Механизмы инициации транскрипции у мезофильных и термофильных бактерий
На правах рукописи
КУЛЬБАЧИНСКИЙ АНДРЕЙ ВЛАДИМИРОВИЧ МЕХАНИЗМЫ ИНИЦИАЦИИ ТРАНСКРИПЦИИ У МЕЗОФИЛЬНЫХ И ТЕРМОФИЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ Специальность 03.00.03 - молекулярная биология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Москва – 2009
Работа выполнена в Лаборатории молекулярной генетики микроорганизмов Учреждения Российской академии наук Института молекулярной генетики РАН (Москва), в сотрудничестве с Общественным институтом здоровья (Public Health Research Institute, Newark, USA), Институтом Ваксмана (Waksman Institute, Piscataway, USA) и Институтом биотехнологии (Institute of Biotechnology, Vilnius, Lithuania).
Официальные оппоненты:
чл.-корр. РАН А.Б. Четверин д.б.н. Г.В. Шпаковский д.б.н. М.К. Куханова
Ведущая организация:
ФГУП Государственный научный центр Российской Федерации Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов
Защита состоится _ на заседании диссертационного совета Д 002.235. при Институте молекулярной биологии им.В.А.Энгельгардта РАН по адресу: 119991, г. Москва, ул. Вавилова, д. 32. ИМБ РАН
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта Автореферат разослан «» _ 2009 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат химических наук А.М. Крицын
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Транскрипция является первой стадией экспрессии генетического материала в клетках всех организмов. Именно на уровне транскрипции действуют основные механизмы генетической регуляции. Главным ферментом, осуществляющим транскрипцию, является РНК-полимераза (РНКП) – сложная молекулярная машина, обладающая многими каталитическими активностями и способная к разнообразным структурным перестройкам. Структура РНКП и механизм синтеза РНК высоко консервативны у всех организмов, от бактерий до человека. РНКП бактерий имеет наиболее простое строение и может служить удобной моделью для изучения механизмов транскрипции с применением самых современных методов молекулярной биологии.
Наиболее сложной и жестко регулируемой стадией транскрипции является стадия инициации. Инициация транскрипции происходит в специфических участках ДНК - промоторах, - и сама состоит из нескольких стадий. В отличие от ДНК-полимераз, РНКП способна самостоятельно осуществлять инициацию и начинать синтез РНК в отсутствие затравки. В ходе инициации РНКП должна: (1) узнать промотор;
(2) расплавить цепи ДНК вокруг стартовой точки транскрипции;
(3) связать инициаторные нуклеотиды и начать синтез РНК;
(4) разорвать контакты с промотором и перейти к продуктивному синтезу РНК - элонгации транскрипции.
Детальный молекулярный механизм инициации транскрипции и механизмы структурных превращений РНКП, происходящих на разных стадиях инициации, во многом остаются неизвестными. Расшифровка данного механизма является одной из фундаментальных задач молекулярной биологии.
У бактерий все стадии инициации осуществляются холоферментом РНКП, состоящим из кор-фермента (субъединичный состав 2) и фактора инициации -субъединицы, которая диссоциирует при переходе к элонгации транскрипции.
Одной из основных функций -субъединицы является узнавание промоторов и плавление ДНК в районе стартовой точки транскрипции. В последние годы появились данные, показывающие, что -субъединица может также играть активную роль на последующих стадиях инициации, в том числе, в процессах инициации синтеза РНК и ухода РНКП с промотора. Таким образом, -субъединица является одним из основных регуляторов транскрипции, действующим на всех стадиях инициации. Анализ функций -субъединицы представляет огромный интерес для понимания механизма транскрипции в целом и основных принципов транскрипционной регуляции.
Анализ трехмерной структуры РНКП, проведенный для РНКП термофильных бактерий T. aquaticus и T. thermophilus, позволил создать структурные модели промоторного и элонгационного комплексов. Предложенные модели, хотя и не дают исчерпывающей информации о механизмах структурных превращений РНКП на разных стадиях синтеза РНК, позволяют предположить функции различных участков фермента и могут являться основой для расшифровки детального молекулярного механизма транскрипции. Наличие структурных моделей транскрипционных комплексов открывает возможности для исследований конформационной подвижности РНКП на всех стадиях транскрипции, начиная от взаимодействия -субъединицы с кор-ферментом, узнавания и плавления промоторов до структурных перестроек транскрипционного комплекса в ходе инициации транскрипции и механизмов катализа в активном центре РНКП.
Термофильные бактерии являются исключительно интересной моделью для изучения механизмов транскрипции и структурной подвижности РНКП, поскольку, при сохранении консервативного механизма транскрипции, они приобрели уникальные особенности, связанные с адаптацией к высоким температурам. В частности, РНКП термофилов обладают повышенной жесткостью структуры и сниженной конформационной подвижностью, обеспечивающей термостабильность.
Анализ транскрипционных свойств термофильных РНКП дает уникальную возможность для поиска функционально-важных участков РНКП, задействованных в узнавании промоторов и в катализе и обеспечивающих адаптивные различия между различными группами бактерий.
Понимание детального механизма транскрипции представляет не только фундаментальный интерес, но имеет и важнейшее практическое значение, поскольку многие заболевания человека связаны с нарушениями процессов инициации и элонгации транскрипции. Кроме того, анализ механизма транскрипции необходим для разработки новых методов подавления активности РНКП, получения новых ингибиторов фермента и антибиотиков, которые могут найти применение в терапии многих инфекционных заболеваний.
Цели и задачи исследования. Целью данной работы являлась расшифровка детального молекулярного механизма инициации транскрипции у различных групп бактерий и анализ структурных перестроек РНКП, происходящих в ходе данного процесса. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
1. Разработать новые подходы к анализу структуры РНКП и механизмов узнавания промоторов с использованием аптамеров.
2. Установить молекулярные механизмы взаимодействий РНКП с различными промоторными элементами.
3. Изучить механизм плавления ДНК при образовании открытого промоторного комплекса РНКП и механизмы стабилизации открытого комплекса.
4. Установить механизм инициации синтеза РНК в активном центре РНКП.
5. Исследовать механизм ухода РНКП с промотора.
6. Охарактеризовать молекулярные механизмы, лежащие в основе различий транскрипционных свойств РНКП термофильных и мезофильных бактерий.
Научная новизна и практическая значимость работы. В результате работы получены важнейшие данные о молекулярных механизмах всех стадий инициации транскрипции, а также о механизмах структурных превращений РНКП, происходящих на данных стадиях. Установлены молекулярные механизмы узнавания основных промоторных элементов РНКП, открыт и охарактеризован новый элемент бактериальных промоторов (GGGA-элемент). Показано, что GGGA является промоторным элементом нового типа, который способен определять межвидовые различия в узнавании промоторов РНКП. Показано, что субъединица РНКП содержит функционально-активные участки связывания ДНК и способна узнавать -10, TG и GGGA-элементы промотора в составе нематричной цепи ДНК. Изучен процесс образования открытого промоторного комплекса РНКП различных мезофильных и термофильных бактерий, показано, что важную роль в плавлении ДНК играют аминокислотные остатки в участках -субъединицы, взаимодействующих с -10 элементом промотора и с кор-ферментом РНКП.
Показано, что стабильность промоторных комплексов определяется контактами субъединицы РНКП с промоторными элементами, а также контактами кор фермента с ДНК спереди по ходу транскрипции. Изучен механизм инициации синтеза РНК в активном центре РНКП;
показано, что в образовании первых связей РНК решающую роль играет -субъединица, которая способствует связыванию инициаторных нуклеотидов. Показано, что -субъединица также играет важную роль в процессе ухода РНКП с промотора при переходе к элонгации транскрипции;
установлено, что растущий РНК-транскрипт конкурирует с -субъединицей за связывание с кор-ферментом РНКП, что в результате приводит к разрыву контактов с промотором. Выявлены структурные элементы РНКП, обеспечивающие различия в каталитических свойствах РНКП мезофильных и термофильных бактерий.
Получен новый тип лигандов к РНКП - аптамеры, - которые открывают широкие возможности для дальнейших исследований механизма транскрипции, а также для создания эффективных ингибиторов фермента.
В целом, полученные в работе данные существенно углубляют наши знания о молекулярных механизмах транскрипции и представляют значительный интерес для понимания основных принципов регуляции генной экспрессии. Кроме большой фундаментальной значимости, результаты работы имеют важное практическое значение и могут найти применение во многих прикладных исследованиях. В частности, открытия, сделанные в работе, могут быть использованы для создания новых типов промоторов и высокоэффективных систем генной экспрессии, разработки новых стратегий направленной регуляции транскрипции, а также для получения новых ингибиторов РНКП, имеющих терапевтическое значение.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на следующих конференциях и симпозиумах: XX Международном генетическом конгрессе (Берлин 2008), 1-м Международном форуме по нанотехнологиям, III и IV Съездах Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Санкт-Петербург 2002, Новосибирск 2008), Летних исследовательских конференциях Федерации Американских обществ экспериментальной биологии (FASEB) (Вермонт 1997, 2004, 2007), 8-й Международной конференции им. Энгельгардта по молекулярной биологии (Москва 2006), 17 Съезде французского биофизического общества (Нуан ле-Фезелье, 2000) и др. Работа официально апробирована на заседании Ученого совета ИМГ РАН 22 декабря 2008 г.
Публикации. По результатам работы опубликовано 15 статей в рецензируемых научных изданиях, 11 тезисов международных и всероссийских конференций.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов, приложения и списка цитируемой литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста и содержит рисунков.
Библиография включает названий, в том числе русских и иностранных.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Получение аптамеров к РНКП 1.1. Общий метод получения аптамеров Для изучения взаимодействий РНКП с нуклеиновыми кислотами и различными регуляторными факторами в нашей работе был разработан новый методический подход с использованием аптамеров. Аптамеры – это синтетические однонитевые молекулы ДНК или РНК, специфически узнаваемые белком-мишенью (в данном случае – РНКП) и полученные путем отбора из комбинаторных библиотек олигонуклеотидов (Gold et al., 1995). При отборе аптамеров была поставлена задача получить лиганды, способные образовывать специфические и стабильные комплексы с каждым из компонентов РНКП: кор-ферментом, субъединицей и холоферментом. В качестве мишеней для отбора были выбраны РНКП мезофильной бактерии Escherichia coli и термофильной бактерии Thermus aquaticus. Данные РНКП являются удобными объектами для исследований, так как первая из них хорошо охарактеризована биохимическими и генетическими методами, а для второй известна трехмерная структура.
