авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ  БИБЛИОТЕКА

АВТОРЕФЕРАТЫ КАНДИДАТСКИХ, ДОКТОРСКИХ ДИССЕРТАЦИЙ

<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Роль fc-рецепторов в реализации биологического действия с-реактивного белка на иммунокомпетентные клетки

На правах рукописи

ТРУЛЁВ Андрей Сергеевич Роль Fc-рецепторов в реализации биологического действия С-реактивного белка на иммунокомпетентные клетки 03.03.04 – клеточная биология, цитология, гистология 14.03.03 – патологическая физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 2013

Работа выполнена в Отделе иммунологии и Отделе биохимии Федерального госу дарственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт экс периментальной медицины» Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Назаров Пётр Григорьевич доктор биологических наук, профессор Перевозчиков Андрей Петрович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессио нального образования «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринар ной медицины» Министерства сельского хозяйства Российской Федерации, про фессор кафедры гистологии и общей биологии Чумасов Евгений Иванович доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины» Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук, заведующий лабораторией общей патологии отдела общей патологии и патологической физиологии Кокряков Владимир Николаевич

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт цитологии Российской академии наук

Защита диссертации состоится " 12 " ноября 2013 г. в часов на заседании Диссертационного совета Д 001.022.02 при Федеральном государственном бюд жетном учреждении «Научно-исследовательский институт экспериментальной ме дицины» Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Федерального государ ственного бюджетного учреждения «Научно-исследовательский институт экспери ментальной медицины» Северо-Западного отделения Российской академии меди цинских наук по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12.

Автореферат разослан " _ " _ 2013 года Учёный секретарь Специализированного Ученого Совета доктор медицинских наук Дыбан П.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. C-реактивный белок принадлежит к семейству пент раксинов, является белком острой фазы. Отличительная черта С-реактивного белка — возможность быстрого, многократного увеличения его концентрации в крови при раз витии воспаления любой природы и локализации. С-реактивный белок играет важную роль в защите организма. В системе врожденного иммунитета пентраксины играют роль растворимых распознающих белков, сходную с ролью иммуноглобулинов: С реактивный белок способен опсонизировать бактерии, а связываясь с компонентами некротизированных или апоптотических клеток, способствуют их фагоцитозу и тем самым препятствуют их накоплению в тканях и развитию аутоиммунных реакций (Du Clos T.W., 1991). При системной красной волчанке имеется недостаточность продук ции C-реактивного белка, а у мышей с нокаутом гена пентраксина (SAP) развивается спонтанный аутоиммунный процесс против компонентов ядер клеток, что указывает на возможную сдерживающую роль пентраксинов в предотвращении аутоиммунитета (Du Clos T.W., Mold C., 2011). До сих пор не описан дефицит С-реактивного белка, связанный с естественной делецией гена или его части. Отсутствие дефицита С реактивного белка и то, что белок филогенетически консервативен по первичной и третичной структуре и лиганд-связывающей специфичности, указывает на то, что С реактивный белок был необходим для выживания (Назаров П.Г., 2010).

С-реактивный белок обладает не только защитными функциями во врожденном иммунитете, но и участвует в патогенезе таких распространенных заболеваний чело века, как сердечно-сосудистые, нейродегенеративные заболевания и различные фиб ротические нарушения. На ранних этапах (острой фазе) воспаления С-реактивный бе лок провляет провоспалительную, на поздних – противовоспалительную активность.

Тучные клетки (ТК) являются мультифункциональными клетками иммунной си стемы и играют важную роль в защите организма, в частности, в таких процессах как фиброз, ангиогенез, перестройка тканей и заживление ран, взаимодействия хозяин паразит (Быков В.Л., 1999). По ряду признаков тучные клетки близки к базофилам крови, например, они экспрессируют высокоаффинный рецептор к IgE и содержат в гранулах вазоактивные вещества. Но, в отличие от базофилов и других клеток кровя ного происхождения, они являются резидентами соединительной ткани и обычно не обнаруживаются в кровяном русле, а располагаются, как правило, в соединительной ткани. В ответ на различные стимулы запускается процесс дегрануляции ТК, что спо собствует запуску процессов воспаления.

Фибробласты (Фб), являются резидентными клетками соединительной ткани.

Они создают микроокружение для ТК, для их созревания и функционирования. ТК находятся в постоянном контакте с Фб и компонентами межклеточного матрикса. Ак тивация ТК необходима для запуска воспалительных реакций в соединительной ткани.

Под действием медиаторов ТК повышается проницаемость локальных сосудов, что приводит к увеличению температуры локуса воспаления, покраснению и отёку, что вместе с болью (которая инициируется, в том числе в результате активности тучных клеток) и является четырьмя основными признаками воспаления (Krishnaswamy, 2010). При воспалении ТК повышают количество контактов с Фб. ТК продуцируют большое количество биологически активных веществ, которые играют как про-, так и противовоспалительную роль. Большинство цитокинов, синтезируемых ТК, оказывает комплексное воздействие на Фб: влияют на их пролиферативную активность, на экс прессию рецепторов гистамина, серотонина, TNF, а также на выброс фибробластами хемокинов CCL8, CCL13, CXCL4 и CXCL6 (Mller et al., 2011).



