Экранирование видимого и уф излучения как фотозащитный механизм растений

На правах рукописи

СОЛОВЧЕНКО Алексей Евгеньевич ЭКРАНИРОВАНИЕ ВИДИМОГО И УФ ИЗЛУЧЕНИЯ КАК ФОТОЗАЩИТНЫЙ МЕХАНИЗМ РАСТЕНИЙ специальность: 03.00.12 — физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва – 2009 2

Работа выполнена на кафедре физиологии микроорганизмов Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор А.М. Носов Доктор биологических наук, профессор А.Я. Потапенко Доктор биологических наук, профессор Г.И. Тараканов

Ведущая организация: Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН

Защита состоится 2009 года в 15 часов 30 минут на заседании диссертационного Совета Д 501.001.46 при Московском государственном универси тете имени М.В. Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, МГУ, био логический факультет, аудитория М-1, тел./факс (495) 939-43-09.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова

Автореферат разослан 200 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук М.А. Гусаковская Актуальность проблемы. Существование растений как фотоавтотрофов неразрывно связано с поглощением и утилизацией энергии солнечного излучения в ходе фотосинтеза.

Основные пигменты растений, локализованные в тилакоидных мембранах хлоропластов, способны эффективно улавливать кванты света и передавать их энергию другим компо нентам ФСА 1 для синтеза АТФ и НАДФН, фиксации CO2 и т.д. [Бухов, 2001;

Ладыгин, 2002;

Horton, Ruban, 2004]. При этом с оптимальной скоростью фотосинтез осуществляет ся в довольно узком диапазоне интенсивностей света и в результате даже при относитель но невысоких потоках не вся световая энергия, поглощенная ФСА, может быть использо вана в фотохимических реакциях [Ort, 2001;

Ensminger et al., 2006]. Дисбаланс между по глощенной энергией света и способностью растения к ее утилизации также возникает при действии экстремальных температур, засухи, дефицита элементов минерального питания [Ensminger et al., 2006], на ювенильных стадиях развития и при старении растений [Steyn et al., 2002;

Hoch et al., 2003]. Часто в подобных ситуациях происходит повышение уровня активных форм кислорода (АФК), вызывающих фотоокислительные повреждения тканей, вплоть до гибели растений [Мерзляк, 1989;

Asada, 2006]. Кроме того, наряду с хлорофил лами (Хл) в клетке содержится целый ряд соединений, таких как порфирины, Fe-S белки митохондрий, флавины и птерины, способных под действием облучения в видимой части спектра приводить к образованию АФК [Kim, Jung, 1995;

Егоров и др., 1999;

Foyer, Noctor, 2000]. Наряду с избыточным облучением в видимой части спектра (ФАР), повреждения растений могут быть связаны с действием УФ [Caldwell et al., 1981–2003].

Необходимость защиты от повреждения солнечной радиацией обусловила возникно вение у растений ряда адаптаций, включающих регуляторные и фотозащитные механиз мы. Поскольку первые фототрофные организмы подвергались действию более жесткого УФ излучения, чем современные, считается, что ферментативные механизмы репарации УФ-индуцированного повреждения нуклеиновых кислот и ресинтеза важных белков ФСА возникли в процессе эволюции одними из первых [Cockell, Knowland, 1999;

Niyogi, 1999].

Универсальными и важнейшими для растений являются ферментативные и нефермента тивные системы дезактивации АФК, играющие ключевую роль в предотвращении фото повреждений окислительного характера [Иванов, Мерзляк, Elstner, 1972–1989;

Foyer, Noc tor, 2000;

Asada, 2006]. Другие механизмы, обеспечивающие эффективное протекание фо тосинтеза в широком диапазоне длин волн и потоков радиации, включают перераспреде Список сокращений: 1О2 — синглетный кислород;

3Хл — триплетное возбужденное состояние хлорофил ла;

-кар — -каротин;

Ант — антоцианы, Антера — антераксантин;

АФК — активные формы кислорода;

Вио — виолаксантин;

ЖК — жирные кислоты;

Зеа — зеаксантин;

Кар — каротиноиды, ЛГ — липидные глобулы;

Лют — лютеин;

Нео — неоксантин;

Ркс — родоксантин;

Хл — хлорофилл(ы), ФеС — фенольные соединения;

Фл — флавонолы;

ФС — фотосистема;

ФСА — фотосинтетический аппарат;

ЭК — эфиры ксантофиллов;

R — коэффицент отражения при длине волны.

ление потока поглощенной ФАР между ФС, изменение стехиометрии ФС I, ФС II и ком понентов ССК, диссипацию энергии возбуждения Хл в виде тепла и тушение 3Хл и 1О [Demmig-Adams, Adams, 1992;

Бухов, 2001;

Ладыгин, 2002;

Horton, Ruban, 2004].

Согласно общепринятым представлениям, фотозащитными являются все перечис ленные выше механизмы, предотвращающие фотоповреждение ФСА и обеспечивающие его стабильную работу в широком диапазоне условий окружающей среды [Иванов, Мерз ляк, Asada, Elstner, 1980–2006]. В нашей работе основное внимание уделяется существен но менее изученным экстратилакоидным пигментам, ослабляющим достигающее тила коидов излучение, а также фотозащитным механизмам, основанным на экранировании УФ и избытка ФАР. Эти механизмы, представляющие большой интерес для исследования адаптационных возможностей растений, были выделены и охарактеризованы сравнитель но недавно, но уже привлекают значительное внимание исследователей [Day et al., 1993, 1994;

Карапетян, 1999;

Bornman et al., 1997;

Cockell, Knowland, 1999;

Mazza et al., 2000;

Shick, Dunlap, 2002;

Steyn et al., 2002;

Hormaetxe et al., 2005;

Merzlyak et al., 2000–2008].

Ключевой особенностью механизмов этого типа является устранение причин фотоповреж дения — чрезмерного поглощения солнечной радиации пигментным аппаратом и облуче ния других фоточувствительных компонентов и эндогенных фотосенсибизаторов клетки.

В основе этих механизмов лежит способность растений синтезировать и накапливать под действием сильного излучения в различных компартментах клеток и структурах тка ней фотозащитные пигменты — соединения, селективно поглощающие в УФ и видимой частях спектра и конкурирующие за поглощение квантов с фотосинтетическими пигмен тами (Хл и Кар, локализованными в тилакоидах) [Bornman et al., 1997;

Cockell, Knowland, 1999;

Shick, Dunlap, 2002;

Merzlyak et al., 2000–2008]. Большинство фотозащитных пиг ментов растений принадлежит к четырем основным группам соединений: микоспорин подобным аминокислотам, ФеС, Кар и беталаинам [Shick, Dunlap, 2002;

Запрометов, 1993;

Harborne, Williams, 2000;

Strack et al., 2003]. К началу наших исследований отдельные классы фотозащитных пигментов были обнаружены практически у всех видов растений [Запрометов, 1993;

Ладыгин, 2000, 2002;

Harborne, Williams, 2000;

Strack et al., 2003] и во многих случаях была доказана и описана их фотозащитная функция. Полученные к на стоящему времени сведения позволяют полагать, что фотозащитные соединения участву ют в долговременной адаптации растений [Cockell, Knowland, 1999;

Steyn et al., 2002;

Hoch et al., 2003;

Merzlyak et al., 1999–2007]. Несмотря на значительные успехи в изуче нии биохимии фотозащитных пигментов, к настоящему времени еще не сформированы четкие представления о значении конкретных пигментов для защиты растений от фото повреждения. Так, для многих видов растений отсутствуют данные о динамике содержа ния, спектральных свойствах in vivo и эффективности фотозащитного действия, а имею щиеся сведения фрагментарны и нуждаются в систематизации. В особой степени это от носится к пигментам, экранирующим излучение в видимой области спектра, фотопротек торная роль которых в настоящее время мало изучена по сравнению с таковой ФеС, уча ствующих в защите от УФ-B [Bornman et al., 1997: Cockell, Knowland, 1999].

Из сказанного ясно, что исследование роли пигментов в фотоадаптации и защите от фотоповреждения у растений различных систематических групп относится к актуальным разделам физиологии растений и фотобиологии, а изучение их состава, динамики, локали зации и особенностей спектроскопии in vivo входит в число направлений, приоритетных в данной области. Мы считаем, что данные исследования могут быть выделены в качестве самостоятельной проблемы, актуальность которой обусловлена необходимостью расши рения текущих представлений об адаптационных возможностях и механизмах фотоавто трофных организмов.

Цели и задачи исследования. Работа посвящена изучению роли пигментов, экра нирующих видимое и УФ излучение, в долговременной адаптации растений к действию высоких потоков солнечной радиации и защите от фотоповреждения. Основная цель рабо ты — выявление закономерностей изменения состава, оптических свойств in vivo и in vitro, а также физиологической роли различных групп пигментов при фотоадаптации и фотоповреждении у растений.

Задачи исследования:

1) исследование динамики содержания, состава и соотношения различных групп фотоза щитных пигментов при адаптации к интенсивному солнечному свету и повреждении им растений на разных этапах онтогенеза;

2) изучение субклеточной локализации и оптических свойств пигментов in vivo в тканях высших растений, клетках микроводорослей, а также отдельных пластидах и вакуолях при адаптации к высоким потокам солнечной радиации и при фотоповреждении;

3) выяснение ролей различных форм Кар и ФеС в долговременной адаптации растений, различающихся по способности к биосинтезу фотозащитных пигментов;

4) исследование значения различных ФеС (фенольных кислот, Фл и Ант) для формирова нии устойчивости ФСА высших растений к повреждению, вызванному УФ и ФАР;

5) разработка новых и совершенствование существующих недеструктивных методов ана лиза пигментов in situ и мониторинга физиологического состояния растений.

Научная новизна работы. В результате изучения представителей разных таксо номических групп растений в экспериментальных и природных условиях, взывающих ин дукцию основанных на экранировании видимого и УФ излучения механизмов фотоадап тации и, в отдельных случаях, фотоповреждение, впервые описаны особенности динамики состава, а также спектроскопия in vivo для ряда фотозащитных пигментов;

охарактеризо вана их роль в защите от повреждения видимой и УФ радиацией. Сформулированы новые и существенно расширены существующие представления о физиологическом значении различных групп пигментов в адаптации растений к интенсивности и спектральному со ставу освещения и защите от фотоповреждений. Установлено, что при длительном воз действии на растения интенсивного солнечного излучения ограничение количества свето вой энергии, поглощаемой фотосинтетическим аппаратом при участи фотозащитных пиг ментов, может являться эффективным дополнением «классических» фотозащитных меха низмов, таких как элиминация АФК и тепловая диссипация избытка поглощенной ФАР.

