Функционально-морфологическая характеристика гистогематического барьера легких у собак при дирофиляриозе
На правах рукописи
ЛЫСЕНКОВА Антонина Сергеевна ФУНКЦИОНАЛЬНО-МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГИСТОГЕМАТИЧЕСКОГО БАРЬЕРА ЛЕГКИХ У СОБАК ПРИ ДИРОФИЛЯРИОЗЕ 06.02.01 - диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Ставрополь – 2013
Работа выполнена в Государственном научном учреждении Северо Кавказский зональный научно-исследовательский ветеринарный институт Российской академии сельскохозяйственных наук (г. Новочеркасск)
Научный консультант: Ермаков Алексей Михайлович доктор биологических наук, профессор
Официальные оппоненты: Квочко Андрей Николаевич доктор биологических наук, профессор ФГБОУ ВПО «Ставропольский государственный аграрный университет», заведующий кафедрой физиологии, хирургии и акушерства Дерезина Татьяна Николаевна доктор ветеринарных наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Донской государственный аграрный университет», заведующая кафедрой внутренних незаразных болезней, патофизиологии, клинической диагностики, фармакологии и токсикологии
Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов»
Защита состоится «05» апреля 2013 года в 1330 часов на заседании диссертационного совета Д.220.062.02 при ФГБОУ ВПО «Ставропольский государственный аграрный университет» по адресу: г. Ставрополь, пер.
Зоотехнический, 12.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБОУ ВПО «Ставропольский государственный аграрный университет» по адре су: г. Ставрополь, пер. Зоотехнический, 12.
Автореферат разослан «_» 2013 года и размещен на сайтах: ВАК Минобразования и науки РФ http://vak.ed.gov.ru «_» _ 2013 г., ФГБОУ ВПО «Ставропольский ГАУ»:
http://www.stgau/ru «_»_ 2013 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Дьяченко Юлия Васильевна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Современные данные по эпидемиологии дирофиляриоза позволяют говорить о широком распространении этого заболевания в различных странах мира, включая Россию. Ареал распро страненности занимает по климатогеографической зоне широты от 41 до 58 град. северной широты (М.В. Сухова, 2002;
В.Б. Ястреб, 2009). В Рос сии дирофиляриоз обнаружен в 39 субъектах (М.В. Сухова, 2002;
А.Ю.
Медведев, 2007;
А.Ю. Аракельян, 2008;
Ю.Г. Бескровная, 2009;
А.С. Жу равлев, 2009;
В.Б. Ястреб, 2009;
Т.Н. Сивкова, 2010;
Н.В. Ярошенко, 2010). Распространению заболевания способствуют усиливающиеся ми грационные процессы человека и животных, высокая приспособляемость зоонозов к новым условиям обитания, отсутствие должных санитарно эпидемиологических мероприятий и др. По данным Суховой М.В. (2002), в Волгоградской области ежегодный прирост заболеваемости дирофиля риозом среди животных составляет 16%. Эта ситуация создает риск рас пространения заболевания как среди животных, так и среди людей. Так, в период с 1999 по 2003 год дирофиляриоз у человека выявлен в 150 случа ях (Е.В. Михайлова, 2008;
Ю.Г. Бескровная, 2009). Случаи дирофилярио за зафиксированы у жителей в Московской, Тульской областей, Алтай ского края, Тюмени, Нижнего Поволжья, Краснодарского края и других регионов (Т.И. Авдюхина, В.Г. Супряга, В.Ф. Постнова, 1997;
Н.А. Аза рова, В.П. Прейдер, 1999;
Л.И. Карпук и др., 2000;
В.В. Гуськов и др..
2001;
А.В. Ушаков, Т.Ф. Степанова, А.С. Стругова, 2002;
А.М. Брон штейн, В.Г. Супряга и др., 2003;
М.В. Григорьев, Е.В. Дворовенко, 2003).
К 2004 году в России отмечено уже 300 случаев дирофиляриозной инва зии у человека (В.Г. Супряга и др., 2004;
С.А. Нагорный, В.В. Карташов, А.А. Артамонова, Ю.Г. Бескровная, 2005).
Авторы указанных исследований утверждают, что эти данные не отражают настоящей ситуации, так как много случаев остается неучтен ными. Вполне очевидно, что при сохранившихся тенденциях заболевае мость дирофиляриозом будет увеличиваться. В научной литературе про должают появляться сообщения об обнаружении дирофиляриоза у чело века (Р.С. Арекельян с соавт., 2011;
Н.Е. Белова, 2012;
М.Г. Тухбатул лин, Р.Ф. Гайнутдинова, 2012).
Экономическая сторона данной проблемы заключается в том, что заболевание имеет выраженную тенденцию к распространению среди специальных групп собак (питомники силовых структур), на подготовку которых затрачиваются значительные средства (Н.В. Серебрякова, А.М.
Ермаков, И.В. Колодий, 2008).
Локализация паразита Dirofilaria immitis в малом круге может про являться в виде пневмонии либо сопровождаться клиникой тромбоэм болии малого круга кровообращения (П.В. Колесников, 2009;
И.В. Ко лодий, 2009). Проявления могут быть выраженными, а могут протекать бессимптомно. Так, по данным Ястреба В.Б. (2009), тяжелое течение отмечено в 37,7 % случаев, средней степени тяжести – в 29,8%, а бес симтомное – в 32,5 % случаев.
Изучение малого круга кровообращения и легких ранее проводи лось отдельными отечественными учеными (П.В. Колесников, 2009).
Была описана клиническая картина острой эозинофильной пневмонии, тромбоэмболии легких при дирофиляриозе. Однако, при всей очевидно сти патогенеза этих поражений, остается много нерешенных вопросов.
В частности, не изучены более глубокие механизмы поражения легоч ной ткани, эндотевлия и сурфактантной системы. Интерес к этим про блемам обусловлен несколькими причинами. В последнее время стало известно, что один из компонентов сурфактантной системы, в частно сти, белок-D (SP-D) играет существенную роль в местной иммунной за щите легких от различного рода инфекций (А.Е. Абатуров, 2011;
2012;
Clark, Reid, 2002;
2003;
Whitsett, 2002;
Wu, Kuzmenko, Wanetal., 2003).
