Механизмы защитного действия мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток при экспериментальном остром пиелонефрите
На правах рукописи
Пулькова Наталья Владимировна Механизмы защитного действия мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток при экспериментальном остром пиелонефрите 03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
МОСКВА 2013
Работа выполнена на факультете биоинженерии и биоинформатики и в НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова».
Научные руководители:
доктор биологических наук Плотников Егор Юрьевич доктор биологических наук, профессор Зоров Дмитрий Борисович
Официальные оппоненты:
Заведующий лабораторией клеточной иммунопатологии и биотехнологии ФГБУ «НИИ морфологии человека» РАМН доктор биологических наук, профессор Болтовская Марина Николаевна Заведующий лабораторией экспериментальной нейроцитологии Отдела исследований мозга ФГБУ «Научный центр неврологии» РАМН доктор биологических наук Хаспеков Леонид Георгиевич
Ведущая организация:
НИИ молекулярной медицины ГБОУ ВПО Первого МГМУ им. И.М. Сеченова Минздрава России
Защита состоится «25» апреля 2013 г. в _ часов на заседании диссертационного совета Д001.004.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт морфологии человека» РАМН по адресу: 117418, Москва, ул. Цюрупы д.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ морфологии человека» РАМН
Автореферат разослан «_» марта 2013 года
Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук Михайлова Лилия Петровна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы Пиелонефрит инфекционно-воспалительное заболевание почек бактериальной этиологии, характеризующееся поражением слизистой оболочки мочевыводящих путей и почечной паренхимы. Пиелонефрит относится к наиболее распространенным заболеваниям почек во всех возрастных группах (Foxman B., 2003). В детском возрасте данное заболевание проявляется в виде острой инфекции мочевых путей, особенно при наличии пузырно мочеточникового рефлюкса, у женщин часто наблюдается во время беременности, увеличивая тем самым риск патологий беременности и преждевременных родов (Gilstrap L.C. and Ramin S.M., 2001). В среднем 1% населения каждый год заболевает пиелонефритом. На начальных стадиях развития пиелонефрит протекает без выраженных структурных изменений и достаточно эффективно лечится антибиотиками. Однако, если не элиминировать бактериальную микрофлору своевременно, происходит хронизация заболевания с вовлечением в воспалительный процесс значительной части почечной паренхимы (David A.B. et al., 1999), что в итоге приводит к потере функционирующих нефронов и замещению паренхимы почки соединительной тканью (Jakobsson B. and Svensson L., 1997). Таким образом, при переходе в хроническую форму пиелонефрит может стать причиной развития хронической почечной недостаточности (Pistor K. et al., 1985). У подавляющего большинства больных пиелонефрит возникает при инфицировании мочевыводящих путей грамотрицательными бактериями, в частности, уропатогенными штаммами E.
coli, а также стафилококками, Рrоteus и др. В настоящее время считается, что бактериальная колонизация является пусковым механизмом воспалительных реакций и окислительного стресса, тогда как ключевая роль в деструкции паренхимы почек принадлежит именно избыточной и длительной реакции иммунной системы на инфицирование (Mundi H. et al., 1991;
Gupta А. et al., 1996;
Badr K.F, 1997). Таким образом, наряду с антибактериальной терапией предотвращение или ограничение развития воспалительного процесса и окислительного повреждения почки во время острой фазы заболевания является одной из основных задач при лечении пиелонефрита (Gupta R. et al., 2004).
Кроме того, в последние годы отмечается повышение частот устойчивости к антибиотикам бактериальной микрофлоры, в том числе и вызывающей развитие острого пиелонефрита. В этих случаях лечение острого пиелонефрита затруднено. Все это указывает на необходимость изучения фундаментальных клеточных и молекулярных процессов, лежащих в основе воспалительного повреждения и механизмов защиты почки при остром пиелонефрите, а также разработки новых подходов к терапии и профилактике нарушений функционирования почек.
Одна из активно изучаемых в последнее время стратегий модуляции чрезмерного воспалительного ответа предполагает использование клеточных технологий, в частности применение мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток (ММСК;
Uccelli A. et al., 2006;
Prockop D.J. et al., 2010).
ММСК являются иммунопривилегерованными клетками, на их поверхности практически не экспрессированы молекулы комплексов гистосовместимости и ко-стимулирующие молекулы, к тому же ММСК способны модулировать иммунный ответ, в первую очередь в сторону иммуносупрессии. Это открывает перспективы их использования при хронических воспалительных заболеваниях разной этиологии, а также позволяет решить проблему иммунологического отторжения самих трансплантированных ММСК (Rasmusson I., 2006). На сегодняшний день терапевтический эффект ММСК выявлен при сепсисе (Nemeth K. et al., 2009), острой почечной недостаточности (Кирпатовский В.И. и др., 2007;
Reinders M.E. et al., 2010), реакции "трансплантат против хозяина" (Le Blanc K. et al., 2004), остром повреждении легочной ткани (Gupta N. et al., 2007) и даже повреждении мозга (Ohtaki H. et al., 2008;
Lee J.A. et al., 2010). Однако в литературе отсутствуют сведения о влиянии ММСК на воспалительный процесс и морфофункциональные изменения в почке при остром пиелонефрите.
Цель и задачи исследования Целью данной работы было исследование механизмов влияния мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток костномозгового происхождения на течение экспериментального острого пиелонефрита, а также поиск способов повышения терапевтической эффективности этих клеток.
Задачи исследования:
1. Оценить при экспериментальном остром пиелонефрите выраженность в тканях почки окислительного стресса по уровню малонового диальдегида и воспалительного процесса по уровню фактора некроза опухоли, а также изучить влияние на эти показатели трансплантированных мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток;
2. Исследовать морфологические изменения в почке при развитии острого пиелонефрита у крыс и влияние на них введения мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток;
3. Изучить на моделях in vitro и in vivo процессы миграции мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток в ткани поврежденной почки;
4. Изучить биохимические изменения, происходящие в мезенхимальных мультипотентных стромальных клетках в условиях воспаления;
5. Исследовать влияние мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток, прекондиционированных ионами лития или лейкоцитами, активированными липополисахаридом, на воспалительный процесс при экспериментальном остром пиелонефрите.
Научная новизна работы Впервые показано иммуносупрессорное действие ММСК костномозгового происхождения, приводящее к снижению выраженности системных и местных проявлений инфекционно-воспалительного процесса после индукции острого пиелонефрита у крыс путем введения в мочевой пузырь инокулята из смешанной культуры фекальных бактерий. Обнаружено, что при экспериментальном остром пиелонефрите ММСК, введенные в кровоток, способны мигрировать в поврежденные ткани почки в большей степени, чем при отсутствии воспаления.
In vitro установлено увеличение миграционной способности ММСК в присутствии фактора некроза опухоли (TNF).
Выявлено, что при совместном культивировании с лейкоцитами, активированными липополисахаридом (ЛПС), как и при инкубации с LiCl в ММСК наблюдается запуск сигнальных путей, характерных для адаптации к окислительному стрессу (прекондиционирование), в частности повышение уровня фосфорилированной формы киназы гликогенсинтазы 3 (GSK-3).
