Геномно-протеомная характеристика вариабельности helicobacter pylori
На правах рукописи
МОМЫНАЛИЕВ Куват Темиргалиевич Геномно-протеомная характеристика вариабельности Helicobacter pylori 03.00.04 - биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук
Москва - 2009
Работа выполнена в лаборатории постгеномных исследований в биологии ФГУ научно-исследовательского института Физико-Химической Медицины Минздравсоцразвития России
Научный консультант:
доктор биологических наук, профессор Вадим Маркович Говорун
Официальные оппоненты:
академик РАН, доктор биологических наук, профессор Николай Александрович Колчанов член-корреспондент РАМН, доктор биологических наук, профессор Георгий Борисович Смирнов доктор биологических наук, профессор Николай Николаевич Соколов
Ведущая организация: Московский Государственный Университет имени М.В.Ломоносова
Защита диссертации состоится «14» мая 2009 года в часов на заседании Диссертационного совета Д 001.010.01 при НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН по адресу: 119121, г. Москва, Погодинская ул., д.10.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ биомедицинской химии им. В.Н. Ореховича РАМН
Автореферат разослан «» 2009 г.
Учёный секретарь диссертационного совета кандидат химических наук Елена Анатольевна Карпова ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Helicobacter pylori – грамотрицательная, микроаэрофильная бактерия, колонизирую щая слизистую оболочку желудка и ассоциированная с язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки, атрофическими гастритами, аденокарциномой или экстранодальной В-клеточной MALT-лимфомой (Mucosa Associated Lymphoid Tissue).
H. pylori является одним из самых распространенных возбудителей инфекционных заболеваний. Согласно некоторым оценкам, более половины населения мира инфицированы этим микроорганизмом. Инфекция H. pylori часто не имеет клинических проявлений. Только у определенной части инфицированных (10–15%) с течением времени появляются клинически значимые симптомы болезни: развивается хронический гастрит, язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки, рак желудка. В 2005 г. первооткрыватели бактерии, Робин Уоррен (Robin Warren) и Барри Маршалл (Barry Marshall), были удостоены Нобелевской премии по физиологии и медицине «за открытие бактерии Helicobacter pylori и ее роли в развитии гастрита и язвы желудка» (Marshall, Warren, 1984;
Warren, 1983;
Marshall, 1996).
Интенсивное изучение H. pylori показало, что у 80% больных, страдающих раком желудка, в анамнезе была зафиксирована инфекция H. pylori (Peterson, 1991;
Parsonnet, 1994;
Forman, 1991;
Watanabe, 1997;
Correa, 1996;
Peek, 2001). Это явилось одной из причин, по которым в 1995 г. Международная ассоциация по изучению рака (IARC, ВОЗ), признала H. pylori канцерогеном 1-го класса. Эпидемиологические и серологические исследования показали, что клиническая картина заболеваний, вызываемых H. pylori, во многом зависит от факторов вирулентности, таких как CagA, VacA, IceA и BabA. Однако тесной связи между определенным генотипом H. pylori (различные комбинации аллелей vacA, cagA, babA и iceA) и клиническими формами заболеваний желудочно-кишечного тракта пока не обнаружено.
С другой стороны, классификация H. pylori, проведенная с помощью различных методов (вычитающая гибридизация, амплификация со случайными праймерами, пульс электрофорез), выявила значительную межштаммовую гетерогенность этой бактерии и показала, что каждый инфицированный индивид является носителем уникального штамма H. pylori.
В отличие от многих других бактерий, в изолятах H. pylori идентичные аллели генов очень редко встречаются. Экстраординарная генетическая гетерогенность H. pylori впервые показана Кансау и соавт. в 1996 г. Было продемонстрировано, что среди 29 клинических штаммов H. pylori нуклеотидная последовательность ureC является уникальной для каждого штамма. В настоящее время уникальность нуклеотидных последовательностей в H. pylori подтверждена на большом количестве генов: cagA, vacA, flaA, flaB, cysS, ureI, trpC и др.
Приблизительно 5%-ая нуклеотидная дивергенция обычно наблюдается для большинства генов между парой неродственных H. pylori штаммов (Wang, 1999;
Suerbaum, 1998). Для сравнения, гомология ДНК между Salmonella typhimurium и Salmonella typhi составляет ~98– 99% и ~85% между S. typhimurium и Escherichia coli. С помощью ДНК-матриц показано, что уровень макровариабельности генома H. pylori на уровне генов может доходить до 25–30% от всех ОРС (Salama et al. 2000;
Gressmann et al. 2005;
Han et al. 2007).
Таким образом, в данное время сложилась парадоксальная ситуация, когда значительная генетическая вариабельность и разнообразие H. pylori достоверно зарегистрированы, а механизмы, обеспечивающие это разнообразие и его значение в процессе адаптации к хозяину и патогенезе, еще не полностью раскрыты. Очевидный дефицит генов в геноме H. pylori, участвующих в процессах рекомбинации/репарации, предполагает вероятное объяснение генетического разнообразия высокой скоростью мутаций, но только немногие из генов, участвующие в этих процессах функционально охарактеризованы. Также необходимо признать, что причины, обусловливающие почему H. pylori, которая обладает естественной компетентностью, способна импортировать только небольшие фрагменты чужеродной ДНК, неизвестны. Скорость дивергенции H. pylori внутри организма хозяина также остается предметом острых дискуссий. Если по данным Д. Фалуша и его коллег (2001) штаммы H. pylori последовательно выделенные от одного пациента через определенные промежутки времени, варьируют достаточно сильно, то А. Люндин (2005) показал, что последовательно выделенные штаммы изменяются незначительно или вообще не меняются, по крайней мере за 9 лет.
Поэтому поиск естественных причин, обусловливающих гетерогенность штаммов H. pylori, является актуальной задачей, решение которой позволит проследить зависимость между генетической вариабельностью и выживаемостью бактерии в организме индивидуального хозяина и развитием патологических процессов на слизистой оболочке желудка.
Цели исследования Оценка структурной и функциональной вариабельности штаммов H. pylori, выделенных на территории России и поиск возможных причин изменчивости бактерии.
Задачи исследования 1. Охарактеризовать аллельную гетерогенность штаммов H. pylori, выделенных у пациентов, живущих на территории России.
2. Разработать ДНК-макроматрицы H. pylori для проведения сравнительного геномного и транскрипционного анализа клинических штаммов H. pylori.
3. Разработать алгоритм поиска горизонтально перенесенных генов в геноме H. pylori на основе гауссовской статистики.
4. Охарактеризовать функциональную гетерогенность H. pylori штаммов при раннем раке желудка и хроническом гастрите и реконструировать молекулярно-генетические взаимодействия дифференциально экспрессирующихся белков H. pylori при этих заболеваниях.
5. Разработать методику оценки степени метилирования генома H. pylori на основе ДНК-макроматриц и белка Каизо (Kaiso).
6. Оценить «вклад» процессов метилирования-дезаминирования ДНК в генетическую вариабельность H. pylori.
7. Разработать микрофлюидный чип для мониторинга жизнедеятельности единичных клеток в бактериальной популяции.