В настоящее время достаточно хорошо изучена провоспалительная активность ТК на стадии инициации воспаления, и репаративная активность фибробластов на продуктивной стадии воспаления. В то же время данных о кооперации этих клеток в острой фазе воспаления, в том числе о роли в этом взаимодействии белков острой фа зы крайне мало. Остается спорным и вопрос о клеточном рецепторе, через который реализуется действие С-реактивного белка на клетки соединительной ткани. Изуче нию данной проблемы и посвящена наша работа.

Цель работы. Изучить влияние С-реактивного белка на взаимодействие иммунокомпетентых клеток (тучных клеток, моноцитов) с фибробластами и эндотелиальными клетками, а также оценить роль Fc-рецепторов в реализации действия С-реактивного белка на клетки.

Решались следующие задачи:

1. Исследовать экспрессию Fc-рецепторов на тучных клетках линии НМС-1, моно цитоподобных клетках линий ТНР-1 и U-937, фибробластах, эндотелиальных клетках EA.hy926, клетках карционмы толстой кишки линии COLO320HSR.

2. Определить рецепторы для С-реактивного белка на тучных клетках НМС-1 и эндо телиальных клетках EA.hy926.

3. Изучить способность С-реактивного белка вызывать выход гистамина из тучных клеток линии HMC-1.

4. Определить влияние С-реактивного белка на адгезию тучных клеток и моноцитов к клеткам эндотелия и фибробластам.

5. Изучить роль Fc-рецепторов в активации NF-B-сигнального пути при действии С-реактивного белка на клетки.

Научная новизна работы. Показано, что рецепторами для С-реактивного белка на тучных клетках НМС-1, а также на эндотелиальных клетках EA.hy926, служат ре цепторы иммуноглобулина класса IgG. Основной рецептор для CRP — низкоаффин ный FcRII. Кроме того, впервые показано, что, действуя на Fc-рецепторы тучных клеток, С-реактивный белок вызывает изменение их адгезивных свойств. Впервые по казано, что пентраксины С-реактивный белок и сывороточный Р-компонент амилоида способствуют прикреплению тучных клеток и моноцитов к матриксу соединительной ткани. Установлено, что высокоаффинный рецептор FcRI также является рецептором для CRP на тучных клетках. Но в отличие от FcRII, конститутивно экспрессирован ного на их поверхности, экспрессия FcRI требует индукции и может быть индуциро вана IFN. Воздействие С-реактивного белка на тучные клетки через FcRI приводит к активации тучных клеток и выбросу гистамина.

Теоретическая и практическая значимость результатов работы. Исследова ние направлено на изучение неаллергических механизмов активации тучных клеток человека, в частности, на оценку роли Fc-рецепторов во влиянии белка острой фазы воспаления — CRP. Получены новые данные о значении Fc-рецепторов в активации тучных клеток. Расшифрованы механизмы вовлечения CRP в патофизиологические процессы. В частности, показано, что влияние С-реактивного белка на тучные клетки вызывает их активацию, проявляющуюся выбросом медиаторов и усилением контак тов с окружающей тканью – с фибробластами и белками межклеточного матрикса. Это углубляет теоретические знания о тучных клетках, их роли в процессах иммунорегу ляции. Результаты работы способствуют углублению представлений о механизмах участия тучных клеток в патофизиологических процессах, важны для развития пред ставлений об аллергии и воспалительных процессах.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Экспрессия Fc-рецепторов необходима для взаимодействия С-реактивного белка с клетами организма.





2. При действии С-реактивного белка на иммунокомпетентные клетки усилива ется их адгезия к другим клеткам и компонентам межклеточного матрикса.

3. Для индукции выброса гистамина из тучных клеток человека линии НМС- под действием С-реактивного белка необходима экспрессия FcRI.

Реализация работы. По теме диссертации опубликовано 23 печатных работ, в том числе 5 статей, из которых 3 опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы представлены на Научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт Петербурге» (С.-Петербург, 2007, 2009, 2011), 7-й английской школе иммунологов им.

Дж. Хэмфри (Москва, 2007), VIII Конгрессе «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии» (Москва, 2007), 6-й Международной научно практической конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуаль ных проблем медицины» (Астрахань, 2008), Международной конференции «Физиоло гия и патология иммунной системы» и IV Международной конференции по иммуно терапии, посвященных 100-летию присуждения И.И. Мечникову Нобелевской премии (Москва, 2008), 3-м Китайско-Российском международном симпозиуме по фармаколо гии (Китай, Харбин, 2008), Всероссийской научной конференции «Проблемы биоме дицинской науки третьего тысячелетия» (С.-Петербург, 2010), заседании Российского научного общества иммунологов (РНОИ) (С.-Петербург, 2012), Всероссийской науч но-практической конференции с международным участием «Дни иммунологии в Си бири» (Иркутск, 2012), Национальной конференции «Клиническая иммунология и ал лергология – практическому здравоохранению» (Москва, 2012), XI и XII Междуна родных конгрессах «Современные проблемы иммунологии, аллергологии и иммуно фармакологии» (Москва, 2012, 2013), I, II и IV Международных симпозиумах «Взаи модействие нервной и иммунной систем в норме и патологии» (С.-Петербург, 2007, 2009, 2013).