Была выявлена способность данного белка определять выраженности иммунного ответа и степень активации воспалительного процесса ле гочной ткани (Crouch, Wright, 2001;
Kishoreetal., 2005;
Hartl, Griese, 2005). Изучение данного компонента сурфактантной системы легких в условиях заражения дирофиляриозом представляет научный и практи ческий интерес.
В последние годы в генезе многих заболеваний, включая и неин фекционные, большое значение придается поражению или дисфункции эндотелия (О.А. Гомазков, 2001;
Т.Ю. Калюта, О.Е. Царева, А.Д. Тру бецков и др. 2005;
А.И. Ковалев, Г.И. Марцинкевич, Т.Е. Суслова, А.А.
Соколов, 2004;
Р.Г. Оганов, Г.В. Погосова, 2007;
О.В. Костенко, 2008;
Coats, 2004). С учетом того, что эндотелий представляет собой важней ший компонент аэрогематического барьера легких является актуальной задачей исследование его функций при дирофиляриозе у собак.
Современное состояние данного вопроса и вышеназванные пред посылки определили выбор темы нашего исследования.
Объект исследования: породные и беспородные собаки обоих по лов в возрасте от 1 до 12 лет, инвазированные D.immitis собаки, кровь, легкие павших животных.
Предмет исследования – механизмы и маркеры повреждения гис тогематического барьера легких собак с дирофиляриозом.
Научная гипотеза. Размножение и развитие дирофилярий в сосу дах малого круга кровообращения сопровождается продукцией ими биологически активных соединений, запускающих каскад реакций, ха рактеризующихся повреждением структуры и функции гистогематиче ского барьера легких. Используя современные маркеры, можно показать и предположить роль отдельных факторов в механизме повреждения легких при дирофиляриозе у собак.
Цель исследования: изучить функциональное и морфологическое состояние гистогематического барьера легких и его отдельных компо нентов у собак при дирофиляриозе.
Задачи исследования:
1. Изучить функциональное состояние гистогематического барьера легких у здоровых и больных дирофиляриозом собак по отношению к белку-D сурфактанта легких (SP-D) в зависимости от возраста, пола и по роды собак.
2. Оценить функциональное состояние эндотелия у здоровых и больных дирофиляриозом собак в зависимости от возраста, пола и по роды собак.
3. Сопоставить особенности морфологических изменений с функ циональным состоянием гистогематического барьера легких у собак с дирофиляриозом.
4. Дать комплексную функционально-морфологическую оценку аэрогематического барьера легких у больных дирофиляриозом собак.
Научная новизна. Впервые получена функциональная и морфо логическая характеристика аэрогематического барьера легких у здоро вых и инвазированных дирофиляриозом собак. Получены данные о дисфункции эндотелия, характеризующиеся в уменьшении синтези рующей функции по отношению к фактору Виллебранда при хрониче ском течении заболевания. Впервые получены данные о резистентности аэрогематического барьера по отношению к белку-D (SP-D) сурфактанта легких. Выявлены возрастные и половые особенности резистентности аэрогематического барьера легких по отношению к белку-D сурфактан та легких у здоровых и больных дирофиляриозом собак. Установлено, что при остром и хроническом течении воспаления в легких резистент ность барьера по отношению к белку-D закономерно изменяется. В па томорфозе определены фазы течения воспалительного процесса в лег ких при дирофиляриозе. Впервые проведены сопоставления морфологи ческой картины легких и их метаболических функций по отношению к белку-D сурфактанта легких.
Теоретическая значимость. Заключается в обосновании исполь зования маркера белка-D сурфактанта для оценки состояния гистогема тического барьера легких и степени его повреждения. Полученные дан ные о динамике изменений концентрации белка-D и фактора Виллеб ранда являются новыми элементами патогенеза органных повреждений, в частности, легких при дирофиляриозе.
Практическая значимость. Полученные данные по концентра ции белка-D и фактора Виллебранда у здоровых и больных собак разно го пола и возраста могут служить в качестве нормативных и критери альных показателей в лабораторной диагностике поражения легких.
Имеющиеся доказательства наличия дисфункции эндотелия и ослабле ния местной иммунной защиты легких диктуют необходимость разра ботки и применения коррекции указанных нарушений. Дополнительные сведения о патогенезе поражения легких и развитии гипоксии при диро филяриозе у собак могут быть использованы в научно-педагогической практике ветеринарных и биологических факультетов.
Положения, выносимые на защиту:
1. Течение дирофиляриоза у собак сопровождается изменениями функциональных и морфологических характеристик гистогематического барьера легких, нарушением обмена белка-D в легких, эндотелиальной дисфункцией, уменьшением дыхательной поверхности легких и после дующим развитием гипоксии.
2. Резистентность гистогематического барьера легких по отноше нию к белку-D сурфактанта легких с возрастом, как у здоровых, так и больных дирофиляриозом собак, независимо от их породы, изменяется фазно и зависит от пола животного.
3. Проницаемость гистогематического барьера легких по отноше нию к белку-D и активность фактора Виллебранда зависят от характера и выраженности воспалительной реакции в легких и половой принад лежности животного.
Материалы исследования были обсуждены: на Международной конференции « Актуальные вопросы науки и образования» (Москва, г.);
Международной конференции «Фундаментальные исследования» (Из раиль, 2012 г.);
Всероссийской конференции «Инновационные пути разви тия агропромышленного комплекса: задачи и перспективы» (Зерноград, 2012 г.);
ХХ Всероссийской научно-практической конференции «Образова ние-наука-технологии» (Майкоп, 2012 г.);
на межлабораторном совещании в Государственном научном учреждении «Северо-Кавказский зональный на учно-исследовательский ветеринарный институт Российской академии сель скохозяйственных наук» (Новочеркасск, 2012);
на Всероссийской научно практической конференции «Научное обеспечение устойчивого развития отрасли животноводства Российской Федерации» (Новочеркасск, 2012).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 науч ных статей, из них 3 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Личный вклад. Представленные в диссертационной работе экс периментальные исследования, теоретический и практический анализ полученных результатов проведены автором самостоятельно. В выпол нении морфологической части работы консультативную помощь оказы вал кандидат медицинских наук, доцент Г.В. Левин.
