Кристаллохимия и морфогенезис природных и биомиметических апатит-(caf)-органических композитов

На правах рукописи

Россеева Елена Владимировна КРИСТАЛЛОХИМИЯ И МОРФОГЕНЕЗИС ПРИРОДНЫХ И БИОМИМЕТИЧЕСКИХ АПАТИТ-(CaF)-ОРГАНИЧЕСКИХ КОМПОЗИТОВ 25.00.05 – минералогия, кристаллография

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата геолого-минералогических наук

Санкт-Петербург 2010

Работа выполнена на кафедре кристаллографии геологического факультета Санкт-Петербургского государственного университета Научный руководитель доктор геолого-минералогических наук, профессор Ольга Викторовна Франк-Каменецкая СПбГУ, Санкт-Петербург

Официальные оппоненты: доктор химических наук, член-корреспондент РАН Виктор Владимирович Гусаров СПбГТИ(ТУ), Санкт-Петербург кандидат геолого-минералогических наук, доцент Михаил Владимирович Морозов СПбГГИ(ТУ) им. Г.В. Плеханова, Санкт-Петербург Институт геологии Коми научного центра

Ведущая организация:

Уральского отделения Российской Академии наук

Защита состоится 18 февраля 2010 г. в 15 ч. 00 мин. на заседании совета Д 212.232.25 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу:

199034, Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, СПбГУ, геологический факультет, ауд. 52.

E-mail: [email protected]

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им.

А.М. Горького Санкт-Петербургского государственного университета.

Автореферат разослан « января 2010 года»

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат геол. – мин. наук Е.В. Баданина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

.

Актуальность исследования. Изучение особенностей строения и образования вещества биологических твердых тканей имеет фундаментальное значение для выяснения механизмов коэволюции минеральной и органической материи, приведших к формированию биосферы, которая стала мощным фактором, влияющим на геохимические процессы в литосфере, гидросфере и атмосфере (Вернадский, 1926, 1935;

Самойлов, 1929;

Лапо, 1987;

Юшкин, 1988, 1993,2002 и др.). Исследования в этой области открывают новые возможности для решения широкого круга геологических задач, связанных с разработкой методов биостратиграфического картирования, поиском и оценкой перспективности месторождений полезных ископаемых. Кроме того, результаты этих исследований широко применяются при создании современных биосовместимых материалов медицинского назначения.

Образующиеся в живых организмах физиогенные органо минеральные композиты (кости, зубы, иголки, скорлупа яиц, экзоскелеты моллюсков и др.) характеризуются особой иерархической самоорганизующейся структурой (Кораго, 1992;

Landis et al., 1996;

Glimcher, 2006). Согласно современным представлениям, вещество твердых тканей ряда живых организмов (морских ежей, моллюсков, кораллов, фораминифер и др.) представляет собой особый тип наноструктурированных материалов, называемых мезокристаллами (Coelfen, Antonietti, 2008;

Zhou, Brien, 2008). Основным минеральным компонентом твердых тканей костей и зубов человека и многих живых организмов является нестехиометрический по составу карбонатсодержащий апатит-(CaOH), который, в процессе фоссилизации превращается в карбонатсодержащий апатит-(CaF) (Elliott, 1994, 2002;

Frank-Kamenetskaya, 2008 и др.). В ряде случаев карбонатсодержащий апатит-(CaF) может составлять основу твердых тканей живых организмов, примером этого является эмалеподобная ткань зубов акулы и рыбы-кабана.

Вещество биологических твердых тканей, в том числе кристаллохимические особенности апатита биогенного происхождения, исследованы недостаточно. Известно, что особенности зарождения и роста апатита в биологических системах контролируются не только значениями температуры, давления и рН среды, но и спецификой присутствующего органического вещества, которое существенно влияет и на структуру агрегата в целом. Механизм этого сложного биокосного взаимодействия, а также всего процесса биоминерализации, в настоящее время являются дискуссионным. Предложено несколько феноменологических моделей формирования твердых тканей живых организмов (Кораго, 1992;

Landis et al., 1996;

Gross, Berndt, 2002;

Glimcher, 2006), которые, однако, не вполне объясняют ключевые закономерности этого сложного процесса. В последние годы существенный прогресс в изучении механизмов биоминерализации достигнут при моделировании образования апатито органических агрегатов в условиях, имитирующих биологический процесс при биомиметическом синтезе (Kniep, Busch, 1996;

Kniep, Simon, 2006, 2008). Проведение новых исследований в данной области имеет как научное, так и практическое значение.

Цель и задачи исследований.

Цель работы - изучение кристаллохимии и морфогенезиса вещества биологических твердых тканей на основе апатита.

Основные задачи

.

1. Изучение морфологии, нанокомпозитной структуры и состава вещества фоссилизованных твердых тканей элементов ротового аппарата конодонтов.

2. Синтез биомиметических апатит-(CaF)-желатиновых композитов аналогов вещества биологических твердых тканей.

3. Изучение морфогенезиса апатит-(CaF)- желатиновых композитов.

4. Выявление влияния карбонат-иона на морфогенетические особенности, нанокомпозитную структуру и изоморфизм апатита синтезированных композитов.

Научная новизна. Изучена кристаллохимия и морфогенезис природных и биомиметических апатит-(CaF)-органических композитов.

Впервые показано, что вещество альбидной и гиалиновой тканей элементов ротового аппарата конодонтов представляет собой полностью или частично наноструктурированный материал Методом (мезокристалл).

монокристального рентгеноструктурного анализа проведено уточнение кристаллической структуры апатита биогенного происхождения (альбидной ткани зубца конодонтового элемента). Синтезированы карбонатсодержащие апатит-(CaF)-желатиновые композиты, являющиеся аналогами вещества ряда биологических твердых тканей.