Рис. 1.1. Общая схема получения аптамеров. (А) Структура библиотеки оцДНК, использованной при отборе (32N случайный район длиной 32 нт). (Б) Схема эксперимента. Общее количество различных последовательностей, использованных при отборе, составляло ~1015. ДНК инкубировали с холоферментом, кор-ферментом или субъединицей РНКП, РНКП-ДНК комплексы отделяли от несвязавшейся ДНК при помощи сорбции на нитроцеллюлозных фильтрах (НЦ), аффинного связывания РНКП на Ni агарозе (Ni) или гель-электрофореза (ЭФ).
При получении аптамеров к сайту связывания рифампицина (Rif) проводили контр-отбор последовательностей, не связывающихся с РНКП в присутствии Rif Для получения аптамеров был использован метод, схема которого показана на Рис. 1.1. При отборе использовали библиотеку оцДНК-олигонуклеотидов, имеющих центральный район длиной 32 нт со случайной последовательностью, окруженный районами с фиксированными последовательностями. Смесь олигонуклеотидов инкубировали с РНКП и проводили отбор связавшихся ДНК. Полученные олигонуклеотиды амплифицировали при помощи праймеров, соответствующих константным областям исходной библиотеки, получали оцДНК и использовали ее для следующего раунда отбора (всего проводили 10-12 раундов). Олигонуклеотиды из обогащенной библиотеки клонировали и определяли последовательности индивидуальных аптамеров. Во всех экспериментах были получены высокоаффинные и специфичные аптамеры, которые были использованы в исследованиях взаимодействий РНКП с промоторами и регуляторными факторами.
1.2. Аптамеры к кор-ферменту РНКП 1.2.1. Общая характеристика аптамеров Целью отбора аптамеров к кор-ферментам РНКП E. coli и T. aquaticus являлось получение лигандов, связывающихся в различных функционально-важных участках молекулы. Отбор аптамеров к обеим РНКП проводили по стандартной методике (раздел 1.1), варьируя условия связывания и метод разделения олигонуклеотидов. В одном из экспериментов по отбору аптамеров к РНКП E. coli была поставлена задача получить аптамеры к конкретному участку фермента – сайту связывания антибиотика рифампицина (Rif). В этом случае при проведении селекции в каждом раунде отбирались олигонуклеотиды, которые связываются со свободным кор ферментом РНКП E. coli, но не связываются с ним в присутствии Rif (стадия контр отбора, Рис. 1.1).
Рис. 1.2. Последовательности аптамеров к кор-ферменту РНКП. (А) Аптамеры к кор-ферменту РНКП E. coli. (Б) Аптамеры к кор-ферменту РНКП T. aquaticus. Приведены последовательности центральной части аптамеров без константных районов. Для каждого из классов показан один из аптамеров. Нуклеотиды, идентичные во всех аптамерах данного класса, выделены серым В целом, было получено пять различных классов аптамеров к кор-РНКП T.
aquaticus (которые получили название Т1-Т5) и тринадцать классов аптамеров к кор-РНКП E. coli (Е1-Е13) (Рис. 1.2). Аптамеры Е5-Е13 были получены при проведении Rif-направленного отбора. Анализ вторичной структуры аптамеров показал, что большинство из них формируют разнообразные шпильки и G-квартеты (предполагаемая структура аптамеров Т1-Т5 к РНКП T. aquaticus и аптамера Е5 к РНКП E. coli показана на Рис. 1.3). Все полученные аптамеры обладают исключительно высоким сродством к кор-РНКП, константы диссоциации (Кд) комплексов составляют 10-9-10-11 М. Комплексы аптамеров с РНКП очень стабильны, их времена полужизни составляют десятки минут. Аптамеры высокоспецифичны к своим мишеням: лиганды к РНКП T. aquaticus не взаимодействуют с РНКП E. coli и наоборот. В то же время, большинство аптамеров к РНКП T. aquaticus способны взаимодействовать с РНКП близкородственной бактерии Thermus thermophilus.
Рис. 1.3. Предполагаемая структура аптамеров к кор-ферменту РНКП. Показана структура аптамеров Т1-Т5 к кор-ферменту РНКП T. aquaticus и одного из аптамеров (Е5) к кор-ферменту E.
coli. На рисунке показаны минимальные варианты аптамеров, полученные путем удаления (частично или полностью) константных районов исходной библиотеки. Аптамеры Т1, Т5 и Е имеют структуру G-квадруплексов, стабилизированных короткими шпильками, аптамеры Т2, Т3, Т4 формируют структуру шпилек 1.2.2. Районы кор-фермента РНКП, участвующие в связывании аптамеров Чтобы установить, какие участки РНКП задействованы в узнавании аптамеров, мы исследовали способность аптамеров подавлять взаимодействия РНКП с минимальной матрицей, структура которой соответствует РНК/ДНК гибриду и переднему дуплексу ДНК в элонгационном комплексе (Рис. 1.4 А) (Korzheva et al., 1998). Было установлено, что все полученные в наших экспериментах аптамеры (и в случае РНКП E. coli, и в случае РНКП T. aquaticus) подавляют взаимодействия РНКП с минимальной матрицей и, таким образом, взаимодействуют с естественными сайтами связывания нуклеиновых кислот. Аптамеры также подавляют активность кор-фермента РНКП в тесте по транскрипции in vitro и являются высокоспецифичными ингибиторами своих РНКП-мишеней (данные для аптамеров к кор-РНКП T. aquaticus показаны на Рис. 1.4 Б).
Для более точной локализации сайтов связывания аптамеров было исследовано их взаимодействие с кор-РНКП, содержащими мутации в различных участках главного канала фермента (Рис. 1.5). В случае РНКП E. coli были Рис. 1.4. Подавление активности РНКП аптамерами к кор-ферменту. (А) Структура минимальной матрицы. (Б) Подавление активности РНКП T. aquaticus аптамерами Т1 Т5. РНКП инкубировали с минимальной матрицей в отсутствие («–») или в присутствии аптамеров, либо контрольных олигонуклеотидов, не связывающихся с кор ферментом (N), и измеряли эффективность удлинения РНК на один нуклеотид (с -[32P]-UTP).
использованием Стрелкой указано положение РНК-продукта длиной 9 нт использованы ферменты с делециями в доменах 2 и flap («заслонка») субъединицы (Kuznedelov et al., 2002b;
Severinov and Darst, 1997) и фермент с инсерцией 8 аминокислот в домене clamp («зажим») -субъединицы (получен в нашей работе, см. раздел 4.3.2), в случае РНКП T. aquaticus – фермент с делецией участка rudder («шип») -субъединицы (Kuznedelov et al., 2002a). Было показано, что каждая из мутаций нарушает связывание некоторых из аптамеров с РНКП, причем разные мутации влияют на связывание разных аптамеров. В частности, делеция rudder в РНКП T. aquaticus нарушает связывание аптамеров Т1 и Т4, но не влияет на связывание аптамеров Т2, Т3 и Т5;
из этого следует, что rudder входит в состав сайта связывания аптамеров Т1 и Т4. В целом, полученные данные свидетельствуют, что аптамеры связываются с различными эпитопами в главном канале РНКП, в участках, взаимодействующих с ДНК и РНК в транскрипционных комплексах.
Рис. 1.5. Мутации в кор-ферменте РНКП, влияющие на связывание аптамеров.
Показана модель элонгационного комплекса РНКП T.aquatius (Korzheva et al., 2000). ДНК (нематричная и матричная цепи показаны желтым и красным, соответственно) и РНК (оранжевая) располагаются внутри главного канала РНКП. Направление транскрипции указано черной стрелкой. - и -субъединицы кор-фермента окрашены зеленым и розовым.
Стрелками показаны домены, мутации в которых нарушают связывание аптамеров (расположение мутаций показано черными кружками), а также участок связывания рифампицина (Rif) 1.2.3. Влияние различных лигандов РНКП на связывание аптамеров Целью дальнейших экспериментов было установить, могут ли аптамеры быть использованы для изучения взаимодействий РНКП с транскрипционными факторами и низкомолекулярными регуляторами. В качестве модельных лигандов были использованы Rif, -субъединица и транскрипционный фактор GreB. Rif связывается внутри главного канала вблизи от активного центра РНКП (Artsimovitch et al., 2005;
Campbell et al., 2001). -субъединица также связывается с кор-ферментом РНКП со стороны главного канала (см. ниже, Рис. 2.1) (Vassylyev et al., 2002). Фактор GreB связывается в области вторичного канала РНКП, в районе, удаленном от сайтов связывания аптамеров (Vassylyeva et al., 2007).
Было показано, что все три исследуемых лиганда способны подавлять взаимодействие различных аптамеров с РНКП (Рис. 1.6). Rif по-разному влияет на взаимодействие аптамеров с РНКП. Связывание некоторых аптамеров (Е1-Е3 в случае РНКП E. coli, Т2, Т3 и Т5 в случае РНКП T. aquaticus) нечувствительно к Rif, в то время как связывание остальных (в том числе, всех аптамеров, полученных в эксперименте по Rif-направленному отбору к РНКП E. coli) эффективно подавляется антибиотиком. Сигма-субъединица ингибирует связывание большинства аптамеров с кор-ферментом РНКП. GreB также способен подавлять связывание некоторых из аптамеров (в частности, Е4, Е9, Е10, Е12), что, вероятно, Рис. 1.6. Влияние различных лигандов РНКП на связывание аптамеров с кор ферментом РНКП E. coli. Приведены кривые подавление связывания аптамеров Е5, Е2 и Е9 рифампицином, субъединицей и фактором GreB, соответственно. РНКП (10 нМ) инкубировали с Rif, или GreB в увеличивающихся концентрациях, после чего добавляли радиоактивно-меченый аптамер (0,3 нМ) и измеряли эффективность связывания (методом сорбции на нитроцеллюлозных фильтрах) объясняется аллостерическим влиянием GreB на структуру сайтов связывания аптамеров. На основе кривых подавления связывания аптамеров (Рис. 1.6) были вычислены Кд для связывания с РНКП Rif, -субъединицы и GreB, которые составили примерно 1, 10 и 100 нМ, соответственно. Таким образом, измерение подавления связывания аптамерами различными лигандами РНКП может быть напрямую использовано для определения аффинности данных лигандов.