Реализация результатов исследований. Полученные показатели концентрации белка-D и фактора Виллебранда у собак внедрены в диаг ностических лабораториях Научно-исследовательского института Южно го федерального университета (г. Ростов-на-Дону), ГБУ «Бузулукское районное управление ветеринарии», «Медицинский центр профилактиче ской медицины» (г. Астана, Казахстан);
в учебный процесс и иммуно генетическую лабораторию ГБОУ ВПО Адыгейского государственного университета, в преподавание дисциплины «Паразитология и инвазивные болезни животных» аграрного факультета Российского университета дружбы народов. Полученные данные по механизмам повреждения лег ких при дирофиляриозе у собак могут использоваться в учебном процес се по специальностям «Биология», «Ветеринария» и «Зоотехния».
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, главы результа тов собственных исследований, обсуждения результатов и заключения, выводов, практических рекомендаций и библиографического списка. Ма териал изложен на 120 страницах, иллюстрирован 25 рисунками и микро фотографиями, 24 таблицами. Библиографический список включает в себя 228 наименований, из них 75 отечественных и 153 зарубежных автора.
Материал и методы исследования.
Всего обследовано 113 собак из специализированных питомников силовых структур г. Ростова-на-Дону, Краснодара и службы по отлову животных г. Бузулука (табл. 1). Из указанного количества прижизненно у 101 собаки (37 здоровых и 64 больных собак) исследовали концентра цию в крови белка-D сурфактанта легких и фактора Виллебранда. Воз раст собак составил от 1 до 12 лет. Из этой группы 19 собак с дирофиля риозом были эвтаназированы по показаниям и на вскрытии у них обна ружены зрелые дирофилярии в сердце и легочных артериях;
12 здоро вых собак, погибших от автотравмы, служили контролем при исследо вании гистологической картины легких.
Для функциональной характеристики аэрогематического барьера был выбран белок-D (SP-D) сурфактанта легких. Выбор обусловлен тем, что этот белок обладает двойственными характеристиками. С одной стороны, обладая гидрофильностью, белок обеспечивает адекватную степень увлажнения сурфактанта и ряд других его физических характе ристик. С другой стороны, белок-D обеспечивает защиту респираторно го тракта от инфекционных агентов (А.Е. Абатуров, 2011;
Jounblat et al., 2004;
Hartl, Griese, 2006;
Kishore et al., 2006).
Учитывая, что метаболизм сурфактанта происходит на уровне аль веолярного пространства (Clark, Reid, 2003), появление компонентов сурфактанта в крови может свидетельствовать о снижении резистентно сти аэрогематического барьера легких.
Определение концентрации SP-D осуществляли иммунофермент ным методом (автоматический иммуноферментный анализатор "Alisei", Италия) с использованием тест-наборов для собак фирмы «Cusabio» (КНР). Концентрация белка выражалась в нг/мл.
Другой маркер – фактор Виллебранда (WF) был выбран по следую щим причинам. Данный фактор синтезируется мегакариоцитами и преиму щественно эндотелием (А.И. Грицюк, Е.Н. Амосова, И.А. Грицюк, 1995;
В.В. Долгов, П.В. Свирин, 2005). С учетом этого интенсивность синтеза данного фактора в основном определяется функциональным состоянием мегакариоцитов и эндотелия (З.С. Баркаган, 2000;
Ф.Дж. Шиффман, 2000).
Для определения фактора Виллебранда использовался иммуно ферментный метод и тест-наборы для собак фирмы «Cusabio» (КНР).
Анализы выполнены в аккредитованной лаборатории НИИ биологии Южного федерального университета (г. Ростов-на-Дону).
Клиническое обследование здоровых и больных животных прово дили по общепринятой методике с последующим занесением результа тов в соответствующие протоколы и истории болезни. У животных из подкожной вены предплечья, латеральной вены сафены утром натощак брали кровь, которую затем исследовали на наличие микрофилярий ме тодом насыщенного (обогащенного) мазка по Knott и иммунохромато графическим методом (Canine SNAP 4Dx, IDEXX) для качественного выявления специфических антигенов Dirofilaria immitis.
Для гистоморфологического исследования кусочки легких фикси ровали в нейтральном формалине и заливали в парафин (Б. Рамейс, 1954), после чего изготавливались микросрезы толщиной 5-6 мкм. Сре зы окрашивали гематоксилин и эозином (М.С. Роскин, 1955).
Для количественной оценки выраженности патологического процес са использовалась морфометрическая методика Г.Г. Автандилова (1990).
Для оценки дыхательной поверхности легких был введен индекс А/МА соотношение площадей альвеол к площади альвеолярного пространства.
Таблица 1 - Экспериментально-клинический материал и методы исследования № Количество Характер исследования п/п животных Изучение морфологической картины легких 1. у здоровых собак, погибших от автотравмы Изучение морфологической картины легких 2. у больных дирофиляриозом собак Исследование концентрации белка-D сурфактанта 3. легких у здоровых собак разных пород Исследование фактора Виллебранда 4. у здоровых собак разных пород Исследование концентрации белка-D сурфактанта 5. легких у больных дирофиляриозом собак разных пород Исследование концентрации фактора Виллебранда 6. у больных дирофиляриозом собак разных пород 7. Клиническая оценка течения дирофиляриоза Идентификация дирофиляриоза методом 8. обогащенной капли по Knott Идентификация дирофилярий 9. иммунохромотаграфическим методом Статистическую обработку проводили с помощью методов вариаци онной статистики, корреляционного анализа по Спирмену, точного крите рия Фишера и Хи-квадрат с использованием стандартной компьютерной программы «Biostat». Различия считались достоверными при р0,05.
Полученные результаты и их обсуждение.
Как показали исследования, определение SP-D в плазме крови здо ровых собак выявили значительные колебания данного маркера в крови в основном в диапазоне от 0,20 нг/мл до 51,05 нг/мл. Однако в 13,5% эти по казатели оказались более 100 нг/мл (101,08 нг/мл-200,0 нг/мл). Средняя концентрация в исследуемой группе составила 6,36±3,28 нг/мл (табл. 2).
Сравнение показателей концентрации по половому признаку не выявило достоверных различий (Р0,5).