Установлено, что после моделирования острого пиелонефрита внутривенно введенные ММСК, прекондиционированные лейкоцитами, активированными ЛПС, в большей степени, чем интактные ММСК и ММСК, прекондиционированные ионами лития, снижают число лейкоцитов в крови, кроме того, по данным активности миелопероксидазы (МПО) ММСК уменьшают выраженность инфильтрации нейтрофилами, следствием чего является снижение уровня TNF в тканях почки.
Научно-практическое значение работы Проведенные исследования расширяют представления о фундаментальных механизмах, лежащих в основе развития инфекционно-воспалительного процесса при остром пиелонефрите, и о влиянии на эти процессы ксеногенных ММСК.
Полученные результаты могут быть использованы для разработки способов направленного изменения свойств ММСК для увеличения их пролиферативной и миграционной активности, а также способности оказывать иммуномодулирующее и противовоспалительное действие. Проведенные исследования открывают перспективы для проведения доклинических исследований использования ММСК в терапии острого пиелонефрита, а также других острых и хронических воспалительных заболеваний почек.
Внедрение в практику Результаты диссертационного исследования используются в лекционном курсе «Стволовые клетки в биологии и медицине» факультета биоинженерии и биоинформатики МГУ имени М.В. Ломоносова.
Основные положения, выносимые на защиту 1. При моделировании острого пиелонефрита у крыс путем введения в мочевой пузырь через уретру инокулята из смешанной культуры фекальных бактерий в почке наблюдается развитие инфекционно воспалительного процесса, выраженность которого снижается после внутривенного введения ММСК.
2. При развитии экспериментального острого пиелонефрита внутривенно введенные ММСК мигрируют в поврежденные ткани почки, при этом TNF стимулирует миграционную способность этих клеток.
3. В ММСК после сокультивирования с лейкоцитами и липополисахаридом увеличивается уровень экспрессии индуцибельной NO-синтазы (iNOS), трансформирующего ростового фактора (TGF1), повышается активность матриксной металлопротеиназы (ММП-2).
4. Сокультивирование с активированными лейкоцитами приводит к значительному повышению количества фосфорилированной GSK-3 в ММСК, что наблюдается и при инкубации ММСК с ионами лития.
5. ММСК, прекондиционированные активированными лейкоцитами или ионами лития, снижают выраженность воспалительного процесса при экспериментальном остром пиелонефрите, уменьшая число лейкоцитов в крови, уровень TNF и активность МПО в тканях почки.
Апробация работы Основные положения диссертационной работы были представлены на Всероссийской научной школе-конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (Москва, 2010), ХХIII Международной зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2011), 15-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука ХХI века» (Пущино, 2011), I Международной научно-практической конференции «Достижения, инновационные направления, перспективы развития и проблемы современной медицинской науки, генетики и биотехнологий» (Екатеринбург, 2011), II Международной интернет-конференции «Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии» (Казань, 2012), 49-м конгрессе Европейской почечной ассоциации и европейской ассоциации диализа и трансплантологии ERA-EDTA (Париж, 2012), 37-м конгрессе Федерации европейских биохимических сообществ FEBS (Севилья, 2012), 4-ой встречи членов Европейской организации молекулярной биологии EMBO (Ницца, 2012), а также на теоретическом семинаре отдела биоэнергетики НИИ физико-химической биологии имени А.Н.
Белозерского МГУ имени М.В. Ломоносова (июнь, 2012).
Публикации Основные положения диссертации опубликованы в 12 печатных работах, из них 1 патент и 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем работы Диссертация изложена на 182 страницах, содержит 48 рисунков и состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы исследования», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы» и «Список литературы». Список литературы включает 13 отечественных и 398 иностранных источника.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Эксперименты на культурах клеток Культура ММСК была получена из костного мозга эмбрионов человека 7 8 недель после оплодотворения и предоставлена ФГБУ "Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова" Министерства здравоохранения Российской Федерации (директор - акад. РАМН Г.Т. Сухих). Иммуноцитохимическим методом исследования фенотип ММСК был подтвержден позитивной окраской на маркеры CD13, CD44, CD90, CD105 и отрицательной на маркеры CD34, CD45.
В работе во всех экспериментах использовали культуру ММСК 4- пассажей. Для анализа изменений, происходящих в ММСК при воспалении и прекондиционировании, к культуре ММСК добавляли суспензию лейкоцитов периферической крови крыс (2x105 кл/мл) и раствор липополисахарида E.coli 0127:B8 (ЛПС, 500 нг/мл, Sigma, США) или 9 мM LiCl. ММСК в среде с лейкоцитами/ЛПС или LiCl культивировали в течение 24 ч.
Уровень генерации активных форм кислорода (АФК) в ММСК и во фракциях лейкоцитов (моноцитов, лимфоцитов, нейтрофилов) исследовали с помощью окрашивания клеток 2,7-дихлородигидрофлуоресцеином диацетатом (2,7-DCF DA, Molecular Probes, США). Образование оксида азота оценивали с помощью окрашивания ММСК 4,5-диаминофлуоресцеином диацетатом (DAF- DA, Calbiochem, США). Флуоресценцию DCF и DAF-2 в ММСК детектировали с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа LSM510 (Carl Zeiss, Германия) с программным обеспечением Zeiss LSM Image Browser (Carl Zeiss Micro Imaging GmbH, Германия). Флуоресценцию DCF в лейкоцитах регистрировали с помощью проточного цитометра CyFlow (Partec GmbH, Германия). Использовали длину волны возбуждающего света 488 нм и измеряли флуоресценцию в диапазоне 505-530 нм.
Активность матриксных металлопротеиназ (ММП) в ММСК определяли с помощью зимографии, которую проводили в 10% полиакриламидном геле, содержащем 0.2% раствор желатина, согласно ранее описанной методике (Woessner J.F., 1995). После окраски геля красителем Кумасси R-250 активность ММП проявлялась в виде светлых полос на темном фоне, интенсивность которых оценивали с помощью программного обеспечения WCIF ImageJ (NIH, Bethesda, MD, США).
Для оценки миграционной способности in vitro культуру ММСК переносили на поликарбонатную мембрану с диаметром пор 8 мкм (Costar, США) в питательной среде (5х104 кл в 200 мкл среды). В лунки 24-х луночного планшета добавляли питательную среду, содержащую 50 нг/мл фактора некроза опухоли (TNF, Invitrogen, США), или экстракт почек, извлеченных на 3 день после индукции острого пиелонефрита у крыс. После 24 ч инкубации клетки фиксировали и окрашивали пропидиум йодидом (Invitrogen, США).
Флуоресценцию детектировали с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа LSM510 (Carl Zeiss, Германия), используя возбуждающий лазер 543 нм и регистрируя флуоресценцию в диапазоне 560- нм. Коэффициент миграции ММСК оценивали по отношению числа клеток, мигрирующих на внутреннюю сторону мембраны, к числу клеток, оставшихся на наружной стороне мембраны.
