пероксидации показало существенное увеличение содержания молекулярных продуктов ПОЛ в сыворотке, эритроци тах крови и в пуле МСМ при хронической альтерации кожи. Однако в группе без ЭИ повышенные значения ДК отмечались у 40% пациентов, а в группе больных с ЭИ только у 26% больных. Содержание ТБК-продуктов имело об ратную зависимость: группа без ЭИ в 40% случаев характеризовалась высоки ми значениями, а ЭИ сопровождалась повышением данного показателя у 60% пациентов (Рис.1).
Рис.1. ПОЛ системы крови при различной степени выраженности ЭИ в норме и альтерациях кожи.
* – достоверность различий с контролем (р0,05) ** – достоверность различий групп между собой (р0,05) Содержание диеновых конъюгатов и ТБК-зависимых продуктов ПОЛ у больных с альтерацией кожи относительно контроля, было существенно выше в эритроцитах, чем в сыворотке крови, и проявилось в среднем с одинаковой ча стотой вне зависимости от ЭИ. Количество ДК в эритроцитах крови на фоне эндотоксикоза на 30% превышало аналогичное значение в группе без ЭИ и бо лее чем в 2 раза контрольные значения. Уровень вторичных продуктов ПОЛ в эритроцитах вне зависимости от ЭИ был достоверно повышен. Умеренный процесс накопления ПОЛ является физиологическим стимулятором их самооб новления (Донцов В.И. и др., 2006).
Анализ результатов по содержанию инактивированных продуктов ПОЛ – основаниям Шиффа (ОШ) (Рис.2.), показал, что при ЭИ снижается образование продуктов конденсации высокоактивных альдегидов и аминов. Это создает условия для запуска цепи свободнорадикальных процессов (СРП) вновь, усу губляя влияние ПОЛ на организм. Опираясь на эти факты, можно сказать, что начальная активация свободнорадикального окисления не зависит от наличия ЭИ и направлена на утилизацию патологических иммунных агентов.
Рис.2. Основания Шиффа сыворотки крови при различной степени выра женности ЭИ в норме и альтерациях кожи.
* – достоверность различий с контролем (р0,05) ** – достоверность различий групп между собой (р0,05) При анализе пула МСМ оказалось, что количество первичных продуктов ПОЛ статистически значимо увеличено относительно контроля как в группе больных с ЭИ, так и без нее (1,08±0,1 и 2,12±0,26;
4,6±0,07 нмоль/л соответ ственно, р0,05) только в сыворотке крови. При этом эндогенная интоксикация сопровождалась увеличением данного показателя в меньшей степени, что, воз можно, связано с наличием в составе МСМ веществ – акцепторов свободных радикалов, например, мочевины, СЖК. Содержание МДА в пуле МСМ как сы воротки крови, так и эритроцитов было статистически значимо выше контроль ных значений, но не зависело от ЭИ. Таким образом, уровень МСМ лимитирует СРП в организме.
Липидный профиль системы крови при эндогенной интоксикации у больных с альтерацией кожи.
Известно, что у больных дерматозами имеются разнонаправленные из менения липидного обмена, имеющие значение в патогенезе заболеваний (Про хоренков В.И., 2000;
Корсунская И.М. и др., 2004;
2005). В доступной литера туре нет сведений об особенностях липидного спектра при хронических дерма тозах в условиях ЭИ.
Применение хроматографических методов с использованием двух систем растворителей дало возможность выявить одновременно 9 - 10 фракций липид ных компонентов в сыворотке крови и мембранах эритроцитов при кожных па тологиях и у здоровых лиц. Из них - 4 фракции фосфолипидов: лизофосфати диохолин (ЛФХ), сфингомиелин (СМ), фосфатидилэтаноламин (ФЭА), фосфа тидилхолин (ФХ);
фракции моно-, ди- и три- глицеридов – МГ, ДГ, ТГ;
свобод ные жирные кислоты (СЖК) и холестерин (ХС). Компьютерная денситометрия хроматограмм позволила оценить соотношение долей отдельных классов липи дов в сыворотке крови и системе эритрона у здоровых лиц и у пациентов с аль терацией кожи.