Таблица 2 - Сравнительный анализ содержания белка-D (SP-D) сурфактанта в плазме крови (нг/мл) здоровых и больных дирофиляриозом собак разных возрастов Контингент животных Возрастные группы здоровые больные концентрация, нг/мл концентрация, нг/мл 15,87±3, 6,36±3, 1. Вся группа (n=47) (n=32) р0, 18,64±11, 0,53±0, (n=7) 2. До 2-х лет (n=11) р0, р2-40, р2-30, 6,88±3,53 1,71±0, (n=16) (n=35) 3. От 2-х лет до 8 лет р2-30,1 р0, р2-40,02 р3-20, 56,83±14, 36,75± 6, (n=5) 4. Более 8 лет (n=5) р4-20, р4-30, р4-30, *Примечание: р - достоверность рассчитана между показателями здо ровых и больных собак.
Сравнение концентрации маркера SP-D в зависимости от породы, среди которых были представители пород немецкой овчарки, лабрадора, цвергшнауцера, ротвейлера, русского черного терьера, также не выяви ло достоверных различий. Однако интересные закономерности были выявлены при анализе показателей в зависимости от возраста. Так, наи меньшая концентрация определялась у собак в возрасте от 1 до 2-х лет.
В возрастной группе от 2-х до 8 лет средняя концентрация по сравнению с группой 1-2 года значительно возрастала (6,88±3,53 нг/мл), однако статистически различие не выявилось из-за большого разброса показателей статистического ряда.
Сравнение показателей в возрастной группе более 8 лет выявило дос товерные различия (56,83±14,20 нг/мл) по сравнению с возрастной группой 1-2 года (0,53±0,13 нг/мл;
p0,02) и с группой 2-8 лет (6,88±3,53 нг/мл;
p0,01). Эти закономерности подтверждались при проведении корреляци онного анализа между показателями концентрации SP-D и возрастом как у здоровых (r=0,66;
p0,01), так и у больных (r=0,74;
р0,008) собак.
Можно предположить, что с возрастом резистентность аэрогемати ческого барьера снижается, и белок-D появляется в плазме крови здоро вых собак. Не исключено, что высокие показатели маркера SP-D у здоро вых собак могли быть обусловлены перенесенной легочной патологией.
Надо полагать, что выявленные 13,5% собак с высокими показателями концентрации белка Д, возможно, относились к такой категории собак.
Анализ показателей концентрации маркера SP-D у больных дирофи ляриозом собак во всей исследуемой совокупности показал достоверно бо лее высокие показатели (6,36±3,28 нг/мл – у здоровых, 15,87±3,00нг/мл – у больных;
p0,039) концентрации белка-Д, но неравнозначные в различ ных возрастных группах.
В отличие от группы здоровых собак, в группе больных лишь у од ной особи уровень белка определялся более 100 нг/мл. Эти же особенно сти наблюдались и в группе до 2-х лет, но разница уже оказалась значи тельной и достоверной (0,53±0,13 нг/мл – у здоровых;
18,64±11,63 нг/мл – у больных;
p0,05).
Интересные показатели были обнаружены в группе более 2-х и менее 8 лет. Концентрация SP-D значительно оказалась ниже, чем у здоровых со бак аналогичного возраста. Кроме этого, концентрация маркера больных собак оказалась достоверно ниже, чем в группе больных собак до 2-х лет.
Полученные данные свидетельствуют о том, что в условиях забо левания и хронического течения дирофиляриоза резистентность альвео локапиллярной мембраны на определенном этапе возрастает. Возможно, что уменьшение концентрации плазменного пула белка-D свидетельст вует о снижении синтезирующей функции альвеоцитов и клеток Клара у больных собак в возрасте от 2 до 8 лет. Это подтверждается более низ кими показателями концентрации маркера у больных собак, особенно сук, по сравнению с группой здоровых собак такого же возраста. Здесь уместно провести аналогию с исследованиями, проведенными на людях, в которых показано, что развитие такого опасного осложнения, как рес пираторный дистресс-синдром взрослых (РДСВ), при котором ведущим механизмом является нарушение синтеза сурфактанта, значительно тя желее протекает у женщин (Gong et al., 2004).
Анализ показателей в зависимости от половой принадлежности показал, что концентрация белка-D у особей женского пола с дирофиля риозом достоверно не отличалась от показателей здоровых собак анало гичного пола. Такой зависимости не было выявлено у кобелей (рис. 1);
у больных кобелей концентрация достоверно (p0,01) оказалась выше (8,13±1,08 нг/мл), чем у здоровых (2,97±1,74 нг/мл). Соответственно, у больных кобелей концентрация значительно превосходила аналогичные показатели у сук (p0,01).
* * здоровые 4 больные кобели суки Рис. 1 - Концентрация белка-D у здоровых и больных собак разного пола Примечание: ** - достоверность (р0,01) между показателями здоро вых и больных собак;
- достоверность (р0,01) между показателями собак разных полов.
Как оказалось, порода собак и степень проницаемости для SP-D не влияла на исследуемый показатель, однако у наиболее представитель ной группы больных – немецких овчарок, как и ожидалось, проницае мость оказалась выше, чем у здоровых (2,34±1,27 нг/мл – у здоровых;
8,41±3,74 нг/мл – у больных).
Особый интерес представляли данные, полученные у собак с различ ной морфологической картиной заболевания. Были выделены 2 группы со бак в зависимости от характера гистологической картины в легких: с при знаками острого воспаления и с признаками хронизации процесса (рис. 2).
Оказалось, что острое течение пневмонии сопровождается значи тельным увеличением проницаемости аэрогематического барьера (65,15±16,06 нг/м), которая оказалась выше, чем у здоровых, и выше, чем у собак с хроническим характером течения воспалительного про цесса в легких (11,61±2,07 нг/мл;
р0,006).
Такое явление можно объяснить тем, что острое воспаление в лег ких сопровождается выбросом провоспалительных цитокинов (IL-1, IL-6, FNO и др.), усилением оксидационных процессов, что сопровождается повышением проницаемости и выходом компонентов воспаления в про свет альвеол с повреждением системы сурфактанта (З.А. Лупинская, 2003;
И.В. Зотова, Д.А. Затейщиков, Б.А. Сидоренко, 2005).