Научная новизна Впервые определена популяционная принадлежность штаммов H. pylori на территории России. Показано, что штаммы H. pylori, выделенные от европейцев, принадлежат к одной европейской (hpEurope) популяции. Среди штаммов H. pylori, выделенных от представителей различных этнических групп, проживающих компактно на Азиатской территории России, обнаружена новая субпопуляция H. pylori – hspSiberia, входящая в популяцию hpEastAsia.
Также среди выделенных образцов встречались изоляты H. pylori, принадлежащие к субпопуляции hspAmerind. Ранее H. pylori с этим гаплотипом была выделена от индейцев Северной Америки. Полученные данные позволили предположить пути распространения бактерии в Америку через Аляску.
Впервые описана функциональная гетерогенность H. pylori штаммов при раннем раке желудка и хроническом гастрите и проведена реконструкция молекулярно-генетических взаимодействий дифференциально экспрессирующихся белков H. pylori при этих заболеваниях. Показано, что основную часть вариабельных белков при адаптации бактерии к новым условиям в биологической нише составляют белки-антиоксиданты, белки цикла трикарбоновых кислот и белки теплового стресса, при этом выброс генов и мутации в них не являются приспособительными реакциями H. pylori в этих условиях.
Для оценки функциональной вариабельности H. pylori популяции разработан микрофлюидный чип, выполненный из оптически проницаемого полиметилметакрилата, состоящий из сети микрофлюидных каналов с ячейками, ввод пробы в которые осуществляется с помощью перистальтического насоса.
Впервые был проведен сравнительный анализ геномов рифампицинустойчивых штаммов H. pylori. Показано, что при адаптации бактерии к антибиотику происходит накопление мутаций, не связанных и/или не обеспечивающих антибиотикоустойчивость.
Предполагается, что обнаруженные мутации в рифампицинустойчивых H. pylori штаммах являются следствием отбора гипермутабельных клеток.
Практическая значимость Для практического использования разработан способ определения степени метилирования генома H. pylori на основе ДНК-макроматриц и белка Каизо. Данный подход может быть использован для оценки степени метилирования генома других бактерий. Были сконструированы рекомбинантные плазмиды для клонирования промоторных областей генов и разработана методика инактивация генов в H. pylori. Для проведения сравнительного геномного и транскрипционного анализа клинических штаммов H. pylori были сконструированы ДНК-макроматрицы. Разработанные методики могут быть использованы для поиска новых факторов вирулентности H. pylori.
Для предсказания горизонтально перенесенных генов (штаммоспецифических) в геноме H. pylori был разработан алгоритм учитывающий корреляцию между компонентами вектора атрибутов и базирующийся на робастном методе. Точность предсказания чужеродных генов с помощью этого метода составила 99%. Кроме того, в 25–40% случаях разработанный классификатор правильно определял источник добавленных генов.
Разработанный алгоритм может быть использован для поиска чужеродных генов в других микроорганизмах.
Для мониторинга жизнедеятельности единичной бактериальной клетки был разработан микрофлюидный чип, элементом которой являются единичные клетки, несущие рекомбинатные плазмиды с репортерной системой на основе GFP белка и промоторными областями генов в качестве сенсоров. Результаты исследований использовались при выполнении работ по Государственному контракту с Федеральным агентством по науке и инновациям № 02.447.11.3003 «Разработка биологических датчиков, созданных на основе микроорганизмов с ограниченной емкостью генома, для диагностики патологий человека» и № 02.512.11.2038 «Эпигенетические факторы регуляции вирулентности патогенного микроорганизма Helicobacter pylori».
Теоретические положения и результаты диссертационной работы используются в курсах лекций по молекулярной медицине в Московском Физико-Техническом институте и Российском государственном медицинском университете. По результатам работ поданы заявки на патент на изобретение: «Бактериальный сенсор для диагностики» (№ заявки 2008127479), «Способ масштабной оценки частоты транзиций в сайтах метилирования бактерий» (№2008127480), «Способ предсказания чужеродных генов в бактериях» (№2008127481) и «Способ раздельного выделения одно- и двунитевых нуклеиновых кислот на силикатных матрицах» (№2008137197). Разработаны и внедрены в серийное производство диагностические ПЦР-наборы (НПФ «Литех», г.Москва) для генотипирования H. pylori в биопсиях слизистой оболочки желудка: «Хеликопол СА», «Хеликопол VА», «Хеликопол IA», «Хеликопол ВА».
Апробация результатов работы. Основные результаты работы были представлены на научных конференциях и симпозиумах, в том числе: 11-м симпозиуме Международного общества по микробной экологии (ISME) в 2006 г, 4-м Международном семинаре «Российские технологии для индустрии» (Санкт-Петербург, 2000 г), международных конференциях Европейской группы по изучению хеликобактера (Рим, 2001 г;
Стокгольм, 2003 г., Рига, 2008 г.), 4-й Международной конференции Организации «Протеом человека» (Мюнхен, 2005 г.), 1-й и 2-й Международной научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2004 г, 2008 г), Российских национальных конгрессах "Человек и лекарство" (Москва 2003 г., 2004 г).
За работу «Сравнительный анализ транскрипционных профилей штаммов Helicobacter pylori» в 2005 г. была присуждена премия ООО МАИК “Наука/Интерпериодика” за лучшую публикацию в издаваемых ею журналах.
Материалы диссертационной работы отражены в 31 публикациях: 18 статьях и материалах российских и международных научных конференций.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов работы и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на страницах, содержит 50 рисунков и 36 таблиц. Список литературы включает 426 источников.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Штаммы Н. pylori и их культивирование Лабораторные штаммы Н. pylori 26695 (№ ATCC 700392) и J99 (№ 700824) были любезно предоставлены проф. М. Ахтманом. (Институт инфекционной биологии им. Макса Планка, Германия). Клинические штаммы Н. pylori выделяли из биопсийного материала (биопсии слизистой оболочки антрального отдела желудка), полученного от пациентов европеоидной расы с язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки и хроническим гастритом из Москвы и Московской области, Красноярска, Уфы, Казани, Новосибирска, Ярославля, Ростова-на-Дону и Санкт-Петербурга, а также из биопсийного материала полученного в ходе профилактического осмотра (с информированного согласия) представителей народностей теленгитов, бурятов, чукчей, эвенов, эвенков, кетов, хантов, коряков, удегейцев, монголов, нанайцев, ненцев, нивхов, тувинцев и якутов. Штаммы H. pylori от пациентов с ранним раком желдука (РР) и хроническим гастритом (ХГ) выделяли совместно с д.м.н. С.В. Кашиным (Областная онкологическая больница г. Ярославля). Всего в ходе работы было выделено 619 клинических штаммов Н. pylori.
Биопсийный материал высевали на среду Pylori (BioMerieux, Франция). Клинические изоляты H. pylori и лабораторные штаммы 26695 и J99 культивировали на плотной питательной среде, содержащей Колумбийский агар (BioMerieux, Франция), 10% инактивированной лошадиной сыворотки (PAA Lab., Австрия), 5% дрожжевого диализата (ГУ НИИ ЭиМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН) и селективную смесь антибиотиков «Dent» (Oxoid, Англия) в анаэростатах с газогенерирующими пакетами для культивирования микроаэрофилов (BBL, Campy Pak Plus, Becton Dickinson, США) при +37°С.