В сыворотке крови больных кожной патологией были выявлены разнона правленные, но статистически незначимые изменения большинства фосфоли пидов: число больных с повышенным и пониженным уровнем СМ составило в среднем по 30%;
уровень ФХ снижен у 32%, а повышен у 20% пациентов;
ФЭА повышен лишь у 17% пациентов. Статистически значимым было снижение ко личества ЛФХ практически у всех больных, которое не зависело от количества в сыворотке крови МСМ.
Анализ основных групп липидов сыворотки крови больных без ЭИ вы явил статистически значимое увеличение содержания общих фосфолипидов (28,45±1,17% относительно 24,28±1,2% в контроле, р0,05), а также снижение содержания ХС (30,44 ±1,57% и 36,67±1,76% в контроле, р0,05). В группе больных с ЭИ имелась лишь тенденция к увеличению содержания в сыворотке крови фосфолипидов и снижению холестерина.
Мембраны эритроцитов крови больных дерматозами по сравнению с контролем характеризовались статистически значимым снижением содержания трудно окисляемых фосфолипидов (СМ и ЛФХ) и повышением количества лег коокисляемых фракций (ФЭА).
Известно, что в составе пула МСМ имеются вещества гидрофобной при роды: холестерин, ФЛ, ТГ, СЖК (Карякина Е.В., 2004). Они связываются с бел ками плазмы крови, приобретают свойства гаптенов и поглощаются, в основ ном, клетками иммунной системы, модулируя ее активность.
Установлено, что в группе больных с ЭИ гидрофобная составляющая МСМ сыворотки крови в 1,2 раза увеличена относительно показателя здоровых лиц. Гидрофобная фракция находится в сыворотке крови практически полно стью в связанном состоянии в виде комплексов с альбуминами и липопротеи нами (Болдырев А.А. и др., 2006;
Белоногов Р.Н. и др., 2009;
Власов А.П. и др., 2010). Таким образом, ЭИ у больных хроническими дерматозами проявляется нарастанием количества гидрофобных веществ в пуле МСМ, что обосновало изучение липидных фракций пула МСМ системы крови. Нами впервые был ис следован липидный спектр МСМ сыворотки и эритроцитов крови при хрониче ских дерматозах (Таблица 1).
Таблица Содержание фракций липидов в пуле МСМ сыворотки крови у больных тяжелыми дерматозами в зависимости от наличия ЭИ (в % от общего количества липидов по данным ТСХ) (М± m).
Группа без Фракции Контроль Общая группа Группа с ЭИ ЭИ ФЛ 12,38±0,90* 13,03±1,34* 10,49±1,40* 6,59±0, МГ 8,69±0,51 9,04±0,68* 8,88±1, 7,14±0, СЖК 22,05±1,32 22,75±1,09 21,89±1,12 25,70±1,18* ** ОГЛ 25,36±1,10 27,91±1,31 28,4±1,65 26,86±2, ХС 44,48±1,85 36,89±1,32* 36,76±1,65* 36,41±3,22* * – уровень значимости различий с контролем (р)0, ** - уровень значимости различий групп между собой (р)0, В составе пула МСМ общей группы больных количество ФЛ увеличено в 2 раза, фракция МГ повышена на 30%, а фракция ХС снижена на 21%. Полу ченные результаты позволяют говорить, что гидрофобная часть пула МСМ при хронических дерматозах формируется ФЛ и ГЛ на фоне низких значений ХС.
В группе с ЭИ содержания ФЛ повышение в 1,6 раза, а в группе без ЭИ в 2 раза по сравнению с контролем (р0,05). Это увеличение, очевидно, связано с окислительной модификацией белка ЛП-частицы, которая нарушает его взаи модействие с фосфолипидной молекулой.