Объем и структура диссертации. Объем – 140 стр. текста, включая 5 таблиц и 47 рисунков. Список литературы состоит из 189 наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Работа выполнена с использованием клеток перевиваемых линий и первичных фибробластов, выделенных из кожи человека.

Тучные клетки (ТК) линии НМС-1, выделенные от больного тучноклеточной лейкемией, получены от проф. J.H. Butterfield (Mayo Clinic, Rochester, MN, USA). По многим свойствам клетки этой суспензионной линии соответствует соединительнот канным ТК: экспрессируют kit-рецептор, продуцируют гистамин, гепарин, хондрои тинсульфат, триптазу, обладают поверхностными антигенами обычных ТК человека, за исключением отсутствия на клетках НМС-1 рецепторов к IgE (Butterfield et al., 1988;

Li et al., 1995). Их культивировали в среде Iscove с необходимыми добавками.

Фибробласты (Фб) кожи человека культивировали в среде DMEM с добавле нием 10 % ЭТС, L-глутамина и гентамицина. Линия клеток THP-1, выделенная от пациента с промоноцитарной лейкемией, получена от проф. M. De Ley (Университет г.

Левена, Бельгия). Клетки экспрессируют 2-интегрины (Hmama et al., 1999;

Ronald et al., 2001), рецептор фракталкина (Umehara et al., 2001;

Ronald et al., 2001), рецептор ламинина, Fc-рецепторы, молекулы главного комплекса гистосовместимости II класса (Montuori et al., 1999).

Клеточная линия U-937, выделенная от больного гистиоцитарной лимфомой в период бластного криза, получена из Института цитологии РАН (Санкт-Петербург).

Экспрессирует маркеры, характерные для моноцитов. Способна дифференцироваться в макрофаги (Старикова Э.А., 2006).

EA.hy926 — линия клеток эндотелия человека, полученная гибридизацией кле ток эндотелия пупочной вены (HUVEC) c клетками карциномы легкого человека А 549 (Edjell et al., 1983), предоставлена Dr. Cora-Jean C. Edgell (Университет Северной Калифорнии, США). По морфологии, фенотипу и функциям сходна с нормальными эндотелиальными клетками человека: спонтанно экспрессирует фактор фон Вилле бранда, ингибитор активатора плазминогена (PAI-1), тканевой фактор и тромбомоду лин. После активации клетки экспрессируют адгезионные молекулы (Е-селектин, ICAM-1 и VCAM-1) и хемокины IL-8 и МСР-1 (Mutin et al., 1998).

Линия клеток карциномы толстого кишечника человека COLO320HSR по лучена из Института цитологии РАН (Санкт-Петербург): не экспрессирует CD64 и CD32 (Орлов и др., 2002). Использована для сравнения.

Все клеточные культуры инкубировали при 37 С в атмосфере с 5 % СО2 и 100 % влажностью. Отсутствие инфицированности контролировалось. Во всех экспе риментах жизнеспособность клеток составляла не менее 98 %.

Проточную цитометрию использовали для оценки экпрессии клетками по верхностных молекул (цитофлюориметры Navios или Epics Altra Cell Sorter, Beckman Coulter) с использованием меченых флюорохромами антител. Для каждого из мо ноклональных антител использовали изотипические контроли. Окраску поверхност ных антигенов антителами производили в соответствии с инструкциями производите ля.

Степень активации тучных клеток оценивали по выбросу гистамина методом Шора (Shore P.A., 1959) после инкубации ТК с тем или иным препартом в течение мин при 37 С. Концентрацию гистамина в надосадочной жидкости определяли по флюоресценции продукта конденсации гистамина с ортофталевым альдегидом при 350/460 нм с помощью Fluoroscan Accent FL (ThermoFisher Scientific).

Оценка адгезии клеток друг к другу. Для оценки интенсивности адгезии сус пензионных клеток (НМС-1, ТНР-1 и U-937) их предварительно метили флуоресцент ным витальным красителем сукциниловым эфиром карбоксифлюоресцеина и добавля ли к конфлюэнтному монослою адгезионной культуры (Фб или EA.hy926). После от мывки монослоя число прикрепившихся клеток оценивали по яркости флюоресценции при помощи спектрофлюориметра Fluoroscan Accent (480/535 нм). Флюоресценция линейно зависела от числа прикрепившихся клеток. При изучении влияния индукто ров на адгезию, стимуляцию клеток индукторами производили в течение суток.

Связывание меченого биотином CRP c ТК линии НМС-1 оценивали проточ ной цитометрией по флюоресценции, с помощью стрептавидина, меченого аллофико цианином (APC). В экспериментах по конкуренции одновременно с меченым биоти ном CRP к клеткам добавляли немеченный CRP или агрегированный IgG человека (aIgG, полученный нагреванием раствора IgG при 63 °С в течение 10 мин.), или анти тела к Fc-рецепторам в различных концентрациях.

Трансфекцию клеток НМС-1 и COLO320HSR проводили двумя плазмидами:

1) плазмидой pNF-Bluc, содержащей ген люциферазы (luc) с промотором, содержа щим пять цис-сайтов для белков NF-B;

2) плазмидой pCMVL с геном галактозидазы под промотором цитомегаловируса (CMV) человека. Клетки активи ровали исследуемыми веществами через сутки после трансфекции, ответ оценивали по активности люциферазы или -галактозидазы.