Морфологически сходные культуры H. pylori идентифицировали с помощью уреазного, оксидазного и каталазного тестов.
Мультилокусное секвенирование штаммов H. pylori Мультилокусный гаплотип клинических штаммов H. pylori устанавливали по нуклеотидным вариациям atpA, efp, mutY, ppa, trpC, ureI и yphC генов (Achtman M., 1999).
Геномную ДНК H. pylori выделяли коммерческим набором Jetflex Genomiс DNA Purification Kit (Genomed, Germany). Определение нуклеотидной последовательности ДНК осуществляли при помощи набор BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems, США) и капиллярного анализатора ABI PRISM 3100 (Applied Biosystems, США) согласно инструкциям фирмы производителя. Данные мультилокусного секвенирования анализировали, с помощью программы MEGA 3.1 и Structure v2.0 (http://pritch.bsd.uchicago.edu/), в которой применен байесовский подход для определения структуры популяции. Для анализа использовали "no ad-mixture” модель, предполагающую, что каждый штамм является потомком одной из N числа популяций и характеризуется определенными частотами встречаемости аллелей каждого локуса. Для мультилокусного секвенирования H. pylori изолятов использовали стандартные праймеры Создание ДНК-макроматриц H. pylori Подбор олигонуклеотидных праймеров для амплификации 1621 открытых рамок считывания генома (ОРС) H. pylori осуществляли с помощью программы ArrayDesigner II (Premier Biosoft International, США) на основе нуклеотидной последовательности генома H. pylori (GenBank Ас. № NC_000915). Амплификацию проводили в 100 мкл реакционной смеси, содержащей 10 мМ Tris/HCl, pH 8.8, 1.5 мМ MgCl2, 50 мМ KCl и 0.1% Triton X-100, 1 U Taq полимеразы, 0.2 мМ каждого dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), 10 пмолей каждого праймера, 0.8 нг геномной ДНК лабораторного штамма H. pylori, в амплификаторе PTC- (MJ Research, США). Далее неочищенные ПЦР продукты наносили на 22 см 22 см сухие нейлоновые мембраны Hybond N+ (Amersham Biosciences, Великобритания) с помощью автоматического репликатора QPix-2 (Genetix, Великобритания) в конфигурации 44. Перед нанесением 30 мкл ПЦР-продуктов разбавляли 5.3 мкл 20 SSC. В качестве контроля гибридизации на мембрану наносили геномную ДНК H. pylori 26695 в шести разведениях (250 пг/мкл, 125 пг/мкл, 62.5 пг/мкл, 31.25 пг/мкл, 15.6 пг/мкл, 7.8 пг/мкл). После нанесения, мембраны помещали на 3M бумагу, смоченную 0.4Н NaOH, 3M NaCl, на пять минут для денатурации ПЦР продуктов, затем мембрану переносили в ванночку с 6 SSC на пять минут для нейтрализации щелочи. Для фиксации ДНК мембраны выдерживали два часа при температуре 80°С. Конечным продуктом являлась нейлоновая мембрана размером 712 см, с иммобилизованными на ней в определенном порядке 1590 ПЦР-продуктами в двух повторах.
Геномное сканирование и транскрипционное профилирование клинических штаммов H. pylori Хромосомную ДНК (25 нг) предварительно метили [-33Р]dATP (3000 Ки/ммоль) с использованием набора Megaprime DNA Labelling Systems (Amersham Biosciences) Тотальную РНК выделяли из клинических изолятов H. pylori с помощью ToTALLY RNA Kit (Ambion, США). мРНК выделяли из двух независимых культивирований каждого клинического изолята H. pylori и использовали в дальнейшем для независимого синтеза кДНК и гибридизации. Меченую кДНК получали с помощью набора cDNA Strip-EZ RT (Ambion) и набора специфических олигонуклеотидов AR-OLHP-RT (Eurogentec), реакционная смесь содержала 1 мкг тотальной РНК и [-33Р]dATP (3000 Ки/ммоль).
Невключившуюся метку удаляли с помощью ProbeQuant G-50 колонок («Amersham»).
Гибридизацию геномной ДНК, выделенной из штаммов на ДНК-макроматрицах проводили в 5 мл свежего 1 гибридизационного буфера, содержащего 5.5106 ипм/мин/мл ДНК зонда в течении 20 часов при 65°С. После гибридизации ДНК-макроматрицы последовательно промывали в 2 SSC, 0.1% SDS, затем 20 мин при 65°С этом же буфере и в 0.2 SSC, 0.1% SDS at 65°C в течение 1 ч. ДНК-макроматрицы экспонировали в течение 48 ч с накопительным экраном (Molecular Dynamics, США), а затем сканировали с помощью Storm 820 (Molecular Dynamics) с разрешением 50 мкм.
Результаты гибридизации анализировали с использованием программы ImageQuant software 5.1 (Molecular Dynamics), J-Express 2.1 (MolMine AS, Норвегия) и Statistica (StatSoft, США).
Дифференциальный двухмерный гель-электрофорез H. pylori изолятов Клеточный осадок (10мкл) растворяли в буфере: 7M мочевина, 2M тиомочевина, 4% CHAPS, 30 mM Tris-HCl, pH 8.5. Концентрацию белков определяли с помощью Quick start Bradford реагентов (Bio-Rad, США) и выравнивали образцы по белку 2 мг/мл. 50 мкг образцов метили 400 пМ Cy3 или Cy5 CyDye DIGE Fluor флуоресцентными красителями (Amersham Biosciences) согласно протоколу производителя. Далее полученные образцы смешивали в равных объемах со 100 мM DTT (Bio-Rad, США) и 2% (о/о) Ampholine 3- (Bio-Rad).
В первом направлении (изоэлектрофокусирование) использовали 4% ПААГ, 9М мочевину и 4% Амфолины (Pharmacia) рН 3-10, либо ИПГ стрипы 3-10 (Bio-Rad).
Изоэлектрофокусирование проводили 14000 Вч по заданной пограмме (2ч-250В, 2ч-450В, 14ч-900В). После проведения изоэлектрофокусирования ИПГ-стрипы или гели вымачивали в растворе, содержащем 125 mM Tris-HCl, 40% (в/о) глицерин, 3% (в/о) ДДС, 65 mM ДДТ, pH 6.8 в течение 15 мин. После этого гель с фокусированными белками переносили во второй полиакриламидный гель с градиентом пористости ПААГ 9–16% и разделяли белки во втором направлении в присутствии 0.1% ДСН. Далее гели сканировали с помощью Typhoon Trio Imager (Amersham Biosciences) с разрешением 200 мкм и анализировали с помощью программы PDQest (Bio-Rad). Дифференциально экспрессированные белковые пятна вырезали из геля, подвергали трипсинолизу и наносили на твердую подложку чипа фирмы Bruker Daltonics, смешивая их с раствором коричной кислоты в этаноле, содержащем 0.1% ТФУ.
Идентификация белков производилась методом пептидного фингерпринта с использованием программного пакета Mascout. Масс-спектры пептидов снимались на приборе MALDI-TOF REFLEX III Bruker Daltonics.
Для верификации данных, полученных с помощью кДНК-макроматриц и протеомики, использовали ПЦР в режиме реального времени.