Характерной особенностью пациентов с ЭИ является статистически зна чимое увеличение содержания СЖК (р0,05) в пуле МСМ. Известно, что СЖК в крови переносятся молекулами альбумина, но накопленные в крови МСМ взаимодействуют с активными центрами этого белка, препятствуя их связыва нию. Содержание холестерина в пуле МСМ сыворотки крови статистически значимо снижено в обеих группах по сравнению с контролем, что соответству ет низкому процентному уровню ХС в системе крови пациента.
В эритроцитах крови не выявлено статистически значимых различий в количестве гидрофобной фракции МСМ исследованных групп и контроля, что сопровождалось и отсутствием изменений в основных ее фракциях (СЖК, ГЛ, ХЛ) по сравнению с контролем и группой с ЭИ.
Влияние ЭИ на окислительную модификацию белков системы крови при альтерации кожи.
Окисление белков является надежным и ранним маркером окислительных повреждений (Dean, R.T., Fu S., Stocker, R. et al., Jackson, M.J.1999). Имеющие ся в литературе данные свидетельствуют, что в условиях окислительного стрес са под влиянием АФК происходят изменения в структуре белковых молекул, нарушающие ее конформацию (Davies, K.J.,1987;
Дубинина Е.Е., 2006;
2008).
Это генерирует новые антигены и провоцирует иммунный ответ (Squier T.C., 2001;
Lambeth J.D.,2007). Измененные белковые молекулы легче подвергаются протеолизу (окислительная модификация белка путем фрагментации) и ката болизму с образованием олигопептидов (ОП) и конечных продуктов белкового обмена (мочевина), которые становятся компонентами ЭИ (Пасечник И.Н., 2004)(Таблица 2).
Группа с выраженной ЭИ характеризовалась статистически значимым повышением ОП сыворотки крови в 50% случаев, что свидетельствует об акти вации у этих больных процессов окислительной деструкции, вызванных ЭИ.
Уровень мочевины в составе МСМ из сыворотки крови и эритроцитов больных с ЭИ превышает контрольные значения и показатели в группе без ЭИ почти в 2 раза. По нашему мнению это свидетельствует о том, что при хрони ческих системных дерматозах имеет место, интенсификация процессов утили зации окислено - модифицированных протеинов. Это является очень важным, так как известна способность мочевины встраиваться в метаболические цепи, нарушая или изменяя их функционирование.
ОМБ может быть связана не только с нарушением структуры полипеп тидной цепочки, но и отдельных аминокислотных остатков, что приводит к из менению конформации белка и его регуляторно - функциональных свойств.
(Дубинина Е.Е., Пустыгина А.В., 2008). Это определяется характером образо вавшихся карбонильных производных, регистрируемых на различных длинах волн спектра ОМБ. Белки плазмы, подвергшиеся окислительной деструкции, имеют довольно большой период полураспада. Исходя из этого, повышение ко личества белков с окисленными карбонильными группами является наиболее перспективным маркером интенсивности СРП.
Таблица Олигопептиды и мочевина пула МСМ системы крови в норме и при альтерации кожи в зависимости от наличия ЭИ.
Группа без Показатель Контроль Группа с ЭИ ЭИ ОП сыворотки, мг/л 40,19±2,27 40,35±2,31 48,76±2,74* ** Мочевина пула МСМ сы 0,41±0,05 0,58±0,06 1,00±0,12* ** воротки, ммоль/л Мочевина пула МСМ 0,87±0,09 0,54±0,06* 1,13±0,09* ** эритроцитов, ммоль/л * – уровень значимости различий с контролем (р)0, ** – уровень значимости различий групп между собой (р)0, У больных общей группы тяжелыми хроническими дерматозами уровень первичных – альдегидных продуктов ОМБ (270нм) был выше контрольных значений на 76% и регистрировался у 60% пациентов, а уровень вторичных кетонных продуктов ОМБ (370 нм) увеличен на 58% относительно контроля и обнаруживался у 74% больных. Высокие значения показателей выявлены у па циентов вне зависимости от ЭИ (Рис.3).