Охарактеризованы закономерности динамики состава и содержания ФеС и экстра тилакоидных Кар в высших растениях при адаптации к действию интенсивного солнечно го света и его УФ компонента. Выявлены черты сходства трансформации фотосинтетиче ских пигментов при старении ассимиляционных тканей растений и их адаптации к дейст вию сильного солнечного света. Установлено, что УФ компонент солнечной радиации иг рает ключевую роль в индукции синтеза ФеС (Фл), обеспечивающих устойчивость к вы званному им фотоповреждению;

именно эта группа индуцибельных ФеС играет ключевую роль в экранировании УФ-А излучения у растений. Показано, что экстратилакоидные Кар, накапливающиеся в липидных глобулах, могут играть важную роль в фотоадаптации мик роводорослей и высших растений, главным образом за счет экранирования избыточного видимого излучения.

Впервые получены спектральные характеристики in vivo для ряда фотозащитных пигментов (Кар, Фл, Ант), накапливаемых растениями в условиях стресса в кутикуле, ва куолях, пластидах и цитоплазматических включениях. Описана локализация и оптические свойства экстратилакоидных Кар высших растений и зеленых микроводорослей на уровне отдельных пластид. Выявлены общие черты ультраструктурных изменений пластид при адаптации к сильному свету, недостатку азота, а также при старении растений. Установ лено, что различные фотозащитные пигменты способны формировать в растениях «экра ны» и «ловушки», эффективно ослабляющие излучение в широком диапазоне спектра, от УФ-B до красной области. Показано, что отличные по химической природе и локализации пигменты, такие как экстратилакоидные Кар и Ант, могут играть сходную роль в защите от повреждения растений в силу сходства их спектральных свойств.

Получены новые данные об изменении оптических свойств растений при фото адаптации и фотоповреждении, а также сведения о влиянии на них накопления фотоза щитных пигментов, позволившие значительно расширить возможности интерпретации спектральных данных и дополнить методологию недеструктивного анализа пигментов. На основании анализа собственных и литературных данных разработана концепция, согласно которой способность растений к биосинтезу определенных групп фотозащитных пигмен тов является важным компонентом стратегии их долговременной фотоадаптации.

Положения, выносимые на защиту. На основании анализа собственных и опуб ликованных в литературе данных о механизмах функционирования и физиологической роли фотозащитных пигментов можно заключить следующее:

1) фотозащитные механизмы, основанные на экранировании видимого и УФ излучения пигментами (такими как экстратилакоидные Кар, Фл и Ант), играют одну из ключевых ролей в долговременной фотоадаптации и защите растений от фотоповреждения на различных этапах онтогенеза;

2) «экранирующие» пигменты задерживают значительную часть излучения в широком спектральном диапазоне, поглощаемую в их отсутствие пигментами ФСА. Особенно сти спектроскопии «экранирующих» пигментов in vivo (батохромные сдвиги максиму мов и уширение полос поглощения), важны для их фотозащитной функции;

3) изменения содержания и состава пигментов растений при адаптации к высоким пото кам солнечного света направлены на снижение поглощения радиации компонентами ФСА и эндогенными сенсибилизаторами, присутствующими в растительной клетке;

во многих случаях за счет накопления «экранирующих» пигментов;

4) адаптация к интенсивному солнечному излучению во многих случаях сопровождается характерными изменениями ультраструктуры клеток: деградацией гранально ламеллярной системы хлоропластов и образованием липидных включений. Экстрати лакоидные Кар, локализованные в этих структурах, обладают высокой фотостабильно стью и способны задерживать значительную часть излучения в синей области;

5) устойчивость фотосинтетического аппарата к повреждению видимым и УФ излучени ем в значительной степени зависит от содержания пигментов, экранирующих излуче ние в этих диапазонах. У видов растений, неспособных к синтезу высоких количеств определенных фотозащитных пигментов, функции этих пигментов восполняются дру гими соединениями, иными по химической природе и субклеточной локализации, но обладающими сходными спектральным свойствам in vivo.

Научно-практическая значимость. Полученные экспериментальные данные рас ширяют существующие представления о механизмах и стратегиях долговременной адап тации растений к высоким потокам солнечного излучения, а также о роли экстратилако идных Кар и ФеС в этих процессах. Результаты работы способствуют углублению пони мания физиологической и экологической роли фотозащитных механизмов, основанных на индукции синтеза пигментов, экранирующих избыток ФАР, они также важны с точки зре ния исследовании адаптации растений к изменяющимся условиям среды, в том числе при постоянно возрастающем антропогенном воздействии.

Были разработаны новые и усовершенствованы существующие методы для недеструк тивного изучения пигментного состава фотосинтезирующих тканей in situ, позволяющие оперативно получать ценную информацию о физиологическом состоянии объекта, не раз рушая его. Использование этих методов открыло новые возможности для мониторинга фотоадаптации и фотоповреждения высших растений и водорослей, а также старения ли стьев и созревания плодов. Полученные экспериментальные данные могут служить осно ванием для включения недеструктивного анализа пигментов в арсенал методов физиоло гии растений, разработки подходов к экспресс-оценке состояния фотоавтотрофных орга низмов, а также методов биоиндикации, применяемых для экологического мониторинга.

Практическая ценность работы в значительной степени определяется выбором в каче стве объектов микроводорослей (Parietochloris incisa) и растений (Aloe arborescens), про дуцирующих ценные биологически активные соединения, а также плодовых растений (Malus domestica). Результаты проведенных нами исследований важны для: 1) изучения механизмов фотоадаптации и фотоокислительной гибели микроводорослей — продуцен тов арахидоновой кислоты;

2) оптимизации фотобиотехнологии, основанной на использо вании этих микроводорослей в плане выхода биомассы и степени обогащения ее ценными ПНЖК;

3) недеструктивного мониторинга и прогноза созревания яблок в саду и при хра нении снятых плодов, а также для выявления и контроля развития физиологических рас стройств плодов (таких как подкожный загар, стекловидность и солнечный ожог).

Научные представления, основные методические приемы и принципы исследований, полученные в ходе проведенных работ, включены в задачи большого и малого практикума по физиологии растений и микроорганизмов, практикумы и лекционные курсы «Биологи ческая спектроскопия» и «Взаимодействие патогенных микроорганизмов с растениями» и «Фотофизиология микроорганизмов» для студентов кафедр физиологии микроорганиз мов, физиологии растений, микологии и альгологии Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Апробация работы. Материалы работы заслушивались на совместных заседаниях кафедр физиологии растений, физиологии микроорганизмов, микологии и альгологии МГУ. Основные положения диссертации также представлены на 35 съездах и конферен циях, среди которых всероссийские: III Съезд фотобиологов России (Воронеж, 2001);

V Съезд общества физиологов растений России (Пенза, 2003);

VI Симпозиум по фенольным соединениям (Москва, 2004);

III Съезд Биофизиков России (Воронеж, 2004);

«Актуальные проблемы биологии и экологии» (Сыктывкар, 2005);

IV Съезд фотобиологов России (Са ратов, 2005);

Всероссийский симпозиум «Автотрофные микроорганизмы» памяти акаде мика Е.Н. Кондратьевой (Москва, 2005);

международные: «Plants under Environmental Stress» (Москва, 2001);

The 5th Conference on Oxygen, Free Radicals and Oxidative Stress in Plants, (Ницца, 2001);

«Биотехнология — состояние и перспективы развития» (Москва, 2005);

«Skin & Environment» (Москва – Санкт-Петербург, 2005);

43rd Conference on Horticultural Science (Потсдам, 2006);

1 Международная конференция «Физиология мик роорганизмов в природных и экспериментальных системах» (Москва, 2006);

«Photosynthe sis in the Post-Genomic Era: «Structure and Function of Photosynthesis» (Пущино, 2006);

Ме ждународная конференция «Современная физиология растений: от молекул до экосистем» (Москва, 2007);

2nd Conference on Precision Crop Protection (Бонн, 2007);

«Light Energy Conversion in Photosynthesis», Пущино, 2008;

V Съезд Российского фотобиологического общества;

годичное собрание ОФР (Екатеринбург, 2008).

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, глав и заключения, включающих обзор литературы, описание объектов и методов иссле дования, изложение и обсуждение полученных результатов, заключение, основные выво ды и список использованных литературных источников. Работа изложена на 410 страни цах машинописного текста, включает 5 таблиц и 122 рисунка. Список литературных ис точников содержит 525 наименований.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Глава I. Разнообразие и функции фотозащитных пигментов у растений Представлен обзор литературы, посвященной исследованию структуры, распространенно сти, оптических свойств in vitro и in vivo, а также эволюции, особенностей функциониро вания и физиологической роли фотозащитных пигментов у различных таксономических групп растений.

