Грибы в коллекциях культур: фундаментальные и прикладные аспекты

и Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина Российской академии наук

На правах рукописи

Озерская Светлана Михайловна Грибы в коллекциях культур: фундаментальные и прикладные аспекты 03.02.12 Микология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Москва - 2012

Работа выполнена в лаборатории мицелиальных грибов отдела «Всероссийская коллекция микроорганизмов» (ВКМ) Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии и физиологии микроорганизмов им.

Г.К.Скрябина Российской академии наук (ИБФМ РАН)

Официальные оппоненты: Мельник Вадим Александрович доктор биологических наук, ФГБУН Ботанический институт им. В.Л. Комарова Российской академии наук, ведущий научный сотрудник лаборатории систематики и географии грибов Синеокий Сергей Павлович доктор биологических наук, профессор, ФГУП "ГосНИИгенетика", директор Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов Феофилова Елена Петровна доктор биологических наук, профессор, ФГБУН Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук, зав. лабораторией экспериментальной микологии

Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт медицинской микологии им. П.Н.Кашкина – ГБОУ ВПО Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И.

Мечникова, Санкт-Петербург

Защита состоится 12 октября 2012 г. в 15 ч. 30 мин. На заседании Диссертационного совета Д 501.001.46 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Московском государственном университете им. М.В.

Ломоносова по адресу: 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, МГУ им. М.В.

Ломоносова, Биологический факультет, аудитория тел/факс (495) 939-39-10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеках Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова и ИБФМ РАН.

Отзывы (в двух экземплярах) просим отправлять по адресу: 119991, Москва, ГСП-1, Ленинские горы, д. 1, стр. 12, МГУ им. М.В. Ломоносова, Биологический факультет, кафедра физиологии растений, ученому секретарю Диссертационного совета Д 501.001.46. Телефон: (495) 939-21-18. Факс: (499) 783-24-02.

Просим высылать также электронную копию отзыва на e-mail: [email protected] Автореферат разослан 2012 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук М.А.Гусаковская Актуальность Возросшие в последние годы цифры, характеризующие выявленное на Земле биологическое (генетическое) разнообразие микроорганизмов и грибов в частности, генерируют новый импульс роста интереса мировой науки к его изучению, практическому использованию и сохранению его представителей в биологических коллекциях. Объем и качество фондов культур микроорганизмов, поддерживаемых в коллекциях мира, составляют важнейший ресурс, обеспечивающий развитие науки, биоэкономики и образования. Актуальность увеличения объема и повышения качества фондов биологических коллекций обусловлена как уникальностью и разнообразием биоресурсов, надлежащих изучению и сохранению ex situ, так и необходимостью решения задач, связанных с инновационным направлением развития стран мира.

Качество фондов биологических коллекций определяется числом и разнообразием единиц хранения, наличием условий, обеспечивающих надежность сохранения биоматериалов в неизменном виде, адекватную характеристику и адекватное информационное сопровождение образцов в современных базах данных. Увеличение темпов изучения микроорганизмов и их свойств, в том числе, перспективных для практического использования, сопровождается возрастающей потребностью исследователей в своевременном получении требуемых образцов из конкретной коллекции, а также быстром доступе к информации о сохраняемых культурах.

Информация, необходимая исследователям, носит разноплановый характер и включает сведения о положении организмов в современной системе классификации, данные о (потенциальных) штаммах-продуцентах, методах их культивирования и долгосрочного хранения, степени опасности при работе с теми или иными группами микроорганизмов (патогенными/условно-патогенными для человека, животных и растений) и др.

Эффективным способом предоставления современному исследователю информации о штаммах микроорганизмов и, в частности, грибов, обладающих чрезвычайно высоким биотехнологическим потенциалом, является обеспечение прямого доступа к специализированным базам данных. С точки зрения результативности и времени поиска нужной информации, наиболее востребованными являются базы данных с открытым доступом и наличием поисковых систем, работающих в режиме on line. Повышению эффекта использования баз данных по грибам способствует их связь с авторитетными международными информационными ресурсами, такими, как, например, Index Fungorum (www.indexfungorum.org), MycoBank (www.mycobank.org), GenBank (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/), StrainInfo (www.straininfo.net/) и другими.

В связи со всем вышесказанным, разработка информационного сопровождения оперативной деятельности коллекций грибных культур, анализ и структуризация в специализированных базах данных собственных экспериментальных данных и разноплановой доступной информации о грибах, организация связи в режиме on-line с релевантными информационными ресурсами мира по грибам, являются в настоящее время одними из актуальных направлений микологических исследований и технологических разработок в микологии.

Целью данной работы было создание информационно-справочной системы по грибам в коллекциях культур для обеспечения оперативной деятельности микологических коллекций на уровне стандартов, рекомендованных Организацией экономического сотрудничества и развития (ОЭСР) для Биологических ресурсных центров (БРЦ), способствующей дальнейшему развитию фундаментальных и научно прикладных исследований, связанных с использованием чистых культур грибов.

Для достижения поставленной цели предполагалось решить следующие задачи.

Сбор, анализ и структуризация данных о видовом разнообразии грибов в 1.

публичных (официальных) и исследовательских (лабораторных) коллекциях мира.

Анализ таксономического разнообразия грибов в генетическом банке 2.

(GenВank - National Center for Biotechnology Information, NCBI), оценка возможностей и ограничений использования информации GenВank для идентификации штаммов грибов.

Сравнительный анализ видового разнообразия условно-патогенных и 3.

патогенных грибов по регуляторным документам РФ, Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), разных государств мира с оценкой релевантности отечественных документов и международных стандартов в области биобезопасности.

Изучение возможности длительного сохранения штаммов грибов ВКМ при 4.

использовании различных методов консервации для предоставления пользователям информации о методах и сроках длительного гарантированного сохранения жизнеспособности разных видов.

Создание прототипа базы данных, обеспечивающей поиск информации по 5.

штаммам-продуцентам при проведении фундаментальных, научно-прикладных и аналитических исследований, на основании анализа опубликованных данных о разнообразии вторичных метаболитов штаммов грибов рода Penicillium.

Разработка структуры, наполнение информационно-справочной системы по 6.

грибам в коллекциях культур и организация ее связи в режиме on-line с релевантными информационными ресурсами мира по грибам.

Методы исследования Сбор и анализ информации. Информационную базу аналитических исследований составили:

• каталоги (печатные и электронные), указатели и другие доступные источники информации по 662 публичным и исследовательским коллекциям мира;

• таксономическое разнообразие грибов на основе Словаря Эйнсворта и Бисби (Ainsworth and Bisby’s Dictionary of the Fungi, 2008, 10-е издание);

• таксономическое разнообразие грибов в генетическом банке (GenBank, NCBI);

• официальные документы разных стран мира и ВОЗ, касающиеся биобезопасности работ с грибами;

• библиография по штаммам грибов ВКМ;

• экспериментальные данные о длительности хранения штаммов мицелиальных грибов, полученные в ходе многолетних исследований автора и руководимого ею коллектива по сохранению фонда грибов ВКМ с использованием известных и модифицированных методов консервации. Состав питательных сред, оптимальные условия культивирования и способы хранения штаммов указаны в электронном каталоге мицелиальных грибов ВКМ, доступном по адресу www.vkm.ru.

Разработка и наполнение баз данных как технологической основы анализа.

Специализированные базы данных были разработаны по всем аспектам проведенного аналитического исследования с использованием персональных компьютеров с операционной системой MS Windows. Тип средств управления базами данных – MS Access 2007. Объем созданных в процессе работы баз данных составляет более 100 МБ.

Основные положения, выносимые на защиту 1. Впервые получены обобщенные данные о видовом разнообразии мирового коллекционного фонда грибов, определена его доля от общего числа известных (описанных) видов и внутривидовых таксонов грибных организмов.

2. На основе структуризации и анализа данных по нуклеотидным последовательностям грибов, депонированным в GenBank, проведена оценка степени его видового разнообразия, возможностей и ограничений использования информации GenВank для идентификации новых штаммов грибов.

3. Результаты сравнительного анализа существующих отечественных и зарубежных регуляторных документов в области биобезопасности, предоставляющие исследователям информацию для планирования и проведения научных экспериментов и биотехнологических разработок. Результаты анализа свидетельствуют об актуальности разработки в РФ новых регуляторных документов, включающих научно обоснованный перечень условно-патогенных и патогенных видов грибов, а также о необходимости их гармонизации с аналогичными документами стран–членов ВТО (связанной со вступлением в эту организацию РФ).

4. Обобщение экспериментальных результатов по длительному (более 40 лет) сохранению в жизнеспособном состоянии штаммов грибов ВКМ, относящихся более чем к 1220 видам, предоставляет пользователям ценную информацию о методах и сроках гарантированного сохранения культур грибов.