Рис. 3. Содержание различных карбонильных производных сыворотки крови в норме и при альтерациях кожи в зависимости от наличия ЭИ (М± m).
* – уровень значимости различий с контролем (р0,05) Проведенный нами анализ ОМБ в группе без ЭИ выявил увеличение дан ного показателя у 66 – 77% пациентов, в то время как повышенный уровень ПОЛ (по вторичным продуктам, вызывающим повреждение белковых молекул) регистрировался лишь в 40% наблюдений. Это позволяет нам говорить о пер воочередности ОМБ, проявляющейся накоплением дефектных протеинов и развитием на этой основе аутоиммунных процессов.
Анализ представленных в таблице 3 данных выявил статистически зна чимое увеличение количества карбонильных производных (230 нм - альдегид ные производные нейтрального характера и 270 нм – альдегидные производ ные основного характера) в группе больных с ЭИ не только относительно кон трольных значений, но и группы больных без ЭИ. Эти изменения говорят об интенсификации окислительной модификации ОП при ЭИ.
Таблица Содержание различных карбонильных производных в пуле МСМ сыворотки крови в норме и при альтерациях кожи в зависимости от наличия ЭИ (опт.ед. на мл сыворотки).
Группа без Показатель Контроль Общая группа Группа с ЭИ ЭИ 230нм 6,62±0,35 7,42±0,30 6,31±0,39 8,04±0,54* ** 270 нм 2,1±0,28 1,98±0,08 1,62±0,11 2,26±0,12 ** * – уровень значимости различий с контролем (р)0, ** – уровень значимости различий групп между собой (р)0, Окислительная модификация нуклеиновых кислот при кожной аль терации в зависимости от ЭИ.
Одним из следствий окислительного стресса на молекулярном уровне яв ляется окислительное повреждение нуклеиновых кислот, вызываемое активны ми формами кислорода, что представляется важнейшим патохимическим про цессом (Дурнев А.Д. и др., 2002). Повреждения ДНК включают однонитевые и/или двунитевые разрывы цепей ДНК, модификацию азотистых оснований и др. Ранее было показано (Dizdaroglu M. et al., 1992), что из четырех оснований, входящих в структуру ДНК, наиболее окисляемым является гуанин.
Пациенты с тяжелыми хроническими дерматозами характеризовались по вышенным уровнем 8-ОН-2-дезоксигуанозина в сыворотке крови в среднем на 36% относительно контроля. Нами выявлено, что наличие ЭИ сопровождается увеличением данного показателя у 50% больных с кожной патологией, и он превышает контрольные значения в 1,5 раза (рис.5.). В тоже время в группе без ЭИ наблюдается рост данного показателя лишь в 25% случаев. Учитывая полу ченные данные можно сказать, что ЭИ усугубляет СРП, выводя их на генетиче ский уровень повреждения клетки.
Рис.5. Содержание 8-ОН-2-дезоксигуанозина в сыворотке крови в норме и при альтерациях кожи в зависимости от наличия ЭИ (нг/мл сыворотки).
* – уровень значимости различий с контролем (р)0, С учетом проведенных исследований была предложена схема, отражающая основные пути взаимовлияния эндогенной интоксикации и окислительных процессов при хронической альтерации кожи (Рис.6.).
ПАТОЛОГИЯ Активация реактивных форм кислорода.
ЭНДОГЕННАЯ ИНТОКСИ Повышенная продукция КАЦИЯ свободных радикалов АКТИВНЫЕ КОМПОНЕН Пул молекул средней массы ТЫ (ИНТЕРМЕДИАТЫ) Повреждение био Повреждение молекул сыворотки мембран клеток крови Протеолиз ОЛИГОПЕПТИДЫ Изменение прони цаемости мембран БЕЛКИ (дегра ДНК дация и окисли ЛИПИДЫ Изменения функ- тельная моди ционирования фикация) Модификация Перекиси рецепторов оснований, липидов ФАРМКОРЕЗИ- деградация Карбонильные Нарушение внутри СТЕНТНОСТЬ дезоксирибозы производные клеточной передачи сигнала НЕКРОЗ АПОПТОЗ ПРОЛИФЕРАЦИЯ Рис.6. Основные пути взаимодействия эндогенной интоксикации и окислительных процессов при хронической альтерации кожи.