Эксперименты на животных Исследования по моделированию острого пиелонефрита проводили на самках белых беспородных крыс (общее число использованных в эксперименте животных - n=220), возрастом 6-8 недель, массой тела 180-200 г, полученных из питомника лабораторных животных «Столбовая» РАМН. Работа с лабораторными животными проводилась в соответствии с приказом Минздрава СССР №755 от 12.08.1977. На проведение экспериментального исследования было получено разрешение Комиссии по биоэтике НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ имени М.В. Ломоносова. Для моделирования острого пиелонефрита крысу наркотизировали хлоралгидратом внутрибрюшинно из расчета 0.3 г/кг массы животного, инфицировали, используя мягкий катетер (Clay Adams, США), путем введения в мочевой пузырь через уретру инокулята из смешанной культуры фекальных бактерий (5 мл/кг, 1x колониеобразующих единиц/мл культуры фекальных бактерий крыс, состоящей преимущественно из E.coli). На 3 день после инфицирования отбирали крыс с повышенным числом лейкоцитов в крови, распределяя их на 4 группы. Группам леченных животных в яремную вену вводили суспензионную культуру нативных ММСК (группа «Пиелонефрит+ММСК», n=50), ММСК, сокультивированных с активированными ЛПС лейкоцитами (группа «Пиелонефрит+ММСК (восп.
ПК)», n=28), или ММСК, обработанных LiCl (группа «Пиелонефрит+ММСК (LiCl ПК)», n=28), в физиологическом растворе в дозе 15x106 кл/кг. На 7 день развития острого пиелонефрита, согласно ранее описанной модели (Лоран О.Б. и др., 2006), животные выводились из эксперимента передозировкой диэтилового эфира, при этом у леченных животных, а также у группы крыс с острым пиелонефритом (группа «Пиелонефрит», n=71) и у контрольных (интактных) животных (группа «Контроль», n=43) производили забор почек и образцов крови для дальнейшего анализа.
Малоновый диальдегид (МДА) в гомогенатах тканей почек определяли с помощью тиобарбитуровой кислоты по методу, предложенному Mihara M. и Uchiyama M. (1978), с некоторыми модификациями. Оптическую плотность раствора измеряли при длине волны 532 нм на спектрофотометре Hitachi- (Hitachi, Япония). Определение TNF проводили методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческого набора Rat TNF- ELISA Ready-SET Go (еBioscience, США). После развития цветной реакции 3,3’,5,5’ тетраметилбензидина оптическую плотность раствора измеряли при длине волны 450 нм на микропланшетном фотометре Multiscan Eх (Thermo Labsystems, Китай). Образование нитрата/нитрита исследовали модифицированным колориметрическим методом Грисса (Giustarini D. et al., 2008). Оптическую плотность раствора измеряли при длине волны 535 нм на микропланшетном фотометре Zenyth 3100 (Anthos, Австрия). Активность миелопероксидазы (МПО) определяли способом, описанным ранее (Schierwagen C. et al., 1990), по хромогенной реакции с ортофенилендиамином. Оптическую плотность раствора измеряли при длине волны 492 нм на микропланшетном фотометре Multiscan Eх (Thermo Labsystems, Китай). Концентрацию МДА, TNF, нитрата/нитрита, МПО нормировали на содержание общего белка в пробах гомогенатов тканей почек, которое, как и в суспензии ММСК, определяли по методу, основанному на колориметрической реакции бицинхониновой кислоты с белками (коммерческий набор, Sigma, США). Оптическую плотность раствора определяли при длине волны 541 нм на микропланшетном фотометре Multiscan Eх (Thermo Labsystems, Китай).
Для проведения морфологического исследования в группах «Контроль» (n=5), «Пиелонефрит» (n=15) и «Пиелонефрит+ММСК» (n=10) у животных извлекали почки, снимали фиброзную капсулу и помещали в фиксирующий раствор, содержащий формалин, H2O, изопропанол в соотношении 2:1:7, после чего почки для дегидратации проводили по растворам изопропанола возрастающей концентрации и заливали готовой гистологической средой Histomix (БиоВитрум, Россия), делали срезы толщиной 5-7 мкм, окрашивали их гематоксилином и эозином. Выраженность воспалительного процесса при остром пиелонефрите оценивали по 4-х балльной шкале: 0 баллов - отсутствие инфильтрации лейкоцитами;
1 балл – единичные лейкоциты (до 10 кл на поле зрения);
2 балла – множественные лейкоциты (до 50 кл на поле зрения);
3 балла – лейкоциты преобладают над тканевыми элементами;
4 балла – абсцессы.
Для определения миграционной способности ММСК in vivo клетки окрашивали флуоресцентным зондом кальцеином зеленым (Molecular Probes, США) или микрочастицами оксида железа (SiMAG, 0.75 мкм, Сhemicell, Германия) и вводили в кровоток подопытным животным на 3 день после моделирования острого пиелонефрита, через 24 ч выявляли наличие меченых ММСК в гомогенатах тканей почек или на гистологических срезах, окрашенных по методу Перлса с дополнительной окраской квасцовым кармином, соответственно. Флуоресценцию кальцеина измеряли при длине волны 535 нм на микропланшетном детекторе Zenyth 3100 (Anthos, Австрия).
Гематологический анализ образцов крови, выделенных из яремной вены крыс, проводили на автоматическом гематологическом анализаторе для ветеринарии PCE 90 Vet (High Technology, США).
Иммуноблоттинг Электрофорез белков тканей почек и ММСК проводили в 10, 12.5% полиакриламидных гелях и псевдоградиентном (10-20% полиакриламидном геле) в денатурирующих условиях по Лэммли (Laemmli U.K., 1970). После разделения белки из геля переносили на PVDF мембрану (Amersham Pharmacia Biotech, Великобритания) согласно методике, описанной ранее (Towbin H. et al., 1992).
Использовали первичные антитела против GSK3-/, TGF1 (Santa Crus Biotechnology, США);
P-GSK-3 (Cell Signaling Technology, США);
TNF (еBioscience, США);
iNOS (Transduction Laboratories, США);
-тубулина (AbCam, США) в разведениях, рекомендованных производителями. Вторичные антитела (конъюгированные с пероксидазой хрена анти-кроличьи антитела козы или анти мышиные антитела козы, ИМТЕК, Россия) использовали в разведении 1:10000.
Детекцию проводили с помощью хемилюминесцентного субстрата ECL Advance Western blotting detection kit (Amersham Pharmacia Biotech, Великобритания).
Изображение оцифровывали и анализировали с помощью программного обеспечения WCIF ImageJ (NIH, Bethesda, MD, США).
Статистика Все эксперименты повторялись минимум в 3 повторах, в случаях клеточных культур и срезов почки оценивали не менее 10 полей зрения для каждого повтора. Полученные результаты обрабатывались с помощью компьютерных программ STATISTICA 6.0 (StatSoft Inc., США), Biostat 4. (McGraw-Hil, США) и представлены в виде: среднее ± стандартная ошибка среднего. Сравнение между группами проводили с учетом характера распределения параметрическими (t-критерий Стьюдента) и непараметрическими методами (U-критерий Манна-Уитни), вычислению t-критерия Стьюдента предшествовала оценка нормальности распределения (критерий Шапиро-Уилка W) и равенства дисперсий распределений (критерий Левена). Статистическая значимость приведена для p0.05, если не указано иное.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Влияние ММСК на окислительный стресс и развитие воспаления при экспериментальном остром пиелонефрите В настоящей работе у крыс индуцировали острый пиелонефрит путем введения в мочевой пузырь инокулята из смешанной культуры фекальных бактерий.