5. На основе полученных и структурированных аналитических материалов, содержащих разноплановую информацию по грибам, поддерживаемым в культуре, разработана информационно-справочная система FungalDC (Fungal diversity in culture collections). Доступ к ней открыт на сайтах ВКМ (www.vkm.ru) и MycoBank (www.mycobank.org, раздел «Specimens and strains links, All-Russian Collection of Microorganisms»»). Взаимодействие FungalDC в режиме on-line с информационными системами Index Fungorum, MycoBank, GenBank и StrainInfo обеспечивает повышение эффективности поиска конкретных штаммов грибов в коллекциях мира и сопряженной информации.

Научная новизна В процессе проведения исследований получены новые научные данные теоретического и прикладного характера. Впервые произведена оценка таксономического разнообразия мирового коллекционного фонда грибов и определена их доля от общего числа известных (описанных) видов грибных организмов. Впервые получены данные о реальном таксономическом разнообразии грибов, представленных в генетическом банке (GenBank NCBI) и выявлены «белые пятна» в информации таксономического, филогенетического и номенклатурного характера по разным группам грибов. Впервые проведен (по официальным документам РФ, ВОЗ и ряда стран мира) сравнительный анализ данных о патогенных и условно-патогенных видах грибов, результаты которого показали необходимость разработки новых, научно обоснованных регуляторных документов по вопросам биобезопасности работы с грибами. Получены новые экспериментальные данные по оценке сроков гарантированного сохранения жизнеспособности различными методами штаммов грибов широкого таксономического спектра. На основе информации, аккумулированной в ходе анализа разнообразия вторичных метаболитов (более 20 классов органических соединений), синтезируемых штаммами рода Penicillium создан прототип базы данных, ориентированной на поиск штаммов-продуцентов различных микробных метаболитов. Впервые в стране разработана оригинальная информационно-справочная система мирового уровня на основе базы данных FungalDC, обеспечивающая возможность поиска в режиме открытого доступа on-line (www.vkm.ru, www.mycobank.org) конкретных штаммов грибов и информации о них в ВКМ и других коллекциях страны и мира. Разработана информационная система по обеспечению деятельсности коллекции грибов ВКМ.

Практическая значимость. Созданная база данных FungalDC и разработанная схема ее взаимодействия с известными международными сетевыми ресурсами (IndexFungorum, MycoBank, GenBank и StrainInfo) обеспечивают удобство и повышение эффективности поиска штаммов и информации о них при планировании и проведении фундаментальных, научно-прикладных и аналитических исследований. Система позволяет в режиме on-line использовать вышеперечисленные информационные ресурсы простым переходом из одной базы данных в другую, выбрать наиболее подходящую коллекцию для запроса штамма, получить информацию по истории и характеристикам штамма или таксона, имеющуюся в мировых информационных сетях (базах данных). Созданная и регулярно обновляемая база FungalDC способствует развитию системы классификации грибов на новом научно-методическом уровне.

Результаты оценки таксономического разнообразия грибов в GenBank позволили определить возможные направления его расширения для повышения эффективности работ по идентификации новых штаммов и мониторинге генетического разнообразия грибов молекулярными методами. Результаты сравнительного анализа регуляторных документов РФ, ВОЗ и ряда государств мира по вопросам биобезопасности востребованы микологами, биотехнологами и эпидемиологами, и могут быть полезны органам государственных структур РФ при разработке новых научно обоснованных регуляторных документов и их гармонизации с аналогичными документами стран– членов ВТО. Результаты экспериментальных работ по оценке сроков гарантированного сохранения жизнеспособности у широкого спектра штаммов грибов ВКМ могут быть востребованы в разных областях науки и практической деятельности, касающихся, в том числе, вопросов патентования штаммов и научно-организационных мероприятий по сохранению биологического разнообразия.

На разработанные в диссертации базы данных получены свидетельства о государственной регистрации № 2010620603 от 13.10.2010 и № 2011620277 от 14.04.2011.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены в виде устных и стендовых докладов на многочисленных российских и международных научных конгрессах и конференциях. Ниже перечислены наиболее значимые из них:

X Congress of European Mycologists, Tallinn, Estonian SSR, 1989;

XII Congress of European Mycologists, Wageningen, the Netherlands, 1995;

International Conference "Selection of Fungi for Degradation Processes", Vilnius, Lithuania, 1995;

15-ое рабочее совещание "Консервация генетических ресурсов", Пущино, 1998;

2nd International Workshop on Computer Science and Information Technologies, Ufa, Russia, 2000;

Съезды микологов России, Москва, 2002, 2008;

Всероссийские конгрессы по медицинской микологии, Москва, 2003, 2004, 2005, 2007;

Научно-практические конференции по медицинской микологии (Кашкинские чтения), Санкт-Петербург, 2004, 2007, 2011, 2012;

Междисциплинарные микологические форумы, Москва, 2009, 2010;

29th Annual Meeting of the European Culture Collections' Organization (ECCO XXIX), Istanbul, Turkey, 2010;

12th International Conference on Culture Collections (ICCC12), Florianpolis, Brazil, 2010;

30th Annual Meeting of the European Culture Collections' Organization (ECCO XXX), Utrecht, the Netherlands, 2011;

International Seminars of World Data Centre for Microorganisms. Beijing, China, 2011, 2012;

31st Annual Meeting of the European Culture Collections' Organization (ECCO XXXI), Braga, Portugal, 2012.

Публикации По результатам диссертации опубликовано 109 работ, из которых 58 составляют статьи в рецензируемых научных журналах и главы в монографиях/учебных пособиях (46 в отечественных и 12 – в зарубежных изданиях). 37 статей опубликовано в журналах из перечня ВАК. Получены свидетельства о государственной регистрации на разработанные в процессе выполнения работы базы данных по грибам.

Место выполнения работы и личный вклад соискателя. Основная часть работы выполнена в лаборатории мицелиальных грибов отдела ВКМ ИБФМ РАН.

Личный вклад автора состоял в планировании и проведении исследований, анализе и обобщении полученных результатов, разработке структур информационных баз данных, наполнению их информацией, подготовке и оформлению публикаций.

Автор выражает глубокую признательность коллегам, принимавшим участие в представленной работе на разных этапах ее выполнения и обсуждения полученных результатов: чл.-корр. РАН Л.В.Калакуцкому, д.б.н. Л.И.Евтушенко, к.б.н.

Г.А.Кочкиной, к.б.н. Н.Е.Иванушкиной, А.Н.Василенко, к.б.н. С.С.Ереминой, д.б.н.

А.Г.Козловскому, д.б.н. О.Е.Марфениной, к.б.н. Н.И.Чигиневой. Автор искренне благодарен сотрудникам ИБФМ РАН, отдела ВКМ и, в особенности, лаборатории мицелиальных грибов, содействовавшим выполнению данной работы.

Работа выполнена при поддержке Программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» и ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007–2013 годы» (государственные контракты №№ 02.518.11.7092 и 16.518.11.7035).

Структура и объем диссертации Диссертационная работа состоит из следующих разделов: введение, главы, посвященные истории вопроса, анализу многолетних экспериментальных результатов, обсуждению сведений по различным аспектам информационного сопровождения оперативной коллекционной деятельности, описанию взаимодействия разработанных автором и существующих микологических баз данных, заключение, выводы, список литературы. Материалы диссертации (том 1) изложены на 294 страницах текста с иллюстрациями в виде 51 рисунка и 48 таблиц. Список литературы содержит наименования, в их числе 144 работы отечественных и 308 иностранных авторов.

Приложения к диссертации (том 2) включают перечень коллекций грибов мира, списки таксонов, относящихся к условно-патогенным и патогенным грибам, сроки гарантированного сохранения жизнеспособности штаммов 1220 видов мицелиальных грибов разными методами, описание структур разработанных баз данных.

Содержание работы Глава 1. Разнообразие грибов, поддерживаемых в культуре, и информация о биологических коллекциях По уточняющимся оценкам, число видов грибов на Земле достигает нескольких миллионов (Hawksworth et Rossman, 1997;

Hawksworth, 2003;

Tang et al., 2006;

Schmit, Mueller, 2007). Из них известно (описано) от 69000 до 120000 видов (Hawksworth, 1991).

При этом число введенных когда-либо в практику микологии наименований (на 12.07.2012 г.) составляет 473400 видов и внутривидовых таксонов (по базе данных Index Fungorum). Значительная часть наименований видов сегодня не используется (невалидные описания, синонимия, отсутствие доступного типового материала и т.п.).

Общее число поддерживаемых в коллекциях мира видов грибов до нашей работы было неизвестно (оценка не проводилась).

В современной биологической коллекции имеет место непрерывная интеграция традиционных видов деятельности и с другими видами деятельности и вопросами, находившимися ранее вне «коллекционной» сферы (информатика, доступ к генетическим ресурсам, биобезопасность, регуляция, интеллектуальная собственность, международное право и многие другие). Концепция коллекций как центров биологических (генетических) ресурсов, призванных решать расширенный спектр задач, активно развивается в последнее время под эгидой Организации по экономическому содействию и развитию – ОЭСР (Organisation for Economic Co-operation and Development, OECD - www.oecd.org). Координация коллекционной деятельности ведется Всемирной федерацией коллекций культур (World Federation for Culture Collections, WFCC, www.wfcc.info) и Европейской организацией коллекций культур (European Culture Collection Organization, ECCO, www.eccosite.org). При WFCC создан Всемирный центр данных по микроорганизмам (World Data Center for Microorganisms, WDCM, www.wfcc.info/wdcmdb).