Сравнительный анализ изученных биохимических маркеров у пациентов с альтерацией кожи при различной восприимчивости к проводимой терапии.
На современном этапе развития медицинской науки и практики, несмотря на значительные достижения в совершенствовании методов диагностики и те рапии, специалисты с тревогой отмечают наблюдающуюся тенденцию к неуклонному росту фармакорезистентных форм различных дерматозов. Для выяснения специфики метаболических сдвигов мы сравнили больных с обыч ным течением заболевания и пациентов с фармакорезистентностью к проводи мой терапии (Таблица 4).
Таблица Основные биохимические показатели ЭИ и прооксидантой системы при альтерации кожи в зависимости от восприимчивости к лечению.
Чувствительны Фармако Показатель Контроль к лечению резистентны МСМ усл.ед 16,15±1,11* 16,18±0,86* 12,80±0, ОП (мг/л) 43,56±2,72 52,42±3,00* 48,39±2, Мочевина 0,42±0,05 0,67±0,09* 0,92±0,10* Сыворотка (нмоль/л) ДК, нмоль/л 7,39±0,63 7,93±0, 6,44±0, МДА, нмоль/л 2,99±0,09* 3,07±0,11* 2,50±0, ОШ, опт.ед. 0,3±0,037* 0,19±0,02* ** 0,14±0, ОМБ (ОЕ*/ мл 14,48±1,50 25,02±0,82* 16,36±1,50** сыв.) МСМ (усл.ед.) 20,92±1,54 20,25±1, Эритроциты 17,00±1, ОП (мг/л) 22,16±1,95 26,73±2,65 26,87±1, Мочевина 0,87±0,09 0,56±0,07* 0,96±0,1** (нмоль/л) ДК, нмоль/л 3,25±0,20 5,49±0,44* 5,45±0,52* МДА, нмоль/л 5,34±0,31 10,86±1,60* 12,45±1,34* ОМБ (О.Е.) 0,156±0,02 0,187±0,01 0,132±0,015** * – достоверность различий с контролем (р0,05) ** – достоверность различий групп между собой (р0,05).
Анализ полученных данных показал, что уровень МСМ сыворотки крови в обеих группах статистически значимо увеличен относительно контроля. Ко личество ОП сыворотки крови в группе пациентов, восприимчивых к терапии, статистически значимо превышало контрольные значения. Частота выявления их повышенного содержания в группе пациентов, чувствительных к лечению, составила 60%, тогда как в другой группе – только 34%.
Уровень мочевины в составе МСМ из сыворотки крови был достоверно повышен в обеих группах по сравнению с контрольными значениями, но в пер вой группе регистрировался в два раза реже, чем во второй, что свидетельству ет об усиленном катаболизме белков в группе с фармакорезистентностью. Со держание мочевины в составе МСМ из эритроцитов в первой группе статисти чески значимо снижено по сравнению с контролем и второй группой. Группа пациентов, восприимчивых к терапии, характеризуется двукратным увеличени ем содержания оснований Шиффа относительно контроля и группы с лекар ственной резистентностью.
Статистически значимо повышенный относительно контроля уровень окислительной модификации белка в сыворотке крови регистрировался в 65% случаев больных, восприимчивых к терапии, и в 30% - в фармакорезистентной группе. При этом между группами отмечается статистически значимое сниже ние ОМБ как в плазме, так и в эритроцитах у пациентов фармакорезистентной группы относительно больных восприимчивых к терапии.