Это приводило к развитию экспериментального пиелонефрита у 70% животных. Такая модель отражает течение Рис. 1. Влияние ММСК на заболевания в клинических условиях, содержание TNF в тканях почек на поскольку в развитии пиелонефрита чаще 7 день после индукции острого всего принимают участие микроорганизмы пиелонефрита у крыс. Представлен толстого кишечника, и именно иммунноблот гомогенатов тканей уриногенный путь инфицирования органов почек (А) и денситометрический мочевой системы считается анализ интенсивности сигнала TNF (Б). При экспериментальном остром доминирующим (Johnson C.E., 1999).
пиелонефрите наблюдалось Прежде всего, в работе было увеличение количества TNF, показано развитие инфекционно которое снижалось после воспалительного процесса в условиях внутривенного введения ММСК. ** экспериментального острого пиелонефрита, р0.01.
выраженность которого уменьшалась при введении ММСК. В частности на день после моделирования острого пиелонефрита у крыс было выявлено значительное увеличение уровня фактора некроза опухоли (TNF) в тканях почек (рис. 1), тогда как внутривенное введение ММСК приводило к уменьшению содержания этого провоспалительного цитокина почти в полтора раза, что отражает снижение активности воспалительных реакций в почке.
На 7 день развития острого пиелонефрита наблюдалось увеличение активных форм кислорода (АФК) лейкоцитами крови крыс. АФК при пиелонефрите генерируются лейкоцитами для защиты от бактериальной инфекции. Однако с развитием воспалительного процесса происходит ряд изменений в клеточных структурах тканей почки, приводящих к дисбалансу в уровнях генерации и нейтрализации АФК, при этом образующиеся избыточные их количества оказывают повреждающее действие (Mundi H. et al., 1991), вызывая развитие окислительного стресса (Cadenas E. and Sies H., 1985), что может стать причиной гибели клеток нефрона и дисфункции почки (Basnakian A.G. et al., 2002). Было выявлено, что при пиелонефрите главным источником АФК среди клеток крови являлись нейтрофилы, поскольку в этих клетках наблюдалось смещение пика флуоресценции DCF в сторону более высоких значений (рис. 2А). Среднее значение интенсивности флуоресценции при этом увеличивалось более чем в 1.5 раза (рис. 2Б). При введении ММСК интенсивность флуоресценции DCF в нейтрофилах уменьшалась (рис. 2А, Б) до значений, наблюдаемых в группе контрольных крыс, что свидетельствует о снижении степени активации нейтрофилов и восстановлении уровня генерации АФК в лейкоцитах до нормы.
Рис. 2. Влияние ММСК на генерацию АФК нейтрофилами на 7 день после индукции острого пиелонефрита у крыс. Продукция АФК в нейтрофилах (проточная цитофлуориметрия, А и анализ интенсивности флуоресценции, Б) была оценена по интенсивности флуоресценции зонда DCF. При моделировании пиелонефрита генерация АФК в нейтрофилах увеличивалась, тогда как внутривенное введение ММСК подавляло этот эффект. **- р0.01.
Результатом повышенной генерации АФК лейкоцитами являлось развитие окислительного стресса в тканях почек, оцениваемое по повышению уровня МДА. Поскольку МДА является продуктом перекисного окисления липидов клеточных мембран при реакции с АФК, он служит наиболее легко определяемым маркером перекисного окисления и окислительного стресса (Goode H.F. et al., 1995). Количество МДА в тканях определялось на 3 и 7 дни развития пиелонефрита. Было обнаружено выраженное окислительное повреждение тканей почек на 3 день, поскольку уровень МДА повышался более чем в 1.5 раза. К 7 дню уровень МДА частично снижался, оставаясь, однако, повышенным по сравнению с контрольными значениями (рис. 3). Таким образом, внутривенное введение ММСК (на 3 день) приходилось на пик развития окислительного стресса, при этом к 7 дню развития заболевания происходило снижение уровня МДА как в группе леченных животных, так и при пиелонефрите без лечения, однако при введении ММСК уменьшение МДА было более выраженным (статистически значимо снижалось до значений, наблюдаемых в контрольной группе крыс).
Другим важным компонентом развития Рис. 3. Влияние ММСК на количество МДА в воспалительной реакции при тканях почек при развитии острого Воспалительные индукции пиелонефрита является пиелонефрита у крыс.
реакции в почках сопровождались развитием оксид азота (NO), синтезируемый окислительного стресса, наблюдаемого по в поврежденных тканях накоплению МДА в тканях почек на 3 и 7 день.
Введение ММСК приводило к значительному снижению уровня МДА к 7 дню после индукции пиелонефрита. *- р0.05, **- р0.01.
макрофагами и нейтрофилами. При взаимодействии NO с АФК образуется промежуточное соединение, пероксинитрит, которое оказывает цитотоксическое действие на клетки почки, вызывая нитрозильное повреждение (Vinas J.L. et al., 2006). Активация Рис. 4. Влияние ММСК на процессов, происходящих при накопление нитрата/нитрита в тканях нитрозильном повреждении, в данной почек на 7 день после индукции работе исследовалась по накоплению в острого пиелонефрита. Концентрация тканях почек нитрата/нитрита, основных нитрата/нитрита, являющаяся продуктов деградации NO и других маркером активности синтеза NO, активных форм азота (АФА). увеличивалась в тканях почек при Концентрация нитрата/нитрита в тканях моделировании пиелонефрита, а при почек на 7 день развития острого внутривенном введении ММСК пиелонефрита более чем в 1.5 раза уменьшалась до контрольных превышала значения, отмеченные в группе значений. *- р0.05, **- р0.01.
интактных крыс (рис. 4). При введении ММСК содержание нитрата/нитрита, и, следовательно, образование NO значительно уменьшалось. Таким образом, введение ММСК приводило к выраженному снижению нитрозильного повреждения и уменьшению окислительного стресса в тканях почек.
Необходимо отметить, что в условиях острого пиелонефрита дисфункции почек и развития почечной недостаточности на данных сроках исследования не обнаруживалось.
Влияние ММСК на морфологические изменения в почке после индукции острого пиелонефрита у крыс При морфологическом исследовании почек у интактных животных лоханка и чашечка (рис. 5А1) были выстланы переходным кубическим эпителием.
Эпителиальные клетки с четкими границами. Собственная пластинка слизистой оболочки тонкая, образована рыхлой волокнистой соединительной тканью, в которой были видны неравномерно полнокровные сосуды микроциркуляторного русла. Клеточные элементы собственной пластинки слизистой оболочки были представлены фиброцитами, фибробластами, единичными лимфоцитами.
Гладкомышечный слой образован 4-5 слоями лейомиоцитов. Во внутреннем мозговом веществе почки (рис. 5А2) собирательные трубочки были выстланы высоким призматическим эпителием, тонкие части петель нефронов образованы плоским эпителием. В наружном мозговом веществе (рис. 5А3) проксимальные и дистальные прямые канальцы, а также собирательные трубочки были выстланы кубическим эпителием. В корковом веществе почки (рис. 5А4) эпителий извитых канальцев и собирательных трубочек кубический и определялся на всем протяжении, границы клеток и их ядер четкие. Строма представлена тонкими прослойками соединительной ткани, отмечалось неравномерное расширение и полнокровие кровеносных сосудов. Капиллярные петли клубочков почки тонкие, неравномерно полнокровные. Просветы капсулы Шумлянского - Боумена узкие свободные.