острое хроническое здоровые * * * * * * * * SP-D, нг/мл WF,нг/мл Рис. 2 - Концентрация белка-D сурфактанта и фактора Виллебранда в плазме крови собак в зависимости от характера течения воспалительного процесса в легких Примечание: * - достоверность (* - р0,05;
** - р0,01;
*** - р0,001) между показателями здоровых и больных собак;
- достоверность (р0,001) между показателями собак с различных характером течения заболевания.
Известно, что в норме синтез и деградация сурфактанта происходят на уровне альвеоцитов и клеток Клара, при этом продукты синтеза или де градации в кровь либо не попадают, либо попадают в минимальном коли честве (Haistma, U. Lachman, B. Lachman, 2004). В условиях повышенной проницаемости и увеличения отека интерстициальной ткани на первых этапах увеличивается образование лимфы в легких (Johnson et al., 1982).
Так, в опытах отечественных авторов (С.А. Симбирцев, Н.А. Беляков, 1986), проведенных на модели микроэмболии легких у собак, отмечено увеличение лимфотока по грудному и правому лимфатическим протокам в течение 1,0-1,5 часов после эмболизации на 40%, а через 4 часа по правому лимфатическому протоку – в 7 раз. Это может быть механизмом проникно вения компонентов сурфактанта, включая и белка-D, в сосудистое русло.
Выявленные изменения в системе сурфактанта, в частности, белка-D сурфактанта, у больных дирофиляриозом собак являются предпосылкой к снижению местной иммунной защиты легких с риском развития вос паления легких.
Следует обратить внимание на то, что, по современным данным, белок-D может определять и направление воспалительной реакции: ли бо по варианту острого воспаления, либо с переходом в хроническую форму. В этом случае SP-D может обеспечивать направленность иммун ных реакций либо за счет провоспалительных цитокинов: IL-1, TNF-2, IL-12, iFN, либо активацией макрофагов с выработкой противовоспа лительных цитокинов: iL-10, iL-13 (Е.Н. Вассерман и соавт, 2010;
Marti nez, Sica, Mantovani, Locati, 2008).
Направленность этих реакций, как показано в наших исследовани ях на примере острого и хронического воспаления легких, зависит от концентрации этого фактора в плазме крови. В этом отношении SP-D выступает как уникальный эндогенный фактор, действующий по прин ципу «два в одном» (С.В. Лямина с соавт, 2011).
Исходя из полученных данных, более активная деградация сур фактанта и белка-D, повышение плазменного пула SP-D сопровождают ся острым течением, а умеренное повышение концентрации либо его от сутствие – переходом в хроническую форму воспаления в легких. На правленность этих реакций могла быть определена функциональным со стоянием эндотелия, изменения которого мы обнаруживали при изуче нии его функциональных и морфологических характеристик.
Эндотелий является одной из важнейших составляющих гистоге матического барьера легких и во многом определяет его характеристи ки, что особенно важно было рассмотреть в нашем исследовании.
Следует отметить, что у здоровых собак колебания концентрации фактора Виллебранда оказались весьма значительными и составили от 0,44 нг/мл до 120,50 нг/мл. Самое низкое значение определялось у цвер гшнауцера, а самое высокое – у суки бельгийской овчарки. В то же вре мя статистических различий концентрации фактора в зависимости от породы собак выявлено не было. Однако по половому признаку были обнаружены существенные отличия. Оказалось, что концентрация фак тора Виллебранда у сук в значительной мере превышает таковую у ко белей (31,62±6,03 нг/мл и 6,20±1,65 нг/мл – соответственно;
р0,002).
Корреляционной зависимости концентрации фактора Виллебранда от возраста животного (r=-0,01;
р0,5) не выявлялось.
Таблица 3 - Сравнительный анализ содержания фактора Виллебранда в плазме крови (нг/мл) здоровых и больных дирофиляриозом собак разных возрастов (Мср±m0) Контингент животных Возрастные группы здоровые больные концентрация, нг/мл концентрация, нг/мл 10,91±1,66 (n=43) Вся группа 23,99±6,20 (n=35) р0, До 2-х лет 18,65±9,77 (n=14) 9,50±5,46 (n=9) 16,31±2,13 (n=29) От 2-х лет до 8 лет 24,63±2,01 (n=16) р0, Более 8 лет 29,40±7,03 (n=5) 18,38±2,15 (n=5) *Примечание: достоверность рассчитана по отношению к показате лям здоровых животных.
У больных собак синтезирующая функция эндотелия оказалась сниженной, что подтверждалось отсутствием особей с высокими пока зателями уровня фактора Виллебранда. Пределы колебаний показателя концентрации составили от 0,48 нг/мл до 36,59 нг/мл. В среднем во всей совокупности концентрация фактора составила 10,91±1,66 нг/мл.
Снижение функциональной активности эндотелия у больных собак (табл. 3) доказывалось достоверным уменьшением концентрации фактора Виллебранда. Так, концентрация фактора Виллебранда у больных собак уменьшалась с 23,99±6,20 нг/мл (у здоровых) до 10,91±1,66 нг/мл (у больных), что подтверждалось высокой степенью достоверности разли чий (р0,026). Наиболее заметно эти изменения определялись в возрас тной группе от 2 до 8 лет (р0,012).
Половые различия у больных собак оказались весьма существен ными. Так, у сук концентрация фактора по сравнению с кобелями оказа лась достоверно выше (р0,03), но по сравнению со здоровыми суками концентрация оказалась в 2 раза ниже (31,62±6,03 нг/мл – у здоровых сук;
16,32±2,84 нг/мл – у больных;
р0,33). В то же время у кобелей та ких различий вообще не выявлялось (р0,5). Надо полагать, что глист ная инвазия у особей мужского пола в меньшей степени нарушает син тезирующую функцию эндотелия, вероятно, из-за генетических особен ностей, связанных с полом. Как и в случае с определением маркера SP-D, так и в случае определения фактора Виллебранда, различий по породам собак выявлено не было.
У животных с острым течением пневмонии отмечалась значитель ная активация синтеза фактора Виллебранда, концентрацию которого бо лее чем в два раза (23,99±6,20 нг/мл – у здоровых;
51,29±6,93 нг/мл – у больных собак) превосходила концентрацию, определяемую у здоровых собак (р0,03). В случае хронического течения процесса в легких имело место подавление синтезирующей функции эндотелия. Это подтвержда лось значительным снижением уровня фактора Виллебранда у больных собак с хроническим течением воспаления в легких (0,81±0,24 нг/мл) как по сравнению с группой с острым течением (р0,001), так и по сравне нию с группой здоровых собак (рис. 3).
Следовательно, при остром течении пневмонии обнаруживаются доказательства активации эндотелиальной функции с повышением син теза фактора Виллебранда. При хроническом течении воспалительного процесса в легких обнаруживаются признаки эндотелиальной дисфунк ции, проявляющиеся в снижении синтеза эндотелием фактора Виллеб ранда. В современной физиологии эндотелий по гормональной активно сти рассматривается как одна из мощных эндокринных желез, выраба тывающая более 20 биологически активных субстанций (О.А. Гомазков, 2001;
З.А. Лупинская, 2003). В первую очередь они обеспечивают мест ную регуляцию соответствия тонуса сосудов и реологических свойств крови. Наиболее активными в этом отношении являются эндотелин, ан гиотензин-II, брадикинин и оксид азота (О.А. Гомазков, 1995). При дей ствии токсичных агентов, какими представляются продукты жизнедея тельности дирофилярий и сами дирофилярии, может активироваться об разование продуктов перекисного окисления оксида азота-пероксинит рата, который сам по себе является мощным повреждающим агентом, повышающим проницаемость сосудов (П.П. Голиков, В.И. Картавенко, Н.Ю. Николаева и др., 2000). Кроме того, продукты жизнедеятельности паразита являются антигенами, которые вызывают иммунологическую реакцию на поверхности эндотелия и провоцируют каскад воспалитель ной реакции (К.А. Хайдаров, 2011). Отек интерстиция легких, который мы обнаруживали морфологически, может приводить к нарушению ме таболической функции легочной ткани, что сопровождается снижением интенсивности инактивации ангиотензина-II и накоплением его в легких (Tel et al., 2005). Увеличение уровня ангиотензина-II приводит к проли ферации мышечного слоя сосудов, угнетению синтеза NO, усилению синтеза мощного вазоконстриктора-эндотелина (О.А. Гомазков, 1995;
2001;
З.А. Лупинская, 2003), который увеличивает агрегацию тромбоци тов и эритроцитов в системе микроциркуляции и повышает артериаль ное давление в малом и большом круге кровообращения (Killy, Baffi gand, Smith, 1996). Важно отметить, что ангиотензин-II способствует образованию пероксинитрата (З.А. Лупинская, 2003). Такой комплекс является мощным цитотоксическим агентом, который способен повреж дать эндотелий, интерстициальную ткань и сурфактант легких. При по вреждении эндотелия начинают активно вырабатываться эндотелины, повышающие артериальное давление в большом и малом круге крово обращения (Killy, Baffigand, Smith, 1996).
* 20 здоровые 15 больные кобели суки Рис. 3 - Содержание фактора Виллебранда у здоровых и больных сук и кобелей Примечание: * - достоверность (р0,05) между показателями здоровых и больных собак одноименных полов;
- достоверность (р0,001) меж ду показателями собак разных полов.
Совокупность указанных факторов способствует формированию легочной гипертензии. При исследовании морфологической картины определялись признаки прекапиллярной гипертензии, наряду с ростом мышечного слоя сосудов и переходом их у части животных в склероз.
Следовательно, в генезе легочной гипертензии лежат не только механические факторы, обусловленные тромбозом сосудов малого круга дирофиляриями, но и совокупность метаболических факторов. С учетом этого целесообразно в комплексном лечении дирофиляриоза, вызванно го D.immitis, применять блокаторы ангиотензинпревращающего фер мента (АПФ) либо блокаторы АТ-1 рецепторов ангиотензина-II.
Описанные закономерности в значительной степени соответство вали морфологической картине легких. Наши исследования гистологи ческой картины легких при дирофиляриозе показали, что в начальной стадии (фазе) болезни в патоморфозе легких преобладают изменения, сходные с аллергической реакцией хозяина на внедрение микро- и ди рофилярий, что проявляется в выраженной сосудистой реакции – гипе ремии, стаза, микротромбоза. Характерным в эту фазу заболевания яв ляется нарушение кровообращения в микроциркуляторном русле, экс судативная воспалительная реакция со стороны сосудистой стенки, ин терстиция и терминальных бронхов.
Во второй фазе заболевания поражение легких можно связать с механическим воздействием дирофилярий – тромбозами, тромбэмбо лиями, вторичной (прекапилярная) гипертензией в малом круге крово обращения.
В третьей фазе заболевания преобладает токсическое и гиперток сическое воздействие, связанное с гибелью и лизисом дирофилярий.
Обнаруживаются признаки интерстициальной, а в тяжелых случаях и очаговой геморрагической пневмонии.
Четвертая фаза характеризуется хронизацией воспалительного процесса с развитием пневмосклероза, фиброза, выраженной пролифе рации и склероза мышечных слоев артериол.
Морфометрический анализ позволил выявить уменьшение площа ди просвета и площади альвеол на фоне увеличения площади межальве олярной ткани (рис. 4).
Это подтверждалось достоверным снижением индекса А/МА (р0,001). Увеличение межальвеолярной ткани было обусловлено высо кой степенью проницаемости для плазмы и форменных элементов кро ви. Результатом повышенной проницаемости аэрогематического барьера явилось появление значительных количеств SP-D в крови, особенно при остром воспалительном процессе в легких. При умеренной концентра ции SP-D в крови реакция в легких протекает бессимптомно, а при зна чительных уровнях белка – с выраженной воспалительной реакцией. Та кая картина вполне согласуется с имеющимися в литературе данными о способности белка-D определять интенсивность воспалительной реак ции (С.В. Лямина и соавт., 2011).
16 * * * 12 * * * * расширены * 6 сужены * обычных размеров Здоровые животные Животные с патологией Рис. 4 - Морфометрические показатели альвеол легких здоровых и больных дирофиляриозом собак Примечание: *** - достоверность (р0,001) рассчитана между пока зателями здоровых и больных собак.
На основании проведенных исследований и литературных данных нами представлена схема основных патофизиологических звеньев, ле жащих в основе повреждения гистогематического барьера легочной ткани при дирофиляриозе (рис. 5).