Поскольку повышение уровня ОМБ в крови у больных кожной патологи ей значительно и регистрируется у подавляющего большинства пациентов, не исключено, что этот показатель может служить тестом глубины метаболиче ских нарушений, а возможно и прогнозом тяжести и торпидности течения забо левания.
Мы установили, что высокой информативностью для оценки восприим чивости больных к терапии обладает коэффициент (К) = отношение количества МСМ к показателю окислительной модификации белка сыворотки крови. При К 0,5 предполагается адекватная реакция организма больного на проводимую терапию, при значении 0,5 – резистентность к применяемой терапии.
По результатам клинико-лабораторного анализа 32 больных с обычным течени ем заболевания и хорошим эффектом после проведенной комплексной терапии значения предлагаемого коэффициента были меньше 0,4 у 62,5% обследован ных, в группе больных с тяжелым, резистентным течением заболевания, состо ящей из 36 больных, значения предлагаемого коэффициента были больше или равны 0,5 у 70%.
ВЫВОДЫ.
1. Эндогенная интоксикация (ЭИ) у больных тяжелыми хроническими дерматоза ми сопровождается активацией ПОЛ (по уровню первичных и ТБК- соедине ний) и снижением количества конечных продуктов ( оснований Шиффа) в сы воротке крови. На фоне ЭИ выявляется двукратное увеличение первичных про дуктов ПОЛ в эритроцитах, при дальнейшем развитии свободнорадикальных процессов на мембранах не обнаруживается специфичности по отношению к ЭИ. Дисбаланс окислительного метаболизма у больных с ЭИ выражается уве личением уровня ТБК–продуктов пулов МСМ сыворотки и эритроцитов крови.
Выявлено накопление свободных жирных кислот в пуле МСМ сыворотки крови 2.
при ЭИ. Определено смещение баланса основных липидов системы крови в сторону легко окисляемых фракций, характеризующихся высоким содержанием ненасыщенных жирнокислотных остатков.
Окислительная модификация белков в сыворотке и эритроцитах крови при ЭИ, 3.
сопровождающей тяжелые хронические дерматозы, манифестируется деструк цией протеинов, что проявляется накоплением в составе пула МСМ структурно измененных олигопептидов и мочевины.
ЭИ у пациентов с альтерацией кожи характеризуется повышение уровня 8-ОН 4.
2-дезоксигуанозина в сыворотке крови.
Чувствительность пациента к проводимой терапии определяется статистически 5.
значимым увеличением уровня окислительной модификации белковых молекул системы крови, что объективно характеризуется количественным соотношени ем МСМ и общей окислительной модификации белков сыворотки крови.
Работы, опубликованные по теме диссертации.
Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК:
Копытова Т.В. Комплексная оценка системы эндоинтоксикации и био 1.
трансформации организма человека при патологии кожи / Копытова Т.В., Добротина Н.А., Анненкова А.Б., Абалихина Е.П., Щелчкова Н.А.// Вестник ННГУ (серия Биология). 2006. вып.1(11). С.133-138.
Копытова Т.В. Значение определения липидов в различных биологиче 2.
ских субстратах для диагностики нарушений обменных процессов при псориазе/ Копытова Т.В., Абалихина Е.П., Щелчкова Н.А. //Клиническая лабораторная диагностика. 2007. №11. С.20-22.
Щелчкова Н.А. Значение липидов крови в характеристике степени эндо 3.
генной интоксикации при хронических дерматозах /Щелчкова Н.А.// Вестник ННГУ (серия Биология). 2010. №2., ч 2. С.602 – 606.
Добротина Н.А. Характеристика функционального состояния мембран 4.
эритроцитов при эндогенной интоксикации у больных хроническими распространенными дерматозами/Добротина Н.А, Копытова Т.В., Щелч кова Н.А. // Фундаментальные исследования. 2010. №2. С.39 – 44.
Статьи, тезисы докладов региональных и международных конферен ций:
Добротина Н.А. Функционально-диагностическое значение выявления эн 1.