На 7 день после индукции острого пиелонефрита почки крыс были бледного серо-желтоватого цвета, увеличены в размере, у 8 из 15 животных (53%) выявлялись субкапсулярные точечные кровоизлияния и большое число абсцессов, которые занимали у 9 из 15 крыс (60%) треть поверхности почки, что соответствовало макроскопической картине апостематозного нефрита. Почечная лоханка была расширена, слизистая оболочка тусклая, у 5 из 15 животных (33%) с гнойным содержимым. Микроскопически в эпителиальной выстилке лоханки и чашечки почек (рис. 5Б1) у всех животных этой группы выявлялся выраженный лейкопедез нейтрофилами. Эпителий был очагово десквамирован, в отдельных зонах с образованием эрозий и изъязвлений. В стенке лоханки и чашечки наблюдалась выраженная диффузная воспалительная инфильтрация, главным образом нейтрофилами. В корковом и мозговом слоях почки (рис. 5Б2, Б3, Б4) выявлялась диффузная и очаговая инфильтрация лейкоцитами. Просветы канальцев мозгового вещества были расширены, эпителий десквамирован, в просвете небольшого числа канальцев и собирательных трубочек в 85 из полей зрения (50%) обнаруживали скопление нейтрофилов. Строма отечная, в ней выявлены расширенные полнокровные сосуды, диапедезные кровоизлияния.
В корковом веществе (рис. 5Б4) наблюдалось расширение просвета канальцев, очаговая десквамация эпителиальных клеток. Просветы почечных канальцев в Рис. 5. Влияние ММСК на морфологические изменения в почках крыс с экпериментальным острым пиелонефритом. На 7 день развития пиелонефрита (Б) в чашечке почки (1), во внутреннем (2) и наружном (3) мозговом веществе, в корковом веществе (4) наблюдалась в разной степени выраженности диффузная и очаговая инфильтрация лейкоцитами, интенсивность которой уменьшалась при внутривенном введении ММСК (B). В контрольной группе крыс патологических изменений в почках не выявлялось (А). Окраска гематоксилином и эозином. Ув. А1, А2, А4, Б1, Б2, Б3, В1, В2, В3, В4 320;
А3 100;
Б4 200.
из 190 полей зрения (20%) были заполнены зернистыми или гомогенными эозинофильными массами.
После внутривенного введения ММСК животным с острым пиелонефритом воспалительные изменения в лоханке и чашечке почек (рис.
5В1) были менее выражены. Отмечалось очаговое «разрыхление» эпителиальной выстилки лоханки и чашечки. В собственной пластинке слизистой оболочки лоханки и чашечки выявлялась диффузная слабо и умеренно выраженная воспалительная инфильтрация. Мышечный слой определялся четко на всем протяжении. Диффузная и очаговая инфильтрация мозгового (рис. 5В2, В3) и коркового слоев (рис. 5В4) была минимально выражена. Небольшая часть просветов собирательных трубочек и канальцев оставалась расширенной, отмечалась десквамация эпителия. В строме выявлялись очагово расширенные и полнокровные сосуды.
При пиелонефрите при полуколичественном анализе выраженности инфильтрации лейкоцитами в каждом слое почки (рис. 6) наиболее интенсивная воспалительная инфильтрация обнаружена в мозговом веществе, тогда как в корковом веществе в основном выявляли присутствие лишь единичных лейкоцитов. При введении ММСК выраженность воспалительной инфильтрации во всех слоях значительно уменьшалась.
Рис. 6. Оценка выраженности воспалительной инфильтрации в различных слоях почки.
При остром пиелонефрите в мозговом и корковом веществе наблюдалась воспалительная инфильтрация, интенсивность которой уменьшалась при внутривенном введении ММСК. **- р0.01.
Таким образом, при остром пиелонефрите морфологические признаки воспаления, преимущественно инфильтрация нейтрофилами, заметно уменьшались после внутривенного введения ММСК, особенно в мозговом слое почки. То есть прежде всего MMСК проявляли иммуносупрессорные свойства в зоне, где воспалительный процесс был наиболее выражен.
Миграция экзогенных ММСК в ткани поврежденной почки ММСК обладают высокой способностью к миграции в область повреждения. Известно, что в пораженных тканях почки в основе этого процесса лежит хемотаксис ММСК вдоль градиента цитокинов, особенно TNF (Fu X. et al., 2009).
Для анализа направленной миграции ММСК в данной работе перед введением животным ММСК метили кальцеином, затем анализировали наличие меченых ММСК в тканях почек по интенсивности флуоресценции кальцеина. Результаты показали, что внутривенное введение меченных ММСК интактным крысам не приводило к выраженному накоплению этих клеток в тканях почек, поскольку Рис. 7. Миграция ММСК, меченых интенсивность флуоресценции кальцеином, в ткани поврежденных почек.
Появление ММСК оценено по интенсивности кальцеина составляла 6855. флуоресценции кальцеина в гомогенатах ±316.4 отн.ед. и была близка к почек на 4 день развития острого уровню флуоресценции (аутофлуоресценции), пиелонефрита у крыс. Интенсивность флуоресценции кальцеина в здоровых крысах, обнаруженному в группе крыс, которым были введены меченные ММСК, не которой не вводили ММСК (рис.
отличалась от контроля. *- р0.05. 7). Однако при введении меченых ММСК в условиях острого пиелонефрита наблюдалась высокая интенсивность флуоресценции кальцеина (9149.8±718.5 отн.ед.) в тканях почек. То есть внутривенное введение ММСК инфицированным крысам, в отличие от введения здоровым животным, приводило к значительному накоплению этих клеток в тканях почек, что говорит о высокой способности ММСК к миграции в зону воспаления.
Хоуминг ММСК был оценен также с помощью гистологического окрашивания клеток, меченных микрочастицами оксида железа, на срезах почек.
Выявлено, что накопление в тканях почек ММСК, введенных в условиях острого пиелонефрита, значительно превышает таковое в почках контрольных (здоровых) крыс (рис. 8). Представленные на рисунках изображения (рис. 8А) соответствуют срезам мозгового вещества, поскольку именно в нем наблюдалась наибольшая аккумуляция меченных ММСК.
Основным фактором, обеспечивающим миграцию ММСК в поврежденные ткани почки, вероятно, являлось увеличение концентрации провоспалительных цитокинов в месте инфицирования. Существенная роль TNF в хоуминге ММСК была показана in vitro. Выявлено, что при инкубации ММСК в присутствии экзогенного TNF коэффициент миграции этих клеток был в 7.6 раз выше (рис.
9), чем при культивировании в стандартной питательной среде. Однако еще Рис. 8. Миграция ММСК, меченых микрочастицами оксида железа (МЧОЖ), в поврежденную почку. Меченые ММСК (стрелка) выявляли с помощью окраски гистологических препаратов по Перлсу с дополнительной окраской квасцовым кармином (А). Количество ММСК на срезах почек на 4 день после индукции пиелонефрита достоверно большее, чем число ММСК на срезах почек контрольных крыс (диаграмма, Б). ** - р0.01. Шкала 50, 20 мкм.