Глава II. Объекты и методы исследования Объектами исследования служили растительные организмы (табл. 1), обладаю щие выраженными ответами пигментного аппарата на действие высоких потоков видимо го и УФ излучения. В качестве модельной системы для изучения фотоадаптации микрово дорослей в норме и при действии стресса выбрана пресноводная зеленая водоросль P. incisa, которая в природных условиях подвергается воздействию высокой освещенно сти, экстремальных температур и дефицита минерального питания, в частности, азота [Watanabe et al., 1996]. Накопление и локализацию Ант у высших растений изучали на примере видов, ювенильные и(или) стареющие (осенние) листья которых приобретают красную окраску, особенно выраженную при действии интенсивного солнечного света на фоне низких температур [Merzlyak, Gitelson, 1995–1999;

Merzlyak et al., 2008]. Плоды яб лони были выбраны в качестве объектов исследования, поскольку они представляют со Таблица 1. Объекты исследования и их происхождение Число Объект Место выращивания Год образцов Одноклеточные водоросли Лаборатория биотехнологии микрово Одноклеточная водо- дорослей, Блауштейновский институт росль Parietochloris incisa 2004– изучения пустынь, Университет Бен comb. nov (Chlorophyta, – Гуриона, Израиль Trebuxiophyceae) Кафедра физиологии микроорганизмов МГУ им. М.В. Ломоносова, г. Москва Высшие растения (листья) Алоэ древовидное Лаборатория интродукции Блауштей (Aloe arborescens 35 новского института изучения пустынь, Mill., Liliaceae) Университет Бен-Гуриона, Израиль Клен платановидный 2005– (Acer platanoides L., Ace- – raceae) Дерен (Cornus alba L., 2005– Cornaceae) – Виноград дикий (Parte nocissus quinquefolia, 2005– Ботанический сад МГУ (Siebold. & Zucc.) Planch, – им. М.В. Ломоносова, г. Москва Vitaceae) Кизильник (Cotoneaster 2005– integerrimus Medik., – Rosaceae) Лещина обыкновенная 2006– (Corylus avellana L., – Corylaceae) Высшие растения (плоды) Сорт Ботанический сад МГУ 1999– им. М.В. Ломоносова, г. Москва – (Malus domestica Borkh., Антоновка 1993– Обыкновенная Яблоня домашняя – ОПХ Всероссийского НИИ садоводст- 1999– Rosaceae) Жигулевское ва им. И.В. Мичурина, – г. Мичуринск Тамбовской обл.

Ренет Симиренко Гранни Смит Экспериментальная станция Klein 2001– Брэберн 260 Altendorf, Институт садоводства Рейн – ского университета, г. Бонн, Германия Пинк Леди бой уникальную природную систему, удобную для изучения процессов фотоадаптации и фотоповреждения у растений [Andrews, 1997, 1998;

Merzlyak et al., 1998–2003]. В течение развития плода на одну из его поверхностей, обращенную к периферии кроны («солнеч ную» поверхность), падает высокий поток прямого солнечного излучения, тогда как на поверхность плода, обращенную к центру кроны («теневую» поверхность), падает пре имущественно рассеянное излучение меньшей интенсивности, в остальном ткани плода находятся в идентичных условиях [Andrews, 1997]. В результате ткани на солнечной по верхности оказываются адаптированными к более высоким потокам солнечного света, чем ткани на теневой поверхности, что делает возможным парное сравнение параметров, из меренных на солнечной и теневой поверхностях одного и того же плода [Merzlyak, Chivkunova, 2000].

Условия облучения. Данные об интенсивности ФАР и УФ в естественном солнеч ном излучении для экспериментов, выполненных в Германии, получали из лаборатории мониторинга погодных условий Института Макса Планка (Кельн, Германия). В экспери ментах с блокированием солнечного УФ использовали защитную пленку Folitec UV- (Agrarfolien-Vertriebs, Германия), коэффициент пропускания 1% при длинах волн мень ше 390 нм. Интенсивность УФ и видимого излучения измеряли, соответственно, кванто метрами Grbel (Германия) и Newport (США). Целые плоды, листья и экстракты облуча ли, используя в качестве источника излучения диапроектор «Свитязь» c галогенной лам пой накаливания КГМ 150/24 (НПО «Светотехника», Саранск) мощностью 150 Вт, через 5-см водный фильтр и 5-мм граничный светофильтр БС-8 (макс. плотность мощности на объекте 2500 Вт/м2). Источником УФ-Б служил осветитель с 10 лампами Phillips TL- (Германия) мощностью по 100 Вт (макс. плотность мощности на объекте 40 Вт/м2).

Выделение тилакоидов и ЛГ из клеток P. incisa осуществляли методом центрифу гирования гомогенатов в градиенте плотности сахарозы [Khozin-Goldberg et al., 2002].

Препараты кутикулы плодов яблони получали путем ферментативной мацерации срезов кожицы по Ju, Bramlage (1999) с модификациями [Solovchenko, Merzlyak, 2003].

Содержание пигментов определяли спектрофтометрически в ацетоновых экстрак тах [Lichtenthaler, 1987] либо хлороформных [Wellburn, 1994] и водно-метанольных фрак циях экстрактов по методу Folch [Folch et al., 1957;

Соловченко и др., 2001]. В отдельных экспериментах с плодами яблони использовали ранее разработанные c участием автора методы недеструктивного анализа пигментов [Merzlyak et al., 2003, 2005].

Анализ пигментов осуществляли с использованием традиционных [Straсk, Wray, 1989] и разработанных с участием автора [Solovchenko, Schmitz-Eiberger, 2003;

Merzlyak et al., 2005;

Solovchenko et al., 2006] методов ТСХ и ВЭЖХ на хроматографах Knauer, Merck Hitachi (Германия), Hewlett-Packard (США), оснащенных колонками с обращенной фазой.

Анализ ЖК P. incisa осуществляли путем трансметилирования с последующей ГЖХ на хроматографе Hewlett-Packard c капиллярной колонкой [Cohen et al., 1993].

Световая микроскопия. Микрофотографии временных препаратов клеток P. incisa, а также срезов листьев A. arborescens и кожицы плодов M. domestica получали на фотомикроскопе Zeiss Axioskop 40 (Carl Zeiss, Германия). Люминесцентные микрофо тографии получали на микроскопе Axiophot (Opton, Германия), оснащенном ртутной лам пой HBO 50 в качестве источника возбуждающего света.

Электронная микроскопия. Клетки P. incisa фиксировали согласно [Korzhenevskaya et al. 1993]. Для препаратов листьев алоэ и кожицы плодов яблони ис пользовали два вида фиксации: глутаровый альдегид + MnO4 либо p-формальдегид + глу таровый альдегид + OsO4 Контрастирование проводили уранил-ацетатом (в 70 % этаноле) при обезвоживании и цитратом свинца на ультратонких срезах. Ультратонкие срезы полу чали на ультрамикротоме LKB-8800 (Швеция) и микроскопировали при помощи транс миссионного электронного микроскопа JEM-100 B (Япония).

Спектральные измерения осуществляли на спектрофотометрах Hitachi 150- (Hitachi, Япония;

оснащен интегрирующей сферой с внутренним диаметром 150 мм), Lambda 5 (Perkin-Elmer, США), Cary 50 Bio (Varian, США) Ocean Optics USB2000 (Ocean Optics, США;

оснащен интегрирующей сферой диаметром 50 мм, выполненной из спек тралона). Спектры записывали в стандартных 1-сантиметровых кюветах, спектры погло щения клеточных суспензий регистрировали против сред культивирования, спектры по глощения экстрактов — против соответствующих растворителей, а спектры отражения листьев и плодов — против BaSO4;

в некоторых случаях в качестве стандарта использова ли покрытие на основе мелкодисперсного BaSO4 (Munsell, США). Спектральные данные оцифровывали с шагом 2 нм и обрабатывали в электронных таблицах. Спектры поглоще ния отдельных пластид и вакуолей были измерены на препаратах срезов листьев с исполь зованием модифицированного микроспектрофотометра Leitz MPV2 (Ernst Leitz Wetzlar, Германия), оснащенного 150-Вт ксеноновой лампой высокого давления в качестве источ ника света и спектрофотометром USB2000 (Ocean Optics, США) в качестве детектора (подробное описание методики измерений см. в [Merzlyak et al., 2005]).

Обработка спектральных данных. Спектральные вклады каротиноидов и приме сей в поглощение экстрактов («остаточные» спектры) рассчитывали вычитанием спектров поглощения хлорофиллов a и b [Мерзляк и др., 1996;

Соловченко и др., 2001]. Для ком пенсации спектров поглощения клеточных суспензий микроводорослей на рассеяние ис пользовали ранее описанный метод [Merzlyak et al., 2000, 2007]. Исходя из допущения, что в случае поверхности плода R = R, спектры отражения плодов R() для дальнейшего анализа были преобразованы в спектры функции ремиссии f (R), аналогичной функции Кубелки-Мунка f (R) [Kortm, 1969]. Измеренные спектры пропускания кутикулы, Tm(), и ее спектры поглощения для неотраженного света, Am(), подвергали коррекции [So lovchenko, Merzlyak, 2003], процедура коррекции спектров кожицы яблок мало отличалась от таковой для листьев высших растений (см. [Merzlyak et al., 2002]).

Измерения переменной флуоресценции Хл. Минимальную (Fo) и максимальную (Fm) флуоресценцию Хл кожицы плодов измеряли при помощи импульсного модулиро ванного флуориметра PAM-2000 (фирма «Heinz Walz», Effeltrich, Germany), оснащенного вместо зажима для листовой пластинки специально изготовленной насадкой. Измерения проводили после темновой адаптации объектов в течение 30 мин;

Fo измеряли после воз действия слабого модулированного измеряющего луча ( 0,1 мкЕ при 650 нм), Fm — по сле кратковременного (0,2 с) насыщающего импульса белого света (3000 мкЕ ФАР). Ми нимальный и максимальный уровни флуоресценции Хл в клетках водорослей, адаптиро ванных к темноте (Fo, Fm) и свету (Fo', Fm') измеряли с помощью импульсных флуори метров PEA (Hansatech, Великобритания) и FluorPen PS100 (PSI, Чехия). По результатам анализа переменной флуоресценции Хл рассчитывали максимальную квантовую эффек тивность фотосистемы II;

уровень фотохимического и нефотохимического тушения, а также скорость линейного транспорта электронов в ЭТЦ хлоропластов [Schreiber, 1989;

Rohek, 2002].

Глава III. Изменения оптических свойств растений под влиянием фотозащитных пигментов и разработка недеструктивных ме тодов их анализа Исследования, ранее выполненные в нашей [Мерзляк и др., 1995–2007;

Gitelson et al., 1992–2003;

Merzlyak et al., 1998–2008] и других лабораториях [Peuelas, Filella, 1998;

Gamon et al., 1991–2001] показали, что адаптивные перестройки пигментного аппарата, включая накопление фотозащитных пигментов, с неизбежностью проявляются в оптиче ских свойствах растений. Исследование спектров отражения, поглощения и рассеяния по зволяет количественно описать взаимодействие света с растениями, а также получить ценную информацию о состоянии их ФСА и фотозащитных механизмов [Мерзляк и др., 2003]. В этой связи первые этапы работы были посвящены выявлению и анализу харак терных изменений оптических свойств, сопровождающие адаптивные изменения пиг ментного состава водорослей и высших растений при действии высоких потоков ФАР и УФ излучения. В ходе предпринятых исследований были измерены, обработаны и про анализированы спектры поглощения клеточных суспензий микроводоросли P. incisa, а также спектры поглощения и отражения листьев, препаратов покровных структур (гипо дермы и кутикулы) целых плодов яблони. Также изучали спектральную характеристику Кар, Фл и Ант in situ с целью количественной оценки их вклада в поглощение клетками и тканями растений излучения в различных диапазонах, а также потенциального фотоза щитного эффекта этих пигментов.