Микрофлюидный клеточный сенсор Кодирующая часть гена gfp была получена путём обработки плазмиды pEGFP (Clontech, США) эндонуклеазами рестрикции NotI и NcoI (Fermentas, Литва) и после обработки T4 ДНК полимеразой (Fermentas, Литва) клонирована в плазмиду pHel2, обработанную рестриктазой Ecl136II (Fermentas, Литва). В полученную плазмиду pHel2 promotorlessGFP по сайту узнавания рестриктазы BglII (Fermentas, Литва) были встроены комплементарные друг другу олигонуклеотиды 5`-gatcggatccgagctcccggga и 5`-gatctcccgggagctcggatcc, содержащие дополнительные сайты узнавания эндонуклеаз рестрикции BamHI, Ecl136II, SmaI и BglII с образованием плазмиды pHel2-MCS promotorlessGFP.
Предполагаемые промоторные области генов sodB, flgB, rocF, ansB были выбраны, исходя из анализа нуклеотидных последовательностей соответствующих межгенных областей H. pylori штамма 26695. Полученные фрагменты были обработаны эндонуклеазой рестрикции BglII и клонированы в плазмиду pHel2-MCS-promotorlessGFP, также обработанную эндонуклеазой рестрикции BglII, с образованием плазмид pHel2-sod-GFP, pHel2-flg-GFP, pHel2-roc-GFP, pHel2-ans-GFP. Рекомбинантные плазмиды были получены с использованием штамма E. coli DH5. Полученными плазмидами был трансформирован клинический штамм А45 H. pylori: 2–5 мкг плазмидной ДНК добавляли к суспензии 109 клеток, смесь каплями наносили на поверхность твёрдой питательной среды, через двое суток клетки пересевали на селективную среду, содержащую 8 мкг/мл хлорамфеникола.
Использованный в работе микрофлюидный чип (длина, ширина: 61 22 мм) состоял из 5 независимых дорожек, каждая из которых имеет 4 канала (диаметр 50 мкм), содержащих по 20 ячеек (ширина, длина, высота: 100 100 50 мкм). Чип был сделан из полиметилметакрилата (PMMA) методом фотолитографии с последующим термическим связыванием поверхностей. Производство чипов заказывали в компании Epigem (Великобритания). Микрофлюидный чип с помощью пластиковых коннекторов крепится на платформе (Epigem, Великобритания), позволяющей осуществлять ввод пробы с помощью перистальтического насоса 2232 Microperpex S (LKB Bromma, Швеция).
Сеть микрофлюидных каналов промывали 1 PBS буфером (pH 7.4;
KH2PO4 1.7 мM, NaH2PO4 5.2 мM, NaCl 15 мM), вводили раствор PBS, содержащий Lectin tetragonolobus, Lectin T. vulgaris, Concanavalin A, Fibronectin по 50 нг/мл (Sigma, США) и оставляли на ночь при комнатной температуре. Затем микрофлюидные каналы промывали 1 PBS, вводили суспензию клеток H. pylori и инкубировали в течение 3 часов при 37°С. Неприкреплённые клетки смывали средой BHI.
Анализ клеток проводили с помощью флуоресцентного конфокального микроскопа Nikon Eclipse E800 (Nikon, Япония), оборудованного аргоновым лазером 488 нм. Спектры эмиссии регистрировали в диапазоне 522±35 нм. При сравнительном анализе штаммов, содержащих разные рекомбинантные плазмиды, все параметры сканирования оставались неизменными. В работе использовались объектив Plan Fluor ELWD 40/0.60 и 10/0. Интенсивность флуоресценции оценивалась с помощью программы обработки изображений ImageJ (NIH, США).
Скрининг мутаций в рифампицинустойчивых штаммах H. pylori Определение нуклеотидной последовательности геномной ДНК H. pylori (26695m) и двух рифампицинустойчивых штаммов Р1 и Р2, сборка генома и анализ мутаций был выполнен компанией 454 Life Sciences (Branford, США). Подбор олигонуклеотидных праймеров для подтверждения найденных мутаций в H. pylori 26695 и двух рифампицин устойчивых штаммах осуществляли с помощью программы ArrayDesigner II (Premier Biosoft International, США) на основе нуклеотидной последовательности генома H. pylori 26695.
Определение нуклеотидной последовательности ДНК осуществляли при помощи наборов BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems, США) и капиллярного анализатора ABI PRISM 3100 (Applied Biosystems, США) согласно инструкциям фирмы-производителя.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Макро- и микровариабельность H. pylori 1.1. Аллельная гетерогенность штаммов H. pylori. В настоящее время географическое разделение показано для многих патогенов человека, включая вирус JC, Mycobacterium tuberculosis, Haemophilus influenzae. Генетическая гетерогенность H. pylori в пределах вида намного выше, чем для большинства других бактерий и в 50 раз выше, чем у человека. Этот факт, а также высокая частота рекомбинации между различными штаммами H. pylori, позволяют использовать распределение полиморфных нуклеотидов в геноме в качестве маркеров для популяционно-генетического анализа.
Результаты мультилокусного секвенирования российских штаммов H. pylori, выделенных на Европейской территории РФ, анализировали совместно с данными, полученными для 370 штаммов H. pylori, ранее выделенными д-ром Линц Б. (Институт инфекционной биологии им. Макса Планка, Германия) от представителей различных этносов мира и разделенными на четыре популяции: hpAfrical, hpAfrica2, hpEastAsia и hpEurope.
Принадлежность бактериальных штаммов к тем или иным популяциям определяли на основании распределения полиморфных нуклеотидов (1418) всех 392 штаммов. Программа Structure v2.0 предлагает эвристическую оценку вероятности существования N числа популяций (N = 2, 3, 4...), в результате сравнения которых принимается решение об их истинном количестве. Мы проанализировали возможность существования от 2 до бактериальных популяций. Наиболее вероятным оказалось существование четырех (N = 4) популяций, структура которых сохранялась при различном количестве прогонов программы (от 2 до 14).
hpEurope Российские штаммы hpAsia hspAmerinds hspMaori hspEAsia hpAfrica hpAfrica 0. Рис. 1. Филогенетическое дерево, построенное с учетом мультилокусных гаплотипов штаммов H. pylori, выделенных на Европейской территории России Результаты проведенного исследования показали, что все штаммы H. pylori, выделенные на Европейской территории России, принадлежат к одной европейской (hpEurope) популяции (рис. 1). Попытки разделения этого кластера на субпопуляции не увенчались успехом. При моделировании двух или четырех субпопуляций изоляты последовательно подразделялись на одни и те же группы (в случае предположения трех субпопуляций – одна из них не содержала никаких штаммов). Тем не менее, географической зависимости подобного разделения выявлено не было.
hpAsia hspSiberia hspAmerind 0. hspMaori hspEAsia Рис. 2. Филогенетическое дерево, построенное с учетом мультилокусных гаплотипов 347 штаммов H. pylori, выделенных на Азиатской территории России О принадлежности штаммов H. pylori, выделенных в России, к европейской популяции свидетельствует распределение в их геноме прародительских нуклеотидов. Ранее было показано существование нескольких прародительских популяций H. pylori: предковые Africal, Africa2, EastAsia, Europel (AE1) и Europe2 (AE2). По-видимому, штаммы H. pylori, выделенные в современной Европе, являются рекомбинантами между бактериями популяций АЕ1 и АЕ2. Предполагается, что микроорганизмы этих популяций попали в Европу из различных источников: H. pylori популяции АЕ1 преимущественно из Центральной Азии, АЕ2 из Ближнего Востока и Северной Африки. Следует отметить, что нет ни одного изолята из Европы, геном которого содержал бы более 80% прародительских нуклеотидов одной из популяций АЕ1 и АЕ2. Это соотношение характерно и для проанализированных нами российских штаммов H. pylori, причем доли предковых европейских популяций распределены в них равномерно.