более значительное увеличение миграции ММСК вызвал экстракт поврежденных почек.
Такое увеличение коэффициента миграции, вероятно, можно объяснить синергическим действием TNF, повышенное Рис. 9. Влияние TNF и экстракта тканей почек крыс с пиелонефритом на миграционную способность ММСК. содержание которого Миграция ММСК через поры мембраны (А, стрелка) было найдено в тканях значительно увеличивалась в присутствии TNF и в еще поврежденных почек большей степени при инкубации с гомогенатом тканей (рис. 1), и ряда других цитокинов, поврежденных почек (диаграмма, Б). **- р0.01. Шкала 10 мкм. аккумулирующихся в тканях при развитии воспалительных процессов и обладающих хемотаксическим влиянием на ММСК (Webb N.J. and Brenchley P.E., 2004;
Ponte A.L. et al., 2007).
Таким образом, при пиелонефрите ММСК мигрируют преимущественно в медуллярную зону почки (рис. 8), поскольку здесь выявляется наибольшая инфильтрация лейкоцитами (рис. 6), а, следовательно, и большая концентрация продуцированных ими хемоаттрактантов, в частности провоспалительных цитокинов. Интересно то, что ММСК чаще всего не концентрировались в самом очаге воспаления, а располагались около него.
Сокультивирование с лейкоцитами индуцирует в ММСК запуск сигнальных путей, аналогичных фармакологическому прекондиционированию LiCl Очевидно, в условиях экспериментального острого пиелонефрита у крыс ММСК, мигрировавшие в почку, оказываются под влиянием воспалительного окружения, в частности повышенных концентраций ряда цитокинов (TNF, IL-1, IL-6 и пр.), АФК и NO. В этой связи было решено проанализировать in vitro влияние такого окружения на ММСК на модели совместного культивирования ММСК с лейкоцитами, активированными ЛПС.
Исследовали основные биохимические параметры, имеющие важное значение для функционирования ММСК или реализации их иммуномодулирующих свойств.
Было показано, что после инкубации с лейкоцитами и ЛПС в ММСК Рис. 10. Изменение уровня экспрессии значительно увеличивался уровень ММСК. Представлены экспрессии индуцибельной синтазы оксида iNOS в иммунноблоты клеток с антителами азота (iNOS), тогда как в нативных ММСК против iNOS (А), -тубулина (Б) и не выявлялось специфической полосы iNOS, iNOS (рис. 10А, В).
интенсивность сигнала Вследствие активации экспрессии нормализованная на -тубулин (В).
Сокультивирование с лейкоцитами iNOS в ММСК, сокультивированных с вызывало значительное увеличение активированными лейкоцитами, содержания iNOS в ММСК, тогда как наблюдалось значительное увеличение инкубация с LiCl не влияла на ее уровня генерации NO, оцененного по количество. **- р0.01.
интенсивности флуоресценции DАF- (рис. 11). Полагают, что NO, продуцированный ММСК, обладает иммуномодулирующей активностью (Sato K. et al., 2007). Уровень флуоресценции DАF-2 в ММСК, сокультивированных с лейкоцитами и ЛПС, составлял 42.7±1.6 отн. ед., что почти в 2 раза превышало значения в нативных Рис. 11. Изменение уровня продукции NO в ММСК. Окрашивание ММСК зондом на оксид азота DAF-2 DA (А). Продукция NO в ММСК, сокультивированных с активированными лейкоцитами, значительно увеличивалась. Анализ интенсивности флюоресценции DAF-2 представлен на диаграмме (Б).**- р0.01. Шкала 20 мкм.
ММСК (рис. 11).
Наряду с увеличением продукции NO в ММСК увеличивалась генерация АФК. После совместного культивирования ММСК с лейкоцитами и ЛПС наблюдалось значительное повышение продукции АФК по сравнению со значениями, обнаруженными в нативных ММСК (рис. 12).
Рис. 12. Изменение уровня генерации АФК в ММСК. Окрашивание ММСК зондом на активные формы кислорода DCF DA (А). Инкубация с лейкоцитами и ЛПС вызывала значительное повышение уровня генерации АФК в ММСК. Анализ интенсивности флюоресценции DCF представлен на диаграмме (Б) **- р0.01. Шкала 20 мкм.
При инкубации с активированными лейкоцитами в ММСК также наблюдали изменение уровня экспрессии трансформирующего ростового фактора (TGF1), который, как известно (Di Nicola et al., 2002), играет одну из ключевых ролей в механизмах супрессии клеток иммунной системы под действием ММСК. Было показано двукратное увеличение уровня экспрессии TGF1 в ММСК после совместного культивирования с лейкоцитами и ЛПС (рис.
13А, В).
Кроме того, была оценена активность матриксной металлопротеиназы 2 (ММП-2), которая участвует в модуляции иммунного ответа (Ding et al., 2009) и обеспечивает миграцию и проникновение ММСК в поврежденную ткань (De Becker А. et al., 2007). Было показано, что после совместного культивирования с активированными лейкоцитами активность ММП-2 в ММСК более чем в 1.5 раза увеличивалась по сравнению с контрольными ММСК (рис. 14). Таким образом, хотя ММСК изначально способны ферментативно гидролизовать основные типы белков внеклеточного матрикса для облегчения миграции в ткань, но, в еще большей мере, такая активность (а значит и степень миграции) увеличивается при воспалении.
Рис. 13. Изменение уровня экспрессии TGF1 в ММСК. Представлены иммунноблоты клеток с антителами против TGF1 (А), -тубулина (Б) и интенсивность сигнала TGF1 с нормализацией на -тубулин (В).
Совместное культивирование с лейкоцитами и ЛПС вызывало увеличение содержания TGF1 в ММСК, тогда как обработка LiCl не влияла на уровень экспрессии этого белка. *- р0.05.
Рис. 14. Изменение активности ММП-2 в ММСК. Обработка LiCl не оказывала Обнаружили, что при влияния на изменение уровня активность совместном культивировании с ММП-2 в ММСК, тогда как совместное лейкоцитами и ЛПС в ММСК культивирование с лейкоцитами и ЛПС активировался сигнальный путь, вызывало увеличение ее активности. * подобный запускаемому при р0.05.
ишемическом прекондиционировании (ПК), о чем свидетельствовало значительное повышение количества фосфорилированной киназы гликогенсинтазы 3 (GSK-3;
рис. 15).
Известно, что фермент GSK-3 играет ключевую роль в процессе ишемического ПК, а увеличенное количество фосфорилированной (ингибированной) GSK- является общей точкой ряда сигнальных путей, ведущих к выработке устойчивости к развитию окислительного стресса (Juhaszova M. et al., 2004;
Plotnikov E.Y. et al., 2007). Кроме того, накопление фосфорилированной GSK- может способствовать выживанию стволовых клеток и проявлению ими терапевтических эффектов (Ko K.H. et al., 2011). Интересно, что один из механизмов ишемического ПК опосредован сигнальным повышением уровня АФК, которое также наблюдалось в ММСК после инкубации с активированными лейкоцитами (рис. 12). Поскольку одним из наиболее эффективных индукторов фармакологического ПК являются ионы лития (основной внутриклеточной мишенью ионов лития в клетке является было проанализировано GSK-3), влияние LiCl на ММСК. После инкубации ММСК с LiCl обнаружилось значительное увеличение фосфорилированной изоформы GSK- (Р-GSK-3), сравнимое со значениями при сокультивировании ММСК с активированными лейкоцитами (рис.