Вклад фотозащитных Кар в поглощение ФАР in situ. Исследование спектров по глощения сильно рассеивающих свет суспензий микроорганизмов, в том числе микрово дорослей, сопряжено с трудностями из-за неопределенного вклада рассеяния даже при ис пользовании интегрирующих сфер [Merzlyak, Naqvi, 2000]. Однако применение недавно разработанных методов компенсации на рассеяние [Merzlyak, Naqvi, 2000;

Мерзляк и др., 2008] позволило получить спектры суспензий микроводоросли P. incisa, практически свободные от вклада рассеяния (рис. 1). Установлено, что в ходе роста этой водоросли при высокой интенсивности повышение соотношения Кар/Хл и накопление фотозащитных Кар сопровождается повышением вклада соединений, поглощающих свет в синей области спектра и обладающих характерными максимумами при 480, 460 и плечом при 430 нм.

А Б 3 3' -N +N 3 Освещенность, Освещенность, -2 - 2' мкE м с :

-2 - 2 мкE м с :

2 OD 1' 1 0 1 выцв.

0 В Г 3'- 1, 1, 2'- OD 1, 1, 1'- 3- 0, 0,5 2- 1- 0, 0, 400 500 600 700 400 500 600 700 Длина волны, нм Рис. 1. Средние корректированные на рассеяние спектры поглощения (1-3) суспензий клеток P. incisa с различным соотношением каротиноидов и хлорофиллов, выра щенных на полной среде (А) и в отсутствие азота (Б) и их дифференциальные спектры (В, Г) Результаты анализа дифференциальных спектров суспензий с разным соотношением Кар/Хл и сопоставление их с данными биохимического анализа пигментов позволило приписать возрастающее поглощение суспензий в синей области спектра вкладу Кар (см.

гл. 5), накапливающихся при действии интенсивного освещения. Эти данные свидетельст вуют о том, что экстратилакоидные Кар способны перехватывать значительную часть све та, который в их отсутствие поглощается Хл и особенно Хл b, а также конкурируют с «фотосинтетическими» Кар за поглощение света в синей области спектра.

Сравнительный анализ нормированных и дифференциальных спектров отражения плодов яблони, снятых с теневой и солнечной поверхностей, а также спектров обратных коэффициентов отражения и функции ремиссии Кубелки-Мунка, f(R), также выявил, на ряду со снижением содержания Хл, повышение вклада соединений, очень близких к Кар по характеру спектральных деталей в синей области. Этот вклад был существенно выше на солнечной поверхности, чем на теневой. На заключительных этапах созревания плодов, когда в составе их Кар обнаруживали высокие количества ЭК (рис. 8), Кар вносили доми нирующий вклад в поглощение света.

Вклад Фл в поглощение УФ излучения in situ тканями высших растений. Ана лиз спектров целых растительных объектов, а также препаратов покровных тканей и ку тикулы плодов показал, что, в зависимости от содержания Фл и спектрального диапазона, существенная часть падающей солнечной радиации может задерживаться кутикулой и эпидермой (более 98% излучения в УФ-B диапазоне и 80% в УФ-А). Установлено, что значительную часть УФ излучения в УФ-В диапазоне задерживали ФеС, ковалентно свя занные с компонентами кутикулы и клеточной стенки, предположительно идентифициро ванные как производные оксикоричной кислоты. Нековалентно связанные с кутикулой Фл поглощали в длинноволновой части УФ-B, а также в УФ-А диапазоне.

Эксперименты с исключением УФ компонента из действующего на растения спектра солнечного излучения показали, что наиболее существенную часть УФ излучения, осо бенно в УФ-А и коротковолновой части видимого диапазона поглощают именно Фл, ко торые накапливаются в вакуолях эпидермы и гиподермы в ответ на действие высоких по токов солнечного УФ (рис. 2).

Следует отметить, что при высоком содержании Фл регистрировали очень низкое отражение плодов в широкой полосе от коротковолновой границы УФ-B до 410 нм (рис.

3), при этом положение минимума отражения было связано линейной зависимостью с со держанием Фл в широком диапазоне концентраций этих соединений (см. врезку на рис. 2).

Несмотря на то, что УФ-Б обладает бльшей цитотоксичностью, УФ-А, интенсивность которого в солнечном излучении в десятки раз выше [Bjrn, Murphy, 1985], оказывает су щественные воздействия на растения. Так, максимальное ингибирование фотосинтеза при интенсивностях, характерных для естественных потоков солнечной радиации, наблюдает ся именно при действии УФ-А излучения [Bornman et al., 1997;

Caldwell et al., 2003]. В си лу этих обстоятельств велико значение обнаруженного длинноволнового поглощения Фл в диапазоне 350–410 нм, а также гиперхромные эффекты и батохромные сдвиги максиму мов поглощения, влияющие на спектроскопию этих соединений in vivo.

Спектральные вклады Ант и Ркс in situ. Установлено, что при невысоком содер жании хлорофиллов Ант перехватывают значительную часть солнечной радиации в зеле ной части видимой области спектра [Merzlyak, Chivkunova, 2000]. Это существенно, по скольку, несмотря на невысокие коэффициенты поглощения Хл в зеленой области, мак симум энергии в солнечном спектре приходится на эту область [Bjrn, Murphy, 1985].

Анализ спектров отражения плодов яблони при накоплении Ант (рис. 4) показал, что при накоплении этих пигментов в высоких количествах ( 20 нмоль/см2) происходит ушире ние полосы их поглощения в видимой области спектра (вплоть до 600 нм). Можно сказать, что эффект накопления Ант в количествах, превышающих 40 нмоль/см2, сравним с дейст вием граничного светофильтра, задерживающего значительную часть излучения в полосе с 600 нм (рис. 4);

аналогичный эффект в полосе с 415 нм проявляют Фл, накапли вающихся в количествах больше 100–120 нмоль/см2 (рис. 3).

2 2-2' 16 [f(R)/f(R678)] 1, [f(R)/f(R678)] 2- 12 8 1,0 2'-2' f(R)/f (R678) ' 0, 8 2- 2-2' 2' 0, 1 300 400 500 600 700 800 300 400 500 600 700 4 1' 2' А Б 1' 0 300 400 500 600 700 300 400 500 600 700 Длина волны (нм) Рис. 2. Влияние солнечного УФ на оптические свойства плодов яблони сорта Антоновка.

Приводятся спектры функции Кубелки-Мунка для теневой (1, 1') и солнечной (2, 2') поверхностей плодов, выращенных при действии полного солнечного спектра (А) и в отсутствие УФ (Б).

350 375 400 425 450 475 500 525 Рис. 3. Зависимость оптических свойств A плодов яблони сорта Антоновка от Отрражение, % 40 содержания в них флавонолов. Пока заны спектры отражения (А) с раз ным содержанием флавонолов (1 – 45,7;

2 – 108,5;

3 – 121,8;

4 – 143,5;

5 – 233,8 нмоль/см2), а также соот 2 10 ветствующие им спектры функции 100/R() и спектры их первой произ водной. Врезка: зависимость поло 0 жения максимума первой производ ной спектров, показанных на панели Б Б, от содержания флавонолов.

(100/R) 10 0, Точка перегиба, нм -0, А (100/R)' -0, В 2,5- 5 360 -0,6 Флавонолы, нмоль/см 50 100 150 200 350 375 400 425 450 475 500 525 5- Отражение, % Длина волны, нм 20 10-15 40- 30- 15- 20- Б Рис. 4. Влияние накопления Ант на спек тры отражения плодов яблони сорта Жигулевское (А) и накопле ния кетокаротиноида родоксанти на на спектры отражения листьев A. arborescens (Б). А: приводятся средние спектры, диапазоны со держания Ант указаны рядом с кривыми. Б: Соединенными ли 400 500 600 700 ниями точками показаны коэффи циенты отражения при 700 и Длина волны, нм нм Некоторые ретро- и кетокаротиноиды, такие как Ркс, впервые обнаруженные у голосе менных [Czeczuga, 1987], а затем и у цветковых растений [Diaz et al., 1990], по форме спектра и положению максимумов in vivo чрезвычайно сходны с Ант и также способны поглощать значительную часть ФАР в зеленой области спектра [Han et al., 2003, 2004].

Мы впервые проанализировали вклад Ркс в поглощение света in situ в растениях A. arborescens, накапливающих этот пигмент при действии высоких потоков солнечного излучения (эти растения обладают достаточно широкими листовыми пластинками, более удобными для спектральных измерений). Сравнительный анализ результатов микроспек трофотометрического анализа выявил наличие широкой полосы с максимумом в зеленой области (540–550 нм) на спектрах поглощения вакуолей клеток, содержащих Ант, а также красных пластид, содержащих Ркс. Судя по изменениям спектров отражения листьев A. arborescens, накопление Ркс сопровождалось повышением поглощения излучения в зеленой области видимого спектра (рис. 4Б), сравнимым с таковым при накоплении Ант в плодах яблони (рис. 4А). Таким образом, данные спектроскопии отражения и микроспек трофотометрии свидетельствуют, что Ант в плодах яблони и листьях, а также Ркс в листь ях A. arborescens, обладая сходными спектральными характеристиками in vivo, способны к образованию эффективных экранов и ловушек для излучения в широкой полосе 450– нм, в которой солнечное излучение наиболее глубоко проникает в ткани листа [Sun et al., 1998;

Gitelson et al., 2001].