Коллекции по своим функциям обычно подразделяются на исследовательские, созданные в процессе выполнения конкретных научных задач, и сервисные, обеспечивающие проведение фундаментальных, прикладных, в том числе и поисковых скрининговых исследований. В данной работе будут рассматриваться только сервисные коллекции и проблемы, связанные с их практической деятельностью по сохранению жизнеспособности культур, предоставлению штаммов и информации о них.

Биологические ресурсные центры – новый этап развития коллекций культур Стремительное развитие биологии и биотехнологии в начале XXI века требует от коллекций культур микроорганизмов решения значительно большего объема различных задач по обеспечению научно-исследовательских работ фундаментального и прикладного характера, чем это было прежде. Традиционного снабжения исследователей только чистыми культурами уже недостаточно, нужна комплексная работа по информационному сопровождению, стандартизация процессов поддержания культур на качественном уровне, обеспечение сохранения интеллектуальных прав при передаче штаммов третьим лицам и патентных процедурах.

В связи с этими новыми требованиями, подразделением по развитию биотехнологии ОЭСР в результате многочисленных обсуждений группами экспертов как стран, входящих в эту организацию, так и стран-партнеров, была разработана концепция развития на основе ведущих биологических коллекций Биологических ресурсных центров, или БРЦ (Biological Resource Centres, BRC). По определению ОЭСР БРЦ – это существенная часть инфраструктуры, обеспечивающей развитие биотехнологии. Они включают провайдеров услуг и депозиторов живых клеток, геномов организмов и информации, касающейся наследственности и функций биологических систем. БРЦ содержат коллекции культивируемых организмов (например, микрооорганизмов, клеток растений, животных и человека);

воспроизводимых их частей (т.е. геномов, плазмид, ДНК), жизнеспособных, но пока некультивируемых организмов, клеткок и тканей, а также базы данных, содержащие молекулярную, физиологическую и структурную информацию, относящуюся к этим коллекциям и необходимые для их деятельности сведения по биоинформатике. Для того, чтобы обеспечивать поставку биологических материалов и информации, БРЦ должны соответствовать высоким стандартам качества и экспертизы международного сообщества исследователей и производственников. БРЦ должны обеспечивать доступ к биологическим ресурсам, которые являются основой фундаментальных исследований в науках о жизни и развивающейся биотехнологии. Все эти виды деятельности, по мнению ОЭСР, должны быть объединены в биологических ресурсных центрах, как мировой, так и европейской систем.

В данной главе диссертации подробно описаны условия организации БРЦ, мотивы их создания, стандарты БРЦ и степень их готовности, требования к коллекциям культур, желающим получить статус БРЦ, механизмы сертификации БРЦ, примеры действующих в настоящее время БРЦ. Что касается России, то пока остается открытым вопрос о необходимости и возможности организации БРЦ. Не решен и вопрос о том, сколько их должно быть и как они могут быть созданы. Необходим долгодействующий механизм финансовой поддержки развития инфраструктуры, обогащения и сохранения фондов российских коллекций микроорганизмов.

Коллекции микроорганизмов мира Основной объем информации по штаммам микроорганизмов, которые поддерживаются в коллекциях различных стран мира, может быть получен из данных WDCM. В настоящее время (на 11.07.2012 г.) в WDCM зарегистрировано 621 коллекция из 69 стран. Распределение числа коллекций по частям света и материкам представлено на рисунке 1.

В последнее время WDCM поменял место своего расположения и переместился из Японии в Китай. Существенно интенсифицированы работы по созданию информационной системы, сопровождающей деятельность различных коллекций мира (www.wdcm.org/).

Южная Америка Азия Азия - Африка - Северная Америка Европа - Австралия и Океания - Австралия и Северная Америка - Океания Южная Америка - Африка Европа Рисунок 1 - Распределение мировых коллекций Значительными темпами ведется организационная работа по созданию Глобального каталога микроорганизмов (Global Catalogue of Microorganisms, gcm.wfcc.info/) и обновлению Каталога референтных штаммов микроорганизмов (WDCM Reference Strains Catalogue, refs.wdcm.org/home.htm). В состав последнего входят тест-организмы, использующиеся в процессе проведения различных экспертных лабораторных исследований. Новым шагом в развитии WDCM стало предоставление пользователям информации по библиографии на штаммы микроорганизмов, включенные в базу данных WDCM (Analyzer of Bio-resource Citations (ABC), В таблице 1 представлены 18 российских коллекций, abc.wfcc.info/).

зарегистрированных в WDCM. Это составляет чуть больше 15% от числа коллекций микроорганизмов РФ, информация о которых включена в базу данных ВКМ, частично представленную на ВЕБ-сайте (www.sevin.ru).

Необходимо отметить, что обновление информации на сайте WDCM происходит нерегулярно, в зависимости от желания и активности администрации коллекций. На рисунке 2 показано число коллекций, которые последний раз обновляли информацию о своих фондах в различные, с 1985 по 2012, годы.

В рамках данной работы было проведено исследование степени доступа к информации о составе поддерживаемых фондов коллекций WFCC. Оказалось, что каталожная информация в системе on-line имеется только для 128 коллекций (рисунок 3). У менее половины коллекций представлены только списки видов, у других – только тип поддерживаемых микроорганизмов или информация полностью отсутствует.

Сведения в таблице 2 указаны по доступной информации WDCM. Основные функции коллекций культур микроорганизмов по данным WDCM, указаны на рисунке 4.

Таблица 1 – Российские коллекции, зарегистрированные в WFCC Номер Акроним Название коллекции WDCM CCS 936 Algae Culture Collection of Siberia BOROK 602 The Collection of algae CALU 461 Collection of Algae in Leningrad, St. Petersburg, State University CBMW 986 Collection of bacteriophages and microorganisms MicroWorld CCIBSO 836 Culture Collection IBSO CIAM* 890 Collection of Nonpathogenic Microorganisms for Agriculture EMTC 974 Collection for extremophile microorganisms and type cultures IEGM 768 Regional Specialized Collection of Alkanotrophic Microorganisms IPPAS 596 Culture Collection of Microalgae IPPAS KMM 644 Collection of Marine Microorganisms LE(BIN) 1015 Komarov Botanical Institute Basidiomycetes Culture Collection LTI 554 Cryobank of Microorganisms-Destructors PGC 641 Peterhof Genetic Collection of Microalgae RCAM* 966 Russian Collection of Agricultural Microorganisms RIA 337 The Russia Research Institute for Antibiotics Culture Collection VIZR 760 Collection for Plant Protection, All-Russian Institute of Plant Protection VKM 342 All-Russian Collection of Microorganisms VKPM 588 Russian National Collection of Industrial Microorganisms Примечание:

*-коллекция зарегистрирована дважды под разными номерами Число коллекций Годы Рисунок 2 – Число коллекций, последнее обновление информации о которых датировано годами от 1985 до Рисунок 3 – Информация о микроорганизмах, предоставляемая коллекциями WDCM Таблица 2 - Микроорганизмы, поддерживаемые в коллекциях WDCM Наличие информации Число коллекций Тип организма WFCC Список видов On-line каталог Бактерии 413 255 Грибы и дрожжи 380 220 Водоросли 59 12 Вирусы и клетки 49 8 Число коллекций Всего коллекций Депонирование Хранение Выдача культур Рисунок 4 - Распределение коллекций с указанием проводимых сервисных работ Коллекции грибов Информация о разнообразии грибов, поддерживаемых в коллекциях мира, была получена нами из различных доступных источников. Фонды поддерживаемых грибов в микробных коллекциях, зарегистрированных в WDCM, были изучены как по отдельным страницам WEB-сайта WDCM в Интернете, так и по собственным данным различных коллекций, включая их печатные и электронные источники. Дополнительно была проанализирована информация о 41 коллекции грибов, которые не вошли пока в WDCM, но объявили в сети Интернет о своем существовании или опубликовали каталоги поддурживаемых штаммов в виде отдельных изданий или журнальных публикаций. Таким образом, число коллекций, фонды которых были рассмотрены при выполнении данной работы, составило 662.

Полученные результаты показали, что большая часть коллекций (415 из 662) имеет в своем составе мицелиальные грибы и дрожжи, хотя списки поддерживаемых видов в указателях или каталогах приводят из них только 287. Полный перечень коллекций микроорганизмов, в состав которых входят фонды культур грибов, представлен в приложении 1 к диссертации. Известно, что коллекции, как правило, поддерживают такие культивируемые штаммы микроорганизмов, включая мицелиальные грибы и дрожжи, условия сохранения жизнеспособности которых в искусственных условиях уже известны или могут быть подобраны по аналогии с другими. Встречаемость различных видов в коллекциях культур зависит, на наш взгляд, от нескольких факторов, в число которых могут входить: 1) степень изученности представителей того или иного таксона, 2) условия выделения в чистую культуру, 3) условия последующего хранения культур, 4) возможное прикладное значение штаммов для медицины, биотехнологии, сельского хозяйства, и другие.

Результаты проведенного в работе анализа показали, что представленность различных видов грибов в коллекциях культур различается в довольно большой степени. Основное разнообразие грибов распределено среди небольшого числа коллекций, при этом штаммы более 8000 видов грибов встречаются лишь в единичных коллекциях мира. Полученные результаты показали, что наиболее распространенными в коллекциях являются штаммы только нескольких видов, встречающиеся более чем в коллекциях мира. Виды мицелиальных грибов и дрожжей, культуры которых поддерживаются в наибольшем числе различных коллекций, представлены в таблице 3.

Хорошо известно, что крупнейшей грибной коллекцией мира и по видовому разнообразию и по численности поддерживаемых культур является CBS (Centraalbureau voor Schimmelcultures, Fungal and Yeast Collection, Нидерланды, www.cbs.knaw.nl/). По нашим данным другие коллекции значительно отстают по этим показателям, распределяясь между собой таким образом, что единичные коллекции поддерживают значительное число видов (более 3-х тысяч), тогда как большая часть ограничивается небольшим разнообразием поддерживаемых культур (рисунок 5).

Необходимо отметить, что существуют коллекции, видовое разнообразие которых чрезвычайно мало, но число штаммов поддерживаемых видов довольно значительно. К таким коллекциям относятся в первую очередь генетические коллекции, в которых хранятся фонды мутантов Neurospora crassa (www.fgsc.net/ncrassa.html) и Aspergillus nidulans (www.fgsc.net/Aspergillus/), а также коллекции продуцентов, например, Aspergillus niger – продуцента лимонной кислоты и других органических веществ (Andersen et al., 2011;

Frisvad et al., 2011). Коллекции грибов, фонды которых поддерживают более 1000 различных видов, представлены в таблице 4. ВКМ по разнообразию поддерживаемого фонда является четвертой в Европе и восьмой в мире.

Таблица 3 - Наиболее часто встречающиеся виды грибов в коллекциях культур №№ Число Наименование вида п/п коллекций 1 Saccharomyces cerevisiae Meyen ex E.C. Hansen 1883 Aspergillus niger Tiegh. 2 Aspergillus flavus Link 3 Aspergillus oryzae (Ahlb. 1878) E.Cohn 4 5 Penicillium chrysogenum Thom 1910 6 Trichoderma viride Pers. 1794 7 Fusarium oxysporum Schltdl. 1824 8 Geotrichum candidum Link 1809 9 Chaetomium globosum Kunze 1817 10 Rhizopus oryzae Went et Prins. Geerl. 1895 Число коллекций Число поддерживаемых видов Рисунок 5 – Виды грибов в мировых коллекциях Видовые названия всех микроорганизмов, включая мицелиальные грибы и дрожжи, приведены в базе данных WDCM без проверки, в том виде, как их подала та или иная коллекция. В связи с этим списки представленных в WDCM фондов изобилуют неточностями, связанными как с ошибками в написании, так и с последствиями некачественного распознавания сканированных печатных текстов. Нами проанализировано суммарно 77196 видовых наименований грибов, включенных в каталоги грибных коллекций. Исключение повторяющихся названий в разных коллекциях и названий, написанных с искажениями, позволило определить разнообразие видовых наименований грибов, поддерживаемых в коллекциях мира как 24897 видов и внутривидовых таксонов. При этом в разных коллекциях мира один и тот же организм может поддерживаться под разными наименованиями – синонимами. Тем не менее, даже в таком варианте, по-видимому, правомерно сравнивать объем видового разнообразия коллекционного фонда грибов, с объемом известных видовых наименований, приведенных в номенклатурной базе данных Index Fungorum, в которой также приведены все виды и внутривидовые таксоны, включая синонимы и недействительные наименования. Полученные данные позволяют оценить видовое богатство грибов, поддерживаемых в коллекциях, как 5,26% от числа известных науке.

Таблица 4 - Перечень наиболее крупных по видовому разнообразию грибов коллекций культур мира Число Страна Акроним Название коллекции видов Centraalbureau voor Schimmelcultures, Fungal and Yeast Нидерланды CBS Collection США ATCC American Type Culture Collection Бельгия MUCL Mycotheque de l'Universite catholique de Louvain Великобри IMI CABI Bioscience Genetic Resource Collection тания Япония IFO Institute for Fermentation, Osaka Канада CCFC Canadian Collection of Fungal Cultures Япония JCM Japan Collection of Microorganisms Россия VKM All-Russian Collection of Microorganisms University of Alberta Microfungus Collection and Канада UAMH Herbarium DSMZ-Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Германия DSMZ Zellkulturen GmbH Bioresource Collection and Research Center, Food Тайвань BCRC Industry Research and Development Institute Южная KCTC KCTC Korean Collection for Type Cultures Корея Китай CGMCC China General Microbiological Culture Collectio Center Индия DUM Delhi University Mycological Herbarium Бразилия URM Universidade Federal de Pernambuco Индия MTCC Microbial Type Culture Collection and Gene Bank В процессе анализа полученной информации по разнообразию коллекционных грибных фондов нами была создана база данных, в которую включена информация по разнообразию таксонов разного уровня (от царств до видов), поддерживаемых в коллекциях мира. В группу грибов при выполнении данной работы были включены представители царств Chromista (Hyphochytriomycota, Labyrinthulomycota, Oomycota), Fungi (Zygomycota, Ascomycota, Basidiomycota) и Protozoa (Acrasiomycota, Myxomycota), традиционно поддерживающиеся в коллекциях чистых культур грибов. Анаморфные виды грибов (Anamorphic fungi) внесены нами в соответствующие таксоны сумчатых и базидиальных грибов в соответствии с рекомендациями номенклатурной базы данных Index Fungorum.

В настоящее время в России действуют 15 грибных коллекций, 12 из которых на протяжении многих лет участвовали в различных научных программах совместно с ВКМ. Совокупный фонд поддерживаемых в коллекциях России грибных культур составляет в настоящее время около 15000 штаммов, большая часть которых была помещена в сводный каталог непатогенных микроорганизмов (www.vkm.ru).

Степень уникальности поддерживаемых фондов коллекций грибов России представлена на рисунке 6. Видовое разнообразие грибов российских коллекций в настоящее время насчитывает примерно 3000 видов, относящихся к 732 родам. При этом отмечено увеличение совокупного фонда грибов на 3000 штаммов по сравнению с ВКМ, а разнообразие его - почти на 500 видов. Большая часть этого разнообразия представлена в коллекциях институтов Российской академии наук, что объясняется, в первую очередь, стремлением исследователей к сохранению в искусственных условиях максимально возможного разнообразия выделяемых культур. Для коллекций прикладных институтов более характерно сохранение и поддержание продуцентов известных метаболитов, что приводит к некоторому ограничению таксономического разнообразия фондов при увеличении штаммового разнообразия отдельных видов.

100, 100, 90, 80,0 72, 71,4 68, 70,0 63, Специфика (%) 60, 45, 50, 36, 40,0 32, 29, 30,0 21, 20, 10, 0,0 0, 0, Рисунок 6 – Специфика фондов коллекций грибов России Сведения по мицелиальным грибам ВКМ были включены в несколько сводных каталогов российских коллекций (Каталог…, 1976, 1981, 1992), электронный сводный каталог (www.vkm.ru, - последнее обновление 2003 года) и WFCC Global Catalogue of Microorganisms (GCM - gcm.wfcc.info/). Таксономическое разнообразие фонда грибов ВКМ представлено на рисунке 7.

Темноокрашенные Целомицеты Сумчатые Базидиомицеты Светлоокрашенные Оомицеты 1936 2 Миксомицеты Зигомицеты Рисунок 7 – Таксономическое разнообразие (число штаммов) фонда ВКМ Глава 2 Базы данных по грибам Микологические интернет-ресурсы Одно из направлений биоинформатики по определению Википедии (Wikipedia, ru.wikipedia.org/wiki/) – это создание баз данных для сбора информации по видовым наименованиям живых организмов, их описаниям, ареалам распространения и генетической информации. В течение последних десятилетий активно развиваются база данных Генетического банка (GenBank), разработаны и стали доступны в системе on-line базы данных по номеклатуре и таксономии грибов, такие как Index Fungorum и MycoBank, а также информационная система StrainInfo – по штаммам микроорганизмов.

Все они, дополняя друг друга, выполняют важную функцию обеспечения научных исследователей новейшими данными по различным группам грибов.

Index Fungorum (www.indexfungorum.org)– это глобальная номенклатурная информационная система, координируемая и поддерживаемая коллективом микологов Великобритании (CABI), Нидерландов (CBS) и Новой Зеландии (Landcare Research-NZ).

База данных содержит названия грибов всех рангов, включая дрожжи, лишайники, грибоподобные организмы из царств Chromista и Protozoa, а также древние формы грибов. Включение новых таксонов грибов, опубликованных в Index of Fungi (CABI), в Index Fungorum происходит каждые три месяца. В настоящее время Index Fungorum предлагает систему регистрации новых таксонов, включая новые видовые названия и новые комбинации, а также новых типификаций непосредственно на своем сайте. Index Fungorum предлагает и механизм электронной публикации новых видовых названий.

Species Fungorum (www.speciesfungorum.org/) – это информационная система, координируемая сотрудниками CABI, создает глобальный список (check-list), прошедших таксономическую ревизию видов грибов В настоящее время в этот список входит пока еще небольшое число видовых наименований (47930 вида на 11.07.2012), но он постоянно растет. Species Fungorum представляет собой грибную часть глобального международного проекта по видовому биологическому разнообразию «Species 2000» (www.sp2000.org/) и является партнером Международной интегрированной таксономической информационной системы (The Integrated Taxonomic Information System, ITIS - www.itis.gov/), которая создана с целью разработки Каталога жизни (The Catalogue of Life - www.catalogueoflife.org/).

В целом, Index Fungorum представляет собой чрезвычайно важный открытый информационный источник, использование которого имеет несомненное теоретическое и практическое значение для исследований микологов всего мира.

MycoBank (www.mycobank.org) представляет собой доступную on-line сервисную службу для предоставления исследователям информации по номеклатуре, библиографии, описаниям видов, иллюстрациям и дополнительным интернет-ресурсам по грибам. Каждое видовое название имеет уникальный номер микобанка (MB), который может цитироваться в публикациях. Эти же номера используются для тех же видовых названий в номенклатурной базе данных Index Fungorum, которая была описана ранее, и с которой MycoBank тесно взаимодействует.

GenBank (NCBI, www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) – это аннотированная коллекция доступных пользователям сиквенсов ДНК (Benson et al., 2011), призванная обеспечить доступ в рамках научного сообщества к наиболее актуальной и полной информации о последовательностях ДНК. На 11.07.2012 г. эта база данных содержала нуклеотидных последовательностей для грибов. Значение генетического банка для систематики грибов, также как и других организмов, широко известно. В последнее время активно развиваются филогения, систематика и экспресс идентификация отдельных таксонов грибов разного ранга на основе сравнения последовательностей ITS1/ITS2 (internal transcribed spaces) (Braun et al., 2003;

Nilsson et al., 2005;

Druzhinina et al., 2006), LSU rDNA, SSU rDNA (Padovan et al., 2005;

Tang et al., 2007), CO1 (cytochrome C oxidase 1 gene) (Seifert et al., 2007) и других участков генома.

StrainInfo (www.straininfo.net/) – информационная система по штаммам микроорганизмов, разработанная несколько лет назад специалистами Гентского университета (Бельгия), работающая on-line. В состав коллекций микроорганизмов, информацию о которых объединила эта база данных в настоящее время входит более коллекций мира, включая ВКМ. Известно, что конкретная информация о наличии тех или иных культур в той или иной коллекции, в том числе о типовых штаммах, может быть получена из каталогов коллекций, часть которых доступна в Интернете. Каждая коллекция (БРЦ) присваивает свои номера для поддерживаемых культур, что приводит к длинным перечням многочисленных номеров культур, ссылающихся на один и тот же типовой или референтный штамм. В связи с этим, при необходимости получения информации по определенному штамму, в процессе поиска нужно использовать все известные для данного штамма номера соответствующих культур в разных коллекциях.

StrainInfo решает эту проблему объединением всех существующих параллельно в разных коллекциях номеров культур в единый паспорт штамма. Паспорт штамма содержит, таким образом, все номера относящихся к нему культур и дополнительную информацию по истории их движения от автора штамма до коллекции и в процессе обмена культурами между ними (схема Histri, рисунок 8), а также библиографические сведения, имеющие отношение к конкретному штамму и молекулярно-генетические данные. Особенностью базы данных StrainInfo является и то, что она позволяет посредством связей между разными базами данных отдельных коллекций переходить со страниц сайта StrainInfo непосредственно на страницы с описанием данного штамма в электронных каталогах отдельных коллекций.

Рисунок 8 - Схема Histri Результаты анализа разнообразия грибов в генетическом банке Известно, что таксономическая составляющая GenBank не поддерживается каким либо экспертным советом со стороны специалистов по таксономии и филогении. В настоящее время из более чем 82000 наименований образцов грибных последовательностей, внесенных в NCBI на 14.04.2012 г., только чуть более имеют определенные видовые названия. Остальные представлены на уровне более высоких таксонов – семейств, порядков, отделов и классов. Значительная часть (более 14000) образцов вообще не имеет какого-либо определенного таксономического статуса и обозначена как «unclassified» или «informal» (не имеющие формального таксономического диагноза) грибы, отобранные из природной среды, такие, например, как «beech leaf mycelium 1», «ectomycorrhiza of Salix reinii» и т.д.

Для того чтобы прояснить сложившуюся ситуацию с разнообразием грибов в генетическом банке и обеспечением этого разнообразия типовым материалом нами был проведен анализ информации из нескольких крупных действующих on-line источников:

база данных по видам грибов в генетическом банке (NCBI, Taxonomy) база данных IndexFungorum (CABI, CBS) база данных по видам грибов в коллекциях мира (ВКМ) база данных по культурам грибов в БРЦ (StrainInfo) В базу данных FungalDC были внесены названия всех таксонов грибов в рангах от царства до рода, а также все названия видов, включенные в GenBank и каталоги коллекций мира. Классификация высших таксонов представлена в соответствии с 10-ой редакцией словаря грибов (Dictionary of Fungi, 2008). В результате анализа интегрированных данных удалось оценить степень представленности в GenBank грибных таксонов разного уровня в целом по царствам Fungi, Chromista и Protozoa, в той части, что традиционно поддерживается грибными коллекциями и гербариями.

Анализируя динамику увеличения данных по грибам в генетическом банке в течение последних почти 20 лет, можно сказать, что для начального этапа этого периода было характерно, в основном, изучение последовательностей известных таксонов (рисунок 9). В последние годы в GenBank лавинообразно растет количество неидентифицированных образцов.

Рисунок 9 - Динамика увеличения разнообразия грибов в GenBank Такое положение может быть связано как с тем, что для публикации данных, полученных молекулярно-генетическими методами, требуется помещение соответствующих последовательностей в доступную базу данных (Ryberg et al., 2009), так и с тем, что многие исследователи рассчитывают с помощью внесенных в генетический банк последовательностей быстро и на современном уровне идентифицировать изучаемый образец. Однако, последнее далеко не всегда возможно по следующим причинам:

1) недостаточная представленность в GenBank таксономического разнообразия грибов (Vilgalys, 2003;

Nilsson et al., 2006), 2) GenBank не является авторизованной системой по номенклатуре и таксономии, а приведенные в нем классификационные схемы значительно отличаются от современных (Hibbett et al., 2007). Об этом на каждой его странице есть соответствующее уведомление – «Disclaimer: The NCBI taxonomy database is not an authoritative source for nomenclature or classification - please consult the relevant scientific literature for the most reliable information», 3) для подтверждения идентичности видовых наименований необходимо предварительно изучить степень внутривидовой вариабельности (Druzhinina et al., 2006), 4) количество новых некорректных записей значительно превышает число вносимых исправлений, что ведет к неуклонному росту неточностей (Pennissi, 2008), 5) большое число некорректных последовательностей (около 20%), с которыми и производится сравнение новых данных с помощью специальных компьютерных программ (Bridge et al., 2003;

Bitardonto et al., 2008). Последнее является следствием того, что присвоение определенного видового названия организму, из которого выделена та или иная последовательность, при помещении ее в GenBank, несомненно, зависит от квалификации исследователя и, следовательно, не может исключить влияния, так называемого, человеческого фактора, а именно:

автор может просто неверно провести идентификацию гриба на основании других диагностических характеристик, автор может придерживаться определенной специфической классификационной схемы, что приведет к отличному от других пониманию объема того или иного таксона, последовательности могут быть внесены для образца, идентифицированного лишь приблизительно, а после окончательной идентификации название его в GenBank изменено не было;

живая культура или гербарный образец, подвергшиеся секвенированию, могут быть контаминированы, что станет причиной неправильных данных и, соответственно, повлечет за собой неверные выводы.

Тем не менее, несмотря на вышеперечисленные ограничения, молекулярно генетические исследования имеют несомненное значение для систематики грибов (Bridge et al., 2005), а GenBank выполняет крайне важную функцию, поддерживая огромное количество последовательностей, выделенных из разных организмов, и предоставляя возможность быстрой компьютерной обработки при их сравнении. В связи с этим, именно сейчас, пока объем данных по грибам еще позволяет проводить их детальный анализ, микологическому научному сообществу необходимо осознать совершенную необходимость внесения в GenBank данных по максимально возможному объему существующих номенклатурных типов для видов грибов. Рассматривая общее разнообразие генетического банка (рисунок 10) по высшим таксонам грибов можно отметить, что лидирующее положение по количеству заложенных в GenBank последовательностей известных родов и видов грибов занимают аскомицеты (61,7% родов, 58,7% видов) и базидиомицеты (30,5% родов, 36,8% видов), включая анаморфы соответствующего аффинитета. В малых долях представлены другие высшие таксоны, из которых зигомицеты составляют 3,3 и 1,8% соответственно, а все остальные таксоны в сумме – менее 5%.

Basidiomycota Chytridiomycota Glomeromycota Incertae sedis Microspora Neocallimasti gomycota Zygomycota Ascomycota Oomycota Рисунок 10 - Таксономическое разнообразие грибов в генетическом банке Соотношение по представленности в GenBank родов грибов, относящихся к разным высшим таксонам, по сравнению с числом известных для них названий родов, представленных в базе данных Index Fungorum, позволило оценить уровень изученности отдельных групп грибов молекулярно-генетическими методами. Полученные данные показали, в каких именно таксонах наибольшее количество «белых пятен», а какие из них имеют наивысший показатель по количеству уже имеющегося в GenBank материала. На рисунках 11-12 показано соотношение имеющегося известного таксономического разнообразия разных групп грибов к их разнообразию в генетическом банке. Подробные данные по отдельным классам сумчатых и базидиальных грибов приведены в тексте диссертации.

Arthoniomycetes Dothideomycetes Eurotiomycetes Incertae sedis Laboulbeniomycetes Lecanoromycetes Помещены в Leotiomycetes GenBank Lichinomycetes Отсутствуют в Neolectomycetes Orbiliomycetes Genbank Pezizomycetes Pneumocystidomycetes Saccharomycetes Sordariomycetes Taphrinomycetes 0 1000 Число родов Рисунок 11 - Представленность родов грибов Ascomycota в GenBank Agaricomycetes Agaricostilbomycetes Atractiellomycetes Classiculomycetes Cryptomycocolacomycetes Cystobasidiomycetes Помещены в Dacrymycetes Entorrhizomycetes GenBank Exobasidiomycetes Отсутствуют в Incertae sedis Microbotryomycetes Genbank Mixiomycetes Pucciniomycetes Tremellomycetes Ustilaginomycetes Wallemiomycetes 0 50 100 150 200 250 300 350 Число родов Рисунок 12 - Представленность родов грибов Basidiomycota в GenBank Необходимость использования типовых образцов в разных направлениях микологических исследований неоднократно отмечалась многими авторами, в том числе и в виде открытых писем всему научному сообществу (Agerer et al., 2000;

Hawksworth, 2004b;

Romano et al., 2005). В периодической литературе многие исследователи, приводя номера изученных молекулярно-генетическими методами штаммов, часто не указывают, являются они типовыми (аутентичными) или нет (Tang et al., 2007), часто вообще не приводят обозначения исследованных образцов, указывая лишь Accession Numbers GenBank (Padovan et al., 2005). Следствием такого невнимания к обозначению типа является неопределенность таксономического значения сравнительных данных по молекулярно-генетическим исследованиям. Для уточнения статуса исследованных образцов необходимо проводить довольно трудоемкую сверку их номеров с соответствующими каталогами коллекций или гербариев, что возможно только в случае их существования в открытом доступе. Определение числа исследованных молекулярно-генетическими методами номенклатурных типов для грибных таксонов, имеющих отношение к живым культурам, до сих пор практически невозможно оценить из-за отсутствия в базе данных GenBank специального обязательного поля для внесения обозначения статуса образца (тип/не тип).

Сравнение таксономического разнообразия GenBank и Index Fungorum позволило выявить ряд видовых наименований (примеры которых приведены в таблице 5), отсутствующих в базах Index Fungorum и MycoBank, но имеющихся в GenBank. При этом ни для одного из приведенных в таблице таксонов в описании последовательности нет указания на статус исследуемого образца, а именно, является ли он типовым. По устному сообщению куратора Index Fungorum Пола Керка (Paul Kirk) очередь на внесение в базу данных составляет практически постоянно почти 1000 видовых наименований. Это еще раз подтверждает необходимость взаимодействия разных баз данных и координации прилагаемых усилий их кураторов. Совместно с сотрудниками StrainInfo (Бельгия) и Fungal GenBank Taxonomy Group (NIH/NLM/NCBI) нами была проведена работа по настройке взаимодействия в системе:

«GenBank/Taxonomy/Accession Numbers of Fungi Таксономическая база по грибам ВКМ StrainInfo.net/ex-type fungal cultures» для интеграции информации в отношении типовых культур для видов грибов.

Таблица 5 – Примеры таксонов, информация о которых есть в GenBank, но отсутствует в номенклатурных базах (на 10.07.2012 г.) Номер в Название вида Таксономическое описание в GenBank NN GenBank 1 Appendicheirospora EF584526 Diaporthales;

mitosporic Diaporthales;

graminicola Appendicheirospora 2 Ascobrunneispora AF177154 Sordariales;

Annulatascaceae;

Ascobrunneispora.

aquatica 3 Ascocollumdensa AF132325 Sordariales;

Annulatascaceae;

Ascocollumdensa.

aquatica 4 Cateractispora AF177153 Sordariales;

Annulatascaceae;

Cateractispora recepticuli FungalDC - база данных о разнообразии грибов в коллекциях мира Практически ни одна из крупных коллекций мира в настоящее время не дает на своих ВЕБ-сайтах полного списка поддерживаемых видов, предоставляя возможность пользователю искать нужные культуры по отдельным запросам на каждое требуемое наименование. Поиск необходимого наименования на ВЕБ-сайте WDCM по спискам отдельных коллекций требует крайне длительного времени, поскольку здесь возможен просмотр только отдельных страниц, каждая из которых содержит по 30 видовых наименований, расположенных в алфавитном порядке. Кроме этого до сих пор полностью отсутствуют сведения о разнообразии коллекций культур грибов по таксонам в ранге выше вида и рода – от семейства до царства. В связи с этим нами была разработана собственная специализированная база данных FungalDC (Fungal Diversity in Culture Collection), способная стать справочной системой о поддерживаемых в различных коллекциях мира видах мицелиальных грибов и дрожжей, работающая в системе открытого доступа (on-line). База данных содержит информацию по следующим разделам:

- разнообразие видов грибов в коллекциях мира (по данным WFCC, по электронным каталогам различных коллекций, а также по опубликованным печатным или размещенным в интернете спискам видов грибных культур, имеющихся в работе у отдельных лабораторий);

- типовые культуры (ex-type cultures) видов/внутривидовых таксонов в коллекциях мира (согласно данным Straininfo и каталогам различных коллекций);

- молекулярно-генетические исследования грибных таксонов (мицелиальные грибы и дрожжи) - их таксономическое разнообразие в GenBank;

- присвоение разным таксонам групп риска согласно классификациям, одобренным в различных странах (в соответствии с международными стандартами и регулирующими документами отдельных стран) и международных организациях (Всемирная организация здравоохранения, Европейский Союз).

Разработанная база данных объединила разнообразие видов в GenBank с классификацией высших таксонов и с информацией о доступности типовых культур в коллекциях мира. FungalDC доступна на сайте ВКМ и в режиме реального времени дает информацию для каждого вида гриба через линки на такие источники, как Index Fungorum, MycoBank, GenBank и StrainInfo. Кроме того, существует возможность быстро найти информацию о местонахождении типовой культуры для определенного вида в различных коллекциях культур. В настоящее время объем FungalDC составляет более 74000 записей. Количество внесенных данных постоянно увеличивается в соответствии с периодическими обновлениями. Структура включенной информации представляет перечень всех наименований родов по Dictionary of the Fungi (2008) - более 16000, более 23000 видов грибов (3733 рода) в 287 коллекциях культур мира, более 22000 таксонов в GenBank. Поисковая система (рисунок 13) представлена в двух вариантах – поиск названия для перехода в известные информационные системы по грибам – Index Fungorum, MycoBank, GenBank, Straininfo и поиск названия в коллекциях культур. Особенностью созданной нами информационной системы в отличие от имеющихся известных в мире баз данных является возможность перехода от каждого видового наименования гриба в FungalDC на соответствующее поле каждой из перечисленных на рисунке 14 баз данных. Некоторые функции Straininfo совокупно близки к FungalDC. Однако наша система одновременно охватывает значительно больший спектр коллекций и предоставляет связь с номенклатурными базами.

Рисунок 13 – Поиcковая страница FungalDC на сайте ВКМ (www.vkm.ru) Рисунок 14 - Схема взаимодействия баз данных в FungalDC Из базы данных FungalDC можно перейти к каждой конкретной коллекции в базе данных WDCM. Именно эта возможность была использована Микобанком, который в настоящее время на странице каждого таксона сделал ссылку на FungalDC в разделе «Specimens and strains links, «All-Russian Collection of Microorganism». База данных WDCM в настоящее время не содержит сведений о конкретных номерах штаммов, а названия видов указаны так, как они приводятся в коллекциях, что является причиной определенных неточностей и опечаток. В нашей системе все названия родов и видов уже выверены по Index Fungorum.

Кроме предоставления необходимой различной информации из разных источников, FungalDC позволяет вести анализ имеющейся в ней информации. Это особенно интересно, так как обобщение получаемых ответов на различные запросы, дает возможность оценить насколько имеющееся в коллекциях таксономическое разнообразие использовано для получения молекулярно-генетических характеристик отдельных таксонов или в каких-либо прикладных исследованиях. Так, нами было проведено сравнение объемов различных родов мицелиальных грибов (по числу видов, указанных в Dictionary of the Fungi, 2008) c видовым разнообразием этих родов в коллекциях культур и в GenBank (рисунок 15). Полученные данные показали, какие из таксонов на уровне рода практически не изучены с помощью молекулярно-генетических методов, что дает возможность при планировании проведения фундаментальных исследований по систематике отдельных групп грибов обратить на них больше внимания. При этом можно сразу оценить возможность проведения работ на должном уровне, получив информацию о доступности типового материала или референтных штаммов для каждого нужного вида.

Более наглядно картина, выявляющая «белые пятна» в изучении различных видов грибов с помощью FungalDC показана на рисунке 16. Отчетливо видны незаполненные названиями баз данных участки для перечисленных видов грибов. Таким образом, можно сразу увидеть, для каких из представленных таксонов отсутствует информация по таксономии, номенклатуре или молекулярно-генетическая характеристика, т.е. какие виды больше других нуждаются в изучении. Переход на страницы коллекций культур или в систему StrainInfo даст необходимую информацию о наличии нужных штаммов и контактных сведениях по конкретным коллекциям, из которых их можно получить.

Наличие возможности получения подобной информации имеет большое значение для оценки состояния изученности отдельных таксонов и позволяет направленно вести работу по изучению отсутствующего в GenBank типового материала. Таким образом, нами создана «рабочая площадка», которая, несомненно, будет способствовать дальнейшему повышению эффективности работ по идентификации грибов и развитию системы классификации.

База данных Fungal DC прошла государственную регистрацию, о чем имеется соответствующее свидетельство. Параметры и описание FungalDC приведены в приложении 2.1 к диссертации. В результате работы впервые был создан Указатель мирового коллекционного фонда грибов, доступный на сайте ВКМ (www.vkm.ru).

Объем этого Указателя в настоящее время составляет 24897 наименований мицелиальных грибов и дрожжей. Полученные в результате данной работы материалы, стали основой информационно-справочной системы по грибам в коллекциях культур, особенностью которой является взаимодействие FungalDC с известными базами данных по грибам, такими как IndexFungorum, MycoBank, GenBank и StrainInfo, что позволяет считать ее единой справочной системой по грибному разнообразию мирового коллекционного фонда.

0 1000 2000 3000 Acremonium Alternaria Aspergillus Candida Ceratocystis Cercospora Всего известных видов Chaetomium Fusarium Число видов в коллекциях Mucor Число видов в GenBank Mycosphaerella Nectria Penicillium Phoma Phomopsis Pichia Polyporus Poria Pythium Saccharomyces Рисунок 15 - Представленность видов отдельных родов грибов в GenBank, Index Fungorum и коллекциях мира Наличие такой информации позволит заинтересованным исследователям отыскать среди множества коллекционных каталогов культуру необходимого для решения требуемой задачи вида, что, безусловно, будет иметь большое значение для проведения теоретических и прикладных исследований. Создание источника обзорной информации по культурам грибов, несомненно, может содействовать соотнесению морфо-физиологических и молекулярно-биологических сведений по грибам, что, в свою очередь, позволит выявить наиболее узкие места в классификации и филогении грибов, направить усилия исследователей в наиболее интересные точки для приложения, уточнить логику проводимых изысканий. Подтверждением того, что разработанная нами система достаточно востребована пользователями, служат данные статистики по сайту ВКМ (рисунок 17).

Рисунок 16 - «Белые пятна» в изучении различных видов грибов с помощью FungalDC Рисунок 17 – Статистика запросов по FungalDC Показано, что количество скачанной информации составляет более 120 МБ, а число просмотров страницы FungalDC достигло в мае-июне 2012 года 180000 в месяц.

Информационное сопровождение коллекции мицелиальных грибов ВКМ Деятельность специалистов ВКМ, касающаяся биоинформатики, является одним из важных направлений коллекционной работы и связана с реализацией задач по созданию в перспективе на базе ВКМ Биологического ресурсного центра - коллекции культур новой генерации, а также с интеграцией ВКМ в существующие и создаваемые мировые информационные сети Центров биологических ресурсов (рисунок 18), такие как Всемирная федерация коллекций культур, Straininfo и Глобальный каталог микроорганизмов (GCM).

Рисунок 18 - Схема включения ВКМ в существующие мировые информационные сети В ВКМ разработана (рисунок 19) информационная система, которая состоит из курируемых баз данных, связанных между собой. Практически все из них в настоящее время открыты для пользователей на сайте ВКМ. Каталог коллекционного фонда представлен в нескольких форматах, включая два варианта поисковой системы – по названию организма и по номеру штамма.

База данных «Фонд мицелиальных грибов Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ РАН» - это база данных о штаммах мицелиальных грибов, включенных в фонд ВКМ. Число записей в базе данных составляет более четырех тысяч (4268) и равно количеству поддерживаемых в коллекции культур грибов. База данных периодически обновляется, обеспечивая пользователей сведениями о номенклатуре, таксономии, различных биотехнологически перспективных свойствах поддерживаемых штаммов, а также о методах их культивирования и длительного сохранения в искусственных условиях. Для того, чтобы база данных могла использоваться исследователями разных стран мира, все данные о штаммах приведены на двух языках – русском и английском. База данных содержит таблицы и формы, позволяющие быстро обрабатывать собранные данные и обновлять имеющиеся. Таблицы дополнены большим списком запросов, помогающих исследовать накопленное информационное пространство в различных сечениях и комбинациях. База данных «Фонд мицелиальных грибов ВКМ ИБФМ РАН» и комплекс программ для организации ее работы на сайте ВКМ (www.vkm.ru) прошли государственную регистрацию, о чем имеются соответствующие свидетельства. Параметры и описание базы данных «Фонд мицелиальных грибов ВКМ ИБФМ РАН» приведены в приложении 2.2 к диссертации.

Рисунок 23 - Информационная система ВКМ Глава 3 Грибы в связи с проблемами биологической безопасности Использование культур грибов и в научных исследованиях, и в технологических разработках требует особого внимания к вопросам биологической безопасности.

Необходимо отметить, что русскоязычное определение «биобезопасности», по сути, объединяет два понятия, которые переводятся на английский как «biosafety» и «biosecurity». «Biosafety» – это защита лабораторного персонала и окружающей среды от вредного случайного воздействия патогенных микроорганизмов, а «biosecurity» – предотвращение несанкционированного специального использования патогенных микроорганизмов, в том числе и с целью создания биологического оружия. Выполнение условий по обеспечению биобезопасности при работе с грибами необходимо в связи с существующими правилами и нормами, такими как:

- санитарные правила по работе с патогенными и условно-патогенными культурами грибов в лаборатории и их передаче в другие учреждения (Санитарно эпидемиологические правила…, 2003;

Санитарно-эпидемиологические правила…, 2008);

- карантинные ограничения по ввозу грибов на территорию Российской Федерации и вывозу их за пределы России (Перечень вредителей…, 2007);

- международные обязательства России по нераспространению потенциально опасных грибов, способных быть использованными в качестве биологического оружия (Список возбудителей…, 2001);

- рекомендации по упаковке живых культур мицелиальных грибов и транспортировке их с помощью отечественных и международных почтовых служб (Иванушкина с соавт., 1997;

International Regulations…, 2008).

Категоризация биологического риска Для каждого отдельного государства или конкретного региона Земного шара Всемирная Организация Здравоохранения (Laboratory Biosafety Manual…, 2004) рекомендует проводить обязательную разработку национальной или региональной классификации микроорганизмов по группам биологического риска, которая должна учитывать: 1) патогенность организма, 2) пути передачи инфекции и специфику организма-хозяина, 3) доступность и эффективность профилактических мероприятий на местах, 4) доступность эффективного лечения на местах – пассивная иммунизация, вакцинация после инфицирования, использование противомикробных и химиотерапевтических средств с учетом возможности появления резистентных штаммов. В тексте диссертации подробно рассмотрены определения уровней биологического риска, принятых в различных странах мира и разными международными организациями, связанными с этой проблемой в сравнении с категоризацией патогенных и условно-патогенных грибов в соответствии с российским законодательством.