15А, В). Уровень общей GSK-3/ оставался неизменным (рис. 15Б).
Очевидно, что не все сигнальные пути, запускаемые в ММСК в присутствии активированных лейкоцитов, индуцировались при обработке клеток Рис. 15. Увеличение количества Р- LiCl, поскольку в фармакологически GSK-3 в ММСК. Представлены прекондиционированных ММСК не иммунноблоты клеток с антителами происходило увеличения уровня против Р-GSK-3 (А), GSK-3/ (Б) и экспрессии iNOS (рис. 10), TGF1 (рис.
интенсивность сигнала Р-GSK-3, 13) и не выявлялось достоверного нормализованная на GSK-3/ (В). повышения активности ММП-2 (рис. 14), Инкубация с лейкоцитами и ЛПС, так однако наблюдалось сопоставимое же как с LiCl, вызывала значительное увеличение миграционной (более чем в накопление Р-GSK-3 в ММСК по раза по сравнению с контрольными сравнению с контрольными клетками.
ММСК) и пролиферативной (более чем на **- р0.01.
30% по сравнению с контрольными ММСК) способности. Таким образом, воспалительное окружение (сокультивирование с лейкоцитами и ЛПС) активирует в ММСК запуск сигнальных путей, аналогичных фармакологическому прекондиционированию LiCl, и ряда дополнительных сигнальных путей, что можно охарактеризовать, как воспалительное прекондиционирование.
Влияние ММСК, прекондиционированных ионами лития или воспалением, на течение острого пиелонефрита у крыс Исходя из полученных данных, было исследовано влияние ММСК, подвергшихся воспалительному ПК (при сокультивировании с активированными лейкоцитами) и фармакологическому ПК (при обработке LiCl), на течение экспериментального острого пиелонефрита in vivo. Выявлено, что хотя интактные ММСК приводили к снижению активности воспалительного процесса у крыс, прекондиционированные ММСК демонстрировали гораздо более выраженные терапевтические эффекты.
Рис. Влияние 16.
прекондиционированных ММСК на число лейкоцитов в крови на 7 день после индукции острого пиелонефрита у крыс. Содержание лейкоцитов значительно увеличивалось при пиелонефрите, внутривенное введение интактных ММСК и ММСК, прекондиционированных ионами лития (LiCl ПК), значительно снижало число лейкоцитов в крови, а инъекция ММСК, прекондиционированных воспалением Рис. 17. Влияние (восп. ПК), уменьшала уровень их прекондиционированных ММСК на число содержания до нормы. **- р0.01,*- нейтрофилов (А) и моноцитов (Б) в крови р0.05. на 7 день после индукции острого пиелонефрита у крыс. Повышенное В условиях острого содержание нейтрофилов и моноцитов пиелонефрита у крыс наблюдалось снижалось при внутривенном введении увеличение числа лейкоцитов в крови интактных ММСК, ММСК, прекондиционированных ионами лития почти в 2 раза по сравнению со (LiCl ПК), и в еще большей степи при значениями, выявленными в группе инъекции ММСК, интактных животных (рис. 16).
прекондиционированных воспалением Увеличение содержания лейкоцитов (восп. ПК). **- р0.01, *- р0.05.
происходило главным образом за счет повышения числа нейтрофилов (почти в 4 раза;
рис. 17А) и в меньшей степени за счет увеличения содержания моноцитов (в 2 раза;
рис. 17Б). Внутривенное введение ММСК приводило к значительному ослаблению таких воспалительных изменений, а именно к существенному уменьшению фракции нейтрофилов (рис.
17А) и, как следствие, к снижению числа лейкоцитов в крови (рис. 16). Однако инъекция ММСК, прекондиционированных воспалением, в отличие от интактных ММСК, вызывала нормализацию показателей содержания нейтрофилов (рис. 17А) и всех лейкоцитов (рис. 16). Влияние ММСК, прекондиционированных ионами лития, на снижение числа лейкоцитов (рис. 16) и фракции нейтрофилов (рис. 17А) при пиелонефрите было почти таким же, как влияние интактных ММСК. При введении прекондиционированных (в обоих вариантах) ММСК происходило также уменьшение содержания моноцитов (рис.
17Б), однако эффект в данном случае был сравним с нативными ММСК. Число лимфоцитов при моделировании пиелонефрита практически не изменялось во всех экспериментальных группах. Таким образом, внутривенное введение прекондиционированных воспалением ММСК в отличие от контрольных ММСК и ММСК, прекондиционированных ионами лития, приводило к более выраженному уменьшению содержания лейкоцитов в крови. Очевидно, что в данных экспериментальных условиях обработки клеток LiCl было недостаточно для усиления иммуномодулирующих эффектов ММСК на системные признаки воспаления, поскольку при внутривенном введении находящиеся в крови ММСК, в отличие от ММСК, прекондиционированных воспалением, были не способны повышенно продуцировать противовоспалительные факторы (TGF1, NO и др.).
Однако введение каждого из типов ММСК приводило к значительному ослаблению локального воспаления. Было показало, что активность миелопероксидазы (МПО) в тканях почек – фермента, катализирующего образование сильнейшего окислителя гипохлорита, и маркера степени инфильтрации нейтрофилами, на 3 день пиелонефрита возрастала более чем в раз и почти в 5 раз на 7 день развития заболевания (рис. 18). Внутривенное введение интактных ММСК, ММСК, прекондиционированных воспалением, или Рис. 18. Влияние прекондиционированных ММСК на активность МПО в тканях почек на 7 день после индукции острого пиелонефрита у крыс. Повышенная активность МПО при пиелонефрите снижалась после внутривенного введения ММСК, а также после инъекции ММСК, прекондиционированных воспалением (восп. ПК) или ионами лития (LiCl ПК). **- р0.01, *- р0.05.
литий-прекондиционированных ММСК значительно снижало активность МПО.
Кроме того, было исследовано влияние прекондиционированных ММСК на накопление TNF, наблюдаемое в тканях почек при экспериментальном остром пиелонефрите (рис. 1, 19). При введении ММСК концентрация TNF в условиях пиелонефрита уменьшалась (рис. 19), а инъекция ММСК, прекондиционированных воспалением, и ММСК, прекондиционированных ионами лития, приводила к снижению уровня TNF до нормальных значений (рис.
19). Таким образом, влияние интактных ММСК, прекондиционированных активированными лейкоцитами ММСК и Рис. 19. Влияние прекондиционированных ММСК ММСК, на содержание TNF в тканях почек на 7 день прекондиционированных развития острого пиелонефрита у крыс. После ионами лития, на индукции пиелонефрита наблюдалось значительное накопление TNF, которое снижалось после воспалительный процесс в внутривенного введения ММСК, тогда как инъекция тканях почек было одинаково воспалением эффективным. Этот факт, ММСК, прекондиционированных (восп. ПК) и ММСК, прекондиционированных возможно, объясняется тем, ионами лития (LiCl ПК), восстанавливала в тканях что при воспалительном поврежденных почек уровень содержания TNF до процессе в почке ММСК in vivo прекондиционируются.