Методы недеструктивного анализа пигментов и липидов. В ходе наших исследо ваний с применением новых подходов к получению, обработке и анализу спектральной информации, в основном разработанных в нашей лаборатории [Мерзляк и др., 2003], был создан ряд экспресс-методов анализа пигментов и липидов в тканях и клетках растений по спектрам отражения и поглощения, отличающихся высокой чувствительностью и селек тивностью (табл. 2). Благодаря применению этих методов были прослежены изменения суммарного содержания и соотношения Хл и Кар, а также Фл при фотоадаптации созре вающих плодов яблони. Кроме того, использование недеструктивных методов позволило нам надежно выявлять растительные объекты, подвергшиеся фотоповреждению.

Данные, полученные с применением недеструктивных методов, также позволили вы явить закономерности изменения пигментного состава плодов и разработать модели, опи сывающие изменения содержания Кар и Хл в созревающих плодах в зависимости от ис ходного содержания Хл при разных уровнях освещенности. Разработанные модели были успешно использованы для прогноза динамики этих пигментов как в плодах, развиваю щихся на дереве, а также в отделенных плодах.

Таблица 2. Индексы для недеструктивного определения содержания пигментов и липидов Параметры уравнения регрессии* Диапазон Индекс содержания, Ошибка r2** n b a нмоль/см определения, % M. domestica (плоды) Хлорофиллы a + b R800 /R678 – 1 0,3–5 148 0,92 –0,72 0,86 13, R800 /R700 – 1 0,2–11 166 0,94 0,01 0,11 0, R800 /R640 – 1 0,3–11 132 0,93 0,11 0,31 2, Каротиноиды R800) /R520 – R800 /R550 0,6–4,5 79 0,83 0,06 0,20 3, R800 /R520 – R800 /R700 0,6–4,5 79 0,80 0,13 0,23 3, Молярное соотношение «каротиноиды/(хлорофиллы a + b)» R500 /R800 – R678 /R800 0,34–2,65 78 0,88 –0,14 0,16 2, R480 /R800 – R678 /R800 0,34–2,65 78 0,94 –0,09 0,20 1, Антоцианы R800 /R550 – R800 /R700 5,0–48,1 23 0,93 –0,51 0,41 6, Флавонолы R800 /R410 – R800 /R460 8,93–219 77 0,92 –5,08 12, P. incisa (суспензии клеток) Сумма жирных кислот 510 /678*** 2, 0,09–3,04 46 0,84 –1,96 3, Арахидоновая кислота 510 /678 0,04–1,7 46 0,90 –0,95 1,94 1, Примечание: * уравнения линейной регрессии вида (значение индекса) = a · [содержание пигмента, нмоль/см2] + b;

** 0,001;

***() — OD(), корректированная на рассеяние [Merzlyak, Naqvi, 2000;

Мерзляк и др., 2008].

Глава IV Динамика пигментного состава при фотоадаптации и фотоповреждении на разных этапах развития растений Анализ полученных нами данных, а также их сопоставление с опубликованными в лите ратуре сведениями позволяет выделить некоторые общие моменты в изменении спектров растительных объектов при повреждении высокими потоками света. Фотодеструкция пигментов в ассимилирующих клетках и тканях сопровождается глубоким синхронным выцветание полос, обусловленных поглощением Кар и Хл, в красной и синей областях спектра. Эта особенность наблюдалась у всех изученных растений. По-видимому, Хл яв ляется основным фотосенсибилизатором фотоокислительного повреждения ФСА, в том числе выцветания пигментов [Красновский, 1988;

Мерзляк, 1989;

Егоров и др., 1999].

Вместе с Хл [Мерзляк, 1989;

Asada, 1987, 1994] могут разрушаться Кар, связанные с пиг мент-белковыми комплексами тилакоидов [Merzlyak et al., 1998;

2002] и участвующие в их защите от фотодеструкции [Young, 1991]. Разрушение Хл и Кар в этих случаях, по видимому, происходит со стехиометрией, близкой к стехиометрии этих пигментов в ин тактных ассимиляционных тканях (2,5:1 – 3:1). Это может быть одной из причин наблю даемой синхронности выцветания Хл и Кар под действием высоких потоков ФАР. Разви тие некрозов на терминальной стадии повреждения плодов высокими потоками солнечно го света, искусственной ФАР и УФ радиации, а также другими факторами (обработка n– гексаном, развитие подкожного загара [Barden, Bramlage, 1994;

Bramlage, Weiss, 1997]) индуцировало сходные изменения в спектрах отражения плодов. В объектах с минималь ным содержанием Хл побурение проявляется как монотонное снижение отражения по всему спектру. В случае плодов с высоким содержание Хл и Кар эти изменения были ме нее выражены в полосах поглощения пигментов вследствие перекрывания их с поглоще нием меланиноподобных пигментов, образующихся при побурении. При высоком содер жании пигментов изменения, характерные для побурения, проявлялись, главным образом в NIR и зеленой области спектра, где вклад Хл и Кар был минимальным.

Глава V. Динамика пигментного состава при фотоадаптации и фотоповреждении на разных этапах развития растений Изучение оптических свойств растений, предпринятое на предыдущем этапе нашей рабо ты, позволило выявить некоторые закономерности изменения отражения и поглощения света ассимилирующими клетками и тканями при адаптации к высоким потокам излуче ния в разных спектральных диапазонах (гл. 3), а также при повреждении ими (гл. 4). На ряду с этим были определены спектральные сигнатуры некоторых важных фотозащитных пигментов и их влияние на спектральные свойства растений.

Тем не менее, оставался без ответа ряд важных вопросов, касающихся динамики содержания и состава фотозащитных пигментов при адаптации к высоким потокам ФАР и УФ. Отдельные вопросы удалось решить с использованием недеструктивных методов, по зволяющих оценить содержание суммарных Хл, Кар и других групп пигментов. Однако анализ отдельных форм пигментов, например, каротинов, ксантофиллов, включая пигмен ты, участвующие в виолаксантиновом цикле, а также ЭК, требует применения более точ ных и селективных хроматографических методов анализа. По результатам предыдущего этапа работы также был сделан ряд предположений относительно механизма действия различных групп фотозащитных пигментов. Проверка этих предположений также требо вала применения биохимического определения содержания отдельных пигментов.

В связи с вышесказанным, в продолжение нашей работы был предпринят более де тальный анализ изменений пигментного состава растений, сопровождающий изменения их оптических свойств при фотоадаптации. В отдельных случаях также была прослежена динамика содержания этих пигментов на различных этапах онтогенеза, а также предпри нята попытка определения влияния фотоадаптации на онтогенетические изменения пиг ментного состава.

Динамика содержания Хл и Кар при фотоадаптации. Изучение изменений содержания и соотношений основных фотосинтетических и фотозащитных пигментов растений при фотоадаптации выявило наличие в этих процессах общих тенденций. В целом, эти изме нения направлены на снижение потенциально высокой фотодинамической активности Хл и иных естественных фотосенсибилизаторов, присутствующих в клетке [Егоров и др., Каротиноиды/Хлорофиллы, моль/моль 1999]. Данная цель может достигаться раз 0, личными путями, включая снижение содер 2' жания Хл и накопление фотозащитных пиг ментов, в частности, Кар. Рост культур ис 2 следованной нами зеленой водоросли 0, P. incisa при различной освещенности на полной и безазотной среде сопровождался существенными изменениями пигментного 1' состава (рис. 5). Так, чем больше интенсив 0, ность освещения при культивировании, тем 1 меньше Хл и больше Кар накапливали клет ки водорослей при росте на полной среде;

как следствие, в этом случае быстрее увели 0, 10 20 30 40 50 60 70 чивалось соотношение Кар/Хл (рис. 5, кри Хлорофиллы, нмоль/(мл суспензии) вая 2). Хотя у культур, выращенных на без азотной среде при высокой освещенности, Рис. 5. Зависимость отношения Кар/Хл от происходило относительно небольшое уве суммарного содержания Хл в клет ках P. incisa, выращенных на пол- личение содержания Кар на фоне снижения ной среде (1, 2) и в отсутствие азо содержания Хл, характерном для водорос та (1, 2) при низкой (1, 1), и высо кой (2, 2) освещенности лей, испытывающих дефицит азота [Mer zlyak et al., 2007], соотношение между Кар и Хл возрастало значительнее, чем на полной среде (рис. 5, кривая 2'). Подобные изменения состава пигментов сходны с ответами, ти пичными для адаптации пигментного аппарата ряда водорослей к интенсивному освеще нию и дефициту азота [Mendoza et al., Merzlyak et al., 2007].

Тенденция к повышению относительного содержания Кар (за счет накопления до полнительных количеств этих пигментов либо сохранения Кар на фоне снижения содер жания Хл) при действии сильного видимого света также характерна для ассимилирующих тканей листьев и плодов высших растений. В частности, при созревании плодов яблони на дереве на солнечной поверхности плодов сохраняется более высокое содержание Кар, чем на теневой, при равном содержании Хл;

в результате чего на солнечной поверхности ре гистрировали большие исходные значения и более высокую скорость роста соотношения Кар/Хл (рис. 6, темные символы). Следует также отметить, что индукция синтеза Кар, на ступающая после съема плодов с дерева, также была более выраженной на солнечной по верхности плода по сравнению с теневой (рис. 6, светлые символы;

рис. 7, 1–3).

6 Каротиноиды/Хлорофиллы, моль/моль Теневая сторона Солнечная сторона Дата съема плодов:

4 05. 30. 13. 29. 2 А Б 0 0 1 2 3 0 1 2 3 Хлорофилл a + b, нмоль/см Рис. 6. Зависимость отношения каротиноидов к хлорофиллам от суммарного содержания хлорофиллов в плодах сорта Антоновка Обыкновенная на теневой (А) и солнечной (б) поверхностях Приводятся данные для плодов, собранных в 2004 г. Для определения содержания пигментов использовались разработанные ранее методы недеструктивного анализа.