Статистическую обработку данных проводили с помощью программы Mi crosoft Excel. Результаты цитометрического учета анализировали при помощи пакетов программ Kaluza («Beckman Coulter Inc.», США). Различия между независимыми группами нормально распределённых данных оценивали с помощью парного t критерия Стьюдента и считали статистически достоверными при p0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Исследование экспрессии Fc-рецепторов клетками исследуемых линий. Ре зультаты показали, что ТК линии НМС-1 экспрессируют Fc-рецепторы II типа — CD32. В меньшей степени на поверхности ТК представлены высокоаффинные Fc рецепторы I типа — CD64. Низкоаффинные Fc-рецепторы III типа (CD16) на ТК ли нии НМС-1 отсутствуют (рис. 1).

Под действием IFN на ТК клетках линии НМС-1 усиливалась экспрессия CD с максимумом через 24 ч. На экспрессию низкоаффинных рецепторов клетками НМС 1 стимуляция IFN не влияла (рис. 2).

а. б. в.

СD32 HMC- Рис. 1. Экспрессия клетками линии НМС-1 Fc-рецепторов II типа (CD32).

а. экспрессия CD16 клетками HMC-1;

б. экспрессия CD32 клетками U-937;

в.

экспрессия CD64 клетками EA.hy926. Серым цветом обозначен уровень связывания клеток с антителами изотипического контроля, черным — связывания антител против Fc-рецепторов II типа. По оси абсцисс уровень флюоресценции, в RFU (относитель ных единицах флуоресценции), по оси ординат — процент от общего числа проанали зированных клеток.

В результате наших экспериментов по изучению экспрессии Fc-рецепторов клетками исследуемых линий мы получили следующие данные (табл. 1).

Как известно из литературы, интактные ТК человека, полученные культивиро ванием CD34+-клеток, выделенных из крови, несут на себе главным образом CD32, а в цитоплазме содержат следовые количества мРНК CD64 (FcRI) и CD16 (FcRIII). При стимуляции IFN они начинали экспрессировать высокоаффинный Fc-рецептор I ти па (FcRI, CD64), хотя экспрессия низкоаффинных рецепторов при этом не усилива лась (Okayama et al., 2000).

а. б. в.

Рис. 2. Влияние IFN на экспрессию Fc-рецепторов клетками НМС-1.

а. Экспрессия FcRIII (CD16);

б. Экспрессия FcRII (CD32);

в. Экспрессия FcRI (CD64). Серым цветом обозначено связывание антител против соответствующих Fc рецепторов с интактными клетками, черным — с клетками, активированными IFN.

По оси абсцисс – уровень флюоресценции (RFU), по оси ординат — процент от обще го числа проанализированных клеток.

Таблица Экспрессия исследуемыми клеточными линиями Fc-рецепторов Линия клеток FcRIII(CD16) FcRII (CD32) FcRI (CD64) НМС-1 – +++ + ТНР-1 – ++ ± U-937 – ++ ± EA.hy926 – + – Фибробласты – – – COLO320HSR – –* –* Примечание. * — Орлов и др., 2002;

Issakov et al., 2002.

Нами показано, что интактные ТК линии НМС-1 несут на себе не только CD32, но и небольшое количество CD64, причем при стимуляции IFN экспрессия CD также усиливается (табл. 1).

Из литературы известно, что ТК кожи и легких человека экспрессируют только CD32a (активационный) (Zhao et al., 2006), тогда как ингибирующий рецептор CD32b, возможно, отсутствует на ТК человека, в отличие от базофилов крови. На ТК мышей, напротив, CD32b экспрессируется, причем воздействие на него лиганда генерирует ингибиторный сигнал, в результате чего ингибируется ответ ТК и на агрегацию FcRI (высокоаффинного рецептора для IgE) (Daeron et al., 1995). В некоторых работах пока зано, что FcR II типа (CD32) – единственный Fc-рецептор, который экспрессируют ТК линии НМС-1 (Wedi et al., 1996).

Связывание С-реактивного белка с тучными клетками линии НМС-1.

Наши данные показали, что CRP взаимодействует с ТК. Разрешающая способность проточной цитометрии при использовании аллофикоцианина в качестве флюоресци рующего агента позволяла регистрировать связывания CRP с клетками, начиная с концентрации 10 мкг/мл (рис. 3). Результаты опытов по конкуренции за связывание с ТК HMC-1 биотинилированного и немеченого CRP свидетельствуют о специфичности связывания CRP (рис. 3а). Одновременная инкубация ТК линии НМС-1 с биотинили рованным CRP и aIgG также приводила к зависимому от концентрации aIgG сниже нию флюоресценции клеток (рис. 3б). Антитела к FcR также снижали связывание CRP с клетками НМС-1 (рис. 3в).

а. б. в.

Рис. 3. Оценка специфичности связывания CRP с тучными клетками НМС-1.

Ингибиция связывания меченого биотином CRP возрастающими концентрациями не меченного CRP (а) и агрегированного IgG человека (б), а также моноклональными ан тителами к Fc-рецепторам I (CD64) и II типа (CD32).