На следующем этапе работы для выявления основных путей распространения H. pylori нами были проанализированы штаммы H. pylori, выделенные от различных этнических групп проживающих компактно на Азиатской территории России (http://maps.yandex.ru/russia?upoint=657989278887). Работа была проведена совместно с д-ром Маади А. (Республиканская больница № 1 г. Кызыла, Тува), проф. Ахтманом М. (Институт окружающей среды, Ирландия) и д-ром Мудли Й. (Институт инфекционной биологии им.
Макса Планка, Германия). В результате проведенной работы нами обнаружена новая субпопуляция hspSiberia H. pylori, входящая в популяцию hpEastAsia (рис. 2). Изоляты H. pylori с этим гаплотипом были найдены во всех выделенных группах (всего 141 изолят).
Кроме того, довольно часто среди выделенных образцов встречались изоляты H. pylori, принадлежащие к субпопуляции hspAmerind (174 изолят). Ранее H. pylori с этим гаплотипом были выделены от индейцев Северной Америки. Полученные данные позволили предположить пути миграции бактерии в Америку через Аляску.
1.2. Структурная макрогетероннность H. pylori Разработка ДНК-макроматриц H. pylori. Для изучения структурной гетерогенности изолятов H. pylori был разработан метод полногеномного сканирования на ДНК макроматрицах. Суть метода заключается в иммобилизации интересующих фрагментов известного генома H. pylori на твердой подложке и проведении гибридизации, где в качестве зонда используется меченая ДНК исследуемого штамма микроорганизма (рис. 3).
Рис. 3. Фрагмент гибридизационной картины полногеномной ДНК-макроматрицы H. pylori Оценку ложно-положительных результатов проводили с помощью гибридизации с геномной ДНК штамма J99. Гены, для которых интенсивность сигнала уменьшалась более чем в два раза в экспериментальных штаммах по сравнению с контрольным штаммом, считали отсутствующими. Помимо генов, входящих в функциональное ядро, были получены два неспецифических сигнала, характерные для штамма 26695, что может быть обусловлено перекрестной гибридизацией между геномной ДНК штаммов J99 и 26695. Частота ложно положительных сигналов составила 1.6 %.
Геномное сканирование клинических штаммов H. pylori. Изучена генетическая гетерогеннность 17 выделенных штаммов H. pylori с помощью разработанной ДНК макроматрицы. Генный состав H. pylori штаммов сравнивали с опубликованной нуклеотидной последовательностью генома H. pylori 26695. Показано, что 1272 гена (81% всего генома) встречаются во всех штаммах и образуют функциональное ядро генома (рис. 4). Выявлены также 293 штаммоспецифические ОРС (18.7%), нуклеотидные последовательности которых в исследованных штаммах H. pylori значительно варьируют.
Необходимо отметить, что гомология между 293 штаммоспецифическими ОРС с аналогичными ОРС геномов H. pylori J99 и 26695 составляла 83–98%. Среди штаммо специфических генов H. pylori наиболее представлены ОРС с неизвестными функциями, их доля 71%. Среди остальных штаммоспецифических генов можно выделить гены, регулирующие обмен ДНК между бактериями (системы рестрикции-модификации;
гены, участвующие в транспозиции), а также гены, мембранных белков. Доля генов рестрикции модификации составляет 3–9%, генов транспозиции 2–4% и генов, кодирующих белки внешней мембраны 2–4% от всех штаммоспецифических генов.
Рис. 4. Геномное сканирование штаммов H. pylori.
Слева – увеличенное изображение некоторых участков сканограммы. Cостав (G+C): НР0335 НР0346 –38.4%;
НР0423-НР0466 – 33.3%;
НР0520-НР0548 – 35.6%;
НР0982-НР1028 – 33.2%. Наличие гена отмечено серым цветом, отсутствие – белым.
Штаммоспецифические гены локализованы, в основном в трех достаточно протяженных участках: островке патогенности (НР0520-НР0548) и двух зонах пластичности (НР0423-НР0466 и НР0982-НР1028) (рис. 4). Их доля в этих участках колеблется от 15% (штамм 37) до 44% (штамм 33). В отличие от островка патогенности, распределение штаммоспецифических генов в зонах пластичности не имеет закономерного характера.
Примечательно, что пластичные зоны содержат гены транспозаз (PS3IS, tnpA, tnpB, xerD и traG) и ферментов рестрикции-модификации (hsdR, mod, hsdS, hsdM, mfoKI, hinfIM, mboIIR и bcgIB). По-видимому, эти участки можно рассматривать как участки активной рекомбинации, инсерций и транслокаций. Остальная часть штаммоспецифических генов разбросана случайным образом по геному H. pylori в виде кластеров, содержащих от 1 до генов.
Расположение штаммоспецифических генов в хромосоме H. pylori имеет ряд закономерностей. При сравнении нуклеотидных последовательностей геномов штаммов 26695 и J99 H. pylori обнаружено, что одна из инверсий (фрагмент НР974НР1010 и соответствующая ей инвертированная последовательность НР462НР428) ассоциирована с областью с более низким содержанием G+C (35%), чем в целом геноме (39%). В штаммах 26695 и J99 этот участок, названный «зоной пластичности», содержит 46% и 48% штаммоспецифических генов, соответственно. Присутствие гомологов vir генов и инсерционных элементов также может свидетельствовать о том, что эти участки являются дополнительными островками патогенности (кассета вирулентности) (рис. 5). Как уже отмечалось выше, нами подтверждено, что большинство штаммоспецифических генов действительно локализованы в трех областях (см. рис. 4). По нашему мнению, распределение штаммоспецифических генов по хромосоме указывает на то, что H. pylori использует различные механизмы приобретения и удаления генов. Вполне вероятно, что эти гены могли попасть в геном H. pylori в результате горизонтального переноса.
Рис. 5. Схематическое изображение островка патогенности (патогенный и непатогенный штамм).
Жирным выделены консервативные области генома бактерий. Состав островка патогенности:
ПП – прямые повторы;
vir – гены ассоциированные с вирулентностью;
mob – мобильные элементы;
mob – псевдомобильные элементы. mob-элементы кодируют интегразы, транспозоны, или другие белки, обеспечивающие мобильность генома прокариот.
Полученные нами данные подтверждают концепцию существования вариабельной и постоянной частей генома H. pylori. Очевидно, что вариабельная часть генома формируется благодаря естественной компетентности бактерии, существованию различных механизмов приобретения и элиминации генов, а также внутрипопуляционной рекомбинации.