Показаны средние значения (n = 5) и значения стандартной ошибки Особенности изменений содержания Хл и Кар при фотоповреждении. Фотоокисли тельное повреждение тканей растений чрезмерными потоками ФАР сопровождается, на ряду с прочими деструктивными процессами, выцветанием пигментов, опосредованным АФК [Мерзляк, 1997–2002;

Asada, 2006]. Скорость фотодеструкции пигментов, отличаю щихся по химической структуре и внутриклеточной локализации, может различаться. Ус тановлено, что Кар, тесно ассоциированные с ФСА, выцветают быстро и синхронно с Хл, подобно тому, как это происходит в растворах при прямом фотоокислении Кар. В клетках растений, адаптированных к высоким потокам солнечной радиации, а также в стареющих клетках (у культур микроводорослей на стационарной фазе, в осенних стареющих листьях и в созревающих плодах) присутствует пул экстратилакоидных или экстрапластидных Кар (о локализации этих Кар см. ни же), не связанных непосредст Хл 120 венно с ФСА и отличающихся Отн. содержание пигментов, % Кар высокой фотостабильностью. За Ренет Симиренко Кар/Хл счет присутствия данного пула Грани Смит Кар в целом скорость выцвета ния этих пигментов может быть ниже, чем у Хл. Как следствие, при фотоповреждениях (как ес 4 тественных, таких как солнеч 0 ный ожог плодов яблони, так и 1 2 индуцированных искусственным Антоновка Антоновка Жигулевское облучением повреждениях пло - дов, листьев и клеток микрово дорослей) соотношение Кар/Хл -80 может повышаться даже в боль шей степени, чем при фотоадап тации. Однако изменения содер Рис. 7. Изменения в содержании и соотношении Кар жания пигментов при фотопо и Хл в кожице солнечной поверхности пло дов яблони по сравнению с теневой при фо- вреждении характеризуются тоадаптации (1–3) и фотоповреждении (сол снижением содержания Кар, то нечном ожоге;

5, 4). Относительное содержа ние пигментов рассчитано как (S – гда как фотоадаптация сопрово – H)/H·100%, где S и H — абсолютное со ждается повышением содержа держание пигментов на солнечной и теневой (в случае ожога — поврежденной и интакт- ния этих пигментов (см., напри ной) поверхности, соответственно.

мер, рис. 7).

Изменения состава Кар микроводорослей при фотоадаптации. Для существования в неблагоприятных условиях, в том числе при чрезмерной освещенности и дефиците мине рального питания, некоторые виды микроводорослей выработали ряд адаптационных ме ханизмов, к числу которых относят координированный синтез немембранных липидов, таких как триацилглицериды (ТАГ) [Cohen, 1999;

Bigogno, 2002] и каротиноиды (Кар) [Rabbani et al., 1998;

Ладыгин, 2000]. Подобные механизмы адаптации выявлены у ряда зеленых водорослей: Dunaliella salina [Mendosa et al., 1999], D. bardawil [Rabbani et al., 1998], Haematococcus pluvialis [Boussiba, 2000] и Parietochloris incisa [Khozin-Goldberg et al., 2002;

Merzlyak et al., 2007]. Установлено, что характерным ответом P. incisa на дейст вие высокой освещенности при отсутствии азота является индукция синтеза Кар при сни жении содержания Хл (рис. 5), однако состав накапливающихся при этом Кар, а также роль их отдельных форм в защите от фотоповреждения остаются во многом неясными.

Хроматографический анализ выявил у культур P. incisa, выращенных при высокой осве щенности (рис. 8В, Д), изменения состава Кар, которые могут быть связаны с процессами фотоадаптации. Количественные данные о содержании Кар в культурах, выращенных на полной среде (рис. 5), позволяют предположить, что -кар и Лют, накапливающиеся на сильном свету, синтезируются de novo. В случае культур, испытывающих дефицит азота, это маловероятно, так как общее содержание Кар у них изменялось незначительно. У культур, выращенных на интенсивном свету, повышалась доля Зеа, вероятно, вследствие деэпоксидации Вио (рис. 6), что свидетельствует об эффективном функционировании виолаксантинового цикла у P. incisa в условиях стресса. В дальнейшем это было подтвер ждено измерениями переменной флуоресценции Хл и уровня ее нефотохимического ту шения.

Одной из особенностей клеток P. incisa, выращенных при интенсивном освещении оказалось повышение содержания -кар независимо от наличия азота в среде (рис. 8) как в мембранах тилакоидов, так и в липидных глобулах (ЛГ). В тилакоидах -кар, локализо ванный преимущественно в реакционных центрах (РЦ), выполняет защитную функцию, предохраняя компоненты РЦ от фотоокисления [Young, 1991;

Demmig-Adams et al., 1996;

Ладыгин, 2000]. Выявленные изменения в составе пигментов и липидов, по-видимому, играют важную роль в адаптации P. incisa к неблагоприятным условиям. Так, ранее мы обнаружили [Merzlyak et al., 2007], что при длительном культивировании в отсутствие азота в течение двух месяцев на слабом свету в клетках этой водоросли значительно сни жается содержание Хл, но возрастает содержание Кар и появляется большое число ЛГ, содержащих ТАГ. Такие клетки проявили способность к полному восстановлению пиг ментного аппарата спустя несколько дней после добавления в среду азота.

Neo А Нео Инокулюм (0 сут, +N) 8.5% -Кар Вио -Car Vio 21.6% 8.8% Antn Антера 5.1% Зеа Zea 7.0% Lut Лют 49.0% 400 мкЕ/(м2·с) 35 мкЕ/(м ·с) Б В Neo Vio Нео Вио Нео Вио Vio Neo 6.4% 2.7% 2.2% 4.3% Антера Антера -Car Antn -Кар Antn -Кар -Car 0.8% 1.0% 34.6% 28.3% +N 14 сут. культивирования Лют Lut 42.9% Lut ЗеаZea Зеа Zea 49.1% 15.1% 12.5% Д Г Нео Вио Neo Vio Neo Вио Нео Vio -Кар -Car 2.4% 0.1% 6.4% 1.6% Антера Антера 34.6% Antn Antn -Кар -Car 0.9% 0.3% 27.4% –N Лют Lut Лют Lut 38.4% 47.2% Zea Зеа Зеа Zea 21.8% 16.9% Рис. 8. Состав каротиноидов в клетках P. incisa в начале эксперимента (А) и после 14 суток культивирования на полной среде (Б, В) и в отсутствие азота (Г, Д) при низкой (Б, Г) и высокой (В, Д) освещенности Анализ полученных нами результатов и сопоставление их с литературными данными показывает, что под действием интенсивного освещения в пигментном аппарате P. incisa происходят адаптивные изменения, характер которых зависит от наличия азота в среде культивирования. Подобный ответ обнаружен у значительного числа видов зеленых мик роводорослей [Rabbani et al., 1998;

Mendosa et al., 1999;

Boussiba, 2000;

Wang et al., 2003].

При росте на полной среде в условиях высокой освещенности наблюдается индукция син теза Кар, тогда как при дефиците азота более выражено снижение содержания Хл, в обоих случаях состав Кар претерпевает сходные изменения (снижение доли ксантофиллов, уча ствующих в светосборе [Ладыгин, 2000;

Horton, Ruban, 2004], и повышение доли Кар, вы полняющих, главным образом, защитные функции). Примечательно, что действие разных стрессоров (недостатка азота при низкой освещенности и сильного света на полной среде) вызывает сходные ответы пигментного аппарата, выраженные в увеличении относитель ного содержания Кар (рис. 5, 8).

Изменения состава Кар высших растений при фотоадаптации и старении. Известно, что при старении листьев и созревании плодов часто имеет место сохранение Кар и даже индукция синтеза этих пигментов [Gross, 1987;

Knee, 1988;

Biswal, 1995;

Merzlyak et al., 1999] на фоне снижения содержания Хл. Как правило, в стареющих листьях и созреваю щих плодах значительная часть пула Кар представлена эфирами ксантофиллов и ЖК, ло кализованными в пластоглобулах хлоропластов, подвергающихся трансформации в герон топласты и хромопласты [Lichtenthaler, 1969;

Tevini, Steinmller, 1985;

Biswal, 1995]. По видимому, среди прочих функций, физиологическая роль Кар, включая эфиры ксантофил лов (ЭК), накапливающихся в пластоглобулах, заключается в защите от фотоповреждения стареющих тканей растений, ФСА которых подвергается демонтажу [Steinmller, Tevini 1985;

Merzlyak, Hendry, 1994;

Merzlyak, Gitelson, 1995]. Изучение состава Кар созреваю щих плодов яблони показало, что небольшие количества ЭК присутствуют даже среди Кар незрелых плодов, в остальном их состав Кар близок таковому зеленых листьев (рис.

9). Установлено, что несмотря на близкие значения соотношения Кар/Хл на солнечной и теневой поверхностях незрелых плодов, подвергающихся действию интенсивного излуче ния, состав их Кар обладает рядом различий (рис. 9). Исходя из анализа полученных нами и опубликованных в литературе данных, представляется, что эти различия связаны с адап тацией пигментного аппарата к высоким потокам солнечного излучения. Как и у зеленых водорослей P. incisa (рис. 8А, Б). адаптация ФСА ассимилирующих тканей плодов [Blanke, Lenz, 1989] сопровождается, наряду со снижением содержания Хл, уменьшением доли -кар и ксантофиллов (прежде всего Лют), главной функцией которых является уча стие в светосборе [Demmig-Adams et al., 1996-2006;

Ладыгин, 2000]. Особенностью пло дов яблони является индукция синтеза ксантофиллов, в частности Нео и Вио, во время со зревания. Согласно результатам анализа тушения флуоресценции Хл, значительная часть синтезируемого при этом Вио не участвует в функционировании виолаксантинового цик ла и накапливается, как и Нео, главным образом в виде эфиров с ЖК (о локализации ЭК см. ниже).