Инвазия микрофиляриями приводит к их размножению в подкож ной клетчатке, а затем – в сосудистом русле собаки, и особенно в таких местах, как легочные артерии и артериолы. По мере увеличения количе ства микрофилярий в кровь попадают продукты их жизнедеятельности, которые обладают общетоксическим, а также иммунным эффектом. На этом этапе в месте локазилации микрофилярий и дирофилярий, в ре зультате воздействия повреждающих факторов, возникает воспаление с выделением провоспалительных интерлейкинов, активных форм оксида азота, которые вызывают повреждение эндотелия.
Нарушения функции эндотелия (эндотелиальная дисфункция) приводят к повышенной проницаемости гемато-альвеолярного барьера для плазмы крови и форменных элементов с последующей активацией макрофагов. В результате нарушения трофической функции эндотелия, а также за счет появления плазмы в просвете альвеол нарушается струк тура и синтез сурфактанта. Это приводит к нарушению метаболизма ос новных компонентов сурфактанта, в том числе и исследуемого нами белка-D (SP-D). В результате повышенной проницаемости гистогемати ческого барьера часть белка-D появляется в общем кровотоке.
ИНВАЗИЯ Размножения и рост дирофилярий Преимущественное расселение дирофилярий в легочных артериях Выделение экзотоксинов в малый круг кровообращения Поражения эндотелия, развитие эндотелиальной дисфункции, резкое нарушение сосудистой проницаемости Нарушение синтеза Выход плазмы и Отек меж- Активация фактора белка-D сурфактант форменных эле альвеолярного Виллебранда и ной системы, сниже ментов крови в пространства, аутоиммунного ние местного иммуни альвеолы, акти уменьшение воз- ответа, образование тета, развитие ателек вация макрофагов душности легких микротромбов тазов, эмфиземы Системное поражение легочной ткани, формирование артериальной легочной гипертензии, нарушение метаболической функции легких и диффузионной способности, развитие дыхательной недостаточности ГИПОКСИЯ Рис. 5 - Схема патогенеза поражения легких в условиях инвазии дирофиляриями(d.immitis) В зависимости от концентрации белка в плазме крови воспали тельная реакция в легких может протекать по типу острого воспаления, а в случае незначительного количества белка воспаление в легких при обретает хроническое течение.
В этих условиях нарушаются синтез и инактивация биологически ак тивных веществ (в частности, ангиотензина-II), способствующих пролифе рации мышечного слоя сосудов, развитию склеротических изменений, формированию артериальной легочной гипертензии. Совокупность указан ных факторов приводит к формированию острой либо хронической дыха тельной недостаточности, которая в свою очередь приводит, по принципу обратной связи, к активации патогенетических факторов (легочная гипер тензия, нарушения реологии крови, повышение проницаемости, изменение метаболической функции легких и др.), нарушающих дыхательную и мета болическую функцию легких. Гипоксия и снижение местной иммунной за щиты легких, обусловленные нарушением метаболизма белка-D и эндоте лиальной дисфункцией, являются факторами риска по развитию вторичных легочных осложнений и дыхательной недостаточности.
Проведенное нами исследование позволило сделать следующие выводы.
ВЫВОДЫ:
1. Дирофиляриоз сопровождается нарушением морфофункцио нальных характеристик гистогематического барьера легких, нарушением синтеза компонентов сурфактанта и его утилизации, развитием эндотели альной дисфункции, уменьшением дыхательной поверхности легких с последующим развитием дыхательной недостаточности и гипоксии.
2. Резистентность аэрогематического барьера для белка-D с возрас том снижается, что подтверждается наличием достоверной прямой кор реляционной связи между концентрацией маркера в плазме крови и воз растом как у здоровых особей (r=0,66;
р0,01), так и у больных собак (r=0,74;
р0,008), при этом наиболее выраженное снижение резистентно сти отмечено у больных собак в возрасте до 2-х лет, а белоксинтезирую щей функции легких по отношению к белку-D в возрасте от 2-х до 8 лет.
3. Половые различия функционального состояния гистогематиче ского барьера легких для белка-D в условиях инвазирования дирофиля риями характеризуются более высокой проницаемостью аэрогематиче ского барьера независимо от породы собак у особей мужского пола и умеренной у особей женского пола.
4. В острой стадии воспаления в легких у больных дирофилярио зом собак резистентность аэрогематического барьера снижена, что ха рактеризуется повышением концентрации белка-D в плазме крови, при этом уровень белка-D в значительной степени превосходит уровень бел ка-D у собак с хроническим процессом в легких.
5. Острое течение воспалительного процесса в легких характери зуется значительным увеличением концентрации фактора Виллебранда, а при хроническом – снижением, при этом как в условиях нормы, так и в условиях патологии концентрация фактора Виллебранда у особей жен ского пола превосходит аналогичные показатели особей мужского пола, особенно в возрастной группе от 2-х до 8 лет независимо от породы собак.
6. Морфологическая картина легких у собак, больных дирофиля риозом, свидетельствует о наличии неспецифического воспаления с фазным течением, характеризующимся в острой фазе нарушением про ницаемости аэрогематического барьера, развитием отека интерстиция, кровоизлияниями в интерстиций и альвеолы, а в хронической фазе склеротическими изменениями в сосудах и интерстиции с последующим развитием эмфиземы и ателектазов.
Практические рекомендации:
1. В научно-педагогической практике преподавания курса патоло гической физиологии при изложении патогенеза поражения малого кру га кровообращения при дирофиляриозе целесообразно внести получен ные автором сведения и схему поражения аэрогематического барьера легких.
2. С целью оптимизации лечения и профилактики поражений ма лого круга кровообращения целесообразно провести клиническое ис следование и изучить влияние ингибиторов ангиотензинпревращающего фермента (АПФ) либо блокаторов рецепторов-1 (АТ-1 рецепторов) ан гиотензина-II.
3. Данные по содержанию фактора Виллебранда и белка-D сур фактанта легких у здоровых собак разных пород рекомендуется исполь зовать в качестве нормативных показателей.
Публикации по теме диссертации:
1. Ермаков А.М. Особенности патогенеза поражения легких в ус ловиях инвазии дирофиляриями (D.immitis) / Ермаков А.М., Лысенко ва А.С., Колодий И.В. // Ветеринарная патология.- 2012.- №4. - С. 71-73.
2. Ермаков А.М. Проницаемость аэрогематического барьера легких для белка-D сурфактанта (SP-D) у здоровых и пораженных дирофиляриозом собак / А.М. Ермаков, А.С. Лысенкова, И.В. Коло дий // Российский ветеринарный журнал. Мелкие домашние и дикие животные.– 2013. - №1. - С. 16-18.
3. Лысенкова А.С. Диагностическая ценность определения белка D (SP-D) сурфактанта легких у здоровых и больных дирофиляриозом собак / А.С. Лысенкова // Материалы Всероссийской научно-практи ческой конференции аспирантов, докторантов и молодых ученых. Майкоп: Изд-во Солодовникова А.Н., 2012.- С. 52-57.
4. Лысенкова А.С. Морфологическая картина легких собак с диро филяриозом / А.С. Лысенкова // Материалы Всероссийской научно-прак тической конференции (14-15 июня 2012 г.) «Научное обеспечение ус тойчивого развития отрасли животноводства Российской Федерации». Новочеркасск, 2012. - С. 93-97.
5. Лысенкова А.С. Морфометрическая характеристика легких со бак при поражении их дирофиляриозом / А.С. Лысенкова // Междуна родный журнал экспериментального образования.- 2012.- №6.- С. 15-16.
6. Лысенкова А.С. Морфологические основы формирования ле гочной гипертензии у собак с дирофиляриозом / А.С. Лысенкова, И.В.
Колодий // Материалы XX Международной научно-практической кон ференции «Экологические проблемы современности».- Майкоп: МГТУ, 2012.- С. 187-189.
7. Лысенкова А.С. Нарушения проницаемости гистогематического барьера легких для белка-D сурфактанта у собак с дирофиляриозом / А.С.
Лысенкова // Успехи современного естествознания.- 2012. -№7.- С. 140-141.
8. Лысенкова А.С. Оценка функционального и морфологиче ского статуса гистогематического барьера легких у собак с дирофи ляриозом / А.С. Лысенкова // Современные проблемы науки и обра зования [Электронный ресурс]. - 2013. - №1. - Режим доступа:
www.science-education.ru/107-8221 (дата обращения: 29.01.2013).
9. Лысенкова А.С. Роль эндотелия в генезе поражения легких у собак с дирофиляриозом / А.С. Лысенкова // Материалы ХХ Всероссий ской научно-практической конференции «Образование-наука-техно логии».- Майкоп: Изд-во МГТУ, 2012.- С. 49-51.
10. Лысенкова А.С. Фактор Виллебранда в генезе дисфункции лег ких собак с дирофиляриозом / А.С. Лысенкова // Современные наукоем кие технологии.- 2012.-№7.- С. 55-57.
11. Лысенкова А.С. Характер поражений легких собак с дирофи ляриозом и их морфометрическая характеристика / А.С. Лысенкова // Материалы Всероссийской научно-практической конференции аспиран тов, докторантов и молодых ученых.- Майкоп: Изд-во Солодовникова А.
Н., 2012.- С. 49-52.
Лысенкова Антонина Сергеевна (Россия) ФУНКЦИОНАЛЬНО-МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГИСТОГЕМАТИЧЕСКОГО БАРЬЕРА ЛЕГКИХ У СОБАК ПРИ ДИРОФИЛЯРИОЗЕ На больных дирофиляриозом и здоровых собаках (n=113) исследо ваны проницаемость гистогематического барьера (ГГБ) легких для бел ка-D (SP-D) сурфактанта, синтез фактора Виллебранда (WF) и морфоло гическая картина легких. Установлено, что резистентность ГГБ легких с возрастом снижается как у здоровых, так и у больных дирофиляриозом собак. Наиболее выраженные нарушения проницаемости отмечены у кобелей в возрастной группе до 2-х лет. Острое течение воспалительно го процесса в легких сопровождается повышением проницаемости ГГБ для белка-D (особенно у кобелей) и повышенным синтезом фактора Виллебранда, особенно выраженным у сук. При хроническом течении воспаления в легких отмечается снижение синтеза WF на фоне повы шенной проницаемости для белка-D. Характерных изменений, связан ных с породой собак, выявлено не было. Гистологическая картина лег ких характеризуется фазными изменениями, отражая переход острого воспаления в хроническое. Описанные нарушения являются основой для формирования дыхательной недостаточности и гипоксии.
Lysenkova Antonina Sergeevna, Russia FUNCTIONAL-MORFOLOGICAL CHARACTERISTICS OF HISTO-HAEMATICAL BARRIER OF LUNGS IN DOGS SUFFERING FROM DIROFILARIOSIS Our sample was made up of healthy and dirofilariosis infected dogs (n=113),the goal of research was to analyze the permeability of the HHB for the SP-D protein, production of von Willebrand factor and morphological view of lungs. An analysis of the results from testing canines demonstrated that resistance of HHB of lungs towards SP-D correlates with the age and goes down by the age of the entire pool of healthy and infected dogs. Most significant violations of permeability of HHB were observed among males in the age group under 2 years. Acute type of inflammation of lungs characteriz es by increase of permeability of HHB for SP-D (especially, among males) and by high production of von Willebrand factor among female dogs. Chronic type of inflammation is characterized by increase of permeability of HHB for SP-D and, at the same time, reduction of production of von Willebrand factor.
However, significant differences were not observed according to any particu lar breed.Histological view of lungs characterizes by phases, which illustrate transaction from acute to chronic inflammation.Thus, described violations serve a base for respiratory insufficiency and hypoxia.
ЛЫСЕНКОВА Антонина Сергеевна ФУНКЦИОНАЛЬНО-МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГИСТОГЕМАТИЧЕСКОГО БАРЬЕРА ЛЕГКИХ У СОБАК ПРИ ДИРОФИЛЯРИОЗЕ Автореферат Подписано в печать 27.02.2013 г.
Формат бумаги 60х841/16. Бумага ксероксная. Гарнитура Таймс.
Усл. печ. л. 1,25. Заказ №012. Тираж 100 экз.
ИП Коблева М.Х.
385000, г. Майкоп, пер. Дачный,