По оси абсцисс — концентрация немеченого CRP (а) или аIgG (б), мкг/мл;

наименование антител (в): К – изотипический контроль, CD64 и CD32 – антитела к со ответствующим рецепторам. По оси ординат — уровень флюоресценции клеток, RFU (условные единицы интенсивности флуоресценции).

Как показали наши данные, CRP в концентрациях от 0,03 до 30 мкг/мл не влиял на выход гистамина из клеток НМС-1.

Иная картина наблюдалась при изучении влияния CRP на выброс гистамина из ТК НМС-1, стимулированных IFN. В исследованных концентрациях CRP наблюда лось увеличение выхода гистамина по сравнению с контролем (рис. 4).

Из литературы известно, что стимуляция ТК человека через FcRII IgG не при водит к дегрануляции и не влияет на ответ ТК на анти-IgE (Wedi et al., 1996;

Guo et al., 1992;

Okayama et al., 2001). В то же время, есть данные и о стимулирующем действии агрегированного IgG и CRP на ТК человека линии HMC-1. Так, в исследовании А.П.

Прониной оба лиганда индуцировали дегрануляцию клеток HMC-1 и выход гистами на, при этом эффект CRP был, хотя и умеренным по интенсивности, но достоверным, тогда как эффект aIgG – достаточно выраженным (Пронина, 2011). На ТК клетках мышей также показана дегрануляция при стимуляции FcRII IgG.

Рис. 4. Влияниие CRP на выход гистамина из тучных клеток НМС-1. Зависи мость от IFN Клетки НМС-1 инкубировали 24 ч с 15 нг/мл IFN (столбцы серого цвета) или без IFN (белые столбцы), после чего стимулировали CRP в указанных концентрациях.

По оси абсцисс: К – ЗФР (негативный контроль), 48/80 – соединение 48/80 (20 мкг/мл;

позитивный контроль), цифры — концентрация CRP (мкг/мл). По оси ординат — ин декс стимуляции (отношение выхода гистамина к негативному контролю). Уровень спонтанного выхода гистамина, без обработки IFN составлял 0,2200,01, после обра ботки IFN – 0,1950,02 (p0,05). Достоверность различий с контролем (К): * — p0,05, ** — p0,01, *** — p0,001.

Т.о., в норме FcRII является единственным рецептором к иммуноглобулину IgG на ТК человека, причем стимуляция ТК IgG либо совсем не вызывает дегрануляции, либо вызывает её в малой степени. В то же время показано, что после стимуляции IFN ТК начинают экспрессировать на своей поверхности FcRI и приобретают спо собность отвечать на IgG (Woolhiser et al., 2001).

Наши данные не противоречат этому. Так, интактные клетки НМС-1 не отвеча ли на добавление в среду CRP достоверным выходом гистамина. Но если ТК были предварительно активированы IFN, это приводило не только к повышению экспрес сии высокоаффинных рецепторов FcRI на их поверхности), но и к выходу гистамина в ответ на стимуляцию CRP. По данным литературы, концентрация aIgG, при которой степень дегрануляции ТК максимальна, — 1 мкг/мл (Woolhiser et al., 2004). В наших экспериментах, наибольший выход гистамина наблюдался при стимуляции CRP в концентрации 3 мкг/мл, то есть при концентрации CRP того же порядка.

Влияние С-реактивного белка на адгезию тучных клеток линии HMC-1 к фибробластам. Результаты наших исследований показали, что при увеличении про должительности совместной инкубации тучных клеток и фибробластов (в пределах от 20 до 50 мин) адгезия ТК к Фб возрастала. При совместной инкубации ТК и Фб добав ление в среду 50 мкг/мл CRP приводило к дополнительному увеличению интенсивно сти адгезии. При 30-минутной совместной инкубации клеток в присутствии CRP раз личие с адгезией контрольных клеток было максимальным (рис. 5).

1, К Рис. 5. Адгезия тучных клеток CRP линии НМС-1 к фибробластам 0, при культивировании смеси RFU 0, клеток в присутствии С 0, реактивного белка. Зависи 0, *** * *** * мость от времени 20 минут 30 минут 40 минут 50 минут Белые столбики — спонтанная адгезия тучных клеток к Фб. Серые — адгезия в при сутствии CRP, 50 мкг/мл. Достоверность различий с контролем: * — p0,05, *** — p0,001.

Влияние лигандов Fc-рецепторов (С-реактивного белка, агрегированного IgG) на адгезивность тучных клеток НМС-1. Наши опыты показали (рис. 6), что 24 часовая стимуляция тучных клеток CRP приводит к достоверному и дозозависимому увеличению адгезии тучных клеток к монослою интактных фибробластов. Стимуля ция aIgG также приводила к более интенсивной адгезии тучных клеток линии HMC- к фибробластам.

Рис. 6. Адгезия активированных тучных клеток НМС-1 к интактным фиб робластам.