Экспериментально изучена начальная стадия образования апатит-(CaF) желатиновых нанокомпозитов. Выявлено, что присутствие карбонат-иона в среде кристаллизации существенно влияет на морфологию и внутреннее строение апатит-(CaF)-желатиновых нанокомпозитов. Показано, что вхождение карбонат-иона в структуру апатита-(CaF) приводит к образованию трех серий твердых растворов, различающихся по нестехиометрии и природе ее возникновения.

Практическое значение. Новые данные о структуре и составе вещества твердых тканей конодонтов можно использовать для уточнения классификации твердых тканей конодонтовых элементов, реконструкции процесса их образования и роста, а также таксономической принадлежности этих организмов. Результаты биомиметического синтеза аналогов вещества биологических твердых тканей имеют важное значение для создания биосовместимых материалов медицинского назначения. Результаты проведенных исследований используются в лекционных курсах «Кристаллическое вещество в живых организмах» и «Биоминералогия и органическая минералогия» (пилотный проект «Молекулярная геохимия и биогеохимия») для студентов геологического факультета СПбГУ, а также в курсе «Основы биологической минералогии» для студентов кафедры геологии и геоэкологии географического факультета РГПУ им.

А.И.Герцена.

Объекты и методы исследования. Фактическую основу диссертации составляют результаты изучения состава, строения и морфологических особенностей вещества природных и синтетических апатито-органических композитов. Было исследовано вещество твердых тканей S-элементов ротового аппарата конодонтов рода Polygnathus (отряда Ozarkodinida) из девонских отложений в районе озера Ильмень (Новгородская область), характеризующееся хорошей сохранностью твердых тканей. Образцы были получены от к.г.-м.н. А.В. Журавлева (ВНИГРИ, Санкт-Петербург). Кроме того, методом встречной диффузии в желатиновом геле были синтезированы биомиметические апатит-(CaF) желатиновые композиты. Кристаллизацию осуществляли в U-образной трубке-ячейке, в колена которой помещали растворы реагентов, разделенные цилиндрической колонкой из желатинового геля (концентрация желатина 10 мас.%). Колена ячейки заполняли растворами CaCl2 (0.1333 M) и Na2HPO4, Na2CO3, NaF. Исходное соотношение молярных концентраций CaCl2: Na2HPO4: Na2CO3:NaF = 5:5:x:1, значения x варьировали в диапазоне от 0 до 9 (шаг 0.5, 1). В качестве буфера для исходных растворов использовали трис-(гидроксиметил)-метиламин;

рН, используя 2 М раствор HCl, доводили до значения 7.40(2), которое близко к таковому в плазме крови человека. Начальное значение рН желатинового геля составляло 3.0(2). Синтез проводили в течение 3-21 суток при температуре 25 °С. В ходе эксперимента в желатиновом геле наблюдалось образование пространственно разделенных областей (колец Лизеганга С, М, Р) в которых образование продуктов реакции происходило наиболее интенсивно. Детальное изучение вещества природных и синтетических апатито-органических композитов было проведено методами порошковой и монокристальной рентгенографии, ИК- и КР-спектроскопии, различными методами химического анализа (атомно-эмиссионная спектроскопия с индуктивно-связанной плазмой, потенциометрия;

метод сожжения, комбинированный с горячей газовой экстракцией;

энергодисперсионный рентгеноспектральный микроанализ (ЭДС)), а также гистохимическим методом. Для определения содержания карбонат-ионов и желатина в синтетических биомиметических композитах впервые была использована методика, основанная на расчете их концентраций по данным о соотношении и содержании углерода и азота в чистом желатине и в исследуемом образце. Для однозначного определения присутствия в апатите композита гидрофосфат-иона и позиции карбонат-иона была разработана методика, основанная на совместном использовании ИК- и КР спектров;

получены зависимости для оценки количества карбонат-иона.

Изучение морфологии и иерархической структуры природных и синтетических композитов проводили с привлечением широкого спектра различных методов сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии (СЭМ, ПЭМ). При детальном исследовании структуры агрегатов на нанометровом уровне применяли методы высокоразрешающей ПЭМ (ВР-ПЭМ) и электронной дифракции (ЭД). Приготовление ультратонких срезов для ПЭМ исследований осуществляли ультрамикротомическим методом и методом ионного травления с использованием фокусированного ионного пучка. При изучении электрических свойств частиц синтетических композитов, а также для определения их толщины привлекали метод электронной голографии. При обработке экспериментальных данных использовали статистические методы (метод анализа главных компонент, кластерный и регрессионный анализы).

Защищаемые положения.

1.Нанокомпозитная структура вещества исследованных твердых тканей конодонтовых элементов различается по степени разориентировки кристаллитов карбонатсодержащего апатита В-типа, содержанию органической компоненты и микроэлементов, а также размеру и распределению пор. Вещество альбидной и гиалиновой ткани представляет собой полностью или частично наноструктурированный материал (мезокристалл).

биомиметических апатит-(CaF)-желатиновых 2.Формирование нанокомпозитов начинается с образования мозаичной структуры из нанопластинок апатита вдоль макромолекул желатина, проходит стадию образования упорядоченных гексагонально-призматических композитных частиц сопровождающуюся формированием (мезокристаллов), сверхструктуры нанокомпозита и его внутреннего электрического поля, и заканчивается образованием сферолитов (путем расщепления частиц через серию гантелеобразных форм).

3.С увеличением концентрации карбонат-ионов в среде кристаллизации их содержание в апатите растет (за счет замещения фосфат ионов), что приводит к увеличению числа вакансий в позициях кальция и фтора. Параллельно разориентировка кристаллитов апатита увеличивается, их размеры уменьшаются, призматические грани мезокристаллов замещаются округлыми поверхностями, характер расщепления частиц изменяется.