догенной интоксикации при дерматозах, осложненных бактериальной ин фекцией/ Добротина Н.А., Химкина Л.Н., Копытова Т.В., Щелчкова Н.А.
//Материалы научной конференции, посвященной 85 –летию со дня рожде ния академика РАМН И.Н. Блохиной. – Н.Н.: Изд – во ННГУ. 2006. С.37.
Лобурев А.С. Модификационный метод подсчета количества веществ низ 2.
кой и средней молекулярной массы биологических субстратов //Сборник научных работ /Лобурев А.С., Ведунова М.В, Щелчкова Н.А.// Естество знание и гуманизм (Современный мир, природа и человек) Т3.,№4. 2006.
С. 27-28.
Копытова Т.В. Значение изучения активности протеолитической системы в 3.
оценке степени эндогенной интоксикации организма /Копытова Т.В., Доб ротина Н.А., Новиков В.В., Щелчкова Н.А.//Материалы VI Симпозиум «Химия протеолитических ферментов». 2007. г.Москва. С. 173-174.
Копытова Т.В. Роль липидов фракции средних молекул в характеристике 4.
эндогенной интоксикации при дерматозах/ Копытова Т. В., Добротина Н.
А., Щелчкова Н.А. // Материалы IV съезда Российского общества биохи миков и молекулярных биологов" г. Новосибирск. 2008. С.128.
Щелчкова Н.А. Спектр липидов в составе веществ низкой и средней мо 5.
лекулярной массы для оценки эндотоксемии при тяжелых хронических дерматозов /Щелчкова Н.А. // Тезисы научных работ 14 – й Нижегородской сессии молодых ученых (естественнонаучные дисциплины). 2009г. С.233.
Копытова Т.В. Влияние цитостатиков и энтеросорбентов на уровень эндо 6.
генной интоксикации и проницаемость эритроцитарных мембран при псо риазе/ Копытова Т.В., Химкина Л.Н., Пантелеева Г.А., Щелчкова Н.А.// Сборник научных трудов «Современные проблемы дерматовенерологии и косметологии». г.Харьков. 2009. С.117 – 120.
Копытова Т.В. Особенности фракции средних молекул у больных тяжелы 7.
ми хроническими дерматозами/ Копытова Т.В., Добротина Н.А. Щелчкова Н.А.// Фундаментальные исследования. 2009. №5. С.29-31.
Щелчкова Н.А. Показатели окислительного стресса в оценке тяжести те 8.
чения хронических дерматозов /Щелчкова Н.А.//Кислород и антиоксидан ты. 2010. №2. С.103–104.
Щелчкова Н.А. Антиоксидантные свойства энтеросорбентов в лечении 9.
больных хроническими распространнеными дерматозами с эндогенной ин токсикацией./ Щелчкова Н.А., Печуркина Ю.В.// Тезисы VIII Междуна родной конференции «Биоантиоксидант». Москва. 2010. С.533.
Подана заявка на изобретение: Способ выявления фармакорезистентности у больных хроническими распространенными дерматозами. Химкина Л.Н., Ко пытова Т.В., Пантелеева Г.А., Борисов В.И., Щелчкова Н.А., Дмитриева О.Н.
Номер гос. регистрации №2011114640 от 18.04.2011г.
Список сокращений АФК – активные формы кислорода ДК – диеновые конъюгаты ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота ЛФХ – лизофосфатидилхолин МГ – моноацилглицерины МДА – малоновый диальдегид МСМ – молекулы средней массы ОГЛ – общие ацилглицерины ОМБ – окислительная модификация белков ОП – олигопептиды ПОЛ – перекисное окисление липидов СЖК – свободные жирные кислоты СМ – сфингомиелин СРП - свободнорадикальные процессы ТБК – продукты реакции с тиобарбитуровой кислотой ФЛ – общие фосфолипиды ФХ – фосфатидилхолин ФЭА – фосфатидилэтаноламин ХС – общий холестерин ЭИ – эндогенная интоксикация