По оси абсцисс — активаторы туч ных клеток и их концентрация, по оси ординат — индекс стимуляции. Различия с контролем достоверны: ** — p0,01;

*** — p0,001.

Из литературных данных известно, что для С-реактивного белка характерно проявление провоспалительной активности [Назаров, 2001], в частности известно, что он усиливает моноцитарно-эндотелиальную адгезию, увеличивает уровень экспрессии молекул межклеточной адгезии ICAM-1 и VCAM-1 на эндотелиальных клетках [Devaraj et al., 2008]. Кроме того, показано, что агрегация Fc-рецепторов на поверхно сти мышиных тучных клеток приводит к усилению их адгезии к фибронектину [Dastych et al., 1997].

Влияние С-реактивного белка на адгезивность фибробластов для тучных клеток линии НМС-1. Несмотря на отсутствие на фибробластах Fc-рецепторов (табл.

1, раздел «Экспрессия Fc-рецепторов на фибробластах»), прединкубация монослоя Фб с различными концентрациями CRP приводила к дозозависимому увеличению сте пени адгезии к ним интактных ТК линии НМС-1 (рис. 7а).

В отличие от эффекта CRP, после инкубации монослоя Фб с aIgG в концентра циях 10 и 50 мкг/мл достоверного увеличения степени адгезии к ним ТК не происхо дило (p0,05) (рис. 7б). Другой пентраксин, сывороточный Р-компонент амилоида (SAP), который, как известно из литературы, также связывается с FcR, в концентра ции 30 мкг/мл, также оказывал стимулирующее действие на Фб и вызывал увеличение адгезии на 40 % по сравнению с контролем (рис. 7б).

Как показали наши опыты, при стимуляции фибробластов С-реактивным белком все же происходит некоторое усиление адгезии к ним тучных клеток (рис. 7а) несмот ря на отсутствие на фибробластах рецепторов к CRP (то есть Fc-рецепторов). Как из вестно, растущие в культуре фибробласты продуцируют белки матрикса, в том числе фибронектин и ламинин, с которыми на молекуле CRP имеются сайты связывания (Salonen et al., 1984). На обратной же стороне молекулы CRP находятся сайты связы вания с Fc-рецепторами (Marnell et al., 2005).

а. б.

1,35 1, 1, 1, 1, 1,15 1, 1, 1, 1, * *** 0,95 *** 0, 0,85 0, 0, 0, K aIgG, 10 aIgG, 50 SAP, K CRP, 5 CRP, 10 CRP, мкг/мл мкг/мл мкг/мл мкг/мл мкг/мл мкг/мл Рис. 7. Адгезия тучных клеток линии НМС-1 к фибробластам, обработанным CRP, aIgG или сывороточным Р-компонентом амилоида.

По оси ординат — индекс стимуляции. Различия с контролем достоверны:

* — p0,05, *** —p0,001.

В связи с этим мы предположили, что в случае прединкубации фибробластов с CRP этот пентраксин может способствовать их адгезии с ТК не прямо, т.е. не путем непосредственного связывания с Фб и их активации, а косвенно — связываясь с ком понентами межклеточного матрикса (фибронектином и другими белками). Когда же происходит добавление ТК, то они в свою очередь связываются своими FcR с CRP, ассоциированным с матриксом, и таким образом происходит усиление адгезии.

Для проверки данного предположения был произведен следующий эксперимент.

Мы произвели обработку монослоя Фб CRP в концентрации 50 мкг/мл. На следующий день произвели отмывку Фб для удаления несвязавшегося белка. ТК перед добавлени ем к фибробластам обработали Fc-фрагментами IgG человека, чтобы «блокировать» на них FcR. Контролем служили необработанные ТК. После отмывки от несвязавшегося Fc-фрагментов ТК добавили к Фб.

Адгезия ТК с заблокированными FcR не отличалась от контроля, то есть от ад гезии ТК с интактным Фб, не обработанным CRP, и была достоверно ниже адгезии ТК, не обработанных Fc-фрагментами (рис. 9). Т.о., было подтверждено предположе ние, что С-реактивный белок не активизирует фибробласты, а является якорем для тучных клеток в матриксе соединительной ткани.

K Fc Рис. 9. Адгезия тучных клеток линии НМС 1 к фибробластам, активированным CRP.

## ** * ** Роль Fc-рецепторов клеток НМС- К CRP T NF Из наших данных видно, что CRP и aIgG, действуя через одни и те же рецепто ры — FcR I и II типов (Crowell et al., 1991;

Bharadwaj et al., 1999), вызывают у клеток однонаправленный ответ (табл. 2). Также стоит отметить, что для CD32 (FcR II) в большей степени характерно взаимодействие с IgG в виде иммунных комплексов (Gessner et al., 1998), нежели с отдельными молекулами IgG. Результаты наших экспе риментов также показали стимулирующее влияние aIgG на адгезию клеток. Т.о., мож но сделать заключение, что активация FcRII приводит к запуску сигнального каскада, результатом которого является активация генов, отвечающих за адгезию клеток друг к другу или к белкам матрикса соединительной ткани. Подобное действие CRP, в част ности, было показано на эндотелиальных клетках, выделенных из аорты (D. Bharadwaj et al, 1999). Кроме того, авторы показали, что при выключении гена CD32 при помощи siRNA происходит снижение адгезивных свойств клеток эндотелия относительно ин тактных клеток, обработанных CRP. Такого же эффекта авторы достигали при добав лении в среду к эндотелиальным клеткам блокирующих антител против CD32.