нормы. **- р0.01, *- р0.05.
Вероятно, при экспериментальном пиелонефрите введенные в кровоток ММСК способны мигрировать, а затем интегрироваться в поврежденные ткани почек и оказывать там иммуномодулирующее действие путем паракринной регуляции, зависящей от воспалительного окружения.
ВЫВОДЫ 1. При введении инокулята из смешанной культуры фекальных бактерий в мочевой пузырь у крыс развивается острый пиелонефрит, который характеризуется диффузной и очаговой, преимущественно нейтрофильной, воспалительной инфильтрацией, развитием окислительного стресса и повышением содержания провоспалительного цитокина TNF в тканях почки. После введения ММСК костного мозга указанные показатели воспалительного процесса снижаются.
2. При экспериментальном остром пиелонефрите трансплантированные ММСК накапливаются в почке более интенсивно, чем в почке животных контрольной группы. Усилению миграции ММСК способствует высокий уровень TNF.
В условиях сокультивирования с лейкоцитами, активированными 3.
липополисахаридом, в ММСК происходит запуск сигнальных путей, обеспечивающих иммуносупрессорные свойства этих клеток, признаками которых является повышение количества трансформирующего ростового фактора (TG1) и индуцибельной NO-синтазы (iNOS), а также усиление активности матриксной металлопротеиназы (ММП-2).
Сокультивирование с лейкоцитами и липополисахаридом индуцирует в 4.
ММСК сигнальные пути, аналогичные путям, активируемым при фармакологическом прекондиционировании LiCl, о чем свидетельствует повышение количества фосфорилированной формы киназы гликогенсинтазы (GSK-3), ключевого фермента, определяющего устойчивость клеток к окислительному стрессу.
Трансплантация ММСК костного мозга после сокультивирования с 5.
активированными лейкоцитами снижает признаки воспаления при экспериментальном остром пиелонефрите, что выражается в уменьшении числа лейкоцитов в крови, уровня TNF и активности миелопероксидазы (МПО) в тканях почки.
Инкубация с LiCl не приводит к увеличению в ММСК количества TG1, 6.
iNOS и активности ММП-2, однако повышает количество фосфорилированной формы GSK-3. Влияние таких ММСК на число лейкоцитов в крови и активность МПО в тканях почки при остром пиелонефрите не отличается от действия на эти показатели интакных ММСК. ММСК, сокультивированные с активированными лейкоцитами, вызывают более выраженное уменьшение числа лейкоцитов в крови по сравнению с эффектом нативных ММСК и ММСК, обработанных LiCl.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи, опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК РФ 1. Кирпатовский В.И., Хряпенкова Т.Г., Казаченко А.В., Голованов С.А., Плотников Е.Ю., Кудрявцев Ю.В., Тарасова Н.Н., Рогачева (Пулькова) Н.В., Зоров Д.Б., Сухих Г.Т. Влияние фетальных костномозговых мезенхимальных клеток на течение хронического пиелонефрита у крыс.// Экспериментальная и клиническая урология. 2010. № 4. С. 18-24.
2. Плотников Е.Ю., Пулькова Н.В., Силачев Д.Н., Манских В.Н., Хряпенкова Т.Г., Зоров Д.Б., Сухих Г.Т. Методы выявления мезенхимальных стволовых клеток в почке при лечении экспериментальных почечных патологий.// Клеточные технологии в биологии и медицине. 2012. № 3. С. 152-159.
Патент РФ 3. Зоров Д.Б., Плотников Е.Ю., Моросанова М.А., Исаев Н.К., Певзнер И.Б., Хряпенкова Т.Г., Чупыркина А.А., Рогачева (Пулькова) Н.В. Патент на изобретение №2425425 «Модельная тест-система для проверки эффективности воздействия на воспалительный процесс в почечной ткани».
Материалы, опубликованные в сборниках научных трудов 4. Зоров Д.Б., Плотников Е.Ю., Янкаускас С.С., Исаев Н.К., Силачев Д.Н., Зорова Л.Д., Певзнер И.Б., Пулькова Н.В., Зоров С.Д., Моросанова М.А. Феноптозная проблема: от чего гибнет организм? Уроки по почечной недостаточности.// Биохимия. 2012. Т. 77. № 7. С. 893 – 906.
5. Рогачева (Пулькова) Н.В., Плотников Е.Ю., Певзнер И.Б., Янкаускас С.С., Зоров Д.Б. Влияние мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток на воспалительный ответ при пиелонефрите.// Стволовые клетки и регенеративная медицина: Всероссийская научная школа-конференция;
Сборник тезисов. 2010.
С. 61.
6. Рогачева (Пулькова) Н.В., Певзнер И.Б., Янкаускас С.С., Сухих Г.Т., Зоров Д.Б., Плотников Е.Ю. Иммуномодулирующее действие мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток при пиелонефрите.// Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии: ХХIII Международная зимняя молодежная научная школа;
Тезисы докладов и стендовых сообщений. 2011. С. 112.
7. Рогачева (Пулькова) Н.В., Певзнер И.Б., Сухих Г.Т., Зоров Д.Б., Плотников Е.Ю. Влияние мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток на течение пиелонефрита у крыс.// Биология – наука ХХI века: 15-я Международная Пущинская школа- конференция молодых ученых;
Сборник тезисов. 2011. С.160.
8. Рогачева (Пулькова) Н.В., Плотников Е.Ю., Кирпатовский В.И., Хряпенкова Т.Г., Казаченко А.В., Голованов С.А., Кудрявцев Ю.В., Тарасова Н.Н., Сухих Г.Т., Зоров Д.Б. Влияние мультипотентных стромальных клеток костного мозга на течение хронического пиелонефрита у крыс.// Достижения, инновационные направления, перспективы развития и проблемы современной медицинской науки, генетики и биотехнологий: Материалы I Международной научно практической конференции. 2011. С. 218-220.
9. Плотников Е.Ю., Зоров Д.Б., Сухих Г.Т., Певзнер И.Б., Рогачева (Пулькова) Н.В. Исследование механизмов влияния мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток на воспалительный ответ при пиелонефрите.// Актуальные проблемы биохимии и бионанотехнологии;
Сборник трудов II Международной интернет-конференции. 2012. С. 247-249.
10. Zorov D., Plotnikov E., Chupyrkina A., Jankauskas S., Morosanova M., Pevzner I., Pulkova N., Zorova L. Protection of mitochondria: new target to prevent nephrotoxicity.// 49th ERA-EDTA Congress;
Nephrol Dial Transpl. 2012. V. 27. S. 2.
P. 340-341.
11. Pulkova N., Plotnikov E., Sukhikh G., Zorov D. Mechanisms of multipotent mesenchymal stromal cells effects on inflammation under pyelonephritis.// 22nd IUBMB & 37th FEBS Congress;
FEBS J. 2012. V. 279. S. 1. P. 303.
12. Zorova L., Plotnikov E., Pevzner I., Zorov S., Pulkova N., Zorov D. Role of mitochondria in pyelonephritic kidney.// The 4th EMBO Meeting;
Аbstracts. 2012. P.
208-209.
Соискатель Пулькова Н.В.