Таксономическое разнообразие патогенных и условно-патогенных грибов В процессе выполнения данной работы был проведен анализ информации, опубликованной в нормативных документах разных стран мира по биологической безопасности, связанной с мицелиальными и дрожжевыми грибами. В структуру созданной базы данных вошли поля, содержащие сведения по номенклатуре потеницально опасных видов, группе патогенности, объекту инфекции, названию и симптомах болезни, пути инфицирования, жизнеспособности возбудителя в природных условиях, особенностям географического распространения и библиографии, а также сведения по таксономической принадлежности каждого вида – подцарство, класс, отдел, порядок, семейство, род, вид и внутривидовые таксоны. Основное внимание было уделено вводу полного списка известных для каждого конкретного организма номенклатурных синонимов. Это позволяет использовать полученную информацию для предотвращения возможного применения патогенных грибов в биотехнологии, сельском хозяйстве и других видах деятельности человека на ранних стадиях разработки соответствующих технологий.

На основании литературных данных был проведен анализ видов мицелиальных грибов и дрожжей, включенных в официальные списки групп риска различных стран мира – России, Бельгии, Германии, Голландии, Великобритании, США, Швейцарии, Австралии и Новой Зеландии, Сингапура (Directive 2000/54/ec, 2000;

De Hoog et al., 2000;

Liste Risikobewerteter…, 2001;

Biosafety…, 2009;

Safety in Laboratories, 2002;

Санитарно-эпидемиологические правила…, 2008;

Сергеев, Сергеев, 2003;

Approved List…, 2004;

Guidelines on the Import…, 2004;

Herausgegeben vom Bundesamt…, 2004;

Belgian Cassifications…, 2006). Известно, что общее количество видов, относящихся к патогенным формам, по данным разных авторов различается, но быстро увеличивается со временем и сейчас уже насчитывает по нашим данным более тысячи видов.

Обобщенные данные о разнообразии патогенных и условно патогенных грибов представлены в таблице 6. Общий список видов насчитывает, таким образом, более пятнадцати тысяч наименований. Показано, что основная часть этой группы грибов относится к сумчатым грибам и их анаморфам. Анализ проведен с использованием базы данных Index Fungorum, данные представлены на 30.06.2011 г.

Таблица 6 - Таксономическое разнообразие патогенных грибов Царство Подцарство Число родов Число видов Chromista Oomycota 2 Fungi Zygomycota 20 Fungi Basidiomycota 33 Fungi Ascomycota 224 Всего 279 Особый интерес для исследователей в области медицинской микологии могут представлять сведения о том, насколько велико разнообразие чистых культур патогенных и условно-патогенных грибов, поддерживаемых в специализированных коллекциях и доступных для заинтересованных пользователей. Типовые и аутентичные культуры могут быть использованы для проведения сравнительных тестов при диагностических исследованиях или для проведения каких-либо других лабораторных работ прикладного характера. Оценка таксономического разнообразия поддерживаемых в коллекциях патогенных грибов была проведена на основе общего разнообразия фонда грибов в коллекциях WDCM.

При рассмотрении вопроса о таксономическом разнообразии имеющихся списков патогенных видов и представленности этих видов в коллекционных фондах, необходимо иметь в виду тот факт, что в разных документах и каталогах один и тот же вид может одновременно поддерживаться под разными наименованиями, которые могут соответствовать различным стадиям жизненного цикла (таблица 7) или являться синонимами одного вида.

Таблица 7 - Категоризация грибов по разным стадиям жизненного цикла Группа Группа Телеоморфа Анаморфа риска* риска Trichophyton Arthroderma gertleri X/IV III/IV vanbreuseghemii Arthroderma gloriae X Trichophyton gloriae III/IV Debaryomyces hansenii var. fabryi IV Candida famata var. flareri X Eurotium herbariorum X Aspergillus glaucus III/IV Hypocrea aurantiaca X Trichoderma viride III/IV Примечание:

*X - уровень риска для этих видов не определен, однако при работе с ними необходимо придерживаться санитарных правил, определенных национальным законодательством (Швейцария, Guidelines.

Classification …, 2004) Интересная ситуация возникает когда один и тот же организм имеет названия и разных стадий – телеоморфы и анаморфы, и названия их синонимов (таблица 8).

Необходимость решения проблемы использования при категоризации риска различных названий одних и тех же организмов привела к принятию Европейским Союзом специальной Директивы (European Union, 2000), в которой указано, что в официальных списках патогенных видов должны использоваться только современные данные по таксономии и номенклатуре. Это очень существенно, поскольку избавляет пользователя от необходимости сопоставления новых и уже давно устаревших названий.

Таблица 8 - Варианты представления одного гриба в каталогах разных коллекций Группа Группа Название телеоморфы Название анаморфы риска риска Pseudallescheria boydii III/IV Scedosporium apiospermum III/IV Monosporium Synonym Allescheria boydii - Synonym apiospermum В течение длительного времени (с 1980 года) российские списки групп патогенности не пересматривались. В мае 2008 года эта ситуация изменилась и в настоящее время в России действуют новые официальные списки патогенных грибов (Санитарно-эпидемиологические правила…, 2008). При этом категоризация опасных грибов практически не изменилась. В отличие от зарубежных классификаций, в РФ продолжает существовать понятие «патогенность», а не группа риска. В связи с этим, все грибы, включенные в списки групп патогенности, автоматически считаются патогенными, что не соответствует действительности не только в части 4-ой группы, но и третьей. В связи с этим нами был проведен анализ таксономического разнообразия патогенных и условно-патогенных грибов по официальным документам различных стран мира в сравнении с Санитарными правилами России (таблица 9).

Таблица 9 - Разнообразие патогенных грибов второй группы патогенности, соответствующей уровню риска (Risk group 3) Виды грибов Страны* 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 V V V V V V V V V Blastomyces dermatitidis Cladophialophora arxii V V Cl. bantiana V V V V V V V Cl. carrionii V Cl. devriesii V Cladosporium trichoides V V V V V V V V V V V V Coccidioides immitis C. posadasii V V Cryptococcus neoformans V V Cr. gattii (syn. Cr.

V V neoformans var. gattii) Cr. neoformans var. grubii V Cr. neoformans var.

V V neoformans Dactylaria gallopava V V Epidermophyton spp. V Exophiala dermatiditis V Fonsecae pedrosoi V Histoplasma capsulatum V V V V V V V V V V V var. capsulatum H.dubosii (syn. H.capsulatum V V V V V V V V V var. dubosii) H. capsulatum V V V V V var. farciminosum Microsporum spp. V Paracoccidioides V V V V V V V V V brasiliensis Penicillium marneffei V V V V V Rhinocladiella mackenziei V Sporothrix schenckii V Trichophyton spp. V Примечание:

* Названия стран и ссылки на использованные документы: 1. - РФ (2008);

2 - Великобритания (2004);

3 – EU (2000);

4 – Швейцария (2004);

5 – Сингапур (2004);

6 – Бельгия (2006);

7 – Германия (2001);

8 - США (2011);

9 – Нидерланды (2009);

10 - Южная Корея (2005);

11 – Канада (2009).

Виды грибов третьей и четвертой групп патогенности по российским правилам в сравнении с соответствующими группами риска зарубежных официальных документов представлены в приложении 3 к диссертации (в связи с большим объемом материала).

Глава 4 Методы хранения и опыт поддержания фонда грибов ВКМ Проблема надежного сохранения культур грибов возникает практически сразу после выделения свежих изолятов из природных источников и установления их научной и практической значимости. Известно, что физиологические и генетические нарушения, возникающие в чистых культурах грибов при неверно выбранном методе хранения, могут стать причиной значительных экономических потерь в биотехнологии или неудач при проведении научных исследований. Гарантированное сохранение жизнеспособности грибов в течение длительного времени достигается различными способами. В настоящее время разработано большое число доступных методов консервации. В диссертации подробно описаны достоинства и недостатки различных методов хранения грибов, различающихся по сложности воспроизведения и используемой технической базе.

На основе многолетних результатов по сохранению фонда мицелиальных грибов ВКМ в жизнеспособном состоянии разработана база данных, позволяющая получить сведения о максимальных сроках сохранения культур разных видов различными методами, как традиционными (периодические пересевы, хранение под минеральным маслом, под водой, в почве), так и более современными (методы криоконсервации лиофилизация и замораживание, в том числе на инертных носителях).

Опыт хранения мицелиальных грибов в ВКМ Для гарантированного сохранения всех имеющихся таксонов коллекционного фонда обязательным является применение разных способов хранения для каждого штамма параллельно. Международными стандартами, разработанными для Биологических ресурсных центров, рекомендуется максимально возможное использование таких методов как лиофилизация и криоконсервация (Common Access…, 2009). Каждый метод реализуется с использованием конкретных методик, которые подобраны для отдельных штаммов и указаны в каталоге ВКМ в виде буквенно цифрового индекса. Систематически, через определенные промежутки времени ведется контроль за сохранением жизнеспособности, что позволяет оценить длительность гарантированного хранения разных видов микроорганизмов различными методами. В настоящее время для хранения и консервации микроорганизмов фонда используется группы методов: субкультивирование, высушивание, лиофилизация, криоконсервация (таблица 10). Методы хранения, используемые для разных таксономических групп грибов в ВКМ, представлены в таблице 11. Детальная информация по истории штаммов, условиям культивирования и методам их хранения доступна на сайте ВКМ (www.vkm.ru).