5

На правах рукописи

УДК 579.22.577.121 ИГНАТОВ СЕРГЕЙ ГЕОРГИЕВИЧ РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ СОВРЕМЕННЫХ МЕТОДОВ ИЗУЧЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БИОНАНОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ПОДХОДОВ 03.02.03 – микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Оболенск – 2010 2

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении науки «Го сударственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благо получия человека.

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Дятлов Иван Алексеевич

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор Гальченко Валерий Федорович доктор биологических наук, профессор Шемякин Игорь Георгиевич доктор биологических наук Коломбет Любовь Васильевна

Ведущая организация:

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Биологиче ский факультет

Защита диссертации состоится 06 октября 2010 г. в 13-00 часов на заседании диссертационного совета Д 350.002.01 при ФГУН «Государственный науч ный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» по адресу: 142279, Оболенск Серпуховского района Московской области.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии»

Автореферат разослан «_» 2010 г.

Отзывы в двух экземплярах, заверенные печатью, просим отправлять по ад ресу:

142279, Оболенск Серпуховского района Московской области, ФГУН ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии, ученому секретарю совета Н.К. Фурсовой. Факс 8(4967) 36-00-10, e-mail: [email protected]

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Н.К. Фурсова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы Разработка новых методов анализа в микробиологии имеет большое зна чение для развития науки и применения ее результатов в различных отраслях народного хозяйства. Одним из наиболее востребованных направлений в микробиологии является разработка быстрых и чувствительных методов изу чения и идентификации бактерий на основе бионанотехнологий.

В настоящее время разнообразный анализ бактериальных клеток имеет большое значение в биотехнологии и медицине при создании биопрепаратов, оптимизации микробиологического синтеза продуктов и других биотехноло гических процессов, а также при разработке новых методов контроля и ди агностики. Наличие между клетками и измерительным прибором промежу точного звена в виде поддерживающей среды обуславливает ряд недостатков этих методов: инерционность процесса измерений и усреднение измеряемых параметров. Поэтому электрооптический метод анализа, основанный на ис следовании клеток как электрофизических объектов со слоистой структурой и измерении поляризационных характеристик клеточных структур, представ ляет собой новый подход к оценке прижизненных физиологических парамет ров клеток и их гетерогенности (Guliy et al., 2007). Различие электрических свойств среды культивирования (поддерживающей среды) и бактериальных клеток приводит к появлению индуцибельных зарядов при наличии поля.

Взаимодействие индуцированных зарядов с электрическим полем является причиной возникновения вращательного момента, задающим ориентацию клеткам. Изменение ориентации бактериальных клеток приводит к измене нию оптических свойств суспензии. Оптическая плотность суспензии может изменяться на 1-2%, однако этого достаточно для электрооптического анали за бактериальных клеток (Bunin and Angersbach, 2008). Этот метод измерений является прижизненным, он не использует дополнительных меток и не вызы вает изменений в исследуемом объекте. Преимуществом данного метода яв ляется то, что влияние среды на точность измерения поляризационных па раметров является незначительным и предсказуемым. Воздействие на бакте риальные клетки измерительной процедуры также незначительно, и при этом микроорганизмы сохраняют свою жизнеспособность. С помощью электрооп тического метода возможно определить количество и жизнеспособность бак терий. Метод является оперативным, причем процесс измерений может быть полностью автоматизирован.

Применение электрооптического метода для оценки состояния микроор ганизмов в ходе технологического процесса и для анализа взаимодействия бактерий со специфическими антителами и фагами является актуальной и будет раскрыта в данной работе Классические методы определения бактерий, основанные на культиви ровании микроорганизмов с последующим микробиологическим и биохими ческим анализом, являются трудоемкой и длительной процедурой с исполь зованием дорогостоящего оборудования. Биосенсоры - аналитически чувст вительная и недорогая альтернатива стандартным методам, применяемым се годня для идентификации бактерий (Deisingh and Thompson, 2002). Они представляют собой аналитические приборы для селективного определения веществ и организмов, в которых используется комбинация биологической системы узнавания и физического преобразователя. Увеличение числа анали зируемых образцов, требующих проверки и контроля, и потребность в высо кой чувствительности, скорости и точности аналитических измерений стиму лировали значительный интерес к развитию биосенсоров в качестве мощной и недорогой альтернативы по отношению к стандартным химическим и эн зимологическим методам, используемым на сегодняшний день. Вместе с тем, несмотря на применение биосенсоров на основе бактериальных клеток (Buchinger et al., 2010), практически нет данных по использованию клеточ ных фрагментов или субклеточных структур для повышения чувствительно сти и специфичности измерений субстратов. Отсутствуют также литератур ные данные и по использованию простых систем «искусственного носа» и систем на основе оптоволоконных пучков для идентификации бактерий.

Перспективным направлением является разработка биосенсора для анализа антиоксидантной активности веществ с последующим изучением их влияния на защитные функции макроорганизма.

Бионанотехнология – современная биологическая наука, оперирующая наноразмерными объектами. Возможности получения нанообъектов и спо собность анализировать их качественно изменяют уже существующие под ходы в исследованиях. Сканирующая зондовая микроскопия (СЗМ) получила такое название благодаря ключевому элементу, обязательно присутствую щему во всех её модификациях – зонду (Cuenat, 2010). Микроскопический зонд двигается, как правило, построчно вдоль поверхности исследуемого об разца, взаимодействуя с ним таким образом, что становится возможным де тектировать количественную характеристику этого взаимодействия, которая, в конечном счёте, и несёт информацию о свойствах объекта. Атомно силовая микроскопия (АСМ) принадлежит к семейству проксимальной зон довой микроскопии для анализа поверхности и ее свойств на атомно молекулярном уровне. В течение последних десятилетий достигнут большой прогресс в развитии АСМ как инструмента изучения нанообъектов в микро биологии (Dufrene 2002, Dufrene et al., 2009). С помощью АСМ можно полу чить трехмерное изображение поверхностных ультраструктур на молекуляр ном уровне в реальном времени и при физиологических условиях путем ана лиза взаимодействия между анализируемой поверхностью и специальным наконечником – кантилевером. Однако все исследования с применением АСМ в основном сводились лишь к наноразмерному анализу бактериальной поверхности. До проведения настоящей работы не была осуществлена спе цифическая иммобилизация вирусов и бактериальных клеток и/или их на нофрагментов для анализа и идентификации бактерий.

Важным аспектом бионанотехнологии является определение бактери цидной активности наносоединений (Nel et al., 2006). Следует учитывать, что наряду с этим, важна также их роль в функционировании макрофагов при фагоцитозе патогенов.

Бионатехнологии открывают новые перспективы для значительного увеличения чувствительности анализа и идентификации микроорганизмов.

Результаты работы очень важны для микробиологии, поскольку существенно расширяют и дополняют представления о методах идентификации прокариот и вносят существенный вклад в понимание процессов анализа бактериально го мира.

Цель исследования Основной целью работы является разработка и применение новых высо коэффективных методов изучения и идентификации бактерий на основе элетрооптических, биосенсорных и бионанотехнологических подходов.

Задачи исследования 1. Разработка электрооптического метода для анализа и контроля фи зиологического состояния бактерий и их выживаемости в ходе биотехноло гических процессов.

2. Выявление электрооптических изменений микробиологических сис тем, которые могут служить удобным инструментом идентификации микро организмов при анализе взаимодействия бактерий со специфическими анти генами и фагами.

3. Разработка биосенсоров с применением системы искусственного носа на основе высокоплотных оптоволоконных пучков для бесконтактной иден тификации микроорганизмов.

4. Изучение возможности использования глюкозного биосенсора для контроля синтеза авермиктина.

5. Разработка биосенсоров на основе бактериальных клеток или их фрагментов для определения глюкозы, лактата и определения концентрации бактерий.

6. Разработка биосенсора для определения антиоксидантной активности веществ.

7. Определение наличия микроорганизмов по анализу летучих компо нентов бактериальной культуры. Изучение возможности использования про стой модификации метода спектрофотометрического анализа для быстрого выявления присутствия микроорганизмов либо по выделению ими летучих компонентов, либо по их поглощению из окружающей среды.

8. Получение аффинных поверхностей и их анализ для использования бионанотехнологического подхода на основе атомно-силовой микроскопии для высокоспецифичной идентификации микроорганизмов.

9. Изучение токсического действия наносоединений на микроорганиз мы.

Научная новизна Разработан электрооптический метод диагностики физиологического состояния бактериальных клеток в процессе производства биологических препаратов и идентификации бактерий.

Впервые предложено использовать цитоплазматические мембраны бак терий для конструирования новых биосенсоров для определения лактата и оценки бактериальной обсемененности свежего коровьего молока. Использо ваны новые подходы для определения антиоксидантной активности веществ и их роли в ходе инфекционного процесса. Разработан новый простой метод определения бактерий по анализу органических летучих компонентов.

Впервые разработана система специфической визуализации прокариот с помощью АСМ. Предложены методы оценки бактерицидной активности на носоединений.

Практическая значимость Разработан электрооптический метод анализа выживаемости бактериальных клеток и оценки целостности клеточной оболочки в биотехнологических процессах, а также идентификации микроорганизмов (подана заявка на патент). Создана новая система биологического узнавания биосенсора на основе цитоплазматической мембраны бактерий, увеличивающая чувствительность определения лактата по сравнению с биосенсорами на основе бактериальных клеток. Реализована методология специфической визуализации прокариотических клеток и их фрагментов для сверхчувствительной идентификации микроорганизмов с помощью АСМ на основе аффинных поверхностей (Патент России RU 2261279 C1). Разрабо танные методические рекомендации широко используется Институтом тео ретической и экспериментальной физики (г. Москва) в вопросе исследования микроорганизмов с помощью атомно-силовой микроскопии. Разработан ме тод оценки бактерицидной активности наносоединеий для микроорганизмов и фагоцитарной активности макрофагов (готовится заявка на патент). Резуль таты работы применяются Национальным исследовательским технологиче ским университетом «МИСиС» при разработке новых видов нанопокрытий с учетом их бактерицидных свойств и функциональной активности фагоцитов.

Личный вклад соискателя Соискателю принадлежит решающая роль в выборе направлений иссле дований, в формулировании проблемы, постановке целей и задач, разработке экспериментальных подходов и обобщении результатов. Соискатель прини мал участие во всех этапах исследований. В работах, выполненных в соав торстве, соискатель принимал участие в проведении экспериментальной ра боты, в обобщении и интерпретации научных результатов, в подготовке на учных публикаций, а также выступал с научными докладами.

Апробация работы Основные положения диссертационной работы были представлены: на Всесоюзной конференции «Липиды биологических мембран» (Ташкент, г.), на XI научной конференции по итогам НИР ВНИИ ПМ (Оболенск, г.), на Всесоюзной конференции «Теория и практика электрооптических ис следований коллоидных систем» (Велегож, 1990 г.), на международной кон ференции «Развитие медицинского оборудования» (Подольск 1996 г.), на международном симпозиуме «Стресс и азотный обмен» (Москва, 1996 г.), на международном рабочем совещании НАТО «Быстрые методы анализа биоло гических материалов в окружающей среде» (Варшава, 1997 г.), на междуна родном рабочем совещании НАТО «Новые направления в развитии биосен соров» (Киев, 1998 г.), на международной конференции «Биокатализ-98» (Пущино, 1998 г.), на международной конференции «Биокатализ-2000» (Мо сква, 2000 г.), на Всероссийской конференции «Проблемы медицинской и экологической биотехнологии», (Оболенск, 1999 г.), на международной кон ференции «Современные проблемы биохимии и биотехнологии бактерий» (Пущино, 2000 г.), на международной конференции «Биосенсоры 2000» (Сан Диего, США, 2000 г.), на международной конференции «Окись азота: фунда ментальные исследования и применение в клинике» (Эриче, Италия, 2001 г.), на международных конференциях «IT + ME» (Гурзуф, 2003 г., 2007 г.), на международной конференции «Канадский биологический коллоквиум» (Мо сква, 2004 г.), на 5 международном совещании МНТЦ/Корея (Сеул, Корея, 2004 г.), на 37 международном совещании МНТЦ-Япония по наноматериалам (Цукуба, Япония, 2004 г.), на международной конференции «Нанотех» (Бос тон, США, 2006 г.), на VII Межгосударственной научно-практической кон ференции государств-участников СНГ "Чрезвычайные ситуации междуна родного значения в общественном здравоохранении и санитарная охрана территории государств-участников СНГ" (Оболенск, 2006 г.), на IX ежегод ном зимнем совещании «Успехи в исследованиях на молекулярном уровне для биологии и нанонауки» (Линц, Австрия, 2007 г.), на Первой Всероссий ской Школе-семинаре «Современные достижения бионаноскопии» (Москва, 2007 г.), на Международной конференции «Сенсоры для окружающей среды, здравоохранения и безопасности (Виши, Франция, 2007 г.), на IV междуна родной конференции «НаноБио и другие новые перспективные биотехноло гии» (Пущино, 2007 г.), на VI Всероссийской научно-практической конфе ренции с международным участием «Молекулярная диагностика - 2007» (Москва, 2007 г.), на Международном совещании экспертов по разработке лекарств (Москва, 2007 г.), на Международном форуме по нанотехнологиям (Москва, 2008 г), на Международной научно-практической конференции «Нанотехнологии в сельском хозяйстве» (Москва, 2008 г.), на Международ ной конференции «Евромат-2009» (Глазго, Великобритания, 2009 г.) и на Семинаре «Производство и применение наноматериалов в России: токсико логическое воздействие и нормативные вопросы” (Москва, 2009 г.).

Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, методов исследо ваний, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов, списка литературы. Диссертация изложена на 229 страницах, содержит таблиц, 88 рисунков. Список литературы включает 223 работы.

Публикации По теме диссертации опубликовано 74 печатные работы, 18 из которых представлены в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, издана одна монография, получен один патент, приняты две заявки на патент.

Место выполнения работы Работа проводилась в ГНЦ прикладной микробиологии и биотехнологии (Оболенск) в рамках НИР и международных проектов.

Основные защищаемые положения 1. Электрооптический метод анализа бактерий позволяет контролиро вать физиологическое состояние бактерий и их выживаемость в ходе биотех нологических процессов.

2. Новые биосенсоры на основе системы искусственного носа, фермен тов, фагов, бактериальных клеток или их фрагментов увеличивают чувстви тельность и скорость определения глюкозы, лактата и определения концен трации бактерий в анализируемой системе.

3. Использование бионанотехнологического подхода на основе атомно силовой микроскопии (АСМ) совместно с получением аффинных поверхно стей повышает чувствительность выявления микроорганизмов и их иденти фикации.

4. Применение АСМ позволяет более нативно анализировать аффинные взаимодействия в микробиологии.

5. Токсичность наноматериалов может оцениваться с помощью микро биологических приемов.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследований В работе использовали бактерии Escherichia coli, Micrococcus luteus, Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidis, Acetobacter aceti, Mycobacte rium tuberculosis, Bacillus brevis, Bacillus subtilis, Bacillus thuringiensis, Pseu domonas aeruginosa, Yersinia pseudotuberculosis, Streptomyces avermitilis и ас комицет Neurospora crassa. Для индукции специфических ферментативных активностей микроорганизмы культивировали на минимальных средах с раз личными источниками углерода. Мицелий аскомицета выращивали на моди фицированной среде Фогеля, содержащей минеральные соли, сахарозу и биотин.

Выделение мембран проводили путем осмотического лизиса сферопла стов (Игнатов и др. 1981), полученных после обработки клеток лизоцимом с последующей промывкой центрифугированием при охлаждении. Путем суб стратной индукции получали цитоплазматические мембраны (ЦПМ) с зара нее заданными ферментативными свойствами. Наличие нативной иммобили зации ферментативных ансамблей в липидном бислое обеспечивает более стабильную и чувствительную систему анализа. Поверхностный заряд ЦПМ изменяли, используя положительно заряженные цетилтриаммоний бромид и полилизин и отрицательно заряженные додецилсульфат натрия и полиаспа рагиновую кислоту.

Для проведения криоиммобилизации клетки и мембраны смешивали с заранее приготовленным 10 %-ным раствором поливинилового спирта. Сус пензию раскапывали по пластиковой поверхности и помещали в холодиль ник для формирования криогеля. После 24 ч экспозиции при низкой темпера туре гранулы иммобилизованных клеток и мембран оттаивали, промывали несколько раз фосфатным буфером (рН 7,4) и хранили в нем. Приготовлен ные заранее навески иммобилизованных биокатализаторов использовали для детекции соответствующих активностей.

Для размножения и титрования фагов использовали полужидкий L-агар с 0,4 %-ной глюкозой. Для экспериментов использовали заранее размножен ные фаги в концентрации – 1010–1011 частиц/мл.

Исследования антиоксидантной активности соединений проводили в электрохимической ячейке, имеющей трехэлектродную конфигурацию.

Ячейка объемом 1мл включала Ag/AgCl/ 1M KCl электрод сравнения и Pt об ратный (рабочий) электрод. Циклическую вольтаметрию осуществляли с ис пользованием системы "Автолаб". Для измерения антиоксидантной активно сти модифицированный золотой электрод поляризовали при +150мВ по от ношению к Ag/AgCl. В качестве потенциостата использовали «Биоанализа тор» фирмы Kreijci Engineering (Чехия).

При определении лактата для приготовления чувствительной к кислоро ду волоконно-оптической системы готовили тонкую силановую пленку с чувствительным к кислороду флуоресцентным красителем, рутений дифе нилфенантролином, которую механически крепили на конце оптического во локна. Пленку готовили путем приготовления фотополимеризующего рас твора, содержащего мономер силоксана, раствора красителя и индуктора на поверхности чашки. При помощи УФ лампы индуцировали полимеризацию раствора и механическое включение красителя в полимер. Полимерную пленку помещали в раствор дистиллированной воды и хранили в темноте пе ред использованием. На поверхность этого чувствительного к кислороду слоя помещали препарат ЦПМ, адсорбированный на целлюлозном диске. Всю конструкцию крепили на оптическое волокно нейлоновой сеточкой с помо щью резинового кольца.

АСМ-измерения проводили на атомно-силовом микроскопе Nanoscope IIIa (Digital Instruments, США) в режимах постоянного и прерывистого кон такта. При измерениях в контактном режиме сканирования использовали коммерческие кантилеверы из нитрида кремния (Si3N4) с жёсткостью 0,06, 0,32, 0,58 и 0,12 Н/м (в зависимости от объекта). Для измерений в режиме прерывистого контакта на воздухе использовали коммерческие кантилеверы из кремния с номинальной жесткостью 42 Н/м. Резонансная частота сканиро вания лежала в диапазоне 280-310 кГц. Измерения в жидкости проводили с использованием жидкостной ячейки (Digital Instruments, США) для режима прерывистого контакта, применяя коммерческие кантилеверы из нитрида кремния жесткостью 0,58 Н/м, при частоте сканирования 8-10 кГц.

Мышиные перитонеальные макрофаги получали путем инъекции сте рильного раствора NaCl (0,9 %) в перитонеальную область мышей. После аб доминального массажа собирали перитонеальную жидкость, которую по мещали на покровное стекло в присутствии среды 199 с 10 %-ной эмбрио нальной телячьей сывороткой в стерильной чашке Петри с нанообразцами.

Затем добавляли 100 мкл бактериальной суспензии (106 клеток/мл) и культи вировали 2 час при 37 °С. После инкубации монослой макрофагальных кле ток на покровном стекле фиксировали этанолом и окрашивали по Романов скому. Изменения бактерицидной активности макрофагов изучали с помо щью светового микроскопа Olympus BX41.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Глава 1 Электрооптические методы исследования На примере клеток E. coli и B. thuringiensis показана эффективная воз можность оценки жизнеспособности бактерий на основных этапах биотехно логического производства биопрепаратов - этапах ферментации, концентри рования и сушки. На получение и обработку электрооптических данных ухо дит не более 20 мин. При определении интактных клеток учитывался тот факт, что в интервале 7,5 lgfo 7,8 (где fo частота задаваемого поля) элек трооптический сигнал практически равен нулю. Оценку инактивирующего воздействия оценивали (в %) путем сравнения величины электрооптического эффекта (ЭОЭ) до и после воздействия в выбранном нами интервале частоты электрического поля. Электрооптические результаты сравнивали с результа тами, полученными путем высева бактериальных клеток на твердые пита тельные среды, с последующим подсчетом колониеобразующих единиц (КОЕ). Как видно из табл. 1, электрооптический метод позволяет аккуратно и быстро оценить жизнеспособность микроорганизмов после определенного экстремального воздействия.

Таблица 1 - Изменение ЭОЭ и жизнеспособности клеток E.coli и B. thu ringiensis на этапах ферментации, концентрирование и сушки Биотехнологический E. coli B. thuringiensis этап Выживаемость ЭОЭ, % Выживаемость ЭОЭ, % клеток, % клеток, % Инокулят 100 100 100 Ферментация 80±8 78±8 82±8 80± Концентрирование 67±8 65±8 68±8 67± Сушка 13±7 9±7 40±7 39± Небольшое занижение результатов выживаемости бактериальных кле ток, получаемое электрооптическим методом, объясняется тем, что данный метод регистрирует как летальные, так и сублетальные повреждения бакте рий. Данные повреждения и их репарация детально исследованы при изуче нии замораживания и оттаивания клеток, а также при их лиофилизации. Ока залось, что при замораживании-оттаивании активность мембраносвязанных оксидазных и дегидрогеназных ферментов, а также содержание цитохромов не меняется. Не наблюдается также структурных перестроек в липидной фазе мембраны и изменений в ее липидном составе. Однако замораживание оттаивание вызывает повреждение целостности клеточного барьера, с после дующим разобщением окислительного фосфорилирования. В ходе восстано вительных процессов (репарации) после экстремальных воздействий наблю дается восстановление целостности клеточного барьера, с последующим вос становлением синтеза АТФ в ответ на искусственно созданную протондви жущую силу.

Выбор электрофизических параметров эксперимента определялся тем, чтобы для данного вида микроорганизмов электрооптический сигнал успевал за минимально возможное время достичь максимума при включении поля и вернуться к исходному уровню при его выключении. Измерение поляризаци онных параметров клеток как функции частоты электрического поля или час тотной дисперсии анизотропии поляризуемости (ЧДАП) – позволяет опреде лить физиологическую активность клеток. После оптимизации состава под держивающей среды и электрофизических параметров электрооптических измерений было изучено влияние реакции антиген-антитело на ЧДАП ком плекса микроорганизм – антитело. К суспензии бактерий (E. coli или S. enteritidis) в фосфатно-солевом буфере добавляли раствор антител, специ фичных, соответственно, к E. coli или S. enteritidis. Полученную смесь инку бировали 20 мин при 37 °С и легком помешивании. Полученную суспензию помещали в измерительную ячейку электрооптического анализатора. Под действием переменного электрического поля (напряженность Е=100 в/см;

время действия t=2 сек.;

диапазон частот f=10-30000 кГц) происходили изме нения оптических свойств суспензии, которые регистрировали в виде ЧДАП (рис. 1-2). В качестве контроля использовали бактерии, не взаимодейство вавшие с антителами.

Рисунок 1 - ЧДАП суспензии бактерий E. coli после взаимодействия со специфическими антителами На основании полученных результатов можно дать некоторую оценку элек трофизических и морфометрических параметров полученных комплексов ан тиген-антитело. Общее снижение амплитуды электрооптического сигнала в присутствии антител может быть следствием образования конгломератов бактериальных клеток. Сдвиг максимума ЧДАП в область низких частот ука зывает на возможное нарушение целостности бактериальных мембран.

Рисунок 2 - ЧДАП суспензии бактерий S. enteritidis после взаимодейст вия со специфическими антителами 400,00 E.c.контроль от. ед E.c./V 350, 300, 250, 200, 150, 100, 50, kHz 0, 1 10 100 1000 10000 Рисунок 3 - ЧДАП после взаимодействия бактериальной суспензии кле ток E.coli 057 c фагом V18/A Была изучена возможность использования электрооптического метода для идентификации микроорганизмов путем анализа специфического взаи модействия микробных клеток с бактериофагом. На рис. 3 представлены ЧДАП контрольной суспензии бактерий E. coli и ЧДАП тех же бактерий по сле 30-минутной инкубации с фагом V18/А157. На рис. 4 показаны ЧДАП контрольной суспензии S. enteriditis и суспензии тех же бактерий после 30 минутной инкубации с фагом 39. Здесь же представлена ЧДАП суспензии бактерий S. enteriditis после 30-минутной инкубации с фагом V18/А157 – специфичным для E. coli, очевидно, невзаимодействующим с бактериями S. enteriditis. Полученные данные подтверждают возможность использования бактериофагов для идентификации микроорганизмов.

400,00 S.e.контроль от. ед.

S.e./ 350, S.e./V 300, 250, 200, 150, 100, 50, kHz 0, 1 10 100 1000 10000 Рисунок 4 - ЧДАП после взаимодействия бактериальной суспензии кле ток S. enteriditis c фагами V18/A157 и При исследовании взаимодействия клеток B. thuringiensis с фагом Vf, было обнаружено, что если проводить инкубацию бактерий с фагом без аэра ции (как в вышеуказанных случаях с E. coli и S. enteriditis), то даже спустя 90 минут не наблюдается существенного изменения ЧДАП (рис. 5).

Однако при инкубации клеток B. thuringiensis с бактериофагом Vf в ус ловиях аэрации результаты получаются сходными с теми, которые были по лучены при изучении взаимодействия с фагами факультативно анаэробных бактерий E. coli и S. enteriditis (рис. 6). Через 60 мин инкубации бактерий с фагами ЧДАП практически исчезает, что указывает на драматическое нару шение целостности бактериальных оболочек в этих условиях определения.

1000 B.t.контроль от. ед.

B.t./Vf kHz 1 10 100 1000 10000 Рисунок 5 - ЧДАП после взаимодействия бактериальной суспензии кле ток B. thuringiensis без аэрации c фагом Vf 1600 B.t.контроль от. ед.

B.t./Vf kHz 1 10 100 1000 10000 - Рисунок 6 - ЧДАП после взаимодействия бактериальной суспензии кле ток B. thuringiensis при аэрации c фагом Vf Для улучшения измерения ЭОЭ при низкой величине напряженности ориентирующего поля был разработан численный алгоритм определения анизотропии поляризуемости бактериальных клеток, снимающий существен ные ограничения на проведение эксперимента.

Глава 2 Биосенсоры Целью данной части работы является разработка новой генерации био сенсоров на основе системы искусственного носа, ферментов, фагов, бакте риальных клеток или их фрагментов для увеличения чувствительности и ско рости определения глюкозы, лизина, лактата, а также для определения кон центрации бактерий.

2.1 Бесконтактное определение микроорганизмов Разработан бесконтактный метод определения бактерий с применением системы искусственного носа на основе высокоплотных волоконно оптических биосенсорных пучков. Принцип определения бактерий основан на анализе воздушного пространства над образцом для определения летучих компонентов (ЛК). Известно, что выделяемые бактериями ЛК определяют специфический запах бактерий, что может служить характерным признаком данной бактерии. Сенсорным элементом являются полистирольные микро сферы с флуоресцентным красителем интерколированные в проксимальный конец волоконной системы. ЛК способны влиять на микроокружение микро сфер, изменяя флуоресцентные характеристики красителя. Таким образом, анализируя летучие вещества, можно идентифицировать бактерии (рис. 7).

Рисунок 7 - Бесконтактная идентификация бактерий при использовании системы искусственного носа Развивая данный подход, была показана принципиальная возможность использования простой модификации метода спектрофотометрического ана лиза для быстрого выявления присутствия микроорганизмов либо по выделе нию ими ЛК, либо по их поглощению из окружающей среды. Кроме того, данный метод позволяет различить мутанты N. сrassa, дефектные по метабо лизму азота, от штамма дикого типа. По-видимому, nit-2 и nit-6 гены гриба связаны с образованием ЛК у этого организма.

2.2 Биосенсор для определения глюкозы Биосенсоры представляют собой недорогую альтернативу классическо му анализу веществ в ходе биотехнологических процессов. Антибиотик авермиктин играет большую роль как в медицине, так и в ветеринарии. Он продуцируется бактериями S. avermitilis в ходе процесса длительного культи вирования (72 ч). Характерно, что максимальный выход этого антибиотика наблюдается в короткий промежуток времени при минимальной концентра ции глюкозы в среде. Для оптимизации условий выделения антибиотика важно определить минимальную концентрацию глюкозы в среде очень быст ро, так как авермиктин быстро распадается при отсутствии глюкозы. Был разработан глюкозный биосенсор для контроля концентрации авермиктина.

Для приготовления глюкозного модуля использовали бычий сывороточный альбумин, глюкозооксидазу и глутаровый альдегид. Глюкозный модуль по мещали на торец рО2-электрода. Линейный ответ биосенсора наблюдали в диапазоне концентраций глюкозы от 1 до 30 мМ. Данная система очень пер спективна для быстрого определения глюкозы в среде культивирования бак терий с целью увеличения выхода антибиотика.

2.3 Разработка бисенсорной системы узнавания на основе бактери альных клеток и их фрагментов с помощью криоиммобилизации Бактериальные клетки можно рассматривать как систему, содержащую различные ферменты в их естественном окружении, для конструирования биосенсоров. Такая биокаталитическая система на основе бактерий осущест вляет ферментативные реакции в оптимальных, естественных условиях, и, как ожидается, будет более стабильной по сравнению с ферментами, полу ченными путем выделения и очистки. Для создания потенциально новых систем биологического узнавания на основе бактериальных клеток и их фрагментов исследовали три типа бактерий со специфически индуцирован ными ферментативными системами. Для индукции лактатоксидазной систе мы культивировали штаммы E. coli и M. luteus в среде, где в качестве источ ника углерода использовали соли лактата. Клетки A. aceti выращивли в ана эробных условиях для индукции этанолоксидазной системы.

На примере метода криоиммобилизации были отработаны методы им мобилизации бактериальных клеток и их фрагментов. Сущность метода со стоит в замораживании микробных клеток в растворе поливинилового спир та, в ходе которого происходит формирование макро- и микроструктуры матрицы криогеля, при этом поликристаллы замороженного растворителя выступают в роли порообразователей. Получаемые гранулы (пленки) обла дают, наряду с высокой пластичностью, достаточно высокой механической прочностью. Матрица криогеля, будучи высокопористой структурой, не соз дает диффузионных затруднений для основной массы соединений.

Установлено, что удельная респираторная активность иммобилизован ных клеток и мембран бактерий была постоянной во всех образцах и не зави села от величины навески, а количество потребляемого кислорода в реакци онной ячейке зависело от количества иммобилизованного биокатализатора.

2.4 Биосенсоры на основе ЦПМ Цитоплазматические мембраны (ЦПМ) бактерий представляют собой липидный бислой с инкорпорированными белками. Бактериальные ЦПМ иг рают важную роль в многочисленных биологических процессах, таких как дыхание и перенос энергии. Способность индукции определенных фермента тивных систем в ЦПМ в ходе культивирования бактерий делает мембраны весьма привлекательным инструментом при конструировании биосенсора путем выделения таких мембраносвязанных ферментативных комплексов с последующей иммобилизацией их на твердой подложке с сохранением на тивности и биологической активности.

Была изучена возможность модификации поверхностного заряда ЦПМ бактерий для дальнейшего изучения его влияния на чувствительность и ста бильность биосенсорного узнающего элемента. Для этого мы использовали модификаторы поверхностного заряда: цетилтриметиламмоний бромид (ЦТАБ) (положительно заряженный) и додецилсульфат натрия (SDS) (отри цательно заряженный). Первоначально было показано, что добавление ЦТАБ в диапазоне концентраций 10–50 мкМ увеличивает потребление кислорода ЦПМ бактерий в присутствии НАДН, отрицательно заряженного субстрата дыхания. Добавление же SDS в диапазоне концентрации 10–50 мкМ в этих же условиях, наоборот, уменьшало потребление кислорода мембранами. По видимому, данное изменение потребления кислорода ЦПМ и связано с элек тростатическим взаимодействием заряженного субстрата с заряженной по верхностью бактериальных мембран. Для доказательства наличия зарядовой модификации поверхности мембран мы решили оценить изменения поверх ностного заряда с помощью положительно заряженного флуоресцентного зонда disC и отрицательно заряженного флуоресцентного зонда ANS. В каче стве модификаторов поверхностного заряда мы использовали ЦТАБ и SDS.

Добавление к мембранам положительно заряженного модификатора ЦТАБ увеличивало интенсивность флуоресценции отрицательно заряженного зонда ANS. В свою очередь, добавление отрицательно заряженного модификатора SDS уменьшало интенсивность данного флуоресцентного зонда.

Таким образом, была установлена возможность модификации поверхно стного заряда бактериальных ЦПМ с помощью положительно заряженного модификатора ЦТАБ и отрицательно заряженного модификатора SDS. Даль нейшие исследования показали, что поверхностный заряд является барьером проницаемости мембранного аппарата для заряженных субстратов и должен учитываться при конструировании биологической системы узнавания био сенсора.

2.5 Оптоволоконный биосенсор для определения лактата на основе ЦПМ Лактат является важным метаболитом при анализе пищи, поэтому для его определения создано большое количество биосенсорных измерителей.

Данные подходы анализа лактата требуют присутствия НАДН или ДЕАЕ декстран:лактинола, а также присутствия термостабильной пероксидазы из сои. Нестабильность таких комплексов и необходимость присутствия коэн зимов существенно ограничивают их практическое применение.

Рисунок 8 - Схема волоконно-оптического биосенсора для определения лактата В нашей работе описана конструкция волоконно-оптического биосенсо ра, основанного на новом типе биологического узнающего элемента - бакте риальных цитоплазматических мембран (ЦПМ). В качестве вторичного пре образователя использовали волоконно-оптический сенсор для определения кислорода, а в качестве биологического узнающего элемента – ЦПМ. В ре зультате такой комбинации был сконструирован новый тип биосенсора для определения лактата (рис. 8). Его специфичность оценивали по влиянию та ких биологически важных соединений как глюкоза, фруктоза и глутаминовая кислота на сигнал прибора.

На рис. 9 видно, что присутствие данных субстратов в концентрации 50 мМ не влияет на определение лактата. Нами было обнаружено, что кова лентное связывание чувствительного к кислороду слоя красителя на поверх Рисунок 9 - Специфичность лактатного биосенсора к другим субстратам ность оптического волокна улучшает механическую стабильность сенсора.

Другие инструментальные приспособления при конструировании данного сенсора не оказывали значительного влияния на его ответ. Таким образом, была показана способность конструирования биосенсора на основе ЦПМ бактерий. Полученный биосенсор специфически реагирует с лактатом и не чувствителен к наличию в среде измерения таких субстратов как глюкоза, фруктоза и глутаминовая кислота. Уникальная организация ЦПМ совместно с высокой чувствительностью волоконно-оптической системы позволяет применять данные сенсоры как для анализа активных субстратов, так и для косвенного определения бактериальных клеток.

Для определения лактата в молоке был разработан биосенсор на основе бактериальных цитоплазматических мембран (ЦПМ). Нативная организация ферментативных комплексов в липидных бислоях ЦПМ обеспечивала ста бильность и высокую чувствительность узнающего элемента биосенсора.

Для подсчета бактериальных клеток в свежем молоке коровы его образ цы высевали на плотные питательные среды и подсчитывали колонии после 18 час инкубации. С помощью биосенсора удалось установить корреляцию между концентрацией лактата в молоке и его бактериальной обсемененно стью. Концентрация лактата в молоке, равная 5 мМ, соответствует 0,3х клеток/мл. После 3 ч инкубации при 37 °С концентрация лактата составляла 10 мМ, а бактерий - 106 клеток/мл;

после 6 час инкубации – 20 мМ лактата и 107 клеток/мл. С помощью нашего биосенсора можно определить критиче скую точку, характеризующую качество молока, которая соответствует кон центрации бактерий 106 клеток/мл или 10 мМ лактата.

2.6 Амперометрический биосенсор для определения антиоксидант ной активности На рис. 10 представлена схема определения антиоксидантной активно сти различных субстратов.

нA 3 4 5 A A’ A’’ 1 1 мин Рисунок 10 - Схема отклика сенсорного электрода на образование су пероксида при добавлении антиокисиданта и супероксиддисмутазы. 1 – до бавление 100 мM гипоксантина;

2 – добавление ксантиноксидазы, 50 мЕ/мл;

3,4,5 – добавление антиокисиданта;

6 – добавление супероксиддисмутазы, Е/мл. А, А’ и А’’- понижение сигнала при различной концентрации антиоки сиданта в среде Как известно, антиоксиданты предохраняют организмы от вредного воз действия активных форм кислорода. Поэтому использование биосенсорного подхода для регистрации антиокидантных свойств веществ нашло важное применение в медицине и пищевой промышленности. Для определения анти оксидантной активности различных веществ показана высокая эффектив ность использования супероксидно-специфического амперометрического биосенсора (рис. 10).

Антиоксидантная активность субстратов представлена в табл. 2.

Таблица 2 - Антиоксидантная активность субстратов, где I50 As.ac – кон центрация аскорбиновой кислоты, вызывающая 50% ингибирование генера ции супероксида, I 50 – концентрация субстрата, вызывающая 50% ингибиро вание генерации супероксида, E asc,ac – Единицы аскорбиновой кислоты (I As.ac/ I 50) Вещество Сигнал I 50 As.ac, I 50, E asc,ac мкМ нМ электрода, нА (-) Эпигаллокатехин 0,8 9,0 83,7 107, (+) Катехин 0,4 9,6 600,0 16, 9, (+/-) Катехин 0,8 277,0 32, 9, Пирогаллол 0,8 262,7 34, Мирицетин 0,6 7,7 454,7 17, Кверцетин 0,7 4,8 2400,0 2, Танниновые кислоты 0,8 6,6 473,0 14, Исследование данных веществ показало их высокую антиоксидантную активность. Установлено, что обработка бактериальных клеток данными ан тиоксидантами частично предотвращает их элиминацию в мышиных макро фагах.

Глава 3 Бионанотехнологические подходы исследования в микро биологии 3.1 АСМ микроскопия вирусов Вирусы были выбраны для исследования как наименьшие живые биоло гические структуры. Существует два метода иммобилизации вирусов: спе цифическая и неспецифическая. Неспецифический метод заключается в на несении капли вирусной суспензии на поверхность. Специфический метод основан на предварительной модификации поверхности специфическими ан тителами. Стандартные методы получения монослоев вирусных антител ба зируются на ковалентном связывании антител с поверхностью. Хорошо из вестно, что монослои антител и ферментов могут терять свою активность.

Чтобы этого не происходило, используют амфифильные полиэлектролиты и липиды. Был разработан метод с использованием лэнгмюровских пленок ан тител на амфифильном полиэлектролите для иммобилизации ротавирусов и аденовирусов с последующей визуализацией методом АСМ. Аденовирусы и ротавирусы – важные патогены человека. На рис. 11 представлены АСМ изо бражения аденовирусов и ротавирусов, полученные с помощью неспецифи ческой иммобилизации.

А Б Рисунок 11 - АСМ изображение аденовирусов (А) и ротавирусов (Б) на поверхности. Справа показан вертикальный профиль поверхности Такие образцы очень нестабильны и быстро разрушаются при хранении.

Чтобы повысить специфичность и стабильность иммобилизованных вирусов, использовали антитела для их специфического связывания с поверхностью.

Для этого применяли лэнгмюровские пленки антител на амфифильных элек тролитах – полиэтиленимине и полибензилгистидине. Применение таких электролитов делает возможным предохранение конформации белковой гло булы от действия инактивирующих факторов на границе раздела фаз воз дух/вода и приводит к усилению взаимодействий между компонентами лэн гмюровских пленок. Были протестированы различные условия образования монослоев полиэлектролитов. В качестве критерия использовали степень ше роховатости получаемых пленок. В случае полибензилгистидина стало воз можным получать пленки толщиной 1,5-2 нм и шероховатостью 0,2 нм, что в результате приводит к увеличению аффинности пленок полимер/антитело.

После месяца хранения при +5 °С пленки антител оставались целыми, сохраняя свою иммунную активность. Для определения толщины получен ной пленки антител специально разрушали небольшую область ее поверхно сти. Разница в высоте разрушенного и целого слоев интерпретировалась как толщина пленки, которая составляла 8-12 нм в зависимости от выбранной области и материала субстрата (рис. 12).

Рисунок 12 - Пленка аденовирусных антител на поверхности подложки.

Слева (А) показан участок пленки, специально разрушенный для оценки толщины пленки. Справа (В) показана нативная пленка Используя этот подход, можно получать специфически иммобилизован ные аденовирусы и ротавирусы. На рис. 13 представлены АСМ изображения ротавирусов и трехмерное изображение аденовирусов.

А Б Рисунок 13 - АСМ изображение ротавирусов (А), и трехмерное АСМ изображение аденовирусов (Б), специфически связанных с пленкой соответ ствующих антител, образованной на амфифильном полимере 3.2 АСМ микроскопия бактерий Существует множество методов исследования бактерий. Качественную и количественную характеристики бактериальных клеток можно получить методами световой и электронной микроскопии, фотоэлектронной микро скопии Х-лучей, ИК-спектроскопии, измерениями контактного угла и элек трофоретической мобильности. Однако многие из этих методов требуют спе циальной подготовки и условий вакуума во время анализа и не могут быть использованы для нативных исследований. В последние годы в микробиоло гии открыт новый способ исследования бактерий. АСМ микроскопия обеспе чивает получение 3D изображения поверхностных ультраструктур с молеку лярным разрешением, в режиме реального времени и физиологических усло виях. Поверхность живых бактериальных клеток - это очень сложная гетеро генная структура, содержащая липидные, белковые и углеводные компонен ты. Организация некоторых мембранных областей играет важную роль во взаимодействии клеток с поверхностью и между собой. Вместе с тем, не смотря на то, что ультраструктура микробной поверхности изучается мето дом электронной микроскопии уже более 30 лет, прямой информации о ее строении в нативном состоянии получить таким способом нельзя. Понимание процессов адгезии и агрегации бактериальных клеток требует не только зна ния физико-химических свойств (гидрофобности и электрических свойств) и химического состава, но также наномеханических свойств и ультраструктуры их поверхности. Уникальная возможность АСМ представлять бактериальный мир в субнанометровом диапазоне и в водном растворе может быть исполь зована для исследования как самих клеток, так и их поверхности в физиоло гических условиях. АСМ дает изображения бактериальных клеток и их по верхности с высоким разрешением. Эти изображения используются для ана лиза внешнего вида и свойств поверхности бактерий. АСМ может быть ис пользована для изучения физиологических процессов, таких как клеточный рост и прорастание спор, а также для исследования морфологических изме нений живых бактерий под действием антибиотиков. В водных средах мик роорганизмы имеют тенденцию образовывать колонии на твердых поверхно стях, создавая биопленки. Это вызывает загрязнение трубопроводов, морских сооружений и кораблей. Протекающие при этом коррозиционные процессы также изучаются методами АСМ.

В данной работе мы использовали АСМ для идентификации патогенных бактериальных клеток. Некоторые АСМ изображения получены с использо ванием неспецифической адсорбции бактерий (рис. 14).

Рисунок 14 - АСМ изображение клеток M. tuberculosis Для специфической визуализации бактерий был разработан новый под ход, основанный на иммобилизации специфических антител непосредствен но на твердой подложке через связывание антител стафилококковым белком А. Белок А специфически узнает и связывает Fc-фрагменты антител. Получе ны изображение слоя белка А (рис. 15) и 3D изображения специфически им мобилизованных бактерий и спор (рис. 16) с использованием слоя белка А для чувствительной иммобилизации специфических антител.

Рисунок 15 - Трехмерное реконструированное АСМ изображение слоя белка А АСМ очень важна при быстрой и суперчувствительной детекции пато генов. Уникальные возможности АСМ можно использовать в дальнейших исследованиях в нанобиотехнологии не только для детекции бактериальных клеток и вирусов, но и для очень чувствительного определения нанофрагмен тов этих объектов.

Рисунок 16 - Трехмерное реконструированное изображение клеток (сле ва) и спор (справа) B. thuringiensis с использованием слоя белка А 3.3 Изучения взаимодействия фаг-бактерия Был разработан протокол приготовления образцов для визуализации с помощью АСМ взаимодействия бактерий с бактериофагами. Для этого рас творы, содержащие живые бактерии E. coli и бактериофаги, специфичные к данному штамму, смешивали и помещали в термостат при 37 °С. Через опре деленные промежутки времени из термостатируемого раствора извлекали 5 10 мкл смеси для нанесения на слюду и АСМ-мониторинга. Полученные ре зультаты показали эффективность использования АСМ для такого рода сис тем. На рис. 17 и 18 хорошо видна динамика взаимодействия фаг-бактерия.

А Б Рисунок 17 - АСМ изображение E.coli при отсутствии фагов (А) и через 15 мин после добавления фагов (Б) А Б Рисунок 18 - АСМ изображение клетки E. coli после 35 мин (А) и 65 мин (Б) инкубации с фагом На рис. 17А приведено изображение единичной бактериальной клетки при отсутствии бактериофагов. Через 15 мин после добавления бактериофа гов (рис. 17Б) изображение бактериальной клетки изменяется и можно видеть фаговую "шубу" на поверхности бактерии. После 35 мин инкубации бактерий с фагами (рис. 18А) наблюдается выход большого количества фагов из бак териальной клетки в результате ее лизирования. На рис. 18Б изображена бак териальная клетка после фагового лизиса (видны морфологические измене ния бактерии и следы выхода бактериофагов). Данная картина является ти пичной после инкубирования бактерий с бактериофагом более 1 ч.

Кроме этого, были проведены исследования наноструктуры аффинных поверхностей, представляющих собой антитела, закрепленные на латексных и магнитных частицах. Получены изображения высокого разрешения, позво ляющие произвести визуальную оценку процесса агглютинации латексных частиц, несущих специфичные антитела, с антигеном и изображения биона нообъектов, отражающие динамику взаимодействия фагов с бактериальной клеткой – мишенью.

3.4 Изучение фрагментов бактериальных клеток Для изучения специфического связывания фрагментов бактерий с аф финной поверхностью нами была предложена следующая структура этой по верхности: активированная слюда – белок G – антитело. Активированная в тлеющем разряде слюда улучшает адсорбцию на нее белка G, который в свою очередь увеличивает степень адгезии на него антител (в силу их специ фического взаимодействия). Толщина слоя белка G возрастает с увеличением его концентрации в растворе, причем оптимальная величина находится в диапазоне 0,1-0,6 мг/мл, при которой толщина слоя составляет до 1,3 нм (рис. 19).

А Б Рисунок 19 - АСМ изображения обработанной в тлеющем разряде (0,2 мА, 60 с) поверхности слюды, (А) экспонированной в растворе (0,1 мг/мл) моноклональных антител к E. coli;

(Б) экспонированной последо вательно в растворе белка G (0,1 мг/мл), а затем (после промывки) в растворе моноклональных антител к E. coli.

Поверхности, модифицированные «родными» антителами (к E. coli), а также «чужими» антителами (к Salmonella), были изучены как поверхности для связывания с фрагментами клеток E. coli. Из АСМ-изображений, пред ставленных на рис. 20, следует, что количество нанофрагментов, адсорбиро ванных «родными» антителами, в сотни раз больше, чем «чужими». При при готовлении образцов, представленных на рис. 20, время экспозиции поверх ности с нанофрагментами составляло 3 мин, а объем раствора с антигеном – 5 мкл. При таких параметрах адсорбции поверхность переставала эффектив но адсорбировать антиген с концентрациями 107 клеток/мл и ниже. В связи с этим, параметры адсорбции подбирались таким образом, чтобы позволять де тектировать малые концентрации.

А Б Рисунок 20 - АСМ изображения модифицированных антителами к E. coli (А) и к Salmonella (Б) поверхностей после их экспонирования в растворе, содер жащем разрушенные фрагменты клеток E. coli c концентрацией (по целым клеткам) 109 клеток/мл Для этого уменьшали концентрацию антигена в суспензии, в которую помещали изготовленную поверхность. На рис. 21 показано АСМ изображе ние поверхности слюды, активированной в тлеющем разряде, модифициро ванной белком G и антителами к E. coli, экспонированной в течение 10 мин в суспензии фрагментов клеток E. coli, c исходной концентрацией клеток 102 клеток/мл. Как видно из АСМ изображения, на нем присутствуют части цы, которые и являются предположительно фрагментами бактерий. На рис. 21Б и 22В представлены сечения, проведенные по верхней и нижней пунктирным линиям на АСМ изображении. Верхнее сечение демонстрирует профиль бактериального нанофрагмента, а нижнее – глубину белковых слоев на поверхности слюды (белок G + антитело), целостность которых была на рушена в ходе царапающего эксперимента кантилевером атомно-силового микроскопа.

Б А В Рисунок 21 - АСМ изображение поверхности слюды, активированной в тлеющем разряде, модифицированной белком G и антителами к E. coli, экс понированной в течение 10 мин в суспензии, содержащей фрагменты клеток E. coli с исходной концентрацией 102 клеток/мл (А);

(Б) – сечение, проведен ное по верхней пунктирной линии на АСМ изображении, демонстрирующее профиль бактериального фрагмента;

(В) – сечение, проведенное по нижней пунктирной линии на АСМ изображении, демонстрирующее результат цара пающего эксперимента При дальнейшем уменьшении концентрации антигена его количество становится настолько маленьким, что вероятность даже специфического свя зывания очень мала. Поэтому требуется повысить эффективность специфи ческого связывания, понизив при этом эффективность неспецифического.

Для решения этой задачи модифицировали методику нанесения следующим образом. Во-первых, связывание антигена с аффинной поверхностью и по следующую промывку стали проводить при pH 8,2 и температуре 32 °С, что благоприятствует специфическому связыванию. Во-вторых, промывку про водили погружением подложки в буфер с последующим вращением на шей кере в течение 10 мин, чтобы повысить эффективность очищения от неспе цифически связавшегося с поверхностью материала за счет дополнительно возникающих гидродинамических потоков вблизи поверхности.

Рисунок 22 - АСМ изображения поверхностей, модифицированных бел ком G и антителами к E. coli, экспонированных в (А) суспензии, содержащей фрагменты клеток E. coli с концентрацией (по целым клеткам) 100 клеток/мл, (Б) суспензии, содержащей фрагменты клеток E. coli с концентрацией (по це лым клеткам) 101 клеток/мл. Все изображения приведены к одному масштабу по высоте. Размеры изображений составляют 50 мкм. (В) – диаграмма значе ний v для образцов, полученных при экспонировании аффинных к E. coli по верхностей в суспензии E. coli с концентрациями 100 и 101 клеток/мл в срав нении с контрольным изображением Для того, чтобы оперировать количественными критериями изучаемого взаимодействия, была разработана схема статистического анализа АСМ изо бражений. Сначала строится гистограмма распределения по высотам всех объектов на контрольном изображении и выбирается такая высота hmin, ниже которой лежит подавляющее большинство объектов. В дальнейшем анализи руются лишь объекты, высоты которых превышают hmin. Такое отбрасывание более низких объектов позволит избежать анализа примесей. После этого для анализируемого изображения (с бактериальными фрагментами) строится распределение изображенных на нем объектов с высотами, большими hmin, по объемам и рассчитывается суммарный объем объектов V на АСМ изображе нии. Затем суммарный объем нормируется на площадь АСМ изображения v=V/S. Таким образом, величина v, имеющая смысл количества присоеди нившегося к поверхности материала на единицу площади, служит критерием для оценки наличия или отсутствия специфического связывания.

Разработанная методика оценки чувствительности аффинной поверхно сти была применена к антигену со сверхмалыми концентрациями – 100 и 101 клеток/мл. Соответствующие АСМ изображения приведены на рис. 22А, Б, а значения параметра v – на рис. 22В. Сравнение значений параметра v показывает, что чувствительность к определению малых концентраций ста новится значительно меньше, а для концентрации 100 клеток/мл значение v практически совпадает с контрольным.

Таким образом, была показана возможность специфической визуализа ции (идентификации) не только целых бактериальных клеток, но и их фраг ментов с помощью АСМ.

Глава 4 Изучение токсичности нанообъектов Для анализа бактерицидной активности были приготовлены 6 групп об разцов с многофункциональными биоактивными наноструктурными покры тиями (МБНП). Их получали путем магнетронного напыления в атмосфере аргона или смеси аргона с азотом.

Грамотрицательные бактерии E. coli X-blue, E. coli 09, S. typhimurium и P. aeruginosa и грамположительные бактерии B. brevis и B. subtilis выращи вали на твердой среде LB с 2 % агара в течение ночи в присутствии 6 образ цов с МБНП. Не обнаружено разницы в росте бактерий, как в присутствии, так и в отсутствии образцов.

Кроме того, грамотрицательные бактерии E. coli X-blue и P. aeruginosa и грамположительные бактерии B. brevis и B. subtilis выращивали в жидкой среде LB. Исходная концентрация бактерий составляла 106 клеток/мл. Бакте риальный рост анализировали по изменению оптической плотности при 625 нм. После 4 ч культивирования в контролях и опытах не было обнаруже но разницы в росте. Таким образом, установлено, что образцы с МБНП не обладали бактерицидной активностью при культивировании бактерий как на твердых, так и в жидких питательных средах.

Анализ функциональной активности перитонеальных фагоцитов против клеток Y. pseudotuberculosis проводили в присутствии тех же 6-ти образцов с МБНП. Полученные результаты не выявили статистически достоверной раз ницы в бактерицидной активности макрофагов в присутствии всех протести рованных образцов с МБНП. Это означает, что данные МБНП не изменяют бактериальный статус и системы защиты макроорганизма. Таким образом, данные МБНП могут использоваться для имплантантов, работающих под на грузкой.

При анализе наноповерхностей титана, модифицированных одной из трех активных добавок - 10CaO + 2KMnO4, или 20%ZrO2 (TiZrCON), или на носеребром, показано, что после первых 3 ч культивирования оптическая плотность уменьшалась в 1,5 раза при инкубации образца с добавлением Ag с клетками E. coli по сравнению с оптической плотностью бактерий при отсут ствии образцов в среде культивирования. Для остальных образцов бактери цидный эффект не был обнаружен.

Анализ фагоцитарной активности показал, что в присутствии образца (TiC+10CaO + 2KMnO4) в среде бактерицидная активность макрофагов не изменялась. В присутствии образца (TiC+20%ZrO2 (TiZrCON)) количество живых макрофагов уменьшалось вдвое, при этом оставшиеся (живые) мак рофаги обладали нормальной фагоцитарной активностью. В присутствии об разца Ag почти все макрофаги были повреждены, а оставшиеся живые мак рофаги не обладали фагоцитарной активностью.

Таким образом, с помощью микробиологических приемов можно оцени вать токсичность наноматериалов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Современные методы анализа и идентификации микроорганизмов на правлены на повышение чувствительности и уменьшение времени процедур.

С этой точки зрения применение электрооптического и биосенсорного под ходов изучения бактерий представляется весьма привлекательным благодаря нативности и чувствительности (для электрооптики), и чувствительности и быстроте (для биосенсоров), а использование бионанотехнологических под ходов способствует не только визуализации процессов в нанометровом раз решении, но и увеличению чувствительности определения бактериальных клеток.

Электрооптический метод анализа клеток обеспечивает контроль элек трофизических и связанных с ними морфологических и функциональных па раметров бактерий. Интерпретация электрофизических параметров клеточ ных структур, фракционного состава популяции и морфометрии построена на взаимосвязи структуры и функций клетки. Результаты электрооптических исследований взаимодействия микроорганизмов с антителами или с части цами, модифицированными антителами, позволяют оценить возможность совмещения достижений в области иммуноидентификации и электрофизиче ских измерений. Электрооптическое исследование взаимодействия фаг бактерия также может быть применено для обнаружения и идентификации микроорганизмов. На основании итогов многолетней работы по разработке основ электрооптики микроорганизмов, можно сделать обобщающий вывод о создании теоретической и методической базы для широкого внедрения элек трофизического метода анализа клеточных структур и определения гетеро генности клеточных популяций.

Современные методы анализа и идентификации микроорганизмов могут быть чувствительными, недорогими, с хорошими количественными и качест венными характеристиками. Однако их применение требует обученного пер сонала и длительных временных процедур. Биосенсоры представляют собой разумную альтернативу традиционным методам, сокращая процедуру изме рения и улучшая ее качество. В данной работе расширена область примене ния известных биосенсоров и разработаны новые биосенсорные элементы.

В представленной работе предпринята попытка идентификации микро организмов путем анализа летучих компонентов (ЛК) бактерий. Принцип оп ределения бактерий основан на анализе воздушного пространства над образ цом для определения ЛК компонентов с помощью системы искусственного носа. Разработаны два метода неконтактного определения бактерий. Первый – простой анализатор летучих компонентов (термостатируемый и для посто янного мониторинга) для определения бактерий и грибов по анализу газов над микробными культурами. Второй метод - система искусственного носа на основе оптических волокон высокой плотности, позволяющая определять бактерии. Пористые силиконовые микросферы с флуоресцентным красите лем, инкорпорированные в оптоволоконные системы, использовали для оценки изменения их флуоресценции после взаимодействия с ЛК. Анализ достоверности результатов эксперимента показал возможность применения системы искусственного носа на основе оптоволоконной системы для опре деления бактерий.

Известно, что максимальный выход антибиотика авермиктина наблюда ется при полном потреблении глюкозы в среде роста микроорганизма. Био сенсор на глюкозу позволяет оперативно контролировать уровень содержа ния данного углевода в среде культивирования. Биосенсорная система опре деления глюкозы на основе фермента глюкозооксидазы и кислородного дат чика была успешно применена для оптимизации условий выделения анти биотика авермиктина.

Применение микроорганизмов в качестве узнающего элемента биосен сора широко практикуется при анализе окружающей среды и пищи. Однако микроорганизмы представляют собой сложные полиферментные системы, а наличие сложных метаболических процессов мешает интерпретации сигнала.

Поэтому разработка узнающего элемента биосенсора на основе цитоплазма тической мембраны микроорганизмов позволяет увеличить специфичность и чувствительность биосенсора. Более того, путем индукции ферментативных комплексов при культивировании можно получить биосенсор на определен ный субстрат.

Особенно стоит отметить разработку биосенсора для оценки антиокси дантной активности. Влияние антиоксидантов на выживание бактериальных клеток в настоящее время не изучено. Поэтому разработка такого типа био сенсора является перспективным инструментом оценки антиоксидантной ак тивности соединений для выяснения их роли в процессах переживания мик роорганизмов в макрофагах.

Бионанотехнологические подходы в микробиологии – современный тренд в исследовательских направлениях, позволяющий детализировать про цессы в микробиологии на нано-уровне. Применение атомно-силовой микро скопии позволило визуализировать такие процессы, как реакция гемагглюти нации и взаимодействие фагов с бактериальными клетками. Кроме того, дан ный подход с использованием антител позволил специфически визуализиро вать нанофрагменты бактерий. Следует учитывать, что работа в новых облас тях с применением наноподходов требует хотя бы предварительного изуче ния возможных рисков при работе с наноматериалами. Предварительные данные показали, что, несмотря на инертность наноповерхностей, в особых случаях мы можем наблюдать токсический и бактерицидный эффект наноча стиц.

ВЫВОДЫ 1. Показана принципиальная возможность применения электроопти ческого метода для анализа физиологического состояния бактерий и их вы живаемости в ходе биотехнологических процессов. Разработан численный алгоритм определения анизотропии поляризуемости бактериальных клеток, снимающий существенные ограничения на проведение эксперимента.

2. Выявлены электрооптические изменения микробиологических систем, которые могут служить удобным инструментом идентификации микроорга низмов при анализе взаимодействия бактерий со специфическими антитела ми или магнитными частицами с иммобилизованными специфическими ан тителами и фагами.

3. Разработаны биосенсоры с применением системы искусственного но са на основе высокоплотных оптоволоконных пучков для бесконтактной идентификации микроорганизмов. Показана принципиальная возможность использования простой модификации метода спектрофотометрического ана лиза для быстрого выявления присутствия микроорганизмов по выделению или поглощению ими летучих компонентов, из окружающей среды. Кроме того, данный метод позволяет различить мутанты N. crassa, дефектные по метаболизму азота, от штамма дикого типа.

4. На примере синтеза антибиотика авермиктина бактериями S. avermitilis показана принципиальная возможность использования биосен сора для контроля продукции антибиотика. Биосенсорная система определе ния глюкозы на основе фермента глюкозооксидазы и кислородного датчика была успешно применена для оптимизации условий выделения данного ан тибиотика.

5. Впервые сконструирован оптоволоконный биосенсор на основе цито плазматических мембран бактерий для анализа концентрации лактата и уста новлена корреляция между содержанием лактата и бактериальной обсеме ненностью коровьего молока.

6. Разработан амперометрический супероксидный биосенсор для анали за антиоксидантной активности веществ, с последующим изучением дейст вия антиоксидантов на выживаемость бактерий в макрофагальных клетках.

7. Впервые показано использование бионанотехнологического подхода на основе атомно-силовой микроскопии совместно с получением аффинных поверхностей для специфической визуализации бактериальных нано фрагментов, позволяющих повысить чувствительность выявления микроор ганизмов и их идентификации.

8. Для визуализации и анализа взаимодействия фаг-бактерия использо ваны уникальные возможности АСМ для получения трехмерного изображе ния ультраструктур на молекулярном уровне в реальном времени и при фи зиологических условиях.

9. Для поверхностей с многофункциональными биоактивными наност руктурными покрытиями и наноматериалов разработаны методы оценки ток сичности с помощью микробиологических приемов. Разработана методика оценки бактерицидной активности макрофагов в присутствии наносоедине ний.

Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Нефелова М.В., Игнатов С.Г., Чигалейчик А.Г., Виноградов Б.Д., Егоров Н.С. Биосинтез L-аспарагиназы II Bacillus polimixa var Ros. // Прикл. био хим. и микробиол. - 1978. - Т. 14. - № 4. - С. 510-515.

2. Решетняк В.И., Игнатов С.Г., Вострокнутова Г.Н. Влияние естественной и искусственной модификации мембран на энергетику бактериальной клетки. // Энергетика и углеводный обмен у микроорганизмов. Рига. 1979. - С. 64-65.

3. Игнатов С.Г., Александрова Л.А., Евдокимова О.А., Перелыгин В.В., Ка прельянц А.С. Роль липидов в процессе репарации и восстановлении мем бранных функций после низкотемпературного замораживания E.coli.// Липиды биологических мембран. Ташкент. - 1980. - С. 59.

4. Игнатов С.Г., Андреева О.В., Евдокисова О.А., Арцатбанов В.Ю., Пере лыгин В.В., Капрельянц А.С., Островский Д.Н. Роль липидов в процессе репарации и восстановления мембранных функций после низкотемпера турного замораживания.// Тезисы Научной Конференции молодых уче ных, Оболенск. - 1980. - С. 187-199.

5. Игнатов С.Г., Красильников В.А., Перелыгин В.В., Капрельянц А.С., Островский Д.Н. Изучение функциональных и структурных изменений мембран E.coli после низкотемпературного замораживания.// Биохимия. 1981. - Т. 46. - №11. - С. 1996-2003.

6. Игнатов С.Г., Андреева О.В., Евдокимова О.А., Арцатбанов В.Ю., Пере лыгин В.В., Капрельянц А.С., Островский Д.Н. Изучение репарации мем бранных повреждений, вызванных низкотемпературным замораживанием клеток E.coli.// Биохимия. - 1982. - Т. 47. - №10. - С. 1621-1628.

7. Игнатов С.Г., Лапыш М.Е., Светогоров Д.Е. Методика электрооптическо го анализа сухих препаратов.// Методика Т-4061. - 1986. - мбВ 1/1725. - м.

15. - С. 130-138.

8. Игнатов С.Г., Драгунова С.Ф., Перелыгин В.В., Воробьев А.А. Роль ком племента в защите макроорганизма от бактерий.// Журнал микробиол.

эпидемиол. и иммунол. - 1987. - № 5. - С. 97-102.

9. Лапыш М.Е., Игнатов С.Г., Светогоров Д.Е. Измерение электрооптиче ских свойств E.coli.// XI научная конференция по итогам НИР 1986, сек ция-8”, Оболенск. - 1987. - С. 15.

10. Лапыш М.Е., Игнатов С.Г., Брезгунов В.Н., Волошин А.Г., Бунин В.Д., Светогоров Д.Е., Щепкина А.Н. Использование электрооптического мето да для оперативного определения жизнеспособности бактериальных кле ток.// Микробиол. - 1989. - Т. 58. - № 3. - С. 515-517.

11. Лапыш М.Е., Светогоров Д.Е., Игнатов С.Г., Бунин В.Д. Анализ возмож ности использования нелинейной области электрооптического эффекта для определения концентрации и анизотропии поляризуемости бактери альных клеток.// Теория и практика электрооптических исследований кол лоидных систем, Велегож. - 1990. - С. 15.

12.Светогоров Д.Е., Бунин В.Д., Волошин А.Г., Лапыш М.Е., Игнатов С.Г., Брезгунов В.Н. Оперативная диагностика состояния бактериальных кле ток в процессе производства препаратов по результатам ЭО исследова ний.// Теория и практика электрооптических исследований коллоидных систем, Велегож. - 1990. - С. 19-20.

13. Игнатов С.Г., Волошин А.Г., Лапыш М.Е., Светогоров Д.Е. Использова ние электрооптического метода и кратковременных экстремальных воз действий для оценки устойчивости бактериальных клеток к процессу вы сушивания.// Теория и практика электрооптических исследований колло идных систем, Велегож. - 1990. - С. 24.

14. Лапыш М.Е., Игнатов С.Г., Светогоров Д.Е. Изменение электрооптиче ских свойств E.coli в ходе сушки клеток.// Научная конференция по ито гам НИР 1989, Оболенск. - 1990. - С. 40.

15. Лапыш М.Е., Светогоров Д.Е., Игнатов С.Г. Определение анизотропии поляризуемости бактериальных клеток при средней степени ориентации.// Коллоидный журнал. - 1991. - Т. 55. - С. 365-367.

16. Игнатов С.Г., Андреев С.Н., Драгунова С.Ф. Биосенсор на лизин на осно ве pCO2 кондуктометрического электрода.// Биотехнология. - 1992. - № 5. С. 110-111.

17. Игнатов С.Г., Андреев С.Н., Драгунова С.Ф. L-лизиновый биосенсор на основе pCO2 кондуктометрического электрода.// Биотехнология. - 1992. № 6. - С. 63-64.

18. Ignatov S.G., Dragunova S.F. Surface charge controls the barrier properties of the E.coli cell envelope.// J. Biochem. Org. – 1994. - V.1. - Р. 363-373.

19. Игнатов С.Г. Новый метод определения комплемент-опосредованного бактериолитического действия сыворотки на клетки E.coli.// Журнал мик робиол. эпидемиол. и иммунол. - 1994. - № 6. - С. 99-100.

20. Игнатов С.Г., Бесаева С.Г., Кувичкин В.В. Изучение потребления глюко зы при культивировании S.avermitilis 1301 с использованием биосенсорно го измерителя.// Биотехнология. - 1995. - Т. 32. - № 1/2. - С. 54-55.

21. Волошин А.Г., Лапыш М.Е., Игнатов С.Г., Бунин В.Д. Использование электрооптического метода для контроля бактериальных препаратов.

Прикладная биохим. и микробиол. - 1996. - Т. 32. - № 6. - С. 669-670.

22. Ignatov S.G. Biosensors based on CPM In International Symposium “Devel opment of medical equipment technology converted from weapon sciences”, Podolsk, Moscow Region. - 1996. - Р. 54.

23. Ignatov S.G. The role of diamines on bacterial survival after freezing. In “In ternational symposium on stress and inorganic nitrogen assimilation & the 2nd FOHS biostress symposium”. Moscow. - 1996. - P. 34.

24. Ignatov S.G. Rapid method for bacterial counting in the milk by using biosen sor based on E.coli cells. NATO ASI SERIES Workshop “Rapid Methods for the Analysis of Biological Materials in the Environment”. Warsaw. - 1997. - P.

33.

25. Ignatov S.G. Biosensor based on bacterial cytoplasmic membranes. ARW “New trends in biosensor development”. Kiev, Ukraine. - 1998. - P. 25.

26. Ignatov S.G. Bacterial cytoplasmic membranes as a native organized biocata lysis system in biosensorology.// Biocatalysis-98: fundamental and applications.

Pushino. - 1998. - P. 18.

27. Ignatov S.G. New recognition element for biosensor based on cytoplasmic membranes.// 6th SAS-Deauville Conference-98. Valencia, Spain. - 1998. - 98P.

- P. 375.

28. Ignatov S.G. Biosensors, biotechnology.// German-Russia ISTC workshop Biotechnology, DEHEMA-99. Wiesbaden, Germany. - 1999. - P. 25.

29. Ignatov S.G. Biosensor based on the bacterial cells for glucose monitoring in the blood.// IT + ME. Gurzuf, Ukraine. - 1999. - P. 100.

30. Ignatov S.G. Development of the rapid method for determination of comple ment-mediated serum bactericidal activity against gram-negative bacteria.// IT + ME. Gurzuf, Ukraine. - 1999. - P. 100.

31. Ignatov S.G., Besaeva S.G. Avermitelis controlling in cultivation media by us ing glucose biosensor.// IT + ME. Gurzuf, Ukraine. - 1999. - P. 101.

32. Бикетов С.Ф., Игнатов С.Г., Гаврюшкин А.В. Современные тенденции в области определения возбудителей инфекционных болезней.// Проблемы медицинской и экологической биотехнологии. Оболенск. - 1999. - C. 271.

33. Бесаева С.Г., Игнатов С.Г. Контроль глюкозы в среде культивирования Streptomyces avermititlis с помощью биосенсора.// Проблемы медицинской и экологической биотехнологии. Оболенск. - 1999. - C. 228.

34. Makhlis T., Efremenko E., Varfolomeev S., Kaprelyants A.S., Ignatov S.G.

Elaboration of stable biosensors based on the membranes of regular and dor mant cells Micrococcus luteus, immobilized in poly (vinyl alcohol) cryogen for the detection of NADH and lactate.// Biocatalysis-2000. Moscow. - 2000. - P.

121.

35. Ignatov S.G. Rapid method for bacterial counting in the milk by using biosen sor based on E.coli cells.// In book “Rapid Methods for the Analysis of Biologi cal Materials in the Environment” (Ed.P.J.Stopa, M.A.Bartoszcze), NATO ASI Series. - 2000. - V. 30. - P. 93-100.

36. Ignatov S.G., Ge B., Shishniashvili D., Scheller F.W., Lisdat F. The antioxi dant activity detection of the flavonoids using superoxide sensor.// Modern problems of microbial biochemistry and biotechnology. Pushchino. - 2000. - P.

95.

37. Ge B., Lisdat F., Shishniashvili D., Ignatov S.G., Scheller F.W. Detection of antioxidant activity using a superoxide sensor.// Biosensor-2000. San Diego USA. - 2000. - P. 251.

38. Ignatov S.G., Ge B., Scheller F.W., Lisdat F. Detection of the antioxidant ac tivity of flavonoids by using superoxide sensor.// In book “Nitric oxide: basic research and clinical application” (Ed.R.J.Gryglewski, P.Minuz) IOS Press, NATO Science Series, Science A: Life Science. - 2001. - V. 317. - P. 168-180.

39. Ignatov S.G., Ferguson J.A., Walt D.R. A fiber-optic lactate sensor based on bacterial cytoplasmic membranes.// Biosensors and Bioelectronics. - 2001. - V.

16. - № 1. - P. 109-113.

40. Stitzel S.E., Albert K.A., Ignatov S.G., Walt D.R. Artificial nose employing microsphere sensor for detection of volatile organic compounds.// Proc. SPIE. 2002. - V. 4575. - P. 132-137.

41. Ignatov S., Shishniashvili D., Ge B., Scheller F.W., Lisdat F. Amperometric biosensor based on a functionalized gold electrode for the detection of antioxi dants.// Biosensors and Bioelectronics. - 2002. - V. 17. - № 3. - P. 191-199.

42. Ignatov S. G., Virjasov S. N., Kozodaev M.A., Ignatyuk T. E., Suvorov A. L.

AFM study of bacteriaphages.// IT + ME. Gurzuf, Ukraine. - 2002. - P. 356 357.

43. Ignatov S. G., Virjasov S. N., Golutvin I. A., Nasikan N. S., Ignatyuk T. E., Suvorov A. L. Nanobiotechnology for microbiology.// MicroRobots, MicroMa chines and MicroSystems. Moscow. - 2003. - P. 345.

44. Ignatov S. G., Virjasov S. N., Golutvin I. A., Nasikan N. S., Ignatyuk T. E., Suvorov A. L. AFM study for specific visualization of bacteria and spores.// IT + ME. Gurzuf, Ukraine. - 2003. - P. 218-219.

45. Ignatov S. G. Atomic force microscopy for nano analysis of bacteria.// Cana dian Biological Colloquium. Moscow. - 2004. - P. 79.

46. Ignatov S.G. Bionanotechnological analysis of affinity surfaces.// The 5-th ISTC/Korea workshop on biotechnology. Korea. - 2004. - P. 67-102.

47. Ignatov S. G., Virjasov S. N., Fedjukina G.N., Baranova E.V., Golutvin I. A., Nasikan N. S., Ignatyuk T. E., Suvorov A. L. Bionanotechnological analysis of affinity surfaces for sensitive bacteria detection.// The proceedings for the ISTC Japan Workshop on Advances Nanomaterials in Russia/CIS. Tsukuba, Japan. - 2005. - P. 148-162.

48. Вирясов С.Н., Голутвин И.А., Насикан Н.С., Бикетов С.Ф., Игнатов С.Г., Игнатюк Т.Е. Способ приготовления аффинных поверхностей на основе химически прошитого белка А.// Патент РФ 2005. RU 2261279 C1.

49. Ignatov S. G., Virjasov S. N., Fedjukina G.N., Baranova E.V., Biketov S.F.

Nano-approach for sensitive monitoring of bacteria.// NSTI Nanotech. Boston.

USA. - 2006. - P. 57.

50. Волошин А.Г., Бесаева С.Г., Веревкин В.В., Игнатов С.Г. Адаптация электрооптического метода для изучения взаимодействия фаг-бактерия.// VII Межгосударственная научно-практическая конференция государств участников СНГ "Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении и санитарная охрана территории госу дарств-участников СНГ". Оболенск. - 2006. - C. 190-192.

51. Федюкина Г.Н., Баранова Е.В., Акимова Л.А., Волошин А.Г., Вирясов С.Н., Косарев Н.В., Дубровин Е.В., Краевский С.В., Игнатюк Т.Е., Игна тов С.Г. АСМ визуализация взаимодействия латексных частиц, модифи цированных антителами в присутствии антигена.// VII Межгосударствен ная научно-практическая конференция государств-участников СНГ "Чрез вычайные ситуации международного значения в общественном здраво охранении и санитарная охрана территории государств-участников СНГ".

Оболенск. - 2006. - C. 250-251.

52. Dubrovin E., Fedyukina G., Ignatov S., Ignatyuk T., Kraevsky S., Voloshin A., Yaminsky I. Visualization of pathogen-host interaction using AFM.// 8th Inter national EMBL PhD Student Symposium. Heidelberg, Germany. - 2006. - P.

46.

53. Ignatov S. G., Virjasov S. N., Fedjukina G.N., Baranova E.V., Golutvin I. A., Nasikan N. S., Ignatyuk T. E. Specific visualization of bacteria and spores by AFM.// IX Annual Linz Winter Workshop “Advances in Single-Molecule Re search for Biology & Nanoscience”. Austria. - 2007. - P. 4-14.

54. Игнатов С.Г., Федюкина Г.Н., Мочалов В.В., Акимова Л.А., Баранова Е.В., Колосова Н.В., Рудницкий С.Ю. Визуализация аффинных взаимо действий методом атомно-силовой микроскопии.// Материалы XV между народной конференции IT+ME. Гурзуф, Украина. - 2007. - С. 315-317.

55. Dubrovin E., Ignatov S., Ignatyuk T., Kraevsky S., Voloshin A., Yaminsky I.

Visualization of pathogen-host interaction using AFM. Biophysical Journal. 2007. - Suppl. S. - Р. 514A-515A.

56. Краевский С, Волошин А., Дубровин В.Е., Игнатов С.Г., Игнатюк Т.Е., Яминский И.В. Изучение влияния бактериофагов на бактерии с помощью АСМ.// Cборник тезисов «Современные достижения достижения биона носкопии» Первая Всероссийская Школа-семинар. Москва. - 2007. - С. 29.