1.3. Аптамеры к -субъединице и холоферменту РНКП Отбор аптамеров к -субъединицам и холоферментам РНКП E. coli и T.
aquaticus был проведен по той же схеме, что и отбор аптамеров к кор-ферменту РНКП. Так как, в отличие от кор-фермента, природной функцией -субъединицы и холофермента РНКП является узнавание специфических промоторных последовательностей, отбор проводили в более жестких условиях (при высокой ионной силе), что позволило полностью подавить неспецифические взаимодействия РНКП с ДНК и получить аптамеры к природным ДНК-связывающим сайтам субъединицы и холофермента. В каждом из четырех экспериментов был получен единственный класс аптамеров, состоящий из сходных последовательностей. Было обнаружено, что все полученные аптамеры содержат в своем составе консервативные промоторные элементы и связываются с РНКП с высокой аффинностью. Это позволило использовать аптамеры в исследованиях механизмов взаимодействий РНКП с промоторами. Подробно свойства данных аптамеров рассматриваются в следующих разделах (разделы 2, 3, 4).
Резюме. Получены и охарактеризованы высокоаффинные и высоко специфичные аптамеры к кор-ферментам, -субъединицам и холоферментам РНКП E. coli и T. aquaticus. Разработан метод сайт-направленного отбора аптамеров, позволяющий получать аптамеры к участкам связывания других лигандов РНКП.
Аптамеры к кор-ферменту РНКП связываются в различных участках внутри главного канала РНКП и являются удобным инструментом для изучения взаимодействий РНКП с ДНК и РНК, транскрипционными факторами и низкомолекулярными регуляторами. Аптамеры ингибируют активность РНКП и могут быть использованы для создания новых эффективных ингибиторов фермента.
2. Механизмы узнавания промоторных элементов РНКП 2.1. Общий механизм узнавания промоторов Одной из главных задач работы являлось исследование молекулярных механизмов узнавания промоторов холоферментом бактериальной РНКП.
Холофермент содержит единственный фактор инициации - -субъединицу. В клетках бактерий обычно присутствует несколько разных -субъединиц, но большинство промоторов узнается при участии одной, главной -субъединицы ( у E. coli, А у других бактерий). В составе главных -субъединиц имеется четыре эволюционно консервативных района, каждый из которых состоит из несколько подрайонов (1.1 и 1.2;
2.1, 2.2, 2.3, 2.4 и 2.5;
3.1 и 3.2;
4.1 и 4.2) (Рис. 2.1) (Gross et al., 1998).
Промоторы бактерий содержат несколько специфических элементов, необходимых для их узнавания (Рис. 2.1) (Gross et al., 1998). Наиболее консервативными являются -10 (ТАТААТ) и -35 (TTGACA) элементы, которые расположены на расстоянии примерно 10 и 35 нуклеотидов левее старта транскрипции и узнаются районами 2.3/2.4 и 4.2 -субъединицы, соответственно.
Некоторые промоторы содержат дополнительный элемент - динуклеотид TG, который расположен на один нуклеотид левее -10 элемента и узнается районом 2. -субъединицы (промоторы с удлиненной -10 областью) (Barne et al., 1997). Для узнавания таких промоторов не требуется -35 элемента. Наконец, некоторые сильные промоторы содержат А/Т-богатую последовательность, расположенную на расстоянии 50-70 нт от стартовой точки транскрипции, и получившую название UP элемент. UP-элемент промоторов узнается С-концевым доменом -субъединицы РНКП (Рис. 2.1) (Ross et al., 1993).
При взаимодействии РНКП с промотором первоначально образуется «закрытый» промоторный комплекс, в котором ДНК находится в двунитевом состоянии. В процессе изомеризации комплекса ДНК оказывается внутри главного канала фермента, и РНКП осуществляет плавление цепей ДНК в районе стартовой точки транскрипции (от -11 до +2 нт), что приводит к формированию «открытого» промоторного комплекса (см. модель на Рис. 2.1) (Artsimovitch et al., 2004;
deHaseth et al., 1998;
Gross et al., 1998;
Murakami et al., 2002a;
Ross and Gourse, 2005). В плавлении ДНК важную роль играют взаимодействия района 2 -субъединицы с 10 элементом промотора в составе нематричной цепи ДНК (Рис. 2.1, см. ниже, раздел 4.2) (Fenton et al., 2000;
Roberts and Roberts, 1996;
Schroeder et al., 2007;
Tomsic et al., 2001). Контакты -субъединицы с -10 элементом в расплавленном участке ДНК сохраняются в открытом промоторном комплексе и, вероятно, необходимы для поддержания его стабильности. Точная трехмерная структура промоторного комплекса, детальный механизм узнавания перечисленных промоторных элементов, а также роль других участков промоторной ДНК в узнавании промоторов до настоящего времени остаются неизвестны.
Несмотря на то, что -субъединица в составе холофермента РНКП играет ключевую роль в узнавании промоторов, в свободном виде она с ними не взаимодействует. Кор-фермент РНКП индуцирует конформационные перестройки -субъединицы, в результате которых происходит стимуляция ДНК-связывающей активности. В составе холофермента -субъединица взаимодействует с - и Рис. 2.1. Структурная модель промоторного комплекса РНКП. Модель основана на данных о структуре промоторного комплекса РНКП T. aquaticus низкого разрешения (Murakami et al., 2002a). ДНК показана оранжевым;
обозначены -10, TG, -35 и UP-элементы. Передний дуплекс ДНК и участок промотора в районе стартовой точки транскрипции, точная структура которых неизвестна, изображены более светлым цветом. Ион Mg2+ в активном центре обозначен сферой алого цвета. ДНК-узнающие районы -субъединицы показаны в цвете: район 4.2 – зеленый, районы 2.3 и 2.4 – красные, район 1.2 – синий. Петля, образованная районом 3.2, показана желтым.
Звездочками показаны положения флуоресцентных групп, введенных в районы 2.4 и 4.2 в экспериментах по измерению междоменных расстояний в -субъединице. Остаток Gln260 (Gln 440 у E. coli) в районе 2.4 показан желтым. Вероятное расположение района 1.1, точная структура которого неизвестна, показано полупрозрачной синей линией. -, - и -субъединицы кор-фермента показаны светло-голубым, светло-зеленым и светло-розовым, соответственно. С концевые домены -субъединиц (CTD), контактирующие с ДНК левее -35 элемента, схематично изображены овалами голубого цвета (точное положение этих доменов неизвестно). Обозначены домен flap -субъединицы, контактирующий с районом 4 -субъединицы, домен jaw субъединицы, а также расположение исследованных в данной работе мутаций в домене clamp (инсерция шести остатков His в положении 217 в РНКП E. coli, ) и в районе switch 2 субъединицы (замены остатка Arg339 в РНКП E. coli) субъединицами кор-фермента (Рис. 2.1). Основным сайтом связывания с кор ферментом является спираль-спиральный элемент -субъединицы, расположенный в основании участка rudder в главном канале фермента (аминокислотные остатки 262-309 в РНКП E. coli) (см. ниже, Рис. 4.4) (Arthur and Burgess, 1998;
Vassylyev et al., 2002). Однако, из-за отсутствия данных о структуре -субъединицы в свободном состоянии, точные механизмы структурных перестроек -субъединицы, происходящих при связывании с кор-ферментом и в ходе узнавания промоторных элементов, остаются неизвестны.
2.2. Стимуляция ДНК-связывающей активности -субъединицы кор-ферментом РНКП Для анализа стимуляции ДНК-связывающей активности -субъединицы кор ферментом РНКП мы исследовали взаимодействие РНКП E. coli с короткими «нематричными» олигонуклеотидами, соответствующими нематричной цепи промотора и содержащими -10 элемент (ТАТААТ) (Рис. 2.2 А). Ранее было показано, что узнавание нематричных олигонуклеотидов холоферментом РНКП во многом напоминает узнавание -10 элемента в природных промоторах (Marr and Roberts, 1997;
Savinkova et al., 1988).
Для детекции образования комплексов РНКП с нематричными олигонуклеотидами мы использовали метод ковалентных ДНК-белковых сшивок.
Было показано, что свободная 70-субъединица РНКП E. coli не образует ковалентной сшивки с нематричным олигонуклеотидом при облучении ультрафиолетовым светом (длина волны 254 нм) (Рис. 2.2 Б, дор. 5 и 10). В то же время, 70 в составе холофермента образует сшивку с нематричным олигонуклеотидом (дор. 2);
сшивка является специфичной и не образуется в случае контрольного комплементарного олигонуклеотида (дор. 7). Таким образом, кор фермент E. coli стимулирует специфическое узнавание нематричного олигонуклеотида -субъединицей. При помощи метода ограниченного расщепления белка по остаткам метионина (Grachev et al., 1989) сайт ДНК-белковой сшивки был локализован в консервативном районе 2 70, который принимает участие в узнавании -10 элемента в природных промоторах. Следовательно, метод сшивки позволяет зафиксировать функционально-важные взаимодействия - элемента промотора с районом 2 -субъединицы.
Чтобы установить, какая из субъединиц кор-фермента важна для стимуляции связывания ДНК -субъединицей, мы провели эксперименты по сшивке в присутствии изолированных - и -субъединиц кор-фермента. Было обнаружено, что -субъединица также способна стимулировать образование ковалентной сшивки -субъединицы с нематричным олигонуклеотидом, в то время как Рис. 2.2. Взаимодействие субъединицы с олигонуклеотидами, содержащими -10 элемент промотора.
(А) Нематричный и матричный олигонуклеотиды, соответствующие промотору lacUV5 в районе - элемента (подчеркнут). (Б) Ковалентная сшивка РНКП с радиоактивно мечеными олигонуклеотидами. ДНК белковые комплексы разделяли электрофорезом в денатурирующих условиях и идентифицировали при помощи радиоавтографии. Положение свободной ДНК и ДНК-белковых комплексов указано слева от рисунка.