Разработка классификатора для предсказания горизонтально перенесенных генов в геноме H. pylori. Существенным недостатком исследований по сравнительной геномике различных организмов, проводимых с помощью ДНК-матриц, является использование для их конструирования только известных геномов соответствующих организмов. Другими словами, производится сравнение геномного контента клинического изолята с известным геномом лабораторного штамма бактерии этого же вида. При таком варианте исследований не учитываются уникальные гены, которые могут присутствовать только в клиническом изоляте бактерии. Данное обстоятельство имеет большое значение при изучении таких вариабельных бактерий как H. pylori, где макрогетерогенность выражена сильно. Например, ранее было идентифицировано 1495 ОРС в геноме лабораторного штамма H. pylori J99 и 1590 ОРС в геноме штамма H. pylori 26695, из них только 1408 генов встречаются в обоих штаммах. Количество штаммоспецифических (уникальных, встречающихся только в этом штамме) генов в каждом штамме составило около 100 (7% от всех генов). В настоящее время с помощью ДНК-матриц, сконструированных на основе известных геномов Н. pylori 26695 и J99, при геномном сканировании клинических изолятов показано, что только 1111 генов формируют функциональное ядро Н. pylori. Количество штаммоспецифических генов составляет 25% от всех генов в геноме H. pylori. Однако при расшифровке генома еще одного штамма H. pylori – HPAG1, было идентифицировано 1536 ОРС, а количество уникальных генов составило 91, причем, в HPAG1 отсутствует 29 из 1408 генов, присутствующих в Н. pylori 26695 и J99. Кроме того, существует вероятность того, что может быть обнаружен еще клинический изолят Н. pylori, по отношению к которому штаммы 26695 и J99 будут характеризоваться еще большим количеством уникальных генов. Таким образом, ДНК матрицы позволяют идентифицировать только известные штаммоспецифические гены Н. pylori, т.е. ограничивают список кандидатных штаммоспецифических генов. Учитывая эти обстоятельства, а также то, что накопление данных по определению минимального функционального ядра Н. pylori происходит достаточно медленно (к настоящему времени с 2000 г. проведено геномное сканирование только 112 клинических изолятов Н. pylori), мы поставили перед собой задачу разработать алгоритм предсказания потенциальных штаммоспецифических генов Н. pylori, возможно обусловливающих вирулентность бактерии.
Данный алогритм был разработан совместно с С. Сокол (ИНСА/ИНРА, Тулуза, Франция) на основе гауссовской статистики, учитывающей корреляцию между компонентами вектора атрибутов и базирующейся на робастном методе. Алгоритм был разработан с допущением, что штаммоспецифические гены в Н. pylori являются горизонтально перенесенными (Garcia-Vallve, 2003;
Gressmann, 2005). Детально разработанный классификатор описан в диссертации. Суть метода заключается в следующем. Для каждого гена бактерий вычисляется вектор атрибутов, основанный на частотах динуклеотидов. Для этого сначала вычисляется генный вектор og, подсчитывающий количество всех динуклеотидов в g гене. Так как существует только четыре типа нуклеотидов {аденин, A: цитозин, C;
гуанин, Г;
Тимин, T}, то генный вектор имеет размерность 16. Подсчет ведется в кодирующей части гена в направлении 5'–3'. Важно отметить, что, поскольку динуклеотиды перекрываются, возникает статистическая зависимость векторных компонентов. Генный вектор преобразуется в вектор частот fg путем деления его компонент на полную сумму и может меняться в интервале [0;
1]. Вектор атрибутов вычисляется для всех генов каждого из известных бактериальных геномов. Для данного генома G набор векторов {g}, g G может рассматриваться как случайная выборка, размер которой равен количеству генов в геноме G, nG. Плотность распределения этой выборки моделируется как многомерное Гауссовское распределение N (µ G,S G ) определяемое в 16-мерном пространстве и которое задается средним вектором µG и матрицей ковариации S G, которые оцениваются для каждой выборки {g} робастным способом. Как только Гауссовские параметры оценены для каждого из геномов, проводится сравнение каждого гена из генома тестируемой бактерии с геномами всех бактерий, для этого используется Байесовский классификатор. Он позволяет решить, какой из известных бактериальных геномов является наиболее вероятным источником данного гена в тестируемой бактерии. Байесовский классификатор основан на известной формуле Байеса, связывающей априорно и апостериорно условные вероятности.
Идентификация горизонтально перенесенных генов в H. pylori. В результате прове денного анализа с помощью разработанного классификатора было получено, что из белок-кодирующих генов 979 опознаны как гены из рода Helicobacter, причем только 70 из них были распознаны как гены H. acinonychis Sheeba (62) и H. hepaticus (8). Остальные определялись как гены H. pylori. Гены, которые не были распознаны как гены H. pylori (non Hpy genes) распределялись по разным бактериям. Всего таких генов оказалось 587. Среди бактерий, распознавших наибольшее количество генов H. pylori как «свои», были представители класса Gammaproteobacteria (21% от всех non-Hpy генов), Clostridia (13%), Bacilli (10%), Mollicutes (9%) и Alphaproteobacteria (8.5%).
Симуляция ложно-отрицательных результатов. Для симуляции ложно отрицательных результатов в геном H. pylori добавляли 100 случайно выбранных генов различной длины из геномов 538 бактерий и оценивали процент ложно-отрицательных результатов. Процедуру повторяли с 200, 300 и 400 случайно выбранными внешними генами.
Десять независимых повторов (итераций) использовали в каждом случае. В результате проведенного эксперимента было найдено, что количество ложно-отрицательных результатов составляет, в среднем, 0.4% во всех проведенных экспериментах, причем в 25– 40% случаях классификатор правильно определял источник добавленных генов.
Валидация теста. Сравнение с экспериментальными данными. Мы сравнили полученные нами результаты по выявлению функционального ядра H. pylori с экспериментальными данными разных групп авторов (Salama, 2000;
Gressmann, 2005;
Han, 2007), которые показали, что 1176 генов составляют функциональное ядро H. pylori, а вариабельная часть состоит из 390 генов (табл. 1). В результате было обнаружено, что данные корреляции неслучайны (2-test, р 0.001).
Таблица 1. Выявляемость генов H. pylori и корреляция разработанного классификатора с экспериментальными данными клинических штаммов H. pylori (2-test) Эксп. Идентифицированные Идентифицированные P данные\Теоретические как H. pylori гены как не - H. pylori гены (n = 979) (n = 587) Основные гены (n = 1176) 852 324 0. Вариабельные гены 127 (n = 390) Таким образом, данные по классификации H. pylori на «чужеродные» и «свои» гены, полученные с помощью разработанного классификатора достаточно надежно коррелируют с экспериментальными данными. Биологический смысл этой корреляции, вероятно, заключается в том, что большая часть вариабельных генов H. pylori являются горизонтально перенесенными генами, на что и указывает классификатор, идентифицируя их как чужеродные. Учитывая, что экспериментально невозможно изучить структурную макрогетерогеность всей популяции H. pylori, использование классификатора, по всей видимости, представляет теоретические возможности для поиска функционального ядра H. pylori.
Анализ выявленных горизонтально перенесенных генов H. pylori. Проведенный анализ показал, что распределение горизонтально перенесенных (ГП) генов по функциональным группам выглядит неоднородно. Наиболее часто ГП гены, помимо гипотетических генов ( генов), встречаются в группе генов, кодирующих процессы патогенеза (25 генов), а именно, среди генов островка патогенности cag PAI (22 гена из 24), а также vapD и virB4 гены;
группе генов, кодирующих процессы хемотаксиса и подвижности (23 гена), большей части (14) генов, кодирующих флагеллярный аппарат H. pylori;
группе генов, кодирующих внешние белки мембраны (12 генов) и транспорт (16 генов);
генов, кодирующих мобильные элементы генома H. pylori – 11 генов системы рестрикции-модификации и 13 генов-транспозонов.
Таким образом, большинство чужеродных генов, выявленных разработанным классификатором, не связано с кодировкой основных метаболических путей H. pylori, а обеспечивают его адаптацию и вирулентность. Интересны результаты использования классификатора в выявлении природы источника происхождения гипотетических генов в геноме H. pylori. Выявлено, что 46% от всех гипотетических генов H. pylori являются ГП.
Важно, что корреляция в этом случае существенна (2 = 34.271, p 0.001).
1.3. Функциональная вариабельность H. pylori штаммов Сравнительный анализ транскрипционных профилей штаммов H. pylori. Сравнение транскрипционных профилей, как правило, используется для характеристики ответа бактерии на какой-либо внешний стимул (тепловой шок, изменение рН среды и т.д.). Данный подход позволяет выделить группы генов (up- и down-регулируемые), продукты экспрессии которых обеспечивают адаптацию микроорганизма. Нашей целью являлось изучение взаимосвязи геномной гетерогенности H. pylori и его транскрипционной активности.
В результате изучения транскрипционных профилей клинических штаммов H. pylori было обнаружено, что количество генов, интенсивность сигналов гибридизации (ИСГ) которых на кДНК-макроматрице составляла не менее 0.1% от общей интенсивности, изменялось в пределах от 466 до 572. Количество генов, ИСГ, которых превышала средние значения на кДНК-макроматрице более, чем на 2 SD (стандартное отклонение), также варьировало между клиническими изолятами. Среди этой группы генов одиннадцать генов встречаются во всех клинических изолятах H. pylori, в том числе гены HP0601 (flaA), HP (omp28) и НР0875 (catA). Интересно отметить также присутствие в этой группе генов, входящих в один оперон (HP0236-HP0237-HP0238-HP0239-HP0240-HP0241-HP0242 HP0243), и двух генов, кодирующих небольшие пептиды – HP0784 (44 а.к.) и НР (60 а.к.), причем ИСГ первого составляла от 1.5% до 3.8% от суммарной ИСГ на кДНК макроматрице во всех клинических изолятах.
Далее, был проведен корреляционный анализ между общими (суммарными) транскрипционными профилями клинических штаммов H. pylori. Показано, что коэффициент корреляции между cag- изолятами составлял 0.83, в то время как между cag+ изолятами – 0.76. Коэффициент корреляции транскрипционных профилей между cag- и cag+ изолятами составил 0.73. Полученные результаты свидетельствуют о том, что расчет коэффициента корреляции между суммарными транскрипционными профилями клинических штаммов H. pylori является малоинформативным и не позволяет выявить каких-либо генотипических особенностей того или иного клинического изолята. Поэтому был проведен сравнительный анализ транскрипционных профилей групп генов, входящих в определенный функциональный класс. Всего таких классов для H. pylori насчитывается 16, а количество групп генов, входящих в них – 66. Нами было выявлено 44 группы генов, в которых коэффициенты корреляции между всеми изолятами H. pylori составляли более 0.70. Для групп генов коэффициент корреляции составил более 0.90. Можно предполагать, что столь большое количество высококоррелированных групп (44 из 66) обусловлено тем, что гены, входящие в них, кодируют клеточные и метаболические процессы, которые являются безусловно необходимыми для H. pylori (обеспечивают основную жизнедеятельность микроорганизма). Необходимо отметить высокую корреляцию не только групп генов, входящих в определенный функциональный класс, но и некоторых функциональных классов в целом, как синтез белков (синтез белка, 4 группы, 94 гена). Также достаточно много высококорелированных групп в классе синтеза аминокислот (4 из 5), клеточные процессы ( из 8) и транспорта и связывания белков (4 из 7). Полное отсутствие корреляции (0–0.10) между транскрипционными профилями было обнаружено для таких групп генов, обеспечивающих вирулентность микроорганизма.
Для выявления группы генов, экспрессия которых значительно различается между клиническими изолятами H. pylori, мы применяли метод главных компонент (рис. 6), который используется как метод сокращения данных. Всего выявлено 52 гена, экспрессия которых значительно различается между клиническими изолятами Н. pylori. В эту группу генов входят гены из разных классов, однако большинство генов отвечают за вирулентность H. pylori: цитотоксин-ассоциированный ген (cagA), нейтрофил-активирующий белок napA, главный флагеллярный белок (flaA), вакуолизирующий цитотоксин (vacA), несколько генов, кодирующих внешние мембранные белки (omp), некоторые субъединицы уреазы (ureA и ureB), некоторые регуляторные белки, а также гены, кодирующие белки стресса, такие как шапероны и белки теплового шока, groEL и dnaK.
Рис. 6. Диаграмма рассеяния экспрессии генов в клинических изолятах H. pylori, полученная с помощью метода главных компонент Таким образом, помимо того, что каждый клинический изолят H. pylori характеризуется уникальным набором генов, в том числе и штамм-специфических, клинические изоляты достоверно отличаются и по уровню экспрессии генов, играющих ключевую роль в вирулентности микроорганизма.
Сравнительная характеристика протеомных карт клинических изолятов H. pylori.
Принимая во внимание высокую генетическую вариабельность H. pylori штаммов, возникает вопрос, будут ли H. pylori штаммы функционально гетерогенны или же нет. Нами (совместно с протеомным центром ИБМХ РАМН) с использованием двухмерного гель-электрофореза и MALDI-TOF масс-спектрометрии были получены протеомные карты 10 клинических штаммов H. pylori и штамма J99. Полученные электрофореграммы по архитектонике интенсивных пятен, относящихся к мажорным белкам с наибольшим уровнем экспрессии (субъединицы уреазы UreB и UreА, алкилгидропероксидредуктаза TsaA, тиоредоксин и др.), соответствовали протеомным картам, полученным ранее Jungblut и коллегами (2000) и сравнивались с протеомной картой штамма J99, полученной в аналогичных условиях.
Таблица 2. Идентифицированные отличия протеомных карт десяти клинических штаммов H. pylori Клинические штаммы Название белка 36 37 19 8 46 50 52 53 57 Белок островка патогенности Cag26 – – – + + + + + + + АТФ-зависимая связывающая = = = протеазу субъединица (ClpB) 60-кДа шаперон (GroEL) = = = = = = = = = Триггер-фактор (Tig) = Предшественник белка секреции = = = = = гемолизина (HylB) Предполагаемый регулятор = = транскрипции Гипотетический белок = = = = - = = = = Супероксиддисмутаза (SodF) = = = = = = = NADPH-флавиноксидоредуктаза – – + – + – – + + – (FrxA) Предшественник пептидогликан ассоциированного липопротеина = = = = = = = = (PAL;
Omp18) ;
;
;
;
;
;
Адгезин-тиолпероксидаза (TagD) = = Негемовый ферритин (Pfr) = = = = Примечание. Сдвиги по изоэлектрической точке приведены относительно штамма J99. – выраженный сдвиг в щелочную область, – выраженный сдвиг в кислую область;
(+) или (–) – наличие или отсутствие соответствующего белкового пятна;
() или () – снижение или увеличение экспрессии белка;
(=) – приблизительное сходство по отношению к выбранному штамму сравнения 2. Микро- и макровариабельность H. pylori как следствие адаптации бактерии к окружающему стрессу 2.1. Функциональная вариабельность H. pylori при раннем раке желудка Обоснование модели. Многочисленными исследованиями, в том числе и проведенными нами, показано, что H. pylori характеризуется не только структурной, но и функциональной вариабельностью, однако причины и условия возникновения вариабельности H. pylori до настоящего момента не понятны. Можно предположить, что единичный клон H. pylori быстро дивергирует внутри желудка инфицированного индивида, адаптируясь к новым условия окружающей среды, и после того как ниша занята, скорость изменений резко падает. Учитывая, что заражение человека H. pylori происходит в детском возрасте, проследить динамику изменений микроорганизма в период быстрой дивергенции не представляется возможным. Попытки обнаружить генетические изменения в H. pylori при инфицировании взрослых волонтеров лабораторным штаммом H. pylori не увенчались успехом (Salama et al, 2007). Альтернативная гипотеза заключается в том, что заражение является поликлональным, т.е. в организме хозяина в момент инфицирования присутствуют несколько различных популяций H. pylori, и конечный клональный вариант H. pylori является результатом дивергенции популяции в ходе нескольких делений в организме человека.
До настоящего времени вариабельность H. pylori оценивали при сравнении двух H. pylori штаммов, выделенных от одного пациента через определенные промежутки времени. При таком дизайне исследования всегда существует вероятность, что в период (который обычно составляет не менее 6 месяцев) между выделениями желудок пациента был дополнительно колонизирован еще одним новым изолятом H. pylori. Тогда наблюдаемые изменения в последовательно выделенных парах H. pylori изолятах могут являться следствием рекомбинации ДНК двух штаммов H. pylori – исходного и нового, а не результатом естественной дивергенции бактерии. Для исключения этой возможности мы исследовали динамику генетических и фенотипических изменений H. pylori, выделенных из разных участков слизистой оболочки желудка от пациента с ранним раком желудка. Данная модель позволила нам сравнить H. pylori, адаптирующегося (не адапатированного) к новым условиям, появившихся в результате дисплазии (ранний рак) слизистой оболочки желудка, с этим же штаммом H. pylori, но выделенным из неизмененных отделов этого же желудка.
Другими словами, в одном из участков слизистой оболочки желудка, откуда непосредственно выделяли H. pylori, локализовалась опухоль, расположенная в пределах слизистого и подслизистого слоев стенки желудка и не превышающая 2 см (новые условия), в то время как другие участки желудка, откуда также выделяли H. pylori, морфологически изменены не были (старые условия). В качестве контроля мы также исследовали H. pylori из разных отделов желудка от больного, страдающего хроническим гастритом (условия неизменны по всем отделам).
Дифференциальная экспрессия белков HpРР и HpХГ. С каждой биопсии, взятых из свода, тела и антрального отдела желудка, получали по пять колоний. Для установления идентичности H. pylori штаммов, выделенных из одного желудка, использовали метод мультилокусного типирования. В результате секвенирования генов домашнего хозяйства atpA, efp, mutY, ppa, trpC, ureI и yhpC было показано, что H. pylori, выделенные из одной и той же биопсии абсолютно идентичны. В связи с этим для дальнейшей работы было отобрано по три клона для каждого выделенного штамма H. pylori.
Для идентификации дифференциально экспрессирующихся белков в изолятах H. pylori был использован двухмерный электрофорез с дифференциальным окрашиванием образцов Cy3/Cy5 CyDye™ DIGE Fluors (Amersham/GE Healthcare). Белки экстрагировали из трех клонов каждого из шести штаммов для исключения небиологической вариации (рис. 7).
Содержание индивидуального белка в сравниваемой паре считали измененной значительно, если интенсивность флуоресценции различалась более чем в два раза. При анализе штаммов, выделенных от пациента с хроническим гастритом (HpХГ), было обнаружено 14 пятен, отличающихся по интенсивности более чем в два раза от аналогичных пятен штаммов H. pylori из разных отделов желудка, из которых было идентифицировано 12 пятен. При анализе штаммов, выделенных от пациента с ранним раком желудка (HpРР), было выявлено 32 пятна, отличающихся по интенсивности, из которых было идентифицировано 18 пятен.
Всего во всех изолятах H. pylori были идентифицировано 28 вариабельных белков.
Белки Idh, FrdB, MetX, SodB и Cad были идентифицированы только в HpРР изолятах.
FlaA был обнаружен только в изолятах HpХГ. Для того, чтобы проверить не связаны ли данные различия со сдвигом по pI вследствие значительного аминокислотного полиморфизма белков, была определена нуклеотидная последовательность четырех генов icd, sod, cad и tsaA во всех изолятах. Все четыре гена оказались идентичными как в HpРР, так и в HpХГ изолятах. При сравнении аминокислотной последовательности Icd, Sod, Cad и TsaA между изолятами HpРР и HpХГ было выявлено, что белки Icd и TsaA отличаются только одной аминокислотной заменой, не приводящей к изменению заряда и, следовательно, их отсутствие в соответствующей позиции на 2DE-карте в HpХГ изолятах не связано с аминокислотным полиморфизмом. Аминокислотные замены в Sod и Cad приводят к изменению заряда, и вероятно, с этим может быть связано их отсутствие в соответствующей позиции на 2DE HpРР, так и в HpХГ карте HpХГ штаммов в сравнении с HpРР изолятами.
Для оценки экспрессии белков H. pylori в разных отделах желудка при гастрите и раннем раке интенсивность сигналов белков оценивали (нормализовали) по отношению к интенсивности сигналов соответствующих белков H. pylori, выделенного из антрального отдела. В результате для HpХГ штаммов было найдено, что в семи случаях из 13 экспрессия белков увеличивается в изолятах, выделенных из тела и свода желудка. При анализе HpРР штаммов наблюдалась иная картина. Найдено только два белка из 18, экспрессия которых изменялась одновременно в изолятах, выделенных из тела и свода желудка. Кроме того, в отличие от HpХГ штаммов, основное количество гиперэкспрессируемых белков (12 из 18) присутствует только в изоляте, выделенном из свода желудка.
Оценка структурной гетерогенности H. pylori штаммов с помощью ДНК-макроматриц показала, что HpРР изоляты содержат cag PAI – основную детерминанту вирулентности H. pylori, а штаммы, потерявшие этот островок, являются скорее комменсалами, чем патогенами. Более примечательно, что в HpРР изолятах были обнаружены все гены cag PAI, так как присутствие полного набора генов, формирующих этот островок, в пять раз увеличивает тяжесть заболевания, чем неполный PAI. Идентифицирован набор генов, которые встречаются только в HpРР изолятах, среди которых необходимо выделить гены аденин-специфические ДНК метилтрансфераз (НР0260 и НР0481). Однако представляется маловероятