Особенности модифицирующего действия гепарина на эффекты пчелиного яда и наркотических средств
На правах рукописи
Слободянюк Владимир Сергеевич ОСОБЕННОСТИ МОДИФИЦИРУЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ГЕПАРИНА НА ЭФФЕКТЫ ПЧЕЛИНОГО ЯДА И НАРКОТИЧЕСКИХ СРЕДСТВ 03.03.01 – физиология 03.01.04 – биохимия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Нижний Новгород 2011
Работа выполнена на кафедре физиологии и биохимии человека и животных Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Хомутов Александр Евгеньевич доктор биологических наук Малиновская Светлана Львовна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук Романова Елена Борисовна доктор медицинских наук, профессор Смирнов Владимир Павлович
Ведущая организация: Нижегородский государственный педагогический университет
Защита состоится « 22 » декабря 2011 г. в 15 часов на заседании дис сертационного совета Д.212.166.15 Нижегородского государственного уни верситета им. Н.И. Лобачевского по адресу: 603950, Нижний Новгород, пр.
Гагарина, д. 23, корп. 1, биологический факультет.
Факс: (8312) 465-82-
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Нижегородского гос ударственного университета им. Н.И. Лобачевского Автореферат разослан « » 2011 г.
Учный секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук, доцент С.В. Копылова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Проблема регуляции болевой чувствительно сти является одной из сложнейших для фундаментальной физиологии и чрез вычайно важной для практической медицины. Большое значение придается поискам путей целенаправленного изменения болевых и противоболевых ме ханизмов, что невозможно без углубленного изучения процессов, контроли рующих интенсивность реакций организма на болевой стимул (Военнов, Бо яринов, 2006;
Бакарева и др., 2009;
Бабаев и др., 2010). Для решения данной задачи в качестве регуляторов необходимо рассмотреть эндогенные физиоло гически активные вещества, которые контролируют внутреннюю среду орга низма, снижая патогенное воздействие экзогенных веществ, используемых для анальгезии, а также, влияют на проявление свойств данных средств. Рас крытие данных механизмов может быть с успехом использовано для разра ботки новых эффективных и рациональных средств обезболивания (Брагин, 1991;
Liang et al., 2008;
Gandhi, Mancera, 2009) По современным представлениям одним из эндогенных регуляторов, способных нивелировать патогенное действие различного рода токсинов, яв ляется гепарин. Литературные данные, касающиеся свойств гепарина, указы вают на возможность его участия в биохимических и физиологических меха низмах защиты организма при воздействии токсических соединений. Гепа рин нашел широкое применение в физиологии и медицине благодаря своим антикоагуляционным свойствам (Кудряшов, 1975;
Ляпина и др., 1999). Кроме того, исследования последних лет показали, что он является универсальным регулятором функций организма и играет существенную роль в поддержании гомеостаза. Помимо антикоагуляционной активности гепарин обладает цито статическим (Mishra-Gorur, Castellot, 1999), бактериостатическим (Gori et al., 1999), антилипемическим (Hakala et al., 1999), радиопротективным (Лукашин, Софронов, 1996) действием, выявлены антиаллергический (Rice et al., 1998;
Lever, Page, 2002) и гипотензивный (Litorowicz et al., 1998;
Coombe, Kett, 2005) его эффекты. Сравнительно недавно была показана способность гепа рина связывать и инактивировать природные токсины, входящие в состав пчелиного яда и некоторых змеиных ядов (Хомутов, Пурсанов, 2011), а также взаимодействовать с некоторыми фармакологическими веществами (Хому тов и др., 1998;
Пурсанов и др., 2009). Исследования последних лет направ лены на изучение центрального действия этого биополимера, его влияния на формирование поведения и память (Кондашевская и др., 2000;
Никольская, Кондашевская, 2001).
Большинство биологических эффектов гепарина обусловлено его взаи модействием с мембранами клеток или образованием комплексов с фермен тами или регуляторными соединениями. В результате гепарин принимает участие во многих процессах метаболизма в организме (Chen, Van der Meer, 1994;
Liang et al., 2008).
Цель исследования: изучение и сравнительная характеристика селек тивного действия экзогенного и эндогенного гепарина на токсические, седа тивные, гиподинамические, антиноцицептивные и биохимические показатели пчелиного яда, этанола и фармацевтических препаратов, используемых для наркоза.
Задачи исследования:
1. Изучить влияние гепарина на токсическое, седативное, гиподинамиче ское действие пчелиного яда, этанола, аминазина, димедрола и дроперидола.
2. Исследовать влияние гепарина на антиноцицептивные свойства пче линого яда, дроперидола, фентанила и аминазана.
3. Провести сравнительный анализ интрафеморального и интрапорталь ного введений пчелиного яда и этанола в условиях гипер- и гипогепарине мии.
4. Провести оценку эффективности внутривенного и внутриартериально го введений пчелиного яда и этанола.
5. Исследовать активность аминотрансфераз при действии гепарина, пчелиного яда и этанола, а также их совместного введения.
6. Изучить особенности изменения оптической плотности и спектров по глощения в УФ области смеси гепарина с пчелиным ядом, мелиттином, фос фолипазой А2, дроперидолом, фентанилом, оксибутиратом натрия (ГОМК), аминазином, димедролом.
Научная новизна работы. Впервые проведена комплексная оценка се лективного действия гепарина на токсические, седативные, гиподинамиче ские, антиноцицептивные свойства пчелиного яда и наркотических средств.
Установлено, что экзогенный гепарин снижает токсические свойства пчели ного яда, этанола, аминазина, снижает продолжительность сна, вызванного этанолом, аминазином, оксибутиратом натрия, снижает гиподинамическое действие этанола и аминазина, снижает антиноцицептивные свойства пчели ного яда, дроперидола и аминазина. Гепарин не влияет на седативные и анальгетические свойства димедрола и фентанила.
Показано, что токсические свойства пчелиного яда и этанола снижаются при введении в портальную вену по сравнению с внутрифеморальной с инъ екцией. Кроме того, внутриартериальное введение пчелиного яда и этанола менее эффективно с точки зрения интоксикации, чем внутривенная инъек ция.
Впервые установлено, что экзогенный гепарин в зависимости от дозы разнонаправленно влияет на активность аланинаминотрансферазы (АлАТ) и аспартатаминотрансферазы (АсАТ). В дозе 50 МЕ/кг он снижает активность АлАТ и АсАТ, а в высоких дозах (3000 – 5000 МЕ/кг) - достоверно повыша ет. Пчелиный яд и этанол повышают активность АлАТ и АсАТ в перифери ческой крови крыс. Пчелиный яд на фоне действия гепарина потенцирует ак тивность АлАТ и АсАТ. Этанол в зависимости от дозы и способа введения с гепарином увеличивает или уменьшает активность АлАТ и АсАТ относи тельно контрольных величин.
Впервые in vitro, с помощью методов фотоэлектроколориметрии и реги страции спектров поглощения в УФ области, установлено, что пчелиный яд, мелиттин, этанол, дроперидол, оксибутират натрия, аминазин взаимодей ствуют с гепарином в стехиометрических весовых соотношениях, индивиду альных для каждого из исследуемых веществ. Фентанил, димедрол и фосфо липаза А2 с гепарином не взаимодействуют.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные дан ные о модифицирующем действии гепарина на эффекты пчелиного яда и наркотических средств в значительной мере расширяют представления о ро ли эндогенного гепарина в реализации детоксицирующей функции организ ма.
Фундаментальное значение для понимания процессов гомеостаза имеют исследования эндогенных регуляторов, к которым относится гепарин, обла дающих возможностями взаимодействия с широким кругом как метаболиче ских, так и экзогенных соединений.
Результаты работы внедрены в учебный процесс кафедры физиологии и биохимии человека и животных Нижегородского государственного универ ситета им. Н.И. Лобачевского и используются при чтении спецкурса «Неспе цифическая регуляция функций» Положения, выносимые на защиту:
1. Гепарин снижает токсические, седативные, гиподинамические и анти ноцицептивные свойства пчелиного яда, этанола, аминазина, оксибутирата натрия, дроперидола. Гепарин не влияет на седативные и анальгетические свойства димедрола и фентанила.
2. Протамин сульфат потенцирует токсические, седативные, гиподина мические и антиноцицептивные свойства пчелиного яда, этанола, аминазина, оксибутирата натрия, дроперидола. Протамин сульфат не влияет на седатив ные и анальгетические свойства димедрола и фентанила.
3. Интрапортальное и внутриартериальное введение пчелиного яда и этанола менее эффективно, чем интрафеморальное введение.
4. Гепарин в низких дозах (50 МЕ/кг) снижает активность АлАТ и АсАТ, а в высоких дозах понижает активность АлАТ и АсАТ. Пчелиный яд и этанол на фоне действия гепарина в зависимости от дозы и способа введения увели чивают или уменьшают активность АлАТ и АсАТ.
5. Гепарин изменяет оптическую плотность и спектры поглощения в УФ области растворов пчелиного яда, мелиттина, этанола, аминазина, дропери дола, оксибутирата натрия. Гепарин не влияет на оптическую плотность и спектры поглощения в УФ области растворов фосфолипазы А2, димедрола и фентанила.
Апробация работы. Основные положения работы были доложены и об суждены: на научно-производственной конференции «Апитерапия сегодня» (Рыбное, 2006), на XIV Всероссийской конференции «Успехи апитерапии» (Рыбное 2009), на Ш Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2010» (Н. Новгород, 2010), на Международной конференции «Пчеловодство – XXI век» (Москва, 2010), на 16 Всероссийской конференции «Успехи апитерапии» (Ярославль, 2011).По материалам диссертации опубликовано 12 научных статей, 6 из ко торых в изданиях, рекомендованных ВАК.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 169 стра ницах и состоит из введения, 2 глав обзора литературы, материалов и мето дов исследования, 5 глав собственных исследований, выводов, библиографи ческого указателя, приложения. Список цитируемой литературы содержит 272 источника, из которых 132 на русском и 140 на иностранных языках.
Диссертация иллюстрирована 18 таблицами и 41 рисунком.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Эксперименты были проведены на 380 белых лабораторных нелинейных крысах-самцах массой 180 – 200 г и 180 белых мышах массой 18 – 20 г, со держащихся на стандартном рационе вивария.
В работе были использованы следующие вещества:
1) гепарин производства АО «Курган», содержащий 5000 МЕ в 1 мл раствора;
2) 1% раствор протамин сульфата;
3) нативный пчелиный яд;
4) 30% раствор этанола;
5) дроперидол, содержащий в 1 мл раствора 2,5 мг су хого вещества;
6) фентанил, содержащий в 1 мл раствора 0,05 мг сухого вещества;
7) натрия оксибутират (ГОМК), содержащий в 1 мл раствора мг сухого вещества;
8) аминазин, содержащий в 1 мл раствора 25 мг сухого вещества.
Определение токсичности исследуемых веществ производилось на бе лых мышах весом 18-23 г. Исследуемые вещества разводились в изотониче ском растворе хлорида натрия и вводились животным внутрибрюшинно в возрастающих количествах. Полученные результаты были подвергнуты ста тистической обработке методом пробит-анализа Миллера и Тейтнера (Бе ленький, 1963).
При изучении седативных свойств этанола, аминазина и оксибутирата натрия, введенных внутрибрюшинно, у крыс регистрировался наркотический сон (Lheureux et al., 1993), продолжительность которого способна меняться при введении различных веществ (Буров, Ведерникова, 1985;
Сатановская, 1990). Изучение гиподинамии, вызванной нейролептическим действием дро перидола и этанола, проводилось на тредбане.
Ноцицептивные реакции оценивали по двум стандартным тестам, поз воляющим до определенной степени судить о характере влияния веществ преимущественно на спинальном (тест отведения хвоста – «tail flick») и су праспинальном уровнях (тест «горячей пластины» - «hot plate»). Опыты про водили на животных, прошедших фоновое тестирование, исходные ноцицеп тивные пороги (фон) которых в тесте I – не превышал 8 с, в тесте II – 15 с.
(Гацура, 1974).
Сравнительная оценка интрапортального и интрафеморального способа введения производилась на крысах под лгким эфирным наркозом. Живот ные фиксировались на операционном столике в положении на спине. Одной группе крыс вводили исследуемые вещества в бедренную вену, другой - в воротную вену. Тестовую дозу яда, соответствующую примерно 0.2-0.3 ДЛ50, вводили каждые 10 минут, оценивая суммарную дозу, вызвавшую гибель животного. Определение уровня свободного гепарина в периферической кро ви производилось микрометодом по Сирмаи (Сирмаи, 1957). Активность аланинаминотрансферазы и аспартатаминотрансферазы определяли стан дартными методами. Взаимодействие гепарина с исследуемыми веществами in vitro изучали фотоколориметрическим методом, а также по изменению спектров поглощения данных веществ и их смесей в УФ и видимой области.
Колориметрирование осуществляли на фотоэлектроколориметре КФК-3 при синем светофильтре (400 нм). Измерения спектров поглощения в УФ- обла сти проводили на установке, функционально идентичной однолучевому спектрофотометру.
Статистическая обработка экспериментальных данных была выполнена с помощью программы «Биостат». Для сравнения нескольких групп использо вали однофакторный дисперсионный анализ и критерий Стьюдента для мно жественных сравнений (Гланц, 1999).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Модификация гепарином токсического и седативного действия пчелиного яда и наркотических средств 1.1. Влияние гепарина на токсическое действие пчелиного яда и нарко тических средств. Пчелиный яд данного образца в дозе 7.0±0.9 мг/кг вызы вал гибель 50% экспериментальных животных (ДЛ50). Предварительная ин кубация пчелиного яда с гепарином приводила к значительному ослаблению его токсических свойств. Так, при соотношении компонентов смеси яд гепарин 2:1 ДЛ50 возрастала примерно в 2.5 раза (до 17.4±1.8 мг/кг), а при увеличении количества гепарина в смеси в 10 раз была вдвое выше, чем в контроле – 14.1±1.2 мг/кг (табл. 1).
Таблица 1.
Влияние экзогенного и эндогенного гепарина на токсические свойства пчелиного яда № п/п Условия эксперимента Доза яда, мг/кг ДЛ50 пчелиный яд 7.0±0. 1.
ДЛ50 смеси яд-гепарин (1:0.5) 17.4±1.8* 2.
ДЛ100 пчелиного яда 3. 15. ДЛ100 смеси яд-гепарин (1:0.5) 25.0±3.4* 4.
ДЛ50 пчелиного яда на фоне протамин 5.1±0.1* 5.
сульфата (10 мг/кг) * - Различия между контрольными и экспериментальными группами статистически значимы (р 0,05) Доза яда, вызывающая в эксперименте гибель всех крыс (ДЛ100), равня лась 15.0 мг/кг. При добавлении к пчелиному яду гепарина в соотношении яд-гепарин 2:1 ДЛ100 возрастала до 25±3.4 мг/кг. Блокирование эндогенного гепарина его антагонистом протамин сульфатом вызывало заметное увеличе ние токсичности пчелиного яда, ДЛ50 в этом случае составила 5.1±0.1 мг/кг (табл. 1).
При внутрибрюшинном введении этанола в дозе 8.1±0.5 г/кг (ДЛ 50) в те чение суток 50% крыс погибали (табл. 2).
Таблица 2.
Влияние экзогенного и эндогенного гепарина на токсические свойства этанола № п/п Условия эксперимента Доза, мг/кг ДЛ50 этанола 8.1±0. 1.
ДЛ50 смеси этанол-гепарин (1000:50) 15.5±2.7* 2.
ДЛ100 этанола 3. 16. ДЛ100 смеси этанол-гепарин (1000:50) 22.0±3.4* 4.
ДЛ50 пчелиного яда на фоне протамин 4.8±0.6* 5.
сульфата (10 мг/кг) * - Различия между контрольными и экспериментальными группами статистически значимы (р 0,05) При введении смеси этанол-гепарин в соотношении 20:1 ДЛ50 увеличи валась до 15.5±2.7 г/кг. Введение этанола в дозе 16.0 мг/кг (ДЛ100) сопровож далось гибелью всех крыс в течение суток. Инъекция смеси этанол-гепарин в соотношении 20:1 сопровождалась увеличением ДЛ100 до 22.0±3.4 г/кг. Пред варительное введение протамин сульфата в дозе 10 мг/кг в значительной сте пени увеличивало токсичность этанола, и в этом случае ДЛ50 соответствовала 4.8±0.6 г/кг, что достоверно отличалось от контрольной величины (табл. 2).
Исследование токсического действия аминазина показало, что ДЛ50 при внутрибрюшинном введении крысам составляет 208±16.2 мг/кг. Инъекция смеси аминазин-гепарин в весовом соотношении 2:1 сопровождалась досто верным увеличением ДЛ50 до 333±23.1 мг/кг. При предварительном введении гепарина в дозе 5000 МЕ/кг с последующей инъекцией аминазина величина ДЛ50 возрастала относительно контрольных величин и достигала 291±12. мг/кг. Значительное снижение ДЛ50 аминазина регистрируется при предвари тельном введении протамин сульфата, что связано с блокадой эндогенного гепарина (табл. 3).
Таблица 3.
Влияние экзогенного и эндогенного гепарина на токсические свойства аминазина № п/п Условия эксперимента ДЛ50, мг/кг Аминазин 208±16. 1.
Смесь аминазин-гепарин (100:50) 333±23.1* 2.
Аминазин на фоне гепарина (5000 МЕ/кг) 291±12.9* 3.
Гепарин (5000 МЕ/кг) на фоне аминазина 212±14. 4.
Аминазин на фоне протамин сульфата (10мг/кг) 154±18.5* 5.
* - Различия между контрольными и экспериментальными группами статистически значимы (р 0,05) В отличие от пчелиного яда, этанола и аминазина, ни экзогенный, ни эндогенный гепарин не изменяет ДЛ50 димедрола, величина которой колеб лется в пределах от 96±5.7 до 108±6.5 мг/кг (табл. 4).
Таблица 4.
Влияние экзогенного и эндогенного гепарина на токсические свойства димедрола № п/п Условия эксперимента ДЛ50, мг/кг Димедрол 100±8. 1.
Смесь димедрол-гепарин (100:50) 108±6. 2.
Димедрол на фоне гепарина (5000 МЕ/кг) 104±3. 3.
Гепарин (5000 МЕ/кг) на фоне димидрола 102±9. 4.
Димедрол на фоне протамин сульфата (10мг/кг) 96±5. 5.
Интересные данные были получены в серии экспериментов, в которых предварительное введение этанола в дозе 5,0 г/кг при интоксикации пчели ным ядом в дозе 15 мг/кг сопровождалось увеличением количества выжив ших в течение суток особей до 78%. Количество выживших крыс при инъек ции этанола на фоне действия пчелиного яда зависело от времени, прошед шего между инъекцией апитоксина и этилового спирта.
Для исследования возможного механизма антидотного эффекта этанола был проведн ряд экспериментов, в которых производилась оценка уровня эндогенного гепарина при введении этанола и совместного применения эта нола и пчелиного яда (табл. 5).
Эксперименты показали, что введение физиологического раствора в объме 0.5 мл не влияет на гепариновый статус периферической крови. Вве дение пчелиного яда в дозе 15.0 мг/кг сопровождается резким повышением уровня свободного гепарина через 10 мин после инъекции. Со временем уро вень гепарина снижается, однако через 40 мин он не достигает контрольных величин (табл. 5).
Таблица Изменение уровня свободного гепарина периферической крови при введении пчелиного яда и этанола (%) Условия Время после введения, мин эксперимента 10 20 30 Контроль (физ. р-р) 101,0±5,0 96,0±3,2 99,0±2,8 104,0±4, Пчелиный яд 728.0±63.3* 546.0±22.9* 351.0±18.6* 224.0±29.4* (15.0 мг/кг) Этанол (5 г/кг) 529.0±41.3* 484.0±38.1* 445.0±28.5* 492.0±31.7* Пчелиный яд на 945.0±94.2* 722.0±58.8* 694.0±42.3* 625.0±44.7* фоне этанола Этанол на фоне 766.0±45.3* 483.0±32.1* 264.0±18.6* 185.0±12.8* пчелиного яда * Различия между контрольными и экспериментальными группами статистически значимы (р0,05) При введении пчелиного яда на фоне этанола уровень свободного гепа рина в периферической крови также повышается с последующим медленным понижением показателей и к 40-й мин после инъекции более чем в 6 раз пре вышает исходные величины (табл. 5).
Иная картина наблюдается при введении этанола на фоне действия апи токсина. В этом случае уровень свободного гепарина падает со временем и как бы повторяет картину, характерную для серии опытов, в которых приме нялся только пчелиный яд (табл. 5).
1.2. Влияние гепарина на продолжительность наркотического сна. В наших экспериментах внутрибрюшинное введение крысам этанола в дозе г/кг вызывало у них сон, средняя продолжительность которого составила 126.2 ± 6.7 мин, а время засыпания - 4.2±0.3 мин. Предварительное введение гепарина в дозе 2500 и 5000 МЕ/кг с последующей инъекцией этанола в дозе г/кг снижало продолжительность сна до 52.9±2.2 и 55.9±4.6 мин соответ ственно. В этих условиях опыта время засыпания увеличивается до 10 – мин. Протамин сульфат в дозе 10 мг/кг достоверно увеличивает продолжи тельность этанолового сна до 162.0±4.8 мин (в контроле - 126.2±6.7 мин), соответственно время засыпания снижалось до 2.4±0.1 мин.
При внутрибрюшинном введении аминазина в дозе 100 мг/кг продолжи тельность сна соответствует 152±33.5 мин, а время засыпания - 14±3,2 мин.
Эти данные нами были приняты за контрольные величины (рис. 1).
Рис. 1. Влияние экзогенного и эндогенного гепарина на продолжительность аминазинового сна 1-Аминазин (100 мг/кг);
2-Гепарин (500 МЕ/кг)аминазин;
3-Гепарин (2500 МЕ/кг)аминазин;
4-Гепарин (2500 МЕ/кг)+аминазин;
5-Гепарин (5000 МЕ/кг)аминазин;
6-Протамин (10 мг/кг)аминазин.
0 – сон отсутствует в течение 5 часов * - Различия между контрольными и экспериментальными группами статистически значимы (р 0,05) При предварительном введении гепарина в дозе 500 МЕ/кг с последую щей инъекцией аминазина в дозе 100 мг/кг продолжительность наркотиче ского сна недостоверно снижается до 132 ±34.1 мин, а время засыпания 12±4,1 мин. Совместное применение гепарина и аминазина в виде инкубиро ванной смеси в течение 15 мин при температуре 37С сопровождалось пол ным отсутствием наркотического сна в течение 5 часов. Предварительное введение гепарина в дозах 2500 и 5000 МЕ/кг также сопровождалось отсут ствием сна. Таким образом, гепарин в определнных дозах полностью сни мает седативный эффект аминазина. Иная картина наблюдается при предва рительном введении протамин сульфата в дозе 10 мг/кг. Продолжительность аминазинового сна резко увеличивается, достигая 216±24.2 мин, а время за сыпания достоверно снижается относительно контрольных величин и соот ветствует 6.2±2.8 мин (рис. 1).
При внутрибрюшинном введении оксибутирата натрия, который являет ся агонистом гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК), в дозе 100 мг/кг про должительность наркотического сна соответствовала 38.0±2.3 мин. В связи с тем, что в этой серии опытов продолжительность сна была небольшой, время засыпания не регистрировалось (рис. 2).
Рис. 2. Продолжительность сна при введении оксибутирата натрия (ГОМК) в смеси и на фоне гепарина и протамин сульфата 1- Оксибутират натрия (100 мг/кг) 6. Гепарин (5 МЕ/кг) ГОМК 2- Гепарин+ГОМК (0.01:20) 7. Гепарин (50 МЕ/кг) ГОМК 3- Гепарин+ГОМК (0.1:20) 8. Гепарин (500 МЕ/кг) ГОМК 4- Гепарин+ГОМК (1:20) 9. Гепарин (5000 МЕ/кг) ГОМК 5- Гепарин+ГОМК (10:20) 10. Протамин (10 мг/кг) ГОМК * - Различия между контрольными и экспериментальными группами статистически значимы (р 0.05) Инъекция смеси гепарин-ГОМК в соотношении 0.01:20, 0,1:20 и 1: сопровождалась постепенным снижением продолжительности сна в зависи мости от концентрации гепарина, входящего в состав смеси, и равнялась 26.4±1.8 мин, 18.2±2.1 мин и 8.0±0.9 мин соответственно. Таким образом, максимальным протекторным действием обладает соотношение гепарина к ГОМК 1:20. Повышение концентрации гепарина в 10 раз от оптимальной ве личины (10:20) сопровождается увеличением продолжительности сна до 14.6±1.6 мин (рис. 2). В следующей серии опытов схема эксперимента была видоизменена: гепарин вводили не в смеси с ГОМК, а предварительно с по следующей инъекцией ГОМК в тестовой дозе. Оказалось, что в этом случае максимальный протекторный эффект наблюдается при предварительном введении гепарина в дозе 500 МЕ/кг, а продолжительность сна соответствует 12.0±1.8 мин. Как и в предыдущих сериях экспериментов, предварительное введение протамин сульфата в дозе 10 мг/кг значительно увеличивает про должительность наркотического сна, вызванного ГОМК (рис.2).
1.3. Влияние гепарина на гиподинамические эффекты этанола и дропе ридола. При внутрибрюшинном введении этанола в дозе 2 г/кг уже через мин от момента введения наблюдается гиподинамический эффект, а величи на падений с тредбана соответствует 3,3±0,3 раз/мин. Максимальный гипо динамический эффект наблюдался через 20 мин от момента инъекции этано ла и соответствовал 4,1±0,5 раз/мин. К концу наблюдения отмечалось ча стичное восстановление двигательной активности и количество падений с тредбана снижалось до 1,6±0,6 раз/мин. Введение гепарина в виде смеси, в которой концентрация этанола соответствовала 2 г/кг и являлась констант ной величиной, а количество гепарина соответствовало дозам 25 и МЕ/кг, не отличалось достоверно от серии, в которой вводили только этанол.
Увеличение концентрации гепарина в смеси в 10 раз, также как и предвари тельное введение гепарина в дозе 2500 МЕ/кг практически полностью сни мало гиподинамический эффект этанола. При сочетанном применении эта нола в смеси с гепарином, где концентрация гепарина в смеси соответство вала дозе 5000 МЕ/кг незначительно снижала гиподинамический эффект этанола. В то же время предварительное введение протамин сульфата потен цировало гиподинамическое действие этанола и в этом случае количество падений с тредбана значительно увеличивалось.
При внутримышечном введении дроперидола в дозе 5 мг/кг максималь ный гиподинамический эффект регистрируется через 20 мин после инъекции.
В этом случае количество падений с тредбана соответствует 4.1±0.5 раз/мин.
Максимальным антигиподинамическим эффектом обладает смесь дропери дол-гепарин в соотношении 1:5. При таком соотношении компонентов коли чественные показатели падений крыс с тредбана не отличаются от контроль ных величин. Аналогичная картина наблюдается при предварительном вве дении гепарина в дозе 500 МЕ/кг, с последующей инъекцией тестовой дозы дроперидола. Предварительное введение протамин сульфата в дозе 10 мг/кг резко усиливает гиподинамический эффект дроперидола, который является более продолжительным, а показатель гиподинамии соответствует через мин после инъекции дроперидола 7.9±0.4 раз/мин.
Таким образом, гепарин модифицирует токсическое действие пчелиного яда, этанола, аминазина, но не действует на токсические свойства димедрола.
Гепарин снижает продолжительность наркотического сна, вызванного этано лом, аминазином и оксибутиратом натрия (ГОМК). Гепарин модифицирует гиподинамический эффект этанола и дроперидола.
2. Влияние гепарина на антиноцицептивные свойства пчелиного яда и наркотических средств 2.1. Пчелиный яд. Известно, что пчелиный яд способен оказывать антиноци цептивное действие при однократном введении (Шилова, Парин, 1995), при этом происходит активация апитоксином эндогенной опиоидной системы (Парин, Голанов, 1983). Очевидно, этот феномен следует рассматривать в связи с установленным фактом блокирования пчелиным ядом простаглан динсинтетазной активности (Shkenderov et al., 1979), так как способность опиоидов угнетать синтез простагландинов хорошо известна.
Для нас представлял интерес вопрос о модулирующем влиянии гепарина на антиноцицептивное действие пчелиного яда, реализующееся на супрасег ментарном уровне. С этой целью тестировали животных по тесту «горячей пластины» при болюсном введении пчелиного яда, на фоне гепарина, а также инкубированной смеси апитоксин:гепарин (1:0.5).
При внутрибрюшинном введении пчелиного яда в дозе 1 мг/кг достовер ное увеличение латентного периода реакции облизывания лап (ЛП РОЛ) произошло на 90, 120 и 150 мин, на фоне гепарина (500 МЕ/кг) снижение по рога боли отмечалось с 60 по 150 мин. Введение смеси пчелиного яда с гепа рином (1:0,5) привело к анальгезии на 120 и 150 мин.
2.2. Дроперидол. В первой серии опытов исследовали модулирующее влия ние гепарина (500 МЕ/кг) на антиноцицептивное действие дроперидола ( мг/кг) с помощью теста реакции отведения хвоста. Введение дроперидола приводит к постепенному увеличению латентных периодов, начиная с 60 ми нуты опыта, что свидетельствует о развитии анальгезии (рис. 3).
Динамика изменения ЛП РОХ при последовательном введении дропери дола и гепарина, также как и при применении инкубированной смеси дропе ридола и гепарина (1:5) носит периодический характер. Связанный с дропе ридолом гепарин, также как и гепарин, введенный через 10 минут после дро перидола, оказывает незначительное влияние на уменьшение антиноцицеп тивного действия дроперидола. В комплексе гепарин задерживал развитие дроперидолвызванной анальгезии. Наиболее выраженный эффект отмены действия дроперидола наблюдали при предварительном (за 10 минут) введе нии гепарина, когда действие нейролептика на фоне гепарина было отсроче но на 1,5 часа. Динамика изменений длительности латентных периодов при введении дроперидола на фоне протамин сульфата (10 мг/кг), указывает на незначительную роль эндогенного гепарина в модуляции эффекта дропери дола при тестировании болевой чувствительности с помощью теста реакции отведения хвоста.
Изменение тонуса различных нейрохимических систем, принимающих участие в обезболивании, можно вызвать с помощью модуляции активности их рецепторных механизмов. В связи с этим представляет особый интерес рассмотрение результатов экспериментов с участием фармакологических со единений, изменяющих активность рецепторов, а именно, с применением не селективного блокатора опиоидных рецепторов – налоксона, так как, обще принято, что эндогенной опиоидной системе отводится лидирующая роль в контроле боли, а также неселективного блокатора -адренергических рецеп торов – обзидана (пропранолола), так как данные рецепторы принимают непосредственное участие в реализации большинства адаптивных реакций, в том числе, предполагается, и в регуляции болевой чувствительности при раз личных видах воздействий (Брагин, 1991).
* * 280 * ЛП РОХ, % от контроля 240 4 * * * * * * * * * + До Через 60 90 120 введения сутки Время после введения, мин Рис. 3. Влияние дроперидола и гепарина на реакцию отведения хвоста у крыс.
1 – контроль;
2 – дроперидол (5 мг/кг);
3 – гепарин дроперидол;
4 – дроперидол гепарин.
* – p 0.05 сравнение с контролем;
+ – p 0.05 сравнение с дроперидолом.
Значения ЛП РОХ в группах «налоксон, дроперидол, гепарин» и «налок сон, гепарин, дроперидол» были на 100-150% достоверно выше (р0,05) кон трольных и исходных, начиная с 60 минуты и в течение последующих мин эксперимента. Статистически значимые различия между группой без применения гепарина и группами, в которых на фоне налоксона дроперидол вводился вместе с мукополисахаридом в разных вариантах, были зарегистри рованы на 60, 90, 120 и 210 минуте опыта. Таким образом, при блокировании опиоидных рецепторов гепарин либо оказывает влияние на опиодные рецеп торы, либо способствует проявлению анальгетической активности дропери дола через иные механизмы.
Одними из наиболее важных в регуляции многих функций организма являются -адренергические рецепторы. Вклад данной системы в антиноци цептивные процессы, происходящие на спинальном уровне при применении дроперидола и гепарина, оценивали с помощью использования блокатора адренергических рецепторов обзидана, вводимого внутрибрюшинно в дозе мг/кг. Торможение активности -адренергических рецепторов вызывает ча стичное подавление противоболевого действия дроперидола, достоверное отличие от контроля (р0,05) получили только на 120 и 150 мин опыта. При чем, динамика изменений латентных периодов РОХ при введении обзидана после дроперидола и гепарина мало отличалась от таковой в опыте с дропе ридолом и гепарином, анальгетическая активность была достоверно снижена на 90 и 120 мин опыта. Предварительное применение обзидана до введения дроперидола и гепарина (3-я группа) дало неожиданную реакцию нарушения двигательной функции задних конечностей у животных, которая не наблю далась в других группах и продолжалась в течение 1,5 часов и отразилась на длительности латентных периодов. Т.е., наиболее выраженный нейролепти ческий эффект дроперидола при сочетании с гепарином получили при пред варительной блокаде -адренергической системы. Возможно, именно влия ние гепарина на -адренергическую систему играет ключевую роль в подав лении антиноцицептивной активности дроперидола при предварительном введении гепарина.
В следующем блоке экспериментов при анализе влияние тех же ве ществ (дроперидола, гепарина, налоксона обзидана, протамин сульфата) был применен другой способ тестирования – болевую чувствительность оценива ли по латентным периодам реакции облизывания лап. При этом из всего набора применяемых нами сочетаний препаратов статистически значимых межгрупповых различий установлено не было, а увеличение длительности ЛП РОЛ произошло на 30 мин только в группе при введении дроперидола на фоне антагониста гепарина – протамин сульфата.
Вероятнее всего данный прирост был вызван стресс-реакцией на введе ние фармакологических агентов, на это указывает также пикообразный ха рактер динамики изменений ЛП РОЛ с последующим резким сокращением.
Возможно, эндогенный гепарин выполняет в организме отчасти стресслими тирующую функцию, и блокада центральных дофаминовых путей дропери долом на фоне гипогепаринемии протамин сульфатом только усиливает эту стресс реакцию на болевой термический стимул, на участие ДА-механизмов указывает и повышение болевой чувствительности по сравнению с исходным уровнем на 35% в группе с дроперидолом на 60 мин. С этой точки зрения, можно рассматривать стабилизирующие эффекты гепарина и налоксона в со четании с дроперидолом, в данных группах значения ЛП РОЛ были близки к контрольным и исходным.
Отличие результатов полученных разными способами анальгезиомет рии указывает на различия в характере воздействия дроперидола и гепарина, оказываемое на спинальном и супраспинальном уровнях.
2.3. Фентанил. Целью данной части нашей работы было определение степе ни влияния гепарина на анальгезию, вызванную фентанилом. Предваритель но была подобрана доза анальгетика (0,08 мг/кг), при которой развивался не продолжительный минимальный обезболивающий эффект (рис. 4).
500 * * ЛП РОХ, % от контроля *+ * * * *+ * * *+ * * * * * * * * * * * * До 15 60 90 120 30 введения Время после введения, мин Рис. 4. Влияние фентанила и гепарина на реакцию отведения хвоста у крыс.
1 – контроль;
2–фентанил (0.08 мг/кг);
3–гепарин (50 МЕ/кг)фентанил;
4–гепарин (500 МЕ/кг)фентанил;
5–гепарин (5000 МЕ/кг)фентанил;
6 – фентанил + гепарин (1:50).
* – p 0.05 сравнение с контролем;
+ – p 0.05 сравнение с фентанилом.
При тестировании по реакции отведения хвоста значения латентных периодов достоверно превышали контрольные и исходные показатели в среднем на 150% через 15 и 30 минут после внутрибрюшинного введения фентанила (рис. 4), затем наблюдали резкий спад анальгезии, и в течение по следующего времени, до 180 мин опыта, уровень болевой чувствительности восстанавливался до первоначального. На фоне гепарина, который вводили за 10 мин до фентанила в дозах 50, 500 и 5000 МЕ/кг, а также инкубирован ной смеси фентанила и гепарина в соотношении 1:50, восстановление порога болевой чувствительности происходило значительно дольше.
Таким образом, очевидным является факт положительного взаимодей ствия гепарина с фентанилом, которое в данных условиях способствовало пролонгации действия опиоидного анальгетика.
2.4. Аминазин. При исследовании влияния гепарина (500 МЕ/кг) на свойства аминазина использовали тест отведения хвоста. Введение аминазина, в дозе, близкой к терапевтической – 1,25 мг/кг, вызывало у животных гиподинамию, гипотермию, значительное увеличение ЛП РОХ, начиная с 25 мин, в резуль тате седативной реакции время эксперимента было ограничено до 135 мин.
(рис. 5).
Данное действие аминазина полностью снималось предварительным введением гепарина (500 МЕ/кг), либо протамин сульфатом (10 мг/кг), досто верное отличие от группы с аминазином отмечено на 60 мин опыта. Отсут ствие эффекта аминазина наблюдалось и при введении инкубированной сме си.
* * ЛП РОХ, % от контроля * * + + До 25 60 90 введения Время после введения, мин Рис. 5. Влияние аминазина, гепарина и протамин сульфата на реакцию отведения хвоста у крыс.
1 – контроль;
2 – аминазин (1.25 мг/кг);
3 – гепарин аминазин;
4 – протамин аминазин;
5 – аминазин + гепарин (1 : 0.5);
* – p 0.05 сравнение с контролем;
+ – p 0.05 сравнение с аминазином.
Полученные результаты позволяют сделать вывод, что в данном случае блокирование действия аминазином и протамин сульфатом, возможно, про изошло вследствие образования неактивного комплекса аминазина с полиа нионами.
3. Роль гепарина печени и сосудистого русла в реализации антидотного действия при введении пчелиного яда и этанола 3.1. Сравнение кардиотоксического действия пчелиного яда и этанола при введении в бедренную и воротную вены. Для оценки защитной роли пе чени в процессе интоксикации пчелиным ядом и этанолом была изучена их сравнительная активность при разных способах попадания в организм – через бедренную или воротную вены. Тестовую дозу исследуемых веществ вводи ли каждые 10 минут, оценивали их суммарную дозу, вызвавшую гибель жи вотного.
Инъекция крысам пчелиного яда в дозе 2 мг/кг в бедренную вену вызыва ла резкие нарушения сердечной деятельности уже в первые минуты после ин токсикации. У большинства животных наблюдалось выраженное уменьшение частоты сердечных сокращений (ЧСС) через 30 секунд. Как было показано и в работе В. Н. Крылова (1995), наряду с развитием синусовой брадикардии, на ЭКГ наблюдалось извращение желудочкового комплекса, возникновение «ги гантского» зубца Т, снижение других зубцов, характерное для терминального состояния деятельности сердца. Гибель животного наступала в некоторых случаях через 5 минут после первого введения тестовой дозы яда. Средняя ле тальная доза составила 3.330.67 мг/кг. При введении того же количества пче линого яда в воротную вену наблюдали небольшое снижение ЧСС в первые минут после инъекции с последующим восстановлением или незначительным ускорением сердечного ритма. Терминальное состояние сердечной мышцы наступало только при инъекции 6–9 тестовых доз, средняя летальная доза со ставила 14.30.95 мг/кг.
При дробном введении этанола в бедренную вену летальная доза яда со ответствует 10.3±0.94 г/кг, в то время как при тех же условиях эксперимента введение в воротную вену печени сопровождается увеличением летальной дозы до 18.5±1.17 г/кг (рис. 6).
Инфузия гепариа в дозе 500 и 5000 МЕ/кг как в бедренную, так и в во ротную вену сопровождается увеличением летальной дозы этанола, хотя раз ница между введениями в бедренную и воротную вены также сохраняется (рис. 6).
Дальнейшее увеличение дозы предварительно инъецированного гепари на до 7000 МЕ/кг сопровождается снижением величины летальной дозы от носительно экспериментов, в которых гепарин вводился в дозе 5000 МЕ/кг (рис. 6).
Рис. 6. Сравнительная оценка летальной дозы этанола при введении в бедренную и воротную вены в условиях гипергепаринемии 1- Этанол;
2- Гепарин (5 МЕ/кг)этанол;
3- Гепарин (50 МЕ/кг)этанол;
4- Гепарин (500 МЕ/кг)этанол;
5- Гепарин (5000 МЕ/кг)этанол;
6- Гепарин (7000 МЕ/кг)этанол * - Различия между контрольными и экспериментальными группами стати стически значимы (р 0,05) Таким образом, при предварительном введении гепарина как в бедрен ную, так и в воротную вены существует определнный оптимум, выше и ни же которого антидотные свойства гепарина при инфузии этанола снижаются.
Ранее было установлено, что протамин сульфат в дозе 10 мг/кг блокиру ет эндогенный гепарин в течение 6 часов (Пахомова, Хомутов, 2001).
Предварительное введение протамин сульфата в указанной дозе в бедренную и воротную вены с последующей инфузией пчелиного яд и этанола почти в два раза снижало величину летальной дозы исследуемых веществ.
3.2. Сравнительная характеристика токсического действия пчелиного яда и этанола при внутриартериальном и внутривенном введениях. В предыдущих экспериментах было выяснено, что прохождение через ворот ную систему печени однонаправленно влияет на активность пчелиного яда и этанола. Поскольку при этом исследуемые вещества должны миновать си стему вено-венозных капилляров и синусоидов печени, в которых скорость кровотока относительно низкая, возникает вопрос о специфичности защитно го влияния печени по отношению к данным ядам.
В опытах на крысах оценивали суммарную дозу, вызвавшую гибель жи вотного, при дробном введении пчелиного яда и этанола в бедренную вену или хвостовую артерию. В последнем случае, очевидно, что исследуемые вещества, попадая ретроградно в артериальное русло, должен пройти через капиллярную систему задней части тела животного, прежде чем попадет в нижнюю полую вену.
В ходе исследований было выяснено, что токсичность пчелиного яда существенно отличается при внутривенном и внутриартериальном введении.
Так, при внутривенном введении крысы погибали после 2-3 введений тесто вой дозы яда (2 мг/кг), а при внутриартериальном введении – после 6-7 вве дений. Средняя суммарная доза составила 5.7±1.1 мг/кг и 13.3±0.4 мг/кг со ответственно.
4. Модификация гепарином активности аминотрансфераз при действии пчелиного яда и этанола В нашей работе после введения пчелиного яда наблюдалось повышение уровня активности аминотрансфераз в периферической крови крыс. Актив ность аланинаминотрансферазы, определенная по прошествии 1 часа от вве дения пчелиного яда в дозе 2 мг/кг повысилась в 3 раза по сравнению с кон тролем. Через 6 часов после введения яда активность фермента снижалась до уровня, статистически не отличающегося от контроля.
Нейтрализация эндогенного гепарина протамин сульфатом в количестве 10 мг/кг вызывала не слишком значительное, но статистически достоверное повышение активности АлАТ, в то время как введение пчелиного яда ( мг/кг) на фоне протамин сульфата вызывало увеличение уровня фермента более чем в 3,5 раза.
Повышение активности аминотрансфераз можно объяснить воздействи ем компонентов апитоксина непосредственно на мембраны клеток. Известно, что мелиттин – мембранолитик, поэтому он изменяет проницаемость мем браны (Хомутов и др., 2005) и таким путем может влиять на локализацию и активность ферментов.
У интактных животных активность АлАТ и АсАТ равна 0,156±0,064 и 0,103±0,025 мкМ/мл соответственно. Введение физиологического раствора в объме 1 мл многократно снижает активность АлАТ (0,061 ±0,030) и более чем в два раза снижает активность АсАТ (0,051±0,013) относительно интакт ных животных. В связи с тем, что исследуемые вещества мы разводили в фи зиологическом растворе, в качестве контроля для статистической обработки были взяты именно эти данные (рис. 7).
Влияние гепарина и этанола на активность АсАТ в периферической крови крыс 0, * * активность АсАТ (мкМоль/мл.) * 0, * * 0, * 0, * * 0, 0, 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 группы животных Рис. 7. Влияние гепарина, этанола и протамин сульфата на активность аспартатаминотрансферазы 1. Интактная группа;
2. Контроль (физ.раствор);
3. Гепарин (500 МЕ/кг);
4. Гепарин (1000 МЕ/кг);
5. Гепарин (2500 МЕ/кг);
6. Гепарин (3000 МЕ/кг);
7. Гепарин (5000 МЕ/кг);
8. Этанол (12%, 0,5 мл/200г);
9. Этанол (20%, 0,5 мл/200г);
10. Гепарин(500 МЕ/кг) Этанол(12%);
11. Гепарин(1000 МЕ/кг) Этанол(12%, 0,5 мл/200г);
12. Гепарин (2500 МЕ/кг) Этанол(12%, 0,5 мл/200г) 13. Гепарин(2500 МЕ/кг) Этанол(20%, 0,5 мл/200г) 14. Гепарин(2500 МЕ/кг) + Этанол(20%, 0,5 мл/200г) 15. Гепарин (5000 МЕ/кг) Этанол(12%, 0,5 мл/200г) 16. Этанол (12%, 0,5 мл/200г) Гепарин(500 МЕ/кг) 17. Этанол(12%, 0,5 мл/200г) Гепарин(2500 МЕ/кг) 18. Протамин сульфат(1 мг/кг) Этанол (12%,0,5мл/200г) При введении гепарина в дозах от 1000 МЕ/кг до 5000 МЕ/кг активность АлАТ повышается и достигает при введении гепарина 5000 МЕ/кг 0,405±0,048 мкМ/мл. При оценке активности АсАТ установлено, что его ак тивность возрастает в тех же пределах, за исключением введения гепарина в дозе 5000 МЕ/кг (0,081±0,065 мкМ/мл) (рис. 7).
Этанол (12%, 0,5 мл/200г) повышает активность АлАТ и АсАТ, однако 20% этанол объме 0,5 мл/200г снижает активность АлАТ до 0,185±0, мкМ/мл, АсАТ – до 0,022±0,017 мкМм/л, сравнимых с контрольными вели чинами.
Гепарин повышает активность АлАТ и АсАТ, однако следует сказать, что активность АсАТ при введении высокой дозы (5000 МЕ/кг) гепарина рез ко снижается. Гепарин, вероятно, воздействует на состояние дисферменте мии применительно к АсАТ, что, возможно, связано с влиянием гепарина на конститутивный или индуктивный синтез АсАТ в печени или других органах и тканях, а также с образованием биокомплекса гепарин + трансаминазы (Федянин, Патеюк, 1973).
5. Взаимодействие гепарина с исследуемыми веществами in vitro Используя метод фотоэлектроколориметрии и анализ спектров поглоще ния в УФ области, было показано, что гепарин изменяет оптическую плот ность растворов пчелиного яда, мелиттина, этанола, дроперидола, аминазина, оксибутирата натрия, и не влияет на растворы фосфолипазы А2 пчелиного яда, димедрола и фентанила.
Анализ спектров поглощения показал, что гепарин взаимодействует с пчелиным ядом, мелиттином, этанолом, дроперидолом (рис. 8) и не взаимо действует с фентанилом (рис. 9).
Таким образом, в результате проведнных исследований было установ лено, что гепарин как in vivo, так и in vitro модифицирует свойства пчелино го яда, мелиттина, этанола, дроперидола, аминазина, оксибутирата натрия (ГОМК) и не изменяет свойств фосфолипазы, димедрола и фентанила. На наш взгляд в основе механизма этого феномена лежит способность гепарина образовывать комплексные соединения с рядом веществ, разной химической структуры. Так, например, в состав мелиттина входят положительно заря женные аминокислоты, за счт которых и происходит взаимодействие. В мо лекуле дроперидола содержится фтор, имеющий положительный заряд, а, как известно гепарин обладает высоким отрицательным зарядом. Кроме того, ге парин может взаимодействовать за счт электростатического вектора.
1, дроперидол 1, гепарин гепарин+дроперидол 0, Экстинкция 0, 0, 0, 0, 0,20 0,22 0,24 0,26 0,28 0, Длина волны, мкм Рис. 8. Спектры поглощения дроперидола (0,01мг/мл), гепарина (5МЕ/мл) и их смеси в УФ-области 0, фентанил гепарин 0, фентанил+гепарин Экстинкция 0, 0, 0, 0, 0,20 0,22 0,24 0,26 0,28 0, Длина волны, мкм Рис. 9. Спектры поглощения фентанила (0,008мг/мл), гепарина (5МЕ/мл) и их смеси в УФ-области ВЫВОДЫ 1. Экзогенный гепарин снижает токсические свойства пчелиного яда, этанола, аминазина, но не снижает токсических свойств димедрола. Гепарин снижает продолжительность наркотического сна, вызванного этанолом, ами назином и оксибутиратом натрия. Гепарин снижает гиподинамическое дей ствие дроперидола и этанола. Предварительное введение протамин сульфата увеличивает токсичность, увеличивает продолжительность сна, увеличивает показатели гиподинамии исследуемых веществ.
2. Гепарин снижает латентный период реакции отведения хвоста при введении пчелиного яда, дроперидола и аминазина и увеличивает ЛП РОХ при введении фентанила. Предварительное введение гепарина увеличивает латентный период реакции облизывания лап при введении пчелиного яда, дроперидола и фентанила.
3. Токсические свойства пчелиного яда и этанола в значительной мере снижаются при введении в воротную вену печени по сравнению с инъекцией в бедренную вену. Пчелиный яд и этанол при введении в хвостовую артерию крыс в меньшей степени проявляют свои токсические свойства, чем при вве дении в бедренную вену. Экзогенный гепарин усиливает антидотное дей ствие печени, а протамин сульфат снижает детоксицирующую функцию пе чени.
4. Экзогенный гепарин в дозе 50 МЕ/кг снижает активность аланинами нотрансферазы (АлАТ) и аспартатаминотрансферазы (АсАТ), в дозе МЕ/кг максимально повышает активность АлАТ, в дозе 3000 МЕ/кг макси мально повышает активность АсАТ. Пчелиный яд и этанол повышают актив ность АлАТ и АсАТ в периферической крови крыс. Пчелиный яд на фоне действия гепарина потенцирует активность АлАТ и АсАТ. Этанол в зависи мости от дозы и способа введения с гепарином увеличивает или уменьшает активность АлАТ и АсАТ относительно контрольных величин.
5. В экспериментах in vitro, используя метод фотоэлектроколориметрии и анализа спектров поглощения в УФ области, показано взаимодействие ис следуемых веществ в стехиометрических отношениях. Максимальный пик светопоглощения регистрируется при соотношении пчелиный яд-гепарин 1:0.3, мелиттин-гепарин 1:0.5, этанол-гепарин 20:1, дроперидол-гепарин 1:3, оксибутират нария-гепарин 1:3, аминазин 2.5:1, протамин сульфат-гепарин 1:1. Фентанил и димедрол с гепарином не взаимодействуют.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК:
1. Пурсанов К.А., Хомутов А.Е., Бутылин А.Г., Слободянюк В.С. Влия ние гепарина на нейролептические свойства аминазина // Нижегородский ме дицинский журнал, 2008. № 5. – С. 73-77.
2. Пурсанов К.А., Хомутов А.Е., Слободянюк В.С., Бочкарва А.В. Вли яние гепарина на гиподинамию крыс, вызванную этиловым спиртом // Меди цинский альманах, 2009. № 1(6). С. 127-128.
3. Пурсанов К.А., Хомутов А.Е., Бутылин А.Г., Слободянюк В.С. Влия ние гепарина, протамин сульфата, этанола и их сочетанного применения на показатели сна экспериментальных животных // Медицинский альманах, 2009. № 3(8). С. 136-137.
4. Бутылин А.Г., Звонкова М.Б., Хомутов А.Е., Пурсанов К.А., Слободя нюк В.С. Влияние гепарина на антиноцицептивные свойства пчелиного яда // Вестник Нижегородского госуниверситета им. Н.И. Лобачевского, 2010.
№2(2). С.607-611.
5. Звонкова М.Б., Хомутов А.Е., Бутылин А.Г., Пурсанов К.А., Слободя нюк В.С., Перепелюк З.В. Влияние высоких доз гепарина на процессы гемо стаза // Вестник Нижегоодского госуниверситета им. Н.И. Лобачевского, 2010. № 2(2). С. 636-641.
6. Крылов В.Н., Малиновская С.Л., Слободянюк В.С., Малиновский Д.С.
Влияние этанола, гепарина и протамин сульфата на активность аланин- и ас партатаминотрансферазы // Вестник Нижегородского университета им. Н.И.
Лобачевского, 2011. № 2, Ч. 1. – С. 98-102.
Статьи в региональных изданиях и материалах конференций:
7. Пурсанов К.А., Слободянюк В.С., Хомутов А.Е. Снижение токсиче ского действия пчелиного яда при предварительном введении гепарина // Апитерапия сегодня. – Рыбное, 2006. – С. 82-84.
8. Слободянюк В.С., Бочкарва А.В., Хомутов А.Е. Влияние пчелиного яда и гепарина на активность аминотрансфераз // Материалы XIV Всероссий ской конференции «Успехи апитерапии». Рыбное, 28-30 мая 2009. С. 28-33.
9. Слободянюк В.С. Влияние гепарина на антиноцицептиное действие этанола. Материалы Ш Всероссийского с международным участием конгрес са студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз-Россия 2010».24-29 мая 2010.
Н. Новгород, 2010. С. 149-150.
10. Хомутов А.Е., Слободянюк В.С., Бочкарва А.В., Перепелюк З.В.
Торможение этанолом гиподинамии крыс, вызванной пчелиным ядом. Мате риалы Международной конференции «Пчеловодство – XXI век». Москва, 17 20 мая 2010. С. 241-243.
11. Слободянюк В.С., Перепелюк З.В., Хомутов А.Е. Сравнительная ха рактеристика внутрифеморального и интрапортального введения пчелиного яда // Материалы 16 Всероссийской конференции «Успехи апитерапии».
Ярославль 8-11 октября 2011. С. 159-160.
12. Пурсанов К.А., Бутылин А.Г., Слободянюк В.С., Малиновский Д.С., Хомутов А.Е. Влияние гексенала на антидотный эффект гепарина при отрав лении пчелиным ядом // Материалы 16 Всероссийской конференции «Успехи апитерапии». Ярославль 8-11 октября 2011. С. 166-167.
Подписано в печать 27.10.2011 г. Формат 6084 1/16.
Бумага офсетная. Печать офсетная.
Усл. печ. л. 1. Заказ № 697. Тираж 100 экз.
Отпечатано с готового оригинал-макета в РИУ ННГУ им. Н.И. Лобачевского.
603000, г. Нижний Новгород, ул. Б. Покровская,