A Хл = 2.60, Кар = 1,51 нмоль/см2 Б Хл = 2.50, Кар = 1,45 нмоль/см Neo Нео Эфиры Эфиры Нео FAXE. FAXE Neo 1.8 % 1.4 % 5.1 % 10.0 % Вио Vio -Кар Car Car -Кар Дата съема 6. 14.6 % Вио Vio 29.0 % 13.3 % 4.3 % Лют Lut Антера Antn Antn Антера 30.2 % 3.1 % Лют Lut 27.2 % 42.3 % Zea Зеа Zea Зеа 10.0 % 7.9 % В Хл = 1.55, Кар = 0,49 нмоль/см2 Г Хл = 0.67, Кар = 1,14 нмоль/см Нео Neo Нео Neo 10.4 % 5.4 % Эфиры FAXE 19.7 % Дата съема 11. Эфиры Вио Vio Вио FAXE Vio 20.2 % 38.4 % 29.6 % -Кар Car 16.1 % Лют Lut Лют Lut 18.0 % Антера Antn 6.9 % 9.3 % Зеа Car -Кар Zea Зеа Zea 8.8 % 6.4 % Антера Antn 2.9 % 7.9 % Рис. 9. Изменения состава каротиноидов кожицы плодов яблони на теневой (А, В) и солнечной (Б, Г) стороне плодов на начальных (А, Б) и завершающих (В, Г) этапах созревания Существенно, что на солнечной поверхности плодов содержание ЭК во всех случаях было больше, чем на теневой, независимо от этапа созревания (рис. 6);

накопление ЭК и сниже ние содержания Лют на солнечной поверхности плодов происходило быстрее, чем на те невой. В стареющих ассимиляционных тканях синтез Кар регулируется с участием этиле на [Rhodes, 1980;

Vendrell, Palomer, 1998;

Cecci et al., 2005];

АФК, которые образуются в условиях фотоокислительного стресса, также входят в число сигнальных молекул, спо собных индуцировать синтез Кар [Bouvier et al., 1998] и при действии сильного освеще ния, вероятно, могут потенцировать стимулирующий эффект этилена в отношении синте за Кар.

Нами установлено, что Кар, накапливающиеся при адаптации плодов к сильному солнечному свету, а также при созревании плодов, вносят значительный вклад в поглоще ние света тканями и обладают высокой устойчивостью к фотодеструкции (подробнее см.

гл. 5 и 6). Это позволяет предположить, что данные пигменты способны играть важную роль в защите ФСА, подвергающегося демонтажу в стареющих клетках растений и в этой связи особенно уязвимого для фотоокислительного повреждения [Kar et al., 1993;

Munn Bosch, Lalueza, 2007]. Примечательно, что картина изменений в составе Кар при адапта ции плодов к сильному солнечному свету (накопление ЭК, снижение содержания -кар и Лют) качественно сходна с таковой, возникающей при их созревании, но указанные изме нения на солнечной стороне происходят с большей скоростью, чем на теневой (рис. 6). В этой связи можно думать, что пути метаболизма Кар, функционирующие в стареющих ас симиляционных тканях, способны играть важную роль в адаптации растений к сильному свету, особенно на завершающих этапах их онтогенеза.

УФ-индуцированный синтез ФеС. У растений эта группа соединений характеризуется необычайным разнообразием (число ныне известных природных ФеС превышает 100 000), ФеС обнаружены у всех известных видов расте ний [Запрометов, 1993].

Доза солнечного УФ [ * 100 Вт/(м * сут)] У растений ФеС выполняют Флавонолы (нмоль/см ) различные функции, и до не давнего времени одной из главных считалась функция защиты от фитопатогенов и травоядных животных [Close, McArthur, 2002], однако в по следнее время получила при- знание и многочисленные под тверждения функция ФеС как фотозащитных веществ [Caldwell et al., 1983;

Cockell, 30.7 15.8 31.8 16. 15/08 31/08 16/ 30/ Knowland, 1999;

Mazza et al., Дата 2000;

Merzlyak, Chivkunova, Рис. 10. Изменения содержания флавонолов в кожице 2000]. Нами изучено значение теневой (светлые символы) и солнечной (тем солнечного УФ для индукции ные символы) плодов яблони сорта Брэберн в связи с суточными дозами солнечного УФ синтеза Фл в тканях растений, (пунктир) адаптированных к высоким потокам солнечной радиации, а также динамика ФеС плодов яблони в связи с дозами естественного солнечного УФ (рис. 10). Установлено, что при действии высоких потоков солнечного излучения в кутикуле, эпидерме и гиподерме пло дов яблони наблюдается индукция синтеза Фл, представленных преимущественно глико зидами кверцетина, среди которых доминировал рутин. На теневой стороне присутствова ли те же ФеС, однако их содержание было в два–три раза меньше. Индукция синтеза Фл носила дозо-зависимый характер: количество Фл было пропорционально дозе солнечного УФ (рис. 10), при этом на всех этапах развития плода, а также на протяжении долговре менного хранения содержание Фл на солнечной поверхности плодов оставалось сущест венно выше, чем на теневой. Следует отметить чрезвычайно высокую фотостабильность Фл in vivo: признаков фотодеструкции этих соединений не наблюдалось даже при дейст вии очень высоких доз солнечной радиации, провоцирующих развитие солнечного ожога плодов и приводивших к полному выцветанию Хл и Кар.

Нами также исследована динамика содержания Фл в плодах, подвергавшихся воз действию солнечного излучения, из спектра которого был исключен УФ. Отсутствие УФ компонента приводило к снижению содержания Фл на солнечной поверхности до уровня, характерного для теневой поверхности, но не влияло на содержание Фл на теневой сторо не плодов. В аналогичных экспериментах, проведенных с листьями высших растений, также выявлено сохранение содержания Фл на некотором минимальном уровне после ис ключения УФ из спектра действующего излучения [Lingakumar et al., 1999;

Turunen et al., 1999]. Вероятно, этот уровень определяется присутствием конституционных ФеС, а также действием рецепторов излучения в синей области спектра, регулирующих наряду с про чими механизмами синтез ФеС [Mohr, Drumm-Herrell, 1983].

Представляется, что физиологическое значение присутствия Фл и других ФеС в тканях и структурах теневой поверхности плодов может заключаться в защите от повреж дающего действия рассеянного УФ, составляющего значительную часть солнечной радиа ции, рассеиваемой кронами деревьев [Parisi et al., 2000].

Сопоставление результатов анализа фотосинтетических Хл и Кар, а также фотоза щитных Фл свидетельствует о том, что исключение УФ компонента из спектра действо вавшего на плоды солнечного излучения не влияло на изменения содержания и соотноше ния Хл и Кар, характерные для адаптации плодов к высоким потокам ФАР (рис. 8 и 9).

Это дает основания полагать, что процессы адаптации пигментного аппарата к действию излучения в видимой области спектра протекают до некоторой степени независимо от адаптации к действию солнечного УФ, выраженной в индукции синтеза и накоплении вы соких количеств Фл.

Содержание Ант при адаптации к высоким потокам ФАР. Характерным ответом мно гих видов высших растений на действие высоких потоков солнечного света и ряда других стрессовых факторов на разных этапах онтогенеза является индукция синтеза Ант — со единений фенольной природы, обладающих поглощением в УФ-С и зеленой области ви димого спектра [Chalker-Scott, 1999;

Merzlyak, Chivkunova, 2000;

Hoch et al., 2003]. Из вестно, что различные таксономические группы растений существенно отличаются спо собностью к синтезу Ант [Steyn et al., 2000], и следствия этих различий для долговремен ной фотоадапации до сих пор полностью не выяснены. Синтез Ант является генетически детерминированным ответом, регулируемым фитохромной системой, и в многом зависит от интенсивности действующего солнечного излучения [Saure, 1990]. Нами изучена дина мика содержания Ант в сортах Жигулевское, Брэберн, Пинк Леди, а также в листьях неко торых видов растений (табл. 1) при действии интенсивного солнечного света. В плодах яблони и листьях исследованных видов Ант были представлены, главным образом циани дин-3-галактозидом (идеином) и цианидин-3-глюкозидом, соответственно. Плоды, накап ливавшие высокие количества Ант на 60 солнечной поверхности, обладали более высоким содержанием Хл на солнечной Антоцианы (нмоль·см ) - Поверхность плода:

50 поверхности, чем в кожице теневой по теневая солнечная верхности (рис. 11). Вероятно, это объяс няется тем, что в присутствие Ант, за держивающих значительную часть па дающей ФАР (Merzlyak, Chivkunova, 20 2000), для поддержания достаточного уровня фотосинтеза требуются бльшие 10 количества Хл. Следует также отметить, что усиление синтеза Ант наблюдалось 0 1 2 3 4 5 на завершающих этапах созревания пло - Хлорофилл (нмоль·см ) дов (рис. 11) и старения листьев, характе ризующихся низким содержанием Хл ( Рис. 11. Содержание антоцианов в кожице нмоль/см2). Вероятно, дополнительные теневой () и солнечной () по верхности плодов яблони сорта количества Ант обеспечивают более на Жигулевское в зависимости от содержания хлорофиллов. дежную защиту ФСА, уязвимого для фо Точки, полученные при измерениях тоокислительного повреждения в ста на разных поверхностях одного и того же плода, соединены линия- реющих ассимиляционных тканях [Kar et ми al., 1993;

Munn-Bosch, Lalueza, 2007].

Глава VI. Локализация фотозащитных пигментов у растений Локализация Кар и ЭК. При действии неблагоприятных факторов, в частности чрезмер ного освещения, у растений часто наблюдается индукция синтеза экстратилакоидных и экстрапластидных Кар, не передающих энергию возбуждения на Хл [Ben-Amotz et al., 1982;

Wang et al., 2003;

Merzlyak et al., 2002, 2005;

Hormaetxe et al., 2006]. У одноклеточ ных водорослей эти Кар обычно локализуются в цитоплазматических липидных глобулах [Hanagata, Dubinsky, 1999;

Boussiba, 2000] либо в цитоплазме в виде гранул [Rabbani et al., 1998]. Известно, что у некоторых видов зеленых водорослей накопление Кар при стрессах координировано с синтезом нейтральных липидов и формированием цитоплазматических липидных включений [Mendosa et al., 1999].

Мы исследовали локализацию Кар, синтезирующихся при действии света высокой интенсивности в клетках зеленой микроводоросли P. incisa (рис. 5, 8, 12). Ранее было ус 1 мкм КС ВВ T П 2 мкм КС Хл ЛГ П T ЛГ M КЗ ЛГ ЛГ Хл Хл б а 1 мкм КЗ 2 мкм ЛГ ЛГ КЗ ЛГ ЛГ ЛГ ЛГ ЛГ в в Рис. 12. Ультраструктура клеток (А, В) и хлоропластов (Б, Г) P. incisa после 14 дней роста на полной среде (А, Б) и в отсутствие азота (В, Г).

Обозначения: ВВ — внутривакуолярные включения;

КЗ — крахмальные зерна;

КС — клеточная стенка;

ЛГ — липидные глобулы, содержащие -каротин;

М — митохондрии;

П — пиреноид;

Т — тилакоиды;

Хл — хлоропласт тановлено, что синтез Кар в клетках этих водорослей, культивируемых при интенсивном (200–400 мкЕ/(м2 с)) освещении, протекает синхронно с синтезом нейтральных липидов, в основном обогащенных арахидоновой кислотой триацилглицеридов (ТАГ), отклады вающихся в цитоплазме в виде липидных глобул (ЛГ). Показано также, что рост культуры P. incisa в условиях недостатка азота сопровождается глубокими ультраструктурными из менениями пластид, в частности дегенерацией гранально-ламеллярной системы, сопрово ждающейся образованиям ЛГ, число и размеры которых значительно увеличиваются при дефиците минерального питания, особенно азота, и интенсивном освещении (рис. 13).

Предполагается, что липиды, в частности ТАГ, служат депо для фотоассимилятов, кото рые не могут быть утилизированы в неблагоприятных условиях [Bigongo et al., 2002].

Анализ состава пигментов целых клеток, тилакоидов и ЛГ, выделенных из клеток, выращенных при различных интенсивностях освещения, показал, что состав Кар тилакои дов близок к таковому целых клеток, но отличается меньшим содержанием -кар (рис. 5, 10). По нашим предварительным оценкам, значительная доля (до 66%) -кар, накапли вающегося в стрессовых условиях у P. incisa (рис. 5, 8), была локализована в цитоплазма тических ЛГ. Полученные в настоящей работе данные позволяют предположить частич ную транслокацию -кар из мембран тилакоидов в ЛГ. Весьма вероятно, что локализован ные в этих структурах Кар выполняют защитные функции. Так, обладая антиоксидантны ми свойствами [Young, 1991], они могут препятствовать перекисному окислению ненасы щенных липидов ЛГ. Наряду с этим, полученные нами данные свидетельствуют, что Кар, локализованные вне тилакоидов, могут играть роль внутриклеточных ловушек света, тем самым защищая хлоропласты от избыточного облучения.

Сравнительное электронно-микроскопическое исследование листьев алоэ с зеленой и красной окраской показало, что наряду с изменением окраски в пластидах происходят значительные изменения ультраструктуры, включая дегенерацию гранально-ламеллярной системы, образование многочисленных пластоглобул и увеличение размеров крахмальных зерен (рис 12А, В). Пластоглобулы представляются наиболее вероятными местами лока лизации Ркс, накапливающегося при стрессе. Существенно, что, несмотря на столь глубо кие изменения, при затенении и/или восстановлении нормального орошения растения вос станавливают зеленую окраску (Gutterman, личное сообщение). Необходимо также отме тить сходство ультраструктурных изменений в пластидах A. arborescens и других иссле дованных нами видов растений, для которых характерно накопление высоких количеств Кар при действии интенсивной солнечной радиации. Во всех этих случаях происходит об разование многочисленных крупных ЛГ, среди прочего выполняющих функции депо для Кар, обладающих фотозащитными функциями (подробнее см. гл. 5 и 6).

А Б В Г Рис. 12. Внешний вид интактных (A) и подвергшихся действию сильного солнечного све та (Б) растений A. arborescens и микрофотографии поперечных срезов зеленых (В) и красных (Г) листьев 1 мкм 1 мкм КЗ ТГ ПГ ПГ ТС КЗ Рис. 13. Изменения ультраструктуры хлоропластов листьев A. arborescens при адаптации к сильному свету. Справа — хлоропласт интактного листа, слева — каротиноидо пласт из красного листа (см. рис. 12) Обозначения: КЗ — крахмальные зерна;

ТГ — тилакоиды гран;

ТС — тилакоиды стромы;

ПГ — пластоглобулы Некоторые ксантофиллы и ЭК, накапливающиеся при адаптации к высоким пото кам солнечной радиации, откладываются в пластоглобулах хлоропластов [Hormaetxe et al., 2006]. Данный механизм обнаружен у ряда видов высших растений с ограниченной спо собностью к синтезу Ант, в частности у голосеменных из родов Cryptomeria, Taxodium, Thuja и ряда других [Ida et al., 1991;

Han et al., 2003, 2004] и некоторых цветковых [Diaz et al., 1990]. Для исследования этого механизма мы использовали в качестве модельной сис темы алоэ древовидное, листья которого при действии интенсивной солнечной радиации и недостатка влаги приобретают красную окраску (рис. 12А, Б) из-за значительного сниже ния содержания Хл и накопления соединения, идентифицированного как кетокаротиноид родоксантин (Ркс). Микроскопическое исследование, предпринятое с целью выявления локализации этого пигмента, показало, что окрашивание листьев A. arborescens в услови ях стресса сопровождается сменой окраски пластид с зеленой, характерной для интактных листьев (рис. 12В), на ярко-красную (рис. 12Г) через ряд промежуточных стадий, на кото рых пластиды приобретали красно-бурую окраску.

Локализация Ант и Фл. У высших растений, обитающих в наземно-воздушной среде, ФеС локализуются преимущественно в поверхностных структурах включающих кутику лу, эпидерму и ее производные (волоски и трихомы), наиболее подверженных воздейст вию неблагоприятных факторов [Kolb et al., 2001;

Steyn et al., 2002]. Однако в листьях изученных нами видов растений нередко наблюдали накопление Ант и Фл не только в эпидермальных клетках (рис. 14А), но и в вакуолях клеток столбчатого (рис. 14Б, В), а в некоторых случаях и губчатого мезофилла. В плодах яблони Ант и Фл обнаруживали не только в вакуолях клеток эпидермы, но и гиподермы (рис. 15).

Известно, что многие ФеС синтезируются в хлоропластах и цитоплазме и, после гликозилирования, транспортируются в вакуоли, в которых они накапливаются [Запроме тов, Загоскина, 1987;

Markham, 1989;

Harborne, Williams, 2000], при этом их локальная концентрация достигает весьма высоких значений [Lancaster et al., 1994]. По данным мик роспектрофотометрии, локальная концентрация Фл и Ант в вакуолях эпидермы исследо ванных нами плодов яблони достигала 400 и 200 ммоль/л, соответственно.

Клетки эпидермы экскретируют разнообразные ФеС, включая фенольные кислоты [Burchard et al., 2000] в матрикс их стенок, а также в кутикулу, часть ФеС при этом кова лентно связывается с высшими жирными кислотами кутикулярных восков [Krauss at al., 1997]. Исследование показало, что у плодов яблони фенольные кислоты были локализова ны, главным образом, в кутикуле в связанном виде, тогда как в вакуолях их содержание было невысоким. Присутствие Фл, представленных гликозидами кверцетина, обнаружено как в кутикуле, так и в вакуолях клеток эпидермы;

при этом в вакуолях содержание Фл Б Acer platanoides L. Corylus avellana L.

А 1 4 3 50 m 4 В 3 Рис. 14. Схема строения поперечных срезов 100 m листовых пластинок ювенильных (А) и осенних стареющих (Б) листьев A. platanoides, а также листьев 2 C. avellana с ювенильной антоциано вой пигментацией.

Структуры и ткани листа, обозначенные на схеме: 1 – абаксиальная эпидерма;

2 – столбчатый мезофилл;

3 – вакуоли;

4 – пластиды;

5 – губчатый мезофилл;

6 – адаксиальная эпидерма Пластиды показаны зеленым, локализа ция антоцианов — пурпурным было, как правило, в 3–5 раз больше, чем в кутикуле. Установлено, что на солнечной по верхности плодов содержание Фл в кутикуле было существенно больше, чем на теневой, при этом содержание фенольных кислот, связанных с кутикулой, при действии солнечно го излучения существенно не изменялось.

Анализ полученных в этой работе и опубликованных в литературе данных позво ляет заключить, что синтезируемые при действии высоких потоков солнечной радиации фотозащитные пигменты, отличающиеся по своей химической структуре и путям биосин теза, локализуются в разных компартментах клетки. Так, неполярные экстратилакоидные Кар и ЭК накапливаются в гидрофобном окружении липидных глобул (цитоплазматиче ских ЛГ, как в случае зеленой микроводоросли P. incisa, либо пластоглобулах, как у выс ших растений). Более полярные ФеС (Ант и Фл) накапливаются при действии интенсив ного излучения в вакуолях клеток листьев и плодов, как в плодах яблони. Известно, что в Б А Г В Рис. 14. Эпи- и гиподермальные клетки теневой (А, В) и солнечной (Б, Г) поверх ностей плода яблони сорта Жигулевское и люминесцентные (ex = 365 нм, em 410 нм) микрофотографии поперечных срезов кожицы с тех же уча стков (В и Г, соответственно).

Антоцианы локализуются в вакуолях (Б). На поперечных срезах заметна желтая флуоресценция флавонолов в вакуолях эпи- и гиподермы (Г), а также желто-зеленая флуоресценция фенольных кислот в кутикуле (В).

зрелых ассимиляционных тканях растений вакуоли занимают значительную часть объема клетки и выполняет ряд важных физиологических функций [Taiz, 1992], включая осуще ствление завершающих этапов катаболизма Хл [Hrtensteiner, Matile, 1990–2006]. При этом накопление фотозащитных пигментов в вакуолях может, среди прочего, обеспечи вать защиту от фотодинамического действия продуктов деградации Хл и других фотосен сибилизаторов, присутствующих в растительной клетке.

Глава VII. Фотозащитные пигменты и устойчивость растений к фотоповреждениям Важным доказательством наличия у «экранирующего» пигмента фотозащитной функции является повышение устойчивости к фотоповреждению излучением в спектральной поло се, где поглощает данный пигмент, при накоплении его в клетках и тканях. К настоящему времени получены некоторые свидетельства важности фотозащитных пигментов как фак тора устойчивости к высоким потокам УФ и видимого излучения [Cockell, Knowland, 1999;

Caldwell et al., 2003;

Wang et al., 2003], однако для детального и количественного описания фотопротекторного эффекта этих данных было недостаточно. С целью оценки фотозащитного эффекта «экранирующих» пигментов использовался анализ кинетик фото деструкции Хл под действием интенсивного видимого света, а также ингибирования ФС II под действием УФ-B излучения в объектах с различным содержанием фотозащитных пигментов. Также исследовали параметры линейного транспорта электронов в ЭТЦ хло ропластов в зависимости от содержания экранирующих пигментов и освещенности.