апатит-(CaF)-желатиновые агрегаты по 4.Синтезированные нанокомпозитной структуре, содержанию белковой компоненты и особенностям изоморфизма апатита являются аналогами вещества твердых тканей ряда современных и ископаемых организмов.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на международных и российских конференциях: «Федоровские сессии» (Санкт-Петербург, 2006, 2008), «The 11th European Conference on Solid State Chemistry» (Кан, Франция, 2007), «CRTD Summer Conference on Regenerative Medicine» (Дрезден, Германия, 2007), «3nd Bilateral Workshop MPI CPfS and Ko University» (Стамбул, Турция, 2008), «Минералогические музеи» (Санкт-Петербург, 2008), «БIОМIНЕРАЛОГIЯ – 2008» (Луцк, Украина, 2008), «III Российское совещание по органической минералогии» (Сыктывкар, 2009). По теме диссертации по приглашению проф. В. Депмайера в 2008 г была прочитана лекция в Университете им. Христиана Альбрехта (Киль, Германия).

По теме диссертации опубликовано 14 работ, в том числе 7 статей (из них 6 в журналах, входящих в список ВАК).

Работа выполнена при частичной финансовой поддержке Российского Фонда Фундаментальных Исследований (грант №06-05- 65165) и Германского исследовательского фонда (DFG-Biomineralisation: KN 150/14-1 и BR 306/34-1). Отдельные разделы работы отмечены дипломами Российского минералогического общества: диплом победителя конкурса докладов молодых ученых России на международной конференции «Федоровская сессия» (октябрь, 2008);

диплом первой степени в конкурсе научных работ молодых ученых России (октябрь, 2009).

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, шести глав, заключения и списка литературы. Общий объем диссертации 209 страниц, включая 105 рисунков, 17 таблиц и библиографию из наименований.

Благодарности. Работа выполнена на кафедре кристаллографии геологического факультета СПбГУ под руководством доктора геол.-мин.

наук профессора О.В. Франк-Каменецкой, которую автор благодарит за выбор тематики исследования, всестороннюю помощь и внимательное отношение к работе. Выполнение работы во многом стало возможным в результате сотрудничества с проф. д-ром Р.Книпом и другими сотрудниками Института химической-физики твердого тела общества Макса Планка, Дрезден, Германия (д-ром П. Зимоном, д-ром У. Шварцом, д-ром В.Г. Каррилло-Кабрере, д-ром Ю. Процем, д-ром Х. Борманом, д-ром Р. Кордоссо, д-ром Г. Ауферманн, Я. Будер), которых автор искренне благодарит за помощь в проведении экспериментов и интерпретацию данных. Автор признателен д.г.-м.н. О.А. Головановой (ОмГУ, г. Омск) за то, что она обратила внимание диссертанта на проблему биоминерализации в организме человека и за помощь на начальном этапе работы. Автор благодарит за поддержку и полезное критическое обсуждение материалов диссертации преподавателей и научных сотрудников геологического факультета СПбГУ (проф. д.г.-м.н. Ю.О. Пунина, проф. д.г.-м.н. А.Г.

Булаха, проф. д.г.-м.н. С.В. Кривовичева, д.г.-м.н. А.Г. Штукенберга, к.г. м.н. И.В. Рождественскую, к.г.-м.н. М.Л. Зорину, к.г.-м.н. Е.Б. Трейвуса, к.г.-м.н. Т.Ф. Семенову, И.И. Баннову), весь коллектив кафедры Кристаллографии СПбГУ, а также Ю.В. Плоткину (ИГГД РАН, Санкт Петербург) и О.Л. Пихур (СПб МАПО, Санкт-Петербург). Особая благодарность к.г.-м.н. А.В. Журавлеву (ВНИГРИ, Санкт-Петербург) за предоставление уникальной коллекции конодонтовых элементов и консультации. Сердечно благодарю своих родителей за огромную помощь и поддержку на всех этапах работы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

.

1. Нанокомпозитная структура вещества исследованных твердых тканей конодонтовых элементов различается по степени разориентировки кристаллитов карбонатсодержащего апатита В-типа, содержанию органической компоненты и микроэлементов, а также размеру и распределению пор. Вещество альбидной и гиалиновой ткани представляет собой полностью или частично наноструктурированный материал (мезокристалл).

Результаты рентгено- и электронографии, дополненные данными элементного анализа и колебательной спектроскопии, показали, что минеральная компонента всех тканей исследованных конодонтовых элементов (рис.1) представлена карбонатсодержащим апатитом-(CaF) (B типа). Содержание карбоант-иона не превышает 2 мас. % и в апатите альбидной ткани меньше, чем в гиалиновой. По результатам сканирующей и просвечивающей (в том числе высокого разрешения) электронной микроскопии вещество исследованных тканей характеризуется нанокомпозитной Рис. 1. Корональная часть структурой, различающейся по S-элемента конодонта степени порядка и содержанию органического вещества.

Вещество, расположенное в ядрах зубцов альбидной ткани, представляет собой «пористый монокристалл». Нанокомпозитная структура наиболее упорядочена (дифракционная картина характерна для монокристалла) и практически не содержит органического вещества (рис.

2). Нанокристаллы апатита имеют одинаковую кристаллографическую ориентацию с (ось параллельна оси роста – удлинению зубца). Ткань Рис. 2. ПЭМ изображение вещества содержит микропоры (до 10 пористой альбидной ткани зубца мкм) и частично конодонтового элемента и (а) упорядоченные удлиненные полученная от этой области ассоциаты из нанопор (~10- электронограмма (б) нм), которые, вероятно, образовались на месте фибрилл органического вещества. Результаты уточнения кристаллической структуры апатита альбидной ткани методом монокристалла (R = 0.017, Rw = 0.022) выявили его близость к стехиометрическому апатиту-(CaF) (Sudarsanan et al., 1972). Расщепление позиции одновалентного аниона в каналах структуры указывает на присутствие гидроксил-ионов и молекул воды. Примесные катионы металлов расположены в позиции Са2. Уточненная в результате структурного исследования кристаллохимическая формула имеет вид:

Ca4(Ca5.45Sr0.19Na0.10Sn0.03Pb0.03K0.02Mg0.01 0.15){(PO4)5.83(SiO4)0.05(CO3)0.12} {F1.54Cl0.04(ОН)0.06(H2O)0.36}.

Нанокомпозитная структура вещества ткани внешней каймы наименее упорядочена (дифракционная картина характерна для поликристаллов) и содержит существенное количество органического вещества. Толщина каймы при переходе от вершины зубцов к стержню конодонтового элемента увеличивается от нескольких десятков нм до нескольких мкм. Угол между нанокристаллами апатита (между которыми располагаются поры) может достигать ~ 50, их размер варьирует от нескольких единиц до нескольких десятков нанометров. На ВРПЭМ изображениях каймы отчетливо видны удлиненные изогнутые жгутообразные образования (диметр 6-7нм), представляющие собой минерализованные фибриллы (или их остатки) органического вещества ткани.

Вещество, составляющее основу стержней гиалиновой ткани, характеризуется слоистой неоднородной нанокомпозитной структурой с промежуточной степенью порядка (менее упорядоченной, чем структура альбидной ткани, но существенно более упорядоченной, чем структура ткани внешней каймы). Дифракционная картина меняется от монокристаллической, на которой присутствуют диффузные отражения, до практически поликристаллической (появляются дополнительные рефлексы и диффузные кольца). Преимущественно вещество гиалиновой ткани характеризуется упорядоченной структурой, состоящей из кристаллитов апатита, ось с которых практически параллельна оси роста (размеры упорядоченных доменов достигают нескольких мкм). При этом во всех областях присутствуют разориентированные нанокристаллы апатита (до нескольких десятков нм). Поры в основном сконцентрированы в интраламеллярном пространстве, а также между кристаллитами. От границы с альбидной тканью зубцов к области основания стержня конодонтового элемента разупорядоченность распределения кристаллитов и пористость ткани увеличиваются.

Согласно современным представлениям, альбидная и гиалиновая ткани представляют собой особый тип наноструктурированных материалов, называемых мезокристаллами. Изучение характера растворения конодонтового элемента солянокислом растворе ЭДТА (рН~2) показало, что наиболее химически стабильной является вещество альбидной ткани зубцов, при этом после полного растворения минеральной компоненты органическая матрица практически полностью сохраняет морфологию исходного элемента. Результаты гистохимических исследований конодонтовых элементов, протравленных в присутствии Coomassie Blue (0.005%), указывают на то, что после растворения минерального вещества, органический остаток гиалиновой ткани содержит вещества белковой природы или продукты их разложения (синее окрашивание). Вещество исследованных твердых тканей отличается по содержанию как основных (Са, Р, F), так и примесных (Na, Mg, Sr, Si, S, Cl) элементов. Результаты кластерного анализа показали, что суммарное содержание микроэлементов в гиалиновой ткани значительно выше по сравнению с альбидной.

Концентрация микроэлементов максимальна в области у основания стержня, наиболее интенсивно контактирующей с окружающей средой.

Формирование биомиметических апатит-(CaF)-желатиновых 2.

нанокомпозитов начинается с образования мозаичной структуры из нанопластинок апатита вдоль макромолекул желатина, проходит стадию образования упорядоченных гексагонально-призматических композитных частиц сопровождающуюся (мезокристаллов), формированием сверхструктуры нанокомпозита и его внутреннего электрического поля, и заканчивается образованием сферолитов (путем расщепления частиц через серию гантелеобразных форм).

По данным комплексного электронномикроскопического исследования образование апатит-(CaF)-желатиновых нанокомпозитов, начинающиеся с нуклеации апатита на макромакромолекулах коллагена (Kawska et. al., 2008) (стадия 1, рис.3) и заканчивается образованием сферолитов (стадия 8, рис.3). Результаты ВРПЭМ исследований показали, что в желатиновой матрице на начальной стадии морфогенезиса (стадия 2, рис. 3) присутствуют удлиненные сноповидные агрегаты, состоящие из макромолекул желатина, частично минерализованных апатитом. На ВР ПЭМ изображении частично минерализованной макромолекуле желатина хорошо видны отдельные домены (средний размер 10х7х3.5 нм) апатита (CaF) вдоль макромолекулы белка (ось с апатита параллельна длиной оси макромолекулы белка), формирующие своеобразную мозаичную структуру.

За счет присоединения и срастания частично минерализованных макромолекул белка, которые преимущественно параллельно друг другу, образуются практически полностью минерализованные удлиненные наноблоки (20-50х300нм). На следующей стадии (стадия 3, рис.3) происходит формирование сноповидных агрегатов, состоящих из наноблоков, которые частично разориентированы относительно друг друга (угол между ними может достигать 30°). Атомное отношение Са/Р в апатите составляет 1.42(5), что указывает на существенный дефицит кальция.

Проекция электрического потенциала в виде концентрических линий вокруг частицы (размер 150 х 700 нм), полученная путем реконструкции электроноголографического фазового изображения, указывает на наличие заряда вокруг частицы, возникшего вследствие ее облучения электронным пучком. На следующей стадии (стадия 4, на рис. 3) происходит формирование агрегатов с более упорядоченной структурой, сложенной из практически параллельно ориентированных наноблоков, диаметр которых по прежнему составляет 20-50 нм. Распределение электрического потенциала вокруг агрегата (размером 1300 х 350 нм), в целом, соответствует электрическому диполю и очень близко к наблюдавшемуся ранее, вокруг уже сформировавшейся гексагонально-призматической частицы (Simon et.al., 2004, 2006;

Kniep, Simon, 2007) (стадия 6, на рис. 3).

На стадии 4 линии электрического потенциала вокруг частицы характеризуются наличием осцилляций (их форма несколько отклоняется от правильной монотонной), что, вероятно, является следствием частичной разупорядоченности наноблоков. На дифракционных картинах некоторых частиц, полученных с помощью Фурье-преобразования ВР-ПЭМ изображений, на данной стадии появляются диффузные параллельные полосы, расположенные перпендикулярно a* апатита. Таким образом, структура исследуемого композита характеризуется сверхпериодом ~ 10 нм, который примерно в 6 раз больше трансляции вдоль направления [ 2 1 1 0 ] в структуре апатита. Образование сверхпериода обусловлено одномерно упорядоченным распределением дефектов, образующихся в местах выхода на поверхность тройных спиралей макромолекул белка (желатина), на которых происходит нуклеация и рост апатита (Simon et.al., 2004, 2006;

Kniep, Simon, 2007). Цепочки из упорядоченно организованных дефектов вдоль направления a* апатита смещены относительно друг друга случайным образом. Наблюдаемое на стадии 4 уширение сверхструктурных диффузных полос на FFT-изображении, указывает на то, что распределение дефектов на данной стадии образования существенно разупорядоченно. На данной стадии морфогенезиса в структуре агрегатов видны три области, различающиеся ориентацией микрофибрилл желатина относительно граней:

1 - направлены преимущественно перпендикулярно к базальной грани (0001);

2- изогнуты и простираются от центра агрегата к поверхности боковых граней;

3 - ориентируются преимущественно перпендикулярно поверхности призматических граней. На следующей стадии (стадия 5, рис.

3) происходит утолщение частиц по призматическим граням в центральной части агрегата, которое распространяется вдоль всей грани в направлении к базальным плоскостям. В результате образуются микрометровые гексагонально-призматические частицы (стадия 6, на рис. 3), представляющие собой электрические диполи (Simon et.al., 2006, 2009;

Kniep, Simon, 2007). По данным ЭДС атомное отношение Са/Р для апатита на 6 стадии морфогенезиса увеличивается до 1.65(5), т.е. приближается к стехиометрическому значению Затем идет расщепление 1.67.

«гексагонально-призматических частиц» с последующим формированием гантелеобразных структур (стадия 7 на рис.3). Завершается этот процесс образованием сферических агрегатов с поперечной бороздкой (стадия рис.3). Для биомиметических расщепленных агрегатов характерны два основных типа морфологии: «фрактальный» (fractal) (доминирует в Р и МР кольцах Лизеганга) и «веероподобный» (fan-like) (доминирует в С и МС кольцах Лизеганга) (Tlatlik et.al., 2006;

Kniep, Simon, 2007). Для композитов «фрактального» типа характерно наличие центрального «перешейка» (“free bridge”) между расщепленными областями (рис. 4а верхняя строка), что приводит к формированию сферолитов с двулистником. При образовании агрегатов расщепление распространяется «веероподобных» непосредственно от центра исходных гексагонально-призматических частиц (рис. 4а нижняя строка). Формирование сферолитов можно объяснить хорошо разработанным механизмом расщепления кристаллов за счет формирующихся в процессе роста внутренних напряжений (Краснова, Петров, 1997;

. Пунин, Штукенберг, 2008). Нельзя также исключить влияние на морфогенетические особенности биомиметитических нанокомпозитов их внутреннего электрического поля, генерируемого встроенными макромолекулами белка (Kniep, Simon,2007, 2008). По данным химического анализа образцов, выделенных на ранних стадиях морфогенезиса (5 дней кристаллизации), содержание желатина в них составляет ~ 5 мас.%, что примерно в 2 раза больше по сравнению с агрегатами, образующимися на более поздних стадиях роста (21 день кристаллизации), т. е. степень минерализации агрегатов по мере их роста увеличивается.

Рис. 3. Схема, иллюстрирующая стадии морфогенезиса апатит-(CaF) желатинового композита: от атомистического уровня (1) до образования сферолита (8).

3. С увеличением концентрации карбонат-ионов в среде кристаллизации их содержание в апатите растет (за счет замещения фосфат-ионов), что приводит к увеличению числа вакансий в позициях кальция и фтора. Параллельно разориентировка кристаллитов апатита увеличивается, их размеры уменьшаются, призматические грани мезокристаллов замещаются округлыми поверхностями, характер расщепления частиц изменяется.

Результаты РФА, дополненные данными химического анализа и колебательной спектроскопии, показали, что в условиях эксперимента в желатиновой колонке в М-кольцах Лизеганга образуются композиты, минеральная компонента которых представлена карбонатсодержащим апатитом-(CaF) В-типа (содержание карбона-иона 0.05-7.5 мас.%), а органическая – желатином (2-3 мас.%). С увеличением концентрации карбонат-иона в апатите наблюдается значительное уменьшение параметра а и увеличение с. В результате отношение с/а увеличивается, а объем элементарной ячейки уменьшается. В целом, выявленные изменения п.э.я.

характерны для карбонатсодержащего апатита-(CaF) В-типа (LeGeros, 1967;

Elliot, 1994, 2002;

Fleet, Liu, 2008). Для апатита с содержанием карбонат иона до 4 мас.%. зависимость между п.э.я. и содержанием карбонат-иона линейна (R~0.98). При более высоких содержаниях карбонат-иона наблюдаются отклонения от этой линейной зависимости. Применение метода главных компонент факторного анализа и многомерного регрессионного анализа показало, что синтезированный апатит принадлежит к трем сериям твердых растворов, отличающихся по содержанию [СО3]2--иона, степени нестехиометрии и природе ее возникновения. Характерной особенностью первой серии твердых растворов, помимо минимального среднего содержания карбонат-иона (0.85 мас.%), является отсутствие вакансий в позиции фтора и, следовательно, молекул воды в каналах, а также низкое содержание по сравнению с другими сериями вакансий в позициях кальция. Относительное содержание гидрофосфат-иона в этой серии значительно выше, чем в других и превышает содержание карбонат-иона ([CO3]2-/[HPO4]2- 0.4).

Среднее значение [CO3]2-/Na+ = 0.45 (диапазон вариации от 0.05 до 0.99), что указывает на весомый вклад щелочного иона в компенсацию зарядов при вхождении в структуру гидрофосфат- и карбонат-ионов по схемам: Са2+ + [РО4]3- Na+ + [CO3]2-;

Са2+ + [РО4]3- Na+ + [HPO4]2-. Между содержанием ионов Na+ и [CO3]2- существует положительная парная корреляция (r = 0.70, P=0.922). Между суммарным количеством вакансий в позициях кальция и содержанием карбонат- и гидрофосфат-ионов существует сильная достоверная множественная корреляции (R = 0.994, Р=0.9998). При этом наибольший вклад в увеличение доли вакансий в позиции кальция вносит ион-[HPO4]2-(стандартизированный регрессионный коэффициент = 0.81, Р=0.998 ) по схеме 0.5Са2++[РО4]3- 0.5 Са+ [HPO4]2. Для иона [CO3]2- коэффициент составляет 0.20, при Р=0.85. Вторая серия твердых растворов отличается от первой большим средним содержанием карбонат-иона (3.03 мас.%), а также относительно более высоким содержанием ионов Na+ и низким [HPO4]2-. Величина соотношения [CO3]2 /[HPO4]2- для всех образцов больше 0.49 (диапазон значений 0.49-1.82).

Средняя величина отношения [CO3]2-/Na+ = 1.1 (диапазон 0.76-1.4), т.е.

существенно больше, чем для первой серии. Кроме того, важным признаком данной серии является появление небольшого числа вакансий в позиции фтора (0.08-0.2 на эл. яч.), которые частично могут быть заполнены молекулами воды по схемам Са2+ + F-Na++ ( F-,H2O);

0.5 Са2+ + F-0.5 Са + ( F-,H2O). Между количеством вакансий в позициях кальция и содержанием карбонат- и гидрофосфат-ионов, а также вакансий в позиции фтора существует сильная достоверная множественная корреляции (R = 0.978, Р=0.996). Однако, при Р=0.95 вклад третьей переменной F статистически недостоверен. Поэтому образование вакансий в позициях кальция в основном происходит по схемам с участием гидрофосфат- и карбонат-иона: 0.5Са2++[РО4]3- 0.5 Са+ [HPO4]2-, 0.5Са2++[РО4]3- 0.5 Са+ [СO3]2- (для двумерной регрессии R = 0.938, Р=0.995). Дополнительным отличием этой серии твердых растворов является то, что вклад [CO3]2- и [HPO4]2- в образование вакансий практически одинаков (соответствующие коэффициенты =1.52 и 1.56, статистически значимы при Р=0.998). Третью серию твердых растворов образуют образцы апатита с максимальным (по сравнению с первыми двумя) средним содержанием карбонат-ионов (5. мас.%), а также относительно более высоким количеством вакансий в позициях кальция и фтора и более низким - ионов Na+ и [HPO4]2-. Величина соотношения [CO3]2-/[HPO4]2- 0.62 (диапазон значений 0.62-2.25).

Соотношение [CO3]2-/Na+ изменяется в диапазоне от 1.11 до 2.70.

Достоверной корреляции между содержанием ионов Na+ и [CO3]2-, а также Na+ и [HPO4]2- не выявлено. Максимальное содержание вакансий в позиции F- для данной серии составляет 0.27 на эл.яч т.е. выше, чем в серии 2.

Между количеством вакансий в позициях кальция и содержанием ионов [CO3]2- и [HPO4]2-, а также вакансий в позиции фтора выявлена сильная достоверная множественная корреляции (R = 0.992, Р=0.999). Отличием от серии 2 является то, что все коэффициенты статистически значимы. При этом доминирующую роль в образовании вакансий в позициях кальция играет ион [CO3]2- ( = 0.865, Р= 0.9996 ). При этом коэффициенты для [HPO4]2- иона и вакансий в позиции фтора составляют 0.45 и 0.32, соответственно (статистически значимы при Р = 0.97).

Присутствие карбонат-иона в среде кристаллизации оказывает существенное влияние на морфологические и структурные особенности апатит-(CaF)-желатиновых композитов от нано- до микроуровня. Рост агрегатов начинается с удлиненных цилиндрических частиц с последующим формированием гантелеобразных структур и завершается образованием сферических агрегатов с поперечной бороздкой. Для карбонатсодержащих агрегатов также, как и для бескарбонатных агрегатов, характерны два основных типа морфологии: «фрактальный» и С «веероподобный» (рис.4).

увеличением содержания карбонат ионов призматические грани агрегатов становятся менее выраженными и замещаются округлыми поверхностями, а сами частицы сжимаются вдоль оси удлинения. По данным ПЭМ исследования карбонатсодержащих композитов на ранних стадиях образования гантелеобразных форм типа толщина Рис. 4. Агрегаты гантелеобразной «фрактального» апатит-(CaF)-желатиновых микрофибрилл желатина в формы структуре исследуемых агрегатов композитов: А – бескарбонатные;

Б- содержащие 6 мас.% СО32-. Верхняя составляет 6-7 нм, при этом они строка - «фрактальная» серия;

нижняя менее упорядочены по сравнению с бескарбонатными агрегатами.

строка - «веероподобная» серия.

Кроме того, в отличие от бескарбонатных аналогов, для этих агрегатов характерна, так называемая ядерно-корковая структура, характеризующаяся различным строением внутренней и внешней части агрегата. В центральном ядре частицы кристаллиты апатита значительно боле разоринтированы (до15-18°) по сравнению с различными участками каймы (до ~6°). Результаты ПЭМ исследований внутреннего строения сферических агрегатов по ультратонким срезам показали, что размеры наноблоков вдоль направления [0001] для карбонатсодержаших агрегатов (несколько десятков нанометров) существенно меньше по сравнению с бескарбонатными (несколько сотен нанометров). Диаметр наноблоков ~ 10-30 нм. Эти данные достаточно хорошо согласуются с результатами определения размеров областей когерентного рассеяния (ОКР) методом порошковой рентгенографии.

Согласно этим данным, по мере увеличения содержания карбонат ионов от 0.06 до 4 мас.% величина ОКР вдоль [0001] уменьшается от ~ 300 нм до ~ нм. Величина ОКР вдоль [10 1 0 ] практически не зависит от содержания карбонат ионов и равна ~ 30 нм. Такое изменение размеров кристаллитов свидетельствует об уменьшении анизотропии скоростей роста по мере увеличения концентрации карбонат-иона. Основные особенности морфологии и образования исследуемых карбонатсодержащих агрегатов также, как и бескарбонатных, можно объяснить хорошо разработанным механизмом образования расщепленных кристаллов при формировании сферолитов (Ульянова, Пунин, Петров, 1977;

. Пунин, 1981;

Пунин, Штукенберг, 2008). Основное влияние карбонат-иона на изменение морфологии агрегатов в процессе расщепления, вероятнее всего, связано с изменением анизотропии скоростей роста кристаллитов апатита, что проявляется в переходе от нормального (с отрывом) способа разрастания субиндивидов к тангенциальному (рис.4).

4.Синтезированные апатит-(CaF)-желатиновые агрегаты по нанокомпозитной структуре, содержанию белковой компоненты и особенностям изоморфизма апатита являются аналогами вещества твердых тканей ряда современных и ископаемых организмов.

Сравнение синтезированных апатито-желатиновых композитов с биологическими твердыми тканями показало, что в структуре синтезированных композитов так же, как и в случае вещества костной ткани хордовых (Landis et al., 1996;

Gross, Berndt, 2002;

Glimcher, 2006), наблюдается ориентированный рост кристаллитов апатита вдоль макромолекул желатина (ось с апатита параллельна оси удлинения макромолекулы белка). Синтезированные композиты так же, как и вещество ряда биологических твердых тканей (в том числе исследованных нами конодонтовых элементов), представляют собой наноструктурированный материал (мезокристалл) и в ряде случаев проявляют дифракционные свойства, характерные для монокристаллов. В апатите синтезированных композитов так же, как и в апатите биологических твердых тканей, карбонат-ион замещает фосфат-ионы (В-тип замещения). По содержанию органического вещества и кристаллохимическим особенностям апатита (таблица) синтезированные биомиметические композиты являются практически полными аналогами эмалеподобных твердых тканей некоторых современных рыб (акула, рыба кабан). Кроме того, апатит биомиметических композитов близок к апатиту твердых тканей ископаемых организмов с высокой степенью фоссилизации (содержание органической компоненты в них существенно варьирует). По содержанию органической составляющей, ионов натрия, и карбонат-иона синтезированные композиты близки к эмали зубов человека.

Заключение. С использованием широкого комплекса современных инструментальных методов проведено изучение кристаллохимии и морфогенезиса природных и биомиметических апатит-(CaF)-органических композитов. Изучена морфология и нанокомпозитная структура вещества твердых тканей S-элементов конодонтов рода Polygnathus (отряд Ozarkodinida) из девонских отложений вблизи озера Ильмень (Новгородская область). В условиях, имитирующих биологическую минерализацию, методом встречной диффузии в желатиновом геле синтезированы апатит (CaF)-желатиновые композиты, являющиеся аналогами вещества ряда современных и ископаемых биологических твердых тканей.

Проанализированы последовательные стадии формирования биомиметических апатит-желатиновых композитов. Изучено влияние карбонат-иона на их морфогенетические особенности, нанокомпозитную структуру и изоморфизм апатита. Полученные результаты выявляют неизвестные ранее особенности нанокомпозитной структуры вещества биологических твердых тканей и вносят существенный вклад в изучение процессов фосфатной биоминерализации.

Таблица. Сравнение состава биомиметических композитов и вещества различных твердых тканей современных и ископаемых организмов Твердые ткани Твердые Апатит-(СаF)- Эмалеподобная человека ткани Компонент желатиновые ткань зубов конодонтовых композиты акулы Эмаль Кость элементов Органическое не опр.

2.0-2.9 0.1 – 3 25 - 40 0.1 – вещество Апатит Ca, мас.% 35.4-37. 33.9-39.3 36.6-37.7 37.26 35.8-39. Na, мас.% 0.5-1.1 0.5-1.0 0.8-1.0 0.76 0.1- Mg, мас.% - 0.2-0.3 0.6-1.1 0.32 0.06-0. P, мас.% 15.5-17. 16.1-18.8 17.1-17.7 17.91 17.8-18. CO32-, мас. % 0.05-7.51.6 – 7.8 6.5-8.9 2. F, мас. % 3.3-4.20.1 – 0.3 0.03 -0.1 3.65 2.3-3. 9.441- 9.384 – a, 9.334-9.386 9.383 9.374, 9. 9.453 9. 6.878- 6.875 – c, 6.880-6.892 6.882 6.884, 6. 6.898 6. Elliott, 2002;

Франк Литературный LeGeros et al., Наши данные Каменецкая и др., Наши данные источник 2004 и др.

Основные публикаций по теме диссертации.

1. Россеева Е.В., Голованова О.А., Франк-Каменецкая О.В. Влияние аминокислот на образование нанокристаллического гидроксилапатита // Физика и химия стекла. Т. 33, № 3. 2007. С. 393-398.

2. Rosseeva E.V., Buder J., Simon P., Schwarz U., Frank-Kamenetskaya O.V., Kniep R. Synthesis, Characterization and Morphogenesis of Carbonated Fluorapatite- Gelatine Nanocomposites: A Complex Biomimetic Approach toward the Mineralization of Hard Tissues // Chemistry of Materials. 2008, Vol.20, N 19, P. 6003-6013.

3. Pikhur O.L., Rosseeva E.V., Plotkina Yu.V., Kasbohm J., Golovanova O.A., Frank-Kamenetskaya O.V., Zorina M.L. Features of the morphology and composition of salivary calculi of patients from Saint-Petersburg region // Medical Geology Newsletter, № 12, 2008. P. 24-29.

4. Россеева Е. В., Зимон П., Шварц У., Будер Я., Франк-Каменецкая О. В., Книп Р. Апатитo-желатиновые нанокомпозиты - аналоги биологических твердых тканей. I. Синтез и характеристика композитов. Изоморфные замещения в структуре карбонатсодержащего апатита-(CaF) // Записки Российского минералогического общества. 2009. №.4. С.53-71.

5. Simon P., Rosseeva E., Buder J., Carrillo-Cabrera W., Kniep R. Embryonic States of Fluorapatite-Gelatine-Nanocomposites and Their Intrinsic Electric Field Driven Morphogenesis: The Missing Link on the Way from Atomistic Simulations to Pattern Formation on the Meso-Scale // Advanced Functional Materials, 2009, Vol.19, N 22, P. 3596-3603.

6. Россеева Е. В., Франк-Каменецкая О. В., Голованова О. А., Зорина М.Л.

Образование минеральных фаз в прототипах ротовых жидкостей человека // Вестн. СПбГУ. Сер.7. 2009. Вып.2. С.12-20.

7. Россеева Е. В., Франк-Каменецкая О. В., Шварц У., Книп Р. Изоморфные замещения в структуре карбонатсодержащих фторапатитов, полученных при биомиметическом синтезе // Вестн. СПбГУ. Сер.7. 2009. Вып.3. С.35-48.

8. Россеева Е.В., Голованова О.А., Франк-Каменецкая О.В., Зорина М.Л.

Экспериментальное и термодинамическое моделирование образования основных минеральных фаз зубных камней // Федоровская сессия 2006, СПб, 2006. С.99-101.

9. Rosseeva E., Buder J., Simon P., Kniep R. Biomimetic synthesis of carbonated fluorapatite-gelatine-nanocomposites. A dedicated model system for getting insight into the human dental enamel biomineralization process // The 11th European Conference on Solid State Chemistry. Caen, France, 2007, P. 105.

10. Rosseeva E.V., Buder J., Simon P., Frank-Kamenetskaya O.V., Kniep R.

Morphogenesis and characterization of A biomimetic organic-mineral:

carbonated fluorapatite nanocomposites, a new approach for biomineralization of Материалы международного симпозиума hard tissues // VI «Минералогические музеи» Санкт-Петербург, 2008. С. 265- 267.

11. Rosseeva E.V., Simon P., Schwarz U., Buder J., Frank-Kamenetskaya O.V., Kniep R. Biomimetic Carbonated Fluorapatite - Gelatine Nanocomposites:

Synthesis, Characterization and Morphogenesis // Федоровская сессия 2008.

Тезисы докладов. СПб, 2008. С.217-218.

12. Frank-Kamenetskaya O.V., Rosseeva E.V., Zhuravlev A.V., Rozhdestvenskaya I.V.,Banova I.I., Simon P., Buder J., Carrillo-Cabrera W., Kniep R. Hard tissues of S-elements of late Paleozoic Conodont: microstructural and crystallographic aspects. // Федоровская сессия 2008. Тезисы докладов.СПб, 2008. С.229-231.

13. Rosseeva. E. V., Simon P., Schwarz U., Buder J., Frank-Kamenetskaya O. V., Kniep R. Carbonated fluorapatite-gelatine-nanocomposites – a biomimetic approach towards the mineralization of biological hard tissues. // Материали Мiжнародної нуково-практичної конференцiї «БIОМIНЕРАЛОГIЯ – 2008».

Луцьк: Волинський нацiональний унiверситет iм. Л. Українки, 2008.С.94-97.

14. Россеева Е.В., Франк-Каменецкая О.В., Журавлев А.В., Зимон П., Каррилло-Кабрера В.Г., Шварц У., Книп Р., Рождественская И.В., Баннова И.И. Нанокомпозитная структура твердых тканей S-элементов девонских конодонтов рода Polygnathus // Тезисы докладов «III Российского совещания по органической минералогии», Сыктывкар, 2009, С. 208-211.