(В) Стимуляция сшивки фрагментами -субъединицы (границы фрагментов указаны над рисунком (Severinov et al., 1996)) субъединица такого эффекта не оказывает (Рис. 2.2 Б, дор. 3 и 4);
в случае контрольного олигонуклеотида сшивка не образуется (дор. 8 и 9). Использование фрагментов -субъединицы (аминокислоты 1-877 и 820-1407) позволило установить, что для активации связывания ДНК -субъединицей необходима N концевая часть -субъединицы, содержащая основной сайт связывания, в то время как С-конец образование сшивки не стимулирует (Рис. 2.2 В).
Анализ мутантных вариантов -субъединицы с делециями различной длины было установлено, что для стимуляции сшивки с ДНК кор-ферментом РНКП не требуется С-концевой участок белка, содержащий районы 2.5-4.2, а также N концевой участок, содержащий район 1.1 (данные не приведены). Таким образом, взаимодействия данных районов с кор-ферментом не нужны для активации узнавания ДНК.
Итак, проведенные эксперименты позволили установить, что конформационные перестройки -субъединицы, активирующие узнавание - элемента промоторов, происходят в результате взаимодействия с N-концом субъединицы кор-фермента РНКП;
узнавание -10 элемента может осуществляться достаточно коротким фрагментом, включающим консервативные районы 1.2 и 2.
2.3. Узнавание -10 элемента промотора -субъединицей РНКП Следующей задачей исследований было установить, способна ли субъединица к узнаванию промоторных последовательностей в отсутствие кор фермента РНКП и требуются ли для этого серьезные структурные перестройки субъединицы. С этой целью был проведен поиск последовательностей оцДНК (аптамеров), способных взаимодействовать с -субъединицами РНКП E. coli и T.
aquaticus (см. раздел 1.3). Полученные в результате аптамеры к 70-субъединице E.
coli и А-субъединице T. aquaticus были названы sEcap (от sigma E. coli aptamer) и sTap (sigma T. aquaticus aptamer), соответственно. Было обнаружено, что аптамеры имеют в своем составе консервативные мотивы, соответствующие -10 и TG элементам промотора (Рис. 2.3). В аптамерах к 70-субъединице E. coli содержится консервативный мотив TGTAGAAT, а в аптамерах к А-субъединице T. aquaticus TGTA(C/T)AATGGGA (приведена консенсусная последовательность, в обоих случаях подчеркнут -10 элемент промотора). Анализ мутантных вариантов аптамеров с заменами в данных мотивах показал, что эти мотивы абсолютно необходимы для связывания с РНКП (данные не приведены, см. также Рис. 2.5).
Предполагаемая вторичная структура аптамеров к -субъединицам E. coli (sEcap1) и T. aquaticus (sTap1) приведена на Рис. 2.4. Аптамер sEcap1 образует структуру G-квадруплекса, на 3’-конце которого располагается консервативный Рис. 2.3. Последовательности аптамеров к -субъединицам РНКП E. coli (sEcap1) и T.
aquaticus (sTap1). Показаны центральные части аптамеров без константных районов библиотеки.
Красным и зеленым выделены -10 и TG-элементы промотора;
желтым показан элемент GGGA мотив, а аптамер sTap1 имеет структуру шпильки. Аптамеры взаимодействуют с субъединицей с высокой аффинностью (Кд комплексов аптамеров с 70- и А субъединицами составляют 10-20 нМ). Аптамер sEcap1, кроме 70-субъединицы, способен узнавать А-субъединицу T. aquaticus. В то же время, аптамер sTap высокоспецифичен к -субъединице T. aquaticus и не взаимодействует с субъединицами E. coli и других бактерий.
Рис. 2.4. Структура аптамеров, узнаваемых -субъединицами E. coli и T. aquaticus. На рисунке приведены минимальные аптамеры, в которых удалены районы, не принимающие участия во взаимодействии с -субъединицей. -10 и TG-элементы показаны в рамке, синим обозначен GGGA элемент. Показано положение 6-тио-гуанина в модифицированном sTap1-аптамере, использованном в экспериментах по сшивке Наличие -10 элемента в составе аптамеров показывает, что -субъединицы E.
coli и T. aquaticus способны узнавать данный элемент в отсутствие кор-фермента РНКП. Чтобы установить механизм узнавания -10 элемента свободной субъединицей, было проведено несколько экспериментов. Анализ связывания аптамера sEcap1 с делеционными производными -субъединиц показал, что для узнавания аптамера достаточно фрагмента 70, содержащего консервативные районы 1.2 и 2 и лишенного N- и С-концевых участков (аминокислоты 94-448).
Участок контактов аптамера sEcap1 с 70-субъединицей был картирован методом ковалентных ДНК-белковых сшивок. Было показано, что аптамер при облучении ультрафиолетовым светом (254 нм) с большой эффективностью образует сшивку с -субъединицей. Место сшивки было картировано методом ограниченного расщепления белка по остаткам метионина. Было установлено, что сшивка локализуется в районе 2 70, в том же участке, что и сшивка нематричного олигонуклеотида с 70 в холоферменте РНКП (см. раздел 2.2).
Нашей следующей задачей было установить, является ли взаимодействие района 2 -субъединицы с -10 элементом в аптамерах функционально-значимым.
Ранее было показано, что мутации в районе 2.4 70-субъединицы E. coli (в частности, Gln440His) способны супрессировать замены в -10 элементе в природных промоторах (Gross et al., 1998). Мы провели аналогичные эксперименты Рис. 2.5. Замены в -10 элементе в аптамере sTap1 супрессируются мутациями в районе 2.4 А-субъединицы Приведены кривые T. aquaticus.
связывания sTap1-аптамера и его мутантного варианта с заменой ТС в первом положении -10 элемента (-12С, данное положение соответствует - позиции в промоторах) с А-субъединицей дикого типа (WT) и с А-субъединицей с заменой Q260H в районе 2.4. Связывание измеряли при различных концентрациях субъединицы методом сорбции на нитроцеллюлозных фильтрах с использованием аптамера sTap1. Было показано, что замена первого остатка Т в 10 элементе в sTap1 приводит примерно к 100-кратному падению аффинности данного аптамера к А-субъединице T. aquaticus (Кд1000 нМ, Рис. 2.5). Замена остатка Gln на остаток His в 260 положении в районе 2.4 А (что соответствует замене Gln440His в 70) не влияет на узнавание исходного аптамера, но значительно улучшает связывание мутантного варианта sTap1 (Кд=100 нМ) (Рис. 2.5). Таким образом, мутации в районе 2.4 -субъединицы способны супрессировать замены в -10 элементе в аптамерах. Полученные данные свидетельствуют, что узнавание - элемента в составе аптамеров свободной -субъединицей происходит по тому же механизму, что и узнавание данного элемента в промоторах холоферментом РНКП.
2.4. Узнавание TG-элемента Динуклеотид TG, расположенный слева от -10 элемента в аптамерах к субъединицам E. coli и T. aquaticus, напоминает TG-элемент, присутствующий в промоторах с удлиненным -10 элементом, но, в отличие от этих промоторов, не отделен от -10 элемента дополнительным нуклеотидом (Рис. 2.4). Анализ мутантных аптамеров, в которые между TG и -10 элементом был внесен дополнительный нуклеотид, показал, что они также связываются с (Табл. 2.1). В то же время, аптамеры, не содержащие TG, не взаимодействуют с (Табл. 2.1).
Таким образом, свободная -субъединица способна узнавать TG-элемент в составе аптамеров, причем, в отличие от промоторов, где положение TG строго Табл. 2.1. Влияние замен в TG-элементе на связывание аптамера sEcap1 с -субъединицей В таблице приведены Кд для связывания аптамеров с -субъединицами E. coli (дикого типа и с делецией С-концевой части) и T. aquaticus (дикого типа и с заменой Q260H). В верхней части таблицы показаны последовательности консервативного участка аптамера с мутациями фиксировано, узнавание TG в аптамерах может происходить в различных позициях относительно от -10 элемента.
Ранее на основании данных о супрессии замен в TG-элементе в промоторах мутациями в 70-субъединице было показано, что в узнавании данного элемента задействованы районы 2.4 и 2.5 (Barne et al., 1997;
Sanderson et al., 2003).
Имеющиеся данные низкого разрешения о структуре промоторного комплекса РНКП T. aquaticus показывают, что промоторная ДНК в области TG-элемента располагается между районами 2.4 и 2.5 (Рис. 2.1), но не позволяют установить роль каждого из районов в узнавании данного элемента (Murakami et al., 2002a).
Мы показали, что фрагмент 70-субъединицы, не содержащий района 2. (аминокислоты 1-448), узнает sEcap1-аптамер с той же аффинностью, что и дикого типа, но не узнает sEcap1, лишенный TG-элемента (Табл. 2.1). Таким образом, район 2.5 -субъединицы не участвует в узнавании TG в аптамерах. Для выяснения роли района 2.4 в узнавании TG-элемента было проверено, способны ли мутации в данном районе супрессировать замены TG в аптамерах. Было установлено, что замена Gln260His в районе 2.4 А-субъединицы T. aquaticus супрессирует замену TGCC в sEcap1-аптамере (Табл. 2.1). Это означает, что в узнавании TG в составе аптамеров, соответствующих нематричной цепи промотора, участвует район 2.4 -субъединицы. Таким образом, можно предположить, что узнавание TG-элемента в составе двунитевых промоторов осуществляется по обеим цепям ДНК, причем в нематричной цепи TG узнается районом 2.4, а в составе матричной цепи – районом 2.5 -субъединицы.
2.5. Узнавание GGGA-элемента Аптамеры к А-субъединице T. aquaticus, кроме -10 и TG-элементов, содержат консервативный мотив GGGA, расположенный справа от -10 элемента (Рис. 2.4).
Нуклеотидные замены в данном мотиве нарушают связывание аптамера с субъединицей (данные не приведены). Мы предположили, что GGGA может являться новым промоторным элементом, узнаваемым -субъединицей РНКП T.
aquaticus. Это предположение было подтверждено в нашей дальнейшей работе (см.
раздел 3).
Для локализации района -субъединицы, взаимодействующего с GGGA элементом, был использован метод сайт-специфических ДНК-белковых сшивок.
Для проведения эксперимента был использован модифицированный аптамер sTap1, в котором во второе положение GGGA-элемента был внесен 6-тио-гуанин (Рис.
2.4). Модифицированный аптамер при фотоактивации (365 нм) образовывал специфичную сшивку с А-субъединицей, которая подавлялась при добавлении избытка немодифицированного sTap1 (Рис. 2.6 А, дор. 1 и 2). Для картирования места сшивки был применен метод химического расщепления белка по остаткам цистеина. В эксперименте была использована А-субъединица, содержащая единственный остаток Cys в позиции 132. Было показано, что при расщеплении А в составе комплекса с радиоактивно-меченым аптамером по остатку Cys132 место сшивки локализуется в N-концевом фрагменте (Рис. 2.6 Б). Так как А субъединица с делецией N-концевого района 1.1 (аминокислоты 1-91) также образует сшивку с аптамером (Рис. 2.6 А, дор. 4), можно заключить, что место сшивки располагается между между аминокислотными остатками 92 и 132, что Рис. 2.6. Картирование участка контакта GGGA-элемента в sTap1-аптамере с А субъединицей T. aquaticus. (А) Сшивка А-субъединицы с модифицированным sTap1-аптамером, содержащим 6-тио-гуанин во втором положении GGGA-элемента (см. Рис. 2.4). Дор. 1 – сшивка с радиоактивно-меченым аптамером в отсутствие конкурентов, дор. 2 – сшивка в присутствии избытка немеченого аптамера, дор. 3 – сшивка в присутствии контрольного неспецифического олигонуклеотида, дор. 4 – сшивка с фрагментом 92-438, дор. 5 – сшивка с, содержащей остаток цистеина в позиции 132 (S132C). (Б) Картирование участка сшивки при помощи расщепления белка по остаткам цистеина (обработка 2-нитро-5-тиоцианобензойной кислотой, NTCBA). Слева от рисунка показано положение фрагментов А-субъединицы – маркеров молекулярной массы.
Справа показано положение комплекса sTap1 с N-концевым фрагментом, а также ожидаемое положение комплекса с С-концевым фрагментом соответствует консервативному району 1.2 -субъединицы. Функции данного района во взаимодействиях с ДНК до настоящего времени оставались неизвестными. Анализ существующих структурных моделей промоторного комплекса показывает, что район 1.2 -субъединицы располагается поблизости от участка нематричной цепи ДНК, соответствующего GGGA-элементу (Рис. 2.1).
Полученные нами данные позволяют предположить, что район 1.2 -субъединицы принимает непосредственное участие в узнавании данного участка промотора (см.
ниже, раздел 3).
2.6. Ингибирование связывания ДНК в свободной -субъединице Ранее было предложено несколько механизмов ингибирования ДНК связывающей активности в свободной -субъединице. Во-первых, было предположено, что связывание -субъединицы с ДНК ингибируется N-концевым отрицательно-заряженным районом 1.1 (Camarero et al., 2002;
Dombroski et al., 1993). Во-вторых, было показано, что в свободном состоянии принимает компактную конформацию, в которой районы 2 и 4 сближены друг с другом, что также может приводить к экранированию ДНК-связывающих сайтов (Callaci et al., 1999). Наконец, ингибирование связывания ДНК в свободной -субъединице может быть связано с локальными изменениями структуры ДНК-связывающих районов, в частности, района 2 (Anthony and Burgess, 2002;
Callaci et al., 1998).
Рис. 2.7. Расстояния между доменами 2 и 4 -субъединицы в свободном состоянии, в холоферменте, и в комплексе с аптамером sEcap1. Междоменные расстояния в 70-субъединице E.
coli были измерены методом LRET. Флуоресцентные группы, использованные для измерения, были присоединены к остаткам Cys, внесенным в положения 442 и 596 в районах 2 и 4 70, соответственно. Приведены расстояния (в ангстремах) в свободной -субъединице, а также в присутствии кор-фермента РНКП, аптамера sEcap1 и контрольного неспецифического олигонуклеотида (С) Для анализа механизма ингибирования связывания ДНК -субъединицей мы использовали аптамеры sEcap1 и sTap1, содержащие промоторные элементы. Было показано, что делеции районов 1.1 и 4 в -субъединицах E. coli и T. aquaticus не изменяют эффективность узнавания аптамеров (данные не приведены). Таким образом, данные районы не влияют на узнавание -10, TG и GGGA-элементов в составе аптамеров районами 2 и 1.2 -субъединицы.
Для анализа конформационных перестроек, происходящих при связывании аптамеров, был использован метод LRET (Luminescence Resonance Energy Transfer), позволяющий измерять расстояния между флуорофорами, внесенными в различные домены. Ранее было показано, что наиболее заметным конформационным изменением при связывании 70-субъединицы с кор-ферментом E. coli является увеличение расстояния между доменами 2 и 4 (Callaci et al., 1999). Мы проанализировали, изменяются ли расстояния между данными доменами в субъединицах E. coli и T. aquaticus при связывании аптамера sEcap1. Данные эксперименты были проведены совместно с лабораторией Т. Гайдука (Медицинская школа Университета С. Луис, США). В эксперименте были использованы модифицированные 70- и А-субъединицы, содержащие два флуорофора в районах 2 и 4 (Cy5 и группа, хелатирующая атом европия). Для присоединения флуорофоров были использованы варианты -субъединиц, содержащие два остатка цистеина в районах 2 и 4 (расположение данных остатков показано на Рис. 2.1). В соответствии с опубликованными данными, было показано, что взаимодействие с кор-ферментом сопровождается значительным увеличением расстояния между районами 2 и 4 и в 70, и в А-субъединицах (Рис. 2.7 и данные не приведены). В то же время, связывание аптамера sEcap1 не приводит к изменению расстояния между доменами 2 и 4 -субъединицы (Рис. 2.7). Таким образом, сближение доменов 2 и в свободной -субъединице также не может являться основным механизмом ингибирования ДНК-связывающей активности.
Итак, можно сделать вывод, что ингибирование узнавания ДНК в свободной -субъединице не связано с серьезными структурными перестройками субъединицы. Для связывания ДНК, по-видимому, необходимы локальные конформационные изменения, непосредственно затрагивающие ДНК-связывающие сайты.
Резюме. Кор-фермент стимулирует ДНК-связывающую активность района -субъединицы, вероятно, за счет локальных изменений конформации белка, которые индуцируются -субъединицей РНКП. Свободная -субъединица способна узнавать промоторные элементы в составе оцДНК-аптамеров, соответствующих нематричной цепи промотора, при этом узнавание TG и GGGA элементов осуществляется районами 2.4 и 1.2, соответственно. Комплекс с аптамерами является удобной экспериментальной системой для дальнейших структурных исследований механизмов узнавания промоторов.
3. Роль GGGA-элемента в узнавании промоторов РНКП 3.1. Синтетические промоторы на основе аптамеров Аптамеры к -субъединице T. aquaticus содержат в своем составе несколько мотивов (-10, TG и GGGA-элементы), которые специфически узнаются А субъединицей. Это позволило предположить, что аптамерные последовательности в двунитевом состоянии могут являться промоторами, узнаваемыми холоферментом РНКП T. aquaticus. Действительно, было обнаружено, что РНКП T. aquaticus (а также РНКП родственной бактерии T. thermophilus) обладает активностью на двунитевых фрагментах ДНК, содержащих последовательности аптамеров (sTap1 4) (Рис. 3.1 А,Б). Исследование механизмов узнавания данных промоторов было проведено совместно с лабораторией К. Северинова (Waksman Institute, USA). Было установлено, что, как и в случае природных промоторов, инициация транскрипции на данных промоторах происходит на расстоянии 6-7 нуклеотидов от -10 элемента.
Анализ аптамерных последовательностей показал, что они не содержат - элемента промоторов, и, следовательно, этот элемент не нужен для их активности (Рис. 3.1 А). Для более подробного анализа был выбран один из промоторов, sTap2.
Замена динуклеотида TG не приводила к инактивации промотора (промотор sTap2 TG, Рис. 3.1 В). В то же время, удаление GGGA-элемента (sTap2-GGGA) полностью инактивировало промотор (Рис. 3.1 В, дор. 3). Таким образом, активность РНКП на промоторе sTap2 в отсутствие -35 элемента обеспечивается присутствием GGGA элемента. Анализ точечных замен в GGGA показал, что для его узнавания важны все четыре нуклеотида, входящие в его состав (Рис. 3.1 Г).
В отличие от РНКП T. aquaticus, РНКП E. coli не проявляет активности на промоторах, полученных на основе sTap-аптамеров (Рис. 3.1 Б). Это свойство аптамерных промоторов очень необычно, так как большинство известных природных промоторов узнаются РНКП разных бактерий. Было установлено, что аптамерные последовательности не содержат каких-либо специфических элементов, ингибирующих транскрипцию РНКП E. coli, так как в присутствии - элемента данная РНКП способна эффективно транскрибировать аптамерные матрицы (промоторы sTap2+35, sTap2+35-TG и sTap2+35-GGGA, Рис. 3.1 А,В).
Способность к узнаванию GGGA-содержащих промоторов РНКП T. aquaticus не связана с термофильной адаптацией, так как РНКП Deinococcus radiodurans, близкородственной мезофильной бактерии, также способна узнавать аптамерные матрицы в отсутствие -35 элемента (Рис. 3.1 Д). В то же время, РНКП мезофильной бактерии Bacillus subtilis не активна на этом промоторе (Рис. 3.1 Д). Таким образом, способность узнавать GGGA-содержащие промоторы в отсутствие -35 элемента, по видимому, характерна для бактерий группы Thermus/Deinococcus.
Рис. 3.1. Транскрипционные свойства двунитевых матриц, полученных на основе sTap аптамеров. (А) Последовательности матриц на основе аптамеров sTap1-sTap4 (сверху) и различные варианты матриц на основе аптамера sTap2 (снизу). Показан участок от -40 до +5 нт относительно старта транскрипции;
-35, TG, -10 и GGGA-элементы выделены синим, зеленым, красным и желтым, соответственно. Стрелкой обозначена стартовая точка транскрипции.
Матрицы sTap1-sTap4 различаются по длине участка ДНК справа от стартовой точки. (Б) Синтез полноразмерной РНК на аптамерных промоторах sTap1-sTap4 РНКП T. aquaticus (Т) и E. coli (Е).
(В) Активность РНКП T. aquaticus и E. coli на аптамерном промоторе sTap2 с заменами различных элементов. (Г) Влияние точечных замен в GGGA-элементе на активность РНКП T. aquaticus на sTap2-промоторе. «Анти-10» - матрица без -10 элемента;
«-6С», «-5С», «-4С», «-3Т» - матрицы с точечными заменами в GGGA-элементе (номера соответствует позициям относительно старта транскрипции). (Д) Активность РНКП D. radiodurans и B. subtilis на промоторах sTap2 и sTap2+35.
Активность РНКП T. aquaticus измеряли при 60 °С, активности остальных РНКП – при 37 °С 3.2. GGGA в природных промоторах T. aquaticus и T. thermophilus Анализ опубликованных последовательностей промоторов T. aquaticus и T.
thermophilus показал, что некоторые из них также содержат похожие мотивы ссправа от -10 элемента (Рис. 3.2 А). Биоинформатический анализ промоторов в геноме T. thermophilus, проведенный совместно с лабораторией М. Гельфанда (Институт проблем передачи информации, Москва), позволил установить, что мотивы, родственные GGGA-элементу, могут содержаться примерно в 30% всех промоторов, что указывает на важную функциональную роль данного элемента в их узнавании.
Рис. 3.2. Роль GGGA в узнавании природных промоторов РНКП T. aquaticus. (А) Последовательности известных промоторов T. thermophilus и T. aquaticus, содержащих GGGA подобные мотивы (Leontiadou et al., 2001;
Maseda and Hoshino, 1995;
Osipiuk and Joachimiak, 1997;
Sato et al., 1988). -35, -10 и GGGA-элементы показаны синим, красным и желтым, соответственно.
(Б) Активность РНКП T. aquaticus и E. coli на dnaK-промоторе и его мутантных вариантах (стрелкой показана полноразмерая РНК, синтезируемая на данных матрицах). Активность РНКП T. aquaticus измеряли при 60 °С, активность РНКП E. coli – при 37 °С Для изучения роли GGGA в узнавании природных промоторов мы исследовали один из них, промотор гена dnaK, который содержит GGGA-элемент наряду с -10 и -35 элементами. Было показано, что удаление -35 элемента (мутантный промотор dnaK-35) приводит к заметному снижению, а удаление GGGA-элемента (промотор dnaK-GGGA) – почти к полному исчезновению активности РНКП T. aquaticus на данном промоторе (Рис. 3.2 Б, дор. 1-3).
Одновременная замена обоих элементов (промотор dnaK-35-GGGA) полностью инактивирует промотор (дор. 4). Следовательно, GGGA-мотив в промоторе dnaK специфически узнается РНКП T. aquaticus и способен обеспечивать инициацию транскрипции данной РНКП в отсутствие -35 элемента. РНКП E. coli обладает заметно меньшей активностью на dnaK-промоторе, чем РНКП T. aquaticus. В то же время, замена GGGA не оказывает влияния на эффективность транскрипции РНКП E. coli тогда как при замене -35 элемента, либо обоих элементов, активность пропадает (Рис. 3.2 Б). Таким образом, GGGA-элемент играет важную роль в узнавании природных промоторов РНКП T. aquaticus и обеспечивает межвидовые различия в узнавании GGGA-содержащих промоторов РНКП разных бактерий.
3.3. Узнавание GGGA-элемента РНКП E. coli Данные, приведенные в предыдущих разделах, показывают, что РНКП E. coli и T. aquaticus узнают промоторы, содержащие GGGA-элемент, с разной специфичностью. Эти различия могли бы объясняться различиями в специфичности узнавания участка промотора, соответствующего GGGA-элементу, субъединицами E. coli и T. aquaticus. Чтобы установить, способен ли район 1.2 субъединицы E. coli узнавать GGGA-элемент, была получена химерная субъединица (eT), содержащая N-конец, включая район 1.2, от 70-субъединицы E.
coli, а С-концевую часть – от А-субъединицы T. aquaticus. Было показано, что Рис. 3.3. Узнавание GGGA-элемента РНКП E. coli. (А) Активность РНКП T.
aquaticus (сверху) и E. coli (снизу), содержащих А, либо еТ-субъединицу, на промоторах sTap2 и Т7А1. На рисунке показано положение полноразмерной РНК, синтезируемой на sTap2 (RO, от англ. “run off”), и положение РНК, образующейся в результате терминации транскрипции на tR2-терминаторе на матрице Т7А1 (tR2). (Б) Активность РНКП E. coli и T. aquaticus на промоторах sTap2+35 (содержит GGGA) и sTap2+35-GGGA (не содержит GGGA).
Слева показано положение полноразмерной РНК (RO), а также абортивных продуктов, образующихся в ходе инициации транскрипции.
Активности РНКП T. aquaticus и E. coli измеряли при 60 °С и 37 °С, соответственно холофермент РНКП T. aquaticus, содержащий химерную eT-субъединицу, узнает sTap2-промотор с той же эффективностью, что и РНКП дикого типа (Рис. 3.3 А). В то же время, гибридные холоферменты, состоящие из кор-фермента E. coli и А субъединицы T. aquaticus, либо химерной -субъединицы, не способны узнавать sTap2-промотор, хотя и обладают нормальной активностью на контрольном промоторе Т7А1 (сильный промотор бактериофага Т7, содержащий -10 и - элементы) (Рис. 3.3 А). Таким образом, район 1.2 70-субъединицы способен узнавать GGGA в составе промоторов, а неспособность РНКП E. coli к инициации транскрипции на GGGA-промоторах в отсутствие -35 элемента, по-видимому, определяется свойствами кор-фермента РНКП.
Так как район 1.2 70 способен узнавать GGGA-элемент, мы предположили, что данный элемент может играть роль во взаимодействиях холофермента РНКП E.
coli с промоторами, содержащими -35 элемент. Действительно, сравнение транскрипции на промоторах sTap2+35 и sTap2+35-GGGA показало, что удаление GGGA-элемента приводит к изменению общей картины транскрипции и, в частности, к значительному уменьшению количества коротких абортивных продуктов, синтезируемых в ходе инициации (Рис. 3.3 Б). Таким образом, GGGA элемент играет функциональную роль в узнавании промоторов РНКП E. coli (см.
также ниже, раздел 4.3.1).
3.4. Структурные элементы РНКП, необходимые для узнавания GGGA-содержащих промоторов Несмотря на то, что -субъединицы РНКП T. aquaticus и E. coli узнают GGGA элемент с одинаковой специфичностью, только РНКП T. aquaticus способна к инициации транскрипции на GGGA-содержащих промоторах в отсутствие - элемента. Очевидно, что способность узнавать данный тип промоторов должна Рис. 3.4. Влияние делеций CTD, района 4 и flap-домена субъединицы на активность РНКП T. aquaticus на различных типах промоторов. Активность каждой из РНКП на различных промоторах показана в процентах относительно активности РНКП дикого типа на промоторе sTap2 (в случае различных вариантов sTap2), galP1 и Т7А1. Уровень активности измеряли по синтезу полноразмерной РНК на каждой из матриц при 60 °С определяться не только специфическими взаимодействиями с GGGA, но и другими свойствами РНКП. Ранее было показано, что в узнавание промоторов РНКП E. coli могут вносить вклад неспецифические взаимодействия РНКП с промоторной ДНК, в частности, контакты района 4 -субъединицы и CTD с ДНК в участке левее -35 элемента (Davis et al., 2005;
Minakhin and Severinov, 2003;
Ross and Gourse, 2005). Кроме того, было показано, что контакты района 4 субъединицы с ДНК зависят от взаимодействий данного домена с доменом flap («заслонка») -субъединицы РНКП (Kuznedelov et al., 2002b;
Minakhin and Severinov, 2003).
Для анализа возможной роли этих доменов РНКП T. aquaticus в узнавании GGGA-содержащих промоторов мы исследовали мутантные варианты РНКП с делециями CTD, района 4 и домена flap -субъединицы. Активность мутантных РНКП была измерена на различных вариантах sTap2-промотора и на контрольных промоторах T7A1 (промотор с -10 и -35 элементами) и galP1 (промотор с удлиненным -10 элементом). Было обнаружено, что все три мутантные РНКП не способны к инициации транскрипции на sTap2-промоторе. В то же время, все исследованные РНКП обладают высокой активностью на промоторе galР1, содержащем TG-элемент (Рис. 3.4). Таким образом, исследуемые домены РНКП T.
aquaticus необходимы для узнавания GGGA-содержащих промоторов в отсутствие 35 элемента. Вероятно, роль этих доменов заключается в стимуляции связывания РНКП с промотором за счет неспецифических взаимодействий с ДНК в области - элемента и левее от него, причем домен flap, по-видимому, стимулирует контакты района 4 с ДНК (см. модель на Рис. 2.1).
Все три исследуемые делеции (CTD, 4 и flap) также нарушают узнавание промоторов Т7А1 и sTap2+35-GGGA, которые содержат своем составе -10 и - элементы (Рис. 3.4). Таким образом, данные домены необходимы для эффективного узнавания РНКП T. aquaticus «классических» промоторов -10/-35-класса. Наиболее интересными свойствами обладает промотор sTap2+35, содержащий -10, -35, GGGA-элементы и узнаваемый РНКП T. aquaticus с наибольшей эффективностью (Рис. 3.4). Было обнаружено, что, в то время как РНКП с делецией района 4 субъединицы не активна на данном промоторе, делеции CTD и flap существенно не влияют на активность РНКП (Рис. 3.4). Таким образом, одновременное наличие трех промоторных элементов обеспечивает эффективное узнавание промотора РНКП, даже несмотря на отсутствие контактов CTD с промоторной ДНК и взаимодействий домена flap с районом 4.
Полученные данные показывают, что для узнавания GGGA-содержащих промоторов РНКП T. aquaticus необходимы СTD, 4 и flap-домены, которые участвуют в неспецифических взаимодействиях с промоторной ДНК. Вероятно, различия в данных взаимодействиях могут являться основной причиной межвидовых различий в узнавании промоторов данного типа.
Резюме. Охарактеризован новый элемент промоторов бактерий, GGGA элемент, который расположен справа от -10 элемента и узнается районом 1.2 субъединицы. GGGA является промоторным элементом нового типа, который способен определять межвидовые различия в узнавании промоторов;
данные различия зависят от неспецифических контактов РНКП с промоторной ДНК.
GGGA-элемент расширяет список известных промоторных элементов бактерий, включающий также -10, -35, TG и UP-элементы, причем четыре из перечисленных элементов узнаются различными районами -субъединицы (Рис. 2.1). Наличие большого числа независимо узнаваемых элементов промотора открывает широкие комбинаторные возможности для создания промоторов, обладающих разным уровнем активности. Использованный нами подход с использованием аптамеров может быть применен в дальнейшем для анализа механизмов узнавания промоторов РНКП различных бактерий и поиска новых промоторных элементов.
4. Механизм образования открытого промоторного комплекса РНКП 4.1. Узнавание шпилечных матриц холоферментом РНКП После первоначального узнавания промотора, РНКП осуществляет плавление ДНК вокруг стартовой точки транскрипции. Вопрос о том, что является движущей данного процесса и каким образом происходит стабилизация расплавленного участка ДНК в составе промоторного комплекса, во многом остается неразрешенным. Было показано, что в плавлении промотора и стабилизации открытого комплекса важную роль играют специфические взаимодействия субъединицы с нематричной цепью ДНК в области -10 элемента (Fenton et al., 2000;
Gross et al., 1998). Кроме того, известно, что холофермент РНКП способен взаимодействовать с одноцепочечными матрицами, имеющими структуру шпилек, в которых точка инициации транскрипции находится в однонитевом участке.
Примерами таких матриц являются ориджины репликации нитчатых бактериофагов (М13, fd) (Higashitani et al., 1997). Было показано, что для узнавания этих матриц наличие промоторных элементов необязательно (Zenkin and Severinov, 2004). Это позволяет предполагать, что способность холофермента РНКП к узнаванию шпилечной структуры ДНК также вносит вклад в плавление промотора и стабилизацию открытого комплекса.
Чтобы выяснить, какие последовательности ДНК являются оптимальными для связывания с холоферментом РНКП, мы провели отбор аптамеров к холоферментам РНКП E. coli и T. aquaticus (раздел 1.3). Аптамеры к холоферментам РНКП E. coli и T. aquaticus были названы hEcap (от holo E. coli aptamer) и hTap (holo T. aquaticus Рис. 4.1. Структура и транскрипционные свойства аптамеров к холоферменту РНКП. (А) Последовательности аптамеров к холоферментам РНКП T. aquaticus (hTap12) и E. coli (hEcap5, hEcap6). Показаны центральные части аптамеров без константных районов библиотеки. Красным и зеленым выделены мотивы, соответствующие -10 и TG-элементам. (Б) Предполагаемая вторичная структура аптамеров. Промоторные элементы (-10 и TG) обозначены красным и зеленым, соответственно. Участок, внесенный в аптамер hEcap6 для исследования инициации транскрипции, обозначен синей линией. Стартовая точка транскрипции показана стрелкой;
указаны -1 и +1 позиции, которым соответствует динуклеотидная затравка UpA. (Б) Транскрипционная активность РНКП E. coli на шпилечных матрицах, полученных на основе аптамера hEcap6. WT – исходный аптамер;
-TG – аптамер с заменой TG на СС;
-TACACT – аптамер с заменой -10 элемента на TCACCA. Реакцию проводили в присутствии всех четырех нуклеотидов (с добавлением -[32Р]-UTP) и затравки UpA aptamer), соответственно. Анализ последовательностей аптамеров показал, что большинство из них содержат TG и -10-элементы промотора (Рис. 4.1 А) и образуют структуру шпилек, в которых TG-элемент входит в состав двунитевой части, а -10 элемент находится в составе петли в однонитевом состоянии (при этом размер петли различается у разных аптамеров) (Рис. 4.1 Б). Данная структура соответствует структуре расплавленного участка промотора в области -10 элемента.
Аптамеры связываются с РНКП с высокой аффинностью (Кд 1-5 нМ), которая сравнима с аффинностью холофермента к промоторам. Замены TG и -10-элементов нарушают узнавание аптамеров (Кд 100 нМ) и, следовательно, для узнавания аптамеров важна как специфическая шпилечная структура, так и наличие в их составе промоторных элементов.
Аптамеры к холоферментам РНКП E. coli и T. aquaticus имеют сходную структуру (Рис. 4.1 А). Некоторые из изученных аптамеров способны взаимодействовать с обеими РНКП (например, аптамеры hEcap2, hEcap6). Таким образом, способность узнавать данный тип ДНК-матриц может являться общим свойством РНКП различных бактерий. В то же время, некоторые из аптамеров специфичны к своей РНКП-мишени (например, аптамеры hEcap5 и hTap12 к РНКП E. coli и T. aquaticus, соответственно). Вероятно, дальнейший анализ аптамеров может привести к выявлению дополнительных промоторных мотивов, определяющих видоспецифические различия в узнавании промоторов.
Чтобы установить, способны ли аптамеры служить матрицами для специфической инициации транскрипции, мы исследовали транскрипционные свойства одного из аптамеров к холоферменту РНКП E. coli, hEcap6. В этом аптамере в участок, соответствующий возможной точке инициации транскрипции, было внесено несколько дополнительных нуклеотидов, что позволяло исследовать процесс инициации (Рис. 4.1 А). Было обнаружено, что РНКП E. coli способна синтезировать на данном аптамере тринуклеотидный РНК-продукт, используя в качестве инициаторных субстратов динуклеотидную затравку (UpA) и следующий за ней нуклеотид (UTP) (Рис. 4.1 Б). Узнавание данной матрицы высокоспецифично, поскольку замена TG элемента нарушает, а замена -10 элемента полностью подавляет специфическую инициацию транскрипции (Рис. 4.1 Б). Таким образом, аптамеры являются удобной моделью для исследования механизмов инициации на различных типах транскрипционных матриц.
Полученные данные показывают, что оптимальными для узнавания холоферментом РНКП являются ДНК-субстраты, имеющие шпилечную структуру, и содержащие в составе шпильки -10 и TG-элементы промотора. Способность узнавать данный тип ДНК-структур, по-видимому, лежит в основе плавления промоторов холоферментом РНКП.
4.2. Механизм открывания промотора РНКП Как уже говорилось выше, детальный механизм плавления ДНК, осуществляемого РНКП в ходе инициации, остается неизвестным. На основе биохимических данных и анализа мутаций в 70-субъединице РНКП E. coli было установлено, что важную роль в открывании промоторов играют взаимодействия консервативных ароматических аминокислотных остатков в районе 2 70 субъединицы с нематричной цепью ДНК в области -10 элемента (Рис. 4.2) (Fenton et al., 2000;
Panaghie et al., 2000;
Tomsic et al., 2001). Предполагается, что основную роль в инициации плавления играют остатки Y430 и W433 70-субъединицы, которые взаимодействуют с остатком А во втором положении -10 элемента (см.
ниже, Рис. 4.4) (Schroeder et al., 2007). В то же время, роль неконсервативных аминокислот района 2, а также участие других районов -субъединицы и кор фермента в плавлении ДНК исследованы не были. Кроме того, оставалось неизвестным, существуют ли межвидовые различия в механизмах открывания промоторов РНКП разных бактерий.
4.2.1. Открывание промоторов РНКП мезофилов и термофилов Для анализа механизма образования открытого промоторного комплекса и выявления межвидовых различий в инициации транскрипции мы провели сравнение транскрипционных свойств РНКП мезофильных и термофильных бактерий. Ранее было показано, что для РНКП термофильных бактерий характерна сниженная активность (холодочувствительность) при температурах, являющихся оптимальными для ферментов мезофильных бактерий (37 °С) (Meier et al., 1995;
Рис. 4.2. Выравнивание последовательностей района 2 -субъединиц E. coli (Eco), T. aquaticus (Taq) и D. radiodurans (Dra). Границы подрайонов района 2 показаны над выравниванием (подрайон 2.1 – зеленый, подрайон 2.2 – синий, подрайон 2.3 – желтый, подрайон 2.4 – сиреневый). Цифрами над выравниванием указаны номера аминокислотных остатков в 70 субъединице E. coli. Звездочками обозначены аминокислотные остатки, замены которых в 70 субъединице нарушают плавление промотора (Fenton et al., 2000;
Panaghie et al., 2000;
Tomsic et al., 2001). Остатки, отличающиеся в A-субъединицах T. aquaticus и D. radiodurans от 70 субъединицы E. coli, показаны красным. В нижней части выравнивания показаны последовательности мозаичных вариантов 70-субъединицы, содержащих различные комбинации замен в районе 2. В нижней строчке показана последовательность района 2 А-субъединицы B.
subtilis;
серым цветом обозначены аминокислотные остатки, отличающиеся от -субъединиц E.
coli, T. aquaticus и D radiodurans. Данные о плавлении промотора РНКП E. coli, содержащими мозаичные -субъединицы, при 20 °С, приведены справа от выравнивания (RPo – открытый промоторный комплекс). Стрелками под выравниванием показаны неконсервативные остатки, замены которых оказывают наибольшее влияние на температуру плавления промотора Minakhin et al., 2001;
Xue et al., 2000). Было предположено, что данная особенность связана с термофильной адаптацией бактерий, однако, прямых исследований, подтверждающих это, не проводилось. Мы сравнили характеристики промоторных комплексов РНКП нескольких мезофильных и термофильных бактерий, что позволило выявить структурные элементы РНКП, участвующие в плавлении промоторов и стабилизации комплексов, а также установить взаимосвязь между транскрипционными свойствами РНКП и температурной адаптацией бактерий.
В качестве модельных ферментов для исследований были использованы: (1) РНКП термофильных бактерий T. aquaticus и T. thermophilus – бактериальные РНКП, для которых известна трехмерная структура, (2) РНКП мезофильной бактерии E. coli – данная РНКП лучше всего изучена биохимическими и генетическими методами, (3) РНКП мезофильной бактерии D. radiodurans, которая является ближайшим родственником T. aquaticus и T. thermophilus (Makarova et al., 2001), – близкое филогенетическое родство этих бактерий позволяет выявить различия в свойствах данных РНКП, непосредственно связанные с различной температурной адаптацией.
Для анализа механизма образования открытого промоторного комплекса РНКП E. coli, T. aquaticus и D. radiodurans мы исследовали плавление промоторов данными РНКП при разных температурах (Рис. 4.3). Для детекции плавления ДНК был использован метод футпринтинга перманганатом калия, который позволяет специфически модифицировать тиминовые основания в однонитевой ДНК. Было показано, что, в соответствии с опубликованными данными, РНКП E. coli способна Рис. 4.3. Плавление lacUV5-промотора РНКП E. coli (Eco), T. aquaticus (Taq) и D. radiodurans (Dra). Плавление ДНК детектировали при помощи KMnO4 футпринтинга на промоторном фрагменте, содержащем метку в нематричной цепи. Стрелками указаны продукты расщепления ДНК по остаткам тимина в расплавленной области промотора, цифры обозначают позиции нуклеотидов относительно стартовой точки транскрипции. На крайние дорожки нанесен маркер (М), полученный при расщеплении ДНК по остаткам А и G открывать промотор как в условиях температурного оптимума (45 °С), так и при более низкой температуре (20 °С) (Рис. 4.3, дор. 2 и 3). В то же время, данная РНКП термочувствительна и не активна при высоких температурах (65 °С) (дор. 4). РНКП T. aquaticus, напротив, открывает промотор при 45 и 65 °С, но не способна к плавлению ДНК при 20 °С (дор. 11-13). РНКП D. radiodurans открывает промотор при 45 °С, но не плавит ДНК при 20 и 65 °С (дор. 14-16). Таким образом, РНКП мезофильной бактерии D. radiodurans проявляет такую же холодочувствительность открывания промоторов, как и РНКП T. aquaticus. Следовательно, вопреки высказанной ранее гипотезе, холодочувствительность открывания промоторов РНКП термофильных бактерий может быть напрямую не связана с с адаптацией клеток к высоким температурам.
Для того, чтобы установить, какой компонент РНКП – кор-фермент или субъединица, – отвечает за наблюдаемые различия в температуре открывания промоторов, мы исследовали плавление ДНК гибридными холоферментами, состоящими из кор-фермента E. coli и -субъединиц T. aquaticus и D. radiodurans.
Было установлено, что данные холоферменты также не способны открывать промотор при 20 °С (Рис. 4.3, дор. 5-10). Таким образом, холодочувствительность открывания промоторов РНКП T. aquaticus и D. radiodurans определяется свойствами -субъединицы РНКП.
Участки -субъединицы, определяющие температуру открывания 4.2.2.
промоторов Различия в температуре открывания промоторов РНКП E. coli, T. aquaticus и D. radiodurans были использованы для поиска функционально-важных участков субъединицы, задействованных в плавлении промоторов. С этой целью были сконструированы три мозаичных варианта 70-субъединицы E. coli с заменой отдельных районов на гомологичные последовательности T. aquaticus ( ЕЕТ, ЕТЕ и ТЕЕ). В ЕЕТ была заменена С-концевая часть, включающая районы 3 и 4, в ЕТЕ – район 2, а в ТЕЕ – N-концевая часть, включающая район 1 и неконсервативный участок между районами 1 и 2. Анализ плавления промотора РНКП E. coli, содержащими мозаичные -субъединицы, показал, что холодочувствительность открывания промоторов наблюдается только в случае субъединиц ЕТЕ и ТЕЕ, а ЕЕТ не отличается от 70-субъединицы по эффективности плавления ДНК при 20 °С (данные не приведены). Таким образом, холодочувствительность открывания промоторов -субъединицей T. aquaticus определяется N-концевой частью белка и консервативным районом 2. N-концевая часть значительно различается у E. coli и T. aquaticus, что затрудняет поиск индивидуальных аминокислотных остатков, ответственных за различия в температуре открывания промоторов. В то же время, в районе 2 А-субъединицы T.
aquaticus имеется всего 12 аминокислотных замен, а в А субъединице D.
radiodurans – 10 замен по сравнению с 70-субъединицей E. coli (Рис. 4.2).
Для анализа влияния индивидуальных аминокислотных замен в районе 2 на температуру плавления промоторов был получен набор мозаичных вариантов 70 субъединицы с различными комбинациями замен, присутствующих в разных подрайонах района 2 -субъединиц T. aquaticus и D. radiodurans (Рис. 4.2).
Исследование плавления промоторов РНКП, содержащими данные -субъединицы, позволило установить, что замены аминокислот в подрайонах 2.3 и 2.4 ( М3, М4 и М3-4) не нарушают, а замены в подрайонах 2.1 и 2.2 ( М1-2) несколько ослабляют плавление промотора при 20 °С. В то же время, холодочувствительность, характерная для -субъединицы T. aquaticus, наблюдается только в случае субъединиц, содержащих комбинации замен в подрайонах 2.1-2.2 и 2.3 или 2.4 ( М1-3 и М1-2;
4) (Рис. 4.2). Таким образом, холодочувствительность открывания промоторов объясняется комбинированным эффектом аминокислотных замен в различных подрайонах района 2 -субъединицы.
Некоторые из этих замен присутствуют также в А-субъединице мезофильной бактерии B. subtilis (Рис. 4.2). РНКП, содержащая мозаичную -субъединицу ЕВЕ с заменой района 2 на соответствующую последовательность B. subtilis, не проявляет холодочувствительности открывания промоторов. Таким образом, замены, присутствующие в B. subtilis, не влияют на плавление промоторов. Оставшиеся замен (обозначенные стрелками на рисунке Рис. 4.2 и показанные желтым на Рис.
4.4), которые с наибольшей вероятностью влияют на плавление ДНК, можно разделить на три группы.
1) Замены Q400S, I410Q и M413I затрагивают аминокислоты, взаимодействующие с -субъединицей кор-фермента РНКП (Рис. 4.4). Эффект этих замен, по-видимому, объясняется изменением контактов с кор-ферментом, что может приводить к изменению локальной конформации подрайонов 2.3 и 2.4, непосредственно взаимодействующих с ДНК.
2) Замена G425R в подрайоне 2.3 располагается в петле, соединяющей две спирали, взаимодействующих с кор-ферментом и с ДНК. Вероятно, эта замена приводит к снижению конформационной подвижности района 2 -субъединицы, что затрудняет плавление промотора.
3) Замены K414R и T440N в подрайонах 2.2 и 2.4 затрагивают аминокислоты, которые, по структурным и биохимическим данным, напрямую взаимодействуют с ДНК при узнавании и открывании промотора (Fenton et al., 2000;
Tomsic et al., 2001).
Данные замены, вероятно, непосредственно влияют на процесс плавления ДНК.
Таким образом, замены неконсервативных аминокислот в различных участках района 2 -субъединицы совместно влияют на температуру открывания промоторов, за счет изменения конформационной подвижности -субъединицы и Рис. 4.4. Структура района 2 -субъединицы РНКП. Рисунок основан на данных о структуре холофермента РНКП T. thermophilus (Vassylyev et al., 2002). Изображен район 2 -субъединицы, подрайоны 2.1, 2.2, 2.3 и 2.4 обозначены теми же цветами, что на Рис. 4.2. Расположение - элемента в нематричной цепи ДНК показано пунктирной линией. Консервативные остатки Y430 и W433, взаимодействующие с -10 элементом и инициирующие плавление ДНК, изображены темно-желтым. Боковые цепи остатков, различающихся в E. coli и T. aquaticus, изображены светло-желтым (замены, влияющие на температуру плавления промотора) и красным (замены, не влияющие на температуру плавления). Темно-синим изображен участок -субъединицы (остатки 263-307), взаимодействующий с районом 2 -субъединицы ее контактов с кор-ферментом и с ДНК. Нами впервые установлено, что неконсервативные аминокислотные остатки -субъединицы играют важную роль в плавлении промоторов, а их замены у разных бактерий могут обеспечивать изменения в транскрипционных свойствах РНКП.
4.3. Механизмы стабилизации промоторного комплекса Важной характеристикой промоторного комплекса является уровень его стабильности, от которого зависит эффективность инициации транскрипции.
Изменение стабильности промоторных комплексов может служить одним из эффективных механизмов регуляции транскрипции (Gourse et al., 1998;
Gross et al., 1998). Анализ различных природных промоторов E. coli и их мутантных вариантов позволил установить, что стабильность промоторных комплексов РНКП зависит от последовательности промотора;
наличие консенсусных промоторных элементов (-10, -35, TG и UP) увеличивает стабильность (Gourse et al., 1998;
McClure, 1985).
Однако, влияние других участков промотора на стабильность промоторного комплекса исследовано не было. Функции различных структурных элементов РНКП в стабилизации промоторных комплексов также изучены слабо. Было показано, что на стабильность промоторных комплексов влияют мутации в субъединице (Fenton et al., 2000;
Gross et al., 1998;
Vuthoori et al., 2001), а также в кор-ферменте РНКП E. coli (Ederth et al., 2002;
Nechaev et al., 2000). Таким образом, стабильность комплексов, по-видимому, определяется различными типами контактов РНКП с промоторной ДНК. РНКП разных бактерий могут значительно различаться по стабильности промоторных комплексов. Так, РНКП E. coli образует на большинстве промоторов очень стабильные комплексы (время полужизни до нескольких часов) (McClure, 1985). РНКП B. subtilis и Rickettsia prowazekii, напротив, образуют нестабильные комплексы (Aniskovitch and Winkler, 1995;
Artsimovitch et al., 2000). Молекулярные механизмы, лежащие в основе данных различий, оставались неизвестны. Задачей данной части нашей работы являлся анализ механизмов стабилизации промоторных комплексов РНКП различных бактерий.
4.3.1. Роль GGGA-элемента в стабилизации промоторных комплексов Как было показано ранее, важнейшим фактором, определяющим стабильность промоторных комплексов, являются контакты РНКП с консервативными промоторными элементами (Gross et al., 1998;
Haugen et al., 2008a;
McClure, 1985).
В нашей работе был охарактеризован новый промоторный элемент GGGA (см.