Для проверки активации NF-B-сигнального пути при действии на ТК CRP, мы трасфецировали ТК плазмидой, содержащей ген люциферазы под промотором, содер жащим сайты связывания с белками NF-B. Т.о., при активации белков NF-B в клет ках начинала накапливаться люцифераза, активность которой можно измерить при помощи люминометра. Наши данные показали, что ТК НМС-1, трансфецированные Таблица Влияние С-реактивного белка и агрегированного IgG на адгезию клеток исследуемых линий (степень усиления по сравнению с контролем, %) Взаимодействующие Препарат клетки Обработаны Не обрабо- CRP аIgG t p ±m лигандом таны % n % n FcR НМС-1 Фб 18 14 4±8 0,5 0, 54±7 58± EA.hy926 НМС-1 87 66 40±16 2,5 0, 83±11 43± EA.hy926 ТНР-1 66 50 122±35 3,5 0, 78±14 200± U-937 Фб 30 30 30±8 3,75 0, 26±4 56± Примечание. CRP и aIgG использованы в концентрации 50 мкг/мл. Контроль – уровень адгезии при использовании соответствующей пары необработанных клеток.

плазмидой pNF-Bluc, реагировали на стимуляцию CRP синтезом люциферазы: лю минесценция в клетках, стимулированных CRP, увеличивалась на 40 % по сравнению с контрольными.

В контрольных опытах клетки COLO320HSR, не экспрессирующие на своей по верхности Fc-рецепторы, не реагировали на добавление в среду CRP или aIgG ни при одной из исследованных концентраций.

ВЫВОДЫ 1. На тучных клетках НМС-1, моноцитоподобных клетках ТНР-1 и U-937, на эндоте лиальных клетках EA.hy926 экспрессируются Fc-рецепторы второго типа к IgG (FcRII, CD32). Экспрессия высокоаффинных Fc-рецепторов первого типа (FcRI, CD64) на тучных клетках усиливается под влиянием IFN. На фибробластах и клетках карциномы толстой кишки COLO320HSR Fc-рецепторы не экспрессируются.

2. Низкоаффинные Fc-рецепторы к иммуноглобулину класса IgG (FcRII) служат ре цепторами для C-реактивного белка на эндотелиальных клетках EA.hy926 и на тучных клетках НМС-1.

3. Интактные тучные клетки линии НМС-1 не отвечают на стимуляцию C-реактивным белком выходом гистамина. Способность к дегрануляции и выбросу гистамина в ответ на C-реактивный белок требует экспрессии высокоаффинных рецепторов FcRI и наблюдается после активации IFN.

4. С-реактивный белок и другие лиганды Fc-рецепторов – агрегированный IgG и сы вороточный Р-компонент амилоида усиливают адгезию клеток дуг к другу: стимули руют адгезию тучных клеток и моноцитов к фибробластам, усиливают адгезивные свойства эндотелиальных клеток для тучных клеток и моноцитов, повышают адгезив ность фибробластов.

5. При действии С-реактивного белка на клетки, несущие FcRII, происходит актива ция NF-B-сигнального пути.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи (в т.ч. опубликованные в изданиях, рекомендованных ВАК РФ):

1. Trulioff, A.S. C-reactive protein: Fc-gamma receptormediated effects on human peripher al blood basophils in vitro / P.G. Nazarov, A.P. Pronina, A.S. Trulioff // C-Reactive Pro tein: New Research / Ed. S. Nagasawa. – New York: Nova Science Publishers, 2009. – Р.

147–169.

2. Трулёв, А.С. Факторы острой фазы воспаления как модуляторы взаимодействия тучных клеток и фибробластов / А.С. Трулёв, И.В. Кудрявцев, П.Г. Назаров // Бюлл. Восточно-Сибирск. Научн. Центра СО РАМН. – 2012. – № 3 (85). – Ч. 2. – С.

319–322.

3. Трулев, А.С. Влияние факторов острой фазы воспаления на взаимодействие тучных клеток с соединительной тканью. Взаимодействие тучных клеток человека линии HMC-1 с фибробластами / А.С. Трулев, Н.А. Иванова, П.Г. Назаров // Росс. аллер гол. журн. – 2012. – № 1. – Вып. 1. – С. 313–315.

4. Trulioff, A.S. C-reactive protein: Fc receptor-mediated effects on human peripheral blood basophils / P.G. Nazarov, A.P. Pronina, A.S. Trulioff // Basophil Granulocytes / Ed. P.K.

Vellis. – New York: Nova Science Publishers, 2009. – Р. 95–121.

5. Трулев А.С. Базофилы человека: регрануляция и повторная активация в культуре in vitro / А. С. Трулев, П.Г. Назаров // Астраханск. мед. журн. – 2008. – № 3. – С. 135 137.

Тезисы:

6. Трулев, А.С. Индукция программируемой клеточной гибели мономерной формой С реактивного белка / А.А. Бутюгов, А.С. Трулев, П.Г. Назаров // Rus. J. Immunol. – 2004. – Vol. 9. – N 1. – Р. 290.

7. Трулев, А.С. Пентраксины, пептиды, противовоспалительные средства / П.Г. Наза ров, А.А. Бутюгов, А.П. Пронина, А.С. Трулев // Russ. J. Immunol. – 2006. – Vol. 9. – Suppl. 3. – С. 129.

8. Трулев, А.С. Пентраксины и нейромедиаторы / П.Г. Назаров, Г.И. Нежинская, А.А.

Бутюгов, А.С. Трулев // Мед. иммунол. – 2006. – Т. 8. – № 2-3. – С. 161.

9. Trulioff, A.S. Cholinergic regulation of anaphylaxis. The parasympathetic and autono mous mechanisms / P.G. Nazarov, A.P. Pronina, A.S. Trulioff // Abstr. Int. Symp. «Inter action of the Nervous and Immune Systems in Health and Disease». – 2007. – P. 54-55.

10. Трулев, А.С. Активация пентраксинами фактора NF-kB в клетках COLO320HSR, лишенных Fc-рецепторов / А.С. Трулев, С.В. Орлов, А.П. Перевозчиков, П.Г.

Назаров // Мед. иммунол. – 2007. – Т. 9, № 2-3. – С. 166–167.

11. Трулев, А.С. Fc gammaR-независимая активация фактора NF-kB пентраксином / А.С. Трулев, С.В. Орлов, А.П. Перевозчиков, П.Г. Назаров // Росс. аллергол. журн.

– 2007. – № 3, прилож. 1. – С. 36.

12. Trulioff, A.S. Fc gammaR-independent NF-kB activation by a pentraxin / A.S. Trulioff, S.V. Orlov, A.P. Perevozchikov, P.G. Nazarov // Abstr. 8th John Humphrey advanced summer programme in immunology. Immunology and viral infection. Moscow, Sept. 10 14, 2007. – P. 58.

13. Трулев, А.С. Активация базофилов крови лигандами Fc-рецепторов и ее холинер гическая модуляция / А.П. Пронина, П.Г. Назаров, А.С. Трулев // Сибирск. мед.

журн. –2008. – Т. 23. – № 3. – Вып. 1. – С. 108.

14. Trulioff, A.S. Activation of human blood basophils by Fc gamma receptor-specific lig ands and its cholinergic modulation / P.G. Nazarov, A.P. Pronina, A.S. Trulioff // Asian J. Pharmacodyn. Pharmacokin. – 2008. – Vol. 8. – № 3. – Р. 184.

15. Трулев, А.С. Роль Fc gamma-рецепторов в реализации биологического действия пентраксинов на клетки нелимфоидного происхождения / А.С. Трулев, С.В. Орлов, А.П. Перевозчиков, П.Г. Назаров // Росс. аллергол. журн. – 2008. – №1, прил.1. – С.295-296.

16. Трулев, А.С. Способность базофилов крови человека к повторной дегрануляции и выбросу гистамина / А.С. Трулев, П.Г. Назаров // Цитокины и воспаление. – 2008. – Т. 7. – № 3. – С. 67-68.

17. Трулев, А.С. Новые данные о роли Fc-рецепторов в физиологии базофилов чело века / П.Г. Назаров, А.П. Пронина, А.С.Трулев // Аллергол. иммунол. – 2008. – Т. 9.

– № 4. – С. 486-487.

18. Trulioff, A.S. A role of cholinergic system of blood basophilic leukocytes in regulation of spontaneous and Fc-gamma-receptor-induced histamine release / P.G. Nazarov, A.P.

Pronina, A.S. Trulioff [et al.] // Abstr. 2nd Int. symp. ”Interaction of the nervous and im mune systems in health and disease”, June 16 - 19 2009. St. Petersburg, 2009. – Р. 42-43.

19. Трулев, А.С. Пентраксины в защитных реакциях и процессах иммунорегуляции / П.Г. Назаров, А.П. Пронина, А.С. Трулев, [и др.] // Мед. иммунол. – 2009. – Т. 11, № 4. – С. 326-327.

20. Трулев, А.С. Сравнительный анализ влияния С-реактивного белка и агрегирован ного IgG на адгезивность клеток эндотелия для моноцитов / А.С. Трулев, П.Г.

Назаров // Вестн. Уральск. акад. мед. науки. – 2010. – 2/1 (29). – С. 212.

21. Трулев, А.С. Связывание C-реактивного белка с эндотелиальными клетками EA.hy 926 / А.С. Трулев, П.Г. Назаров // Мед. иммунол. – 2011. – Т. 13. – № 4-5. – С. 337 338.

22. Трулёв, А.С. Автономная холинергическая система: пермиссивная роль в регуля ции рецепторных функций тучных клеток / П.Г. Назаров, Н.А. Иванова, А.С. Тру лёв [и др.] // Росс. аллергол. жур. – 2013. – № 2. – ч. 2. – С. 207-208.

23. Trulioff, A.S. Autonomous cholinergic system of mast cells: a role in the modulation of cell-cell contacts / P.G. Nazarov, N.A. Ivanova, A.S. Trulioff // «Взаимодействие нерв ной и иммунной систем в норме и патологии»: Тезисы IV Международного симпо зиума. Санкт-Петербург, 18 июня – 21 июня 2013 г. – С. 125-126.



 

Похожие работы:





 
2013 www.netess.ru - «Бесплатная библиотека авторефератов кандидатских и докторских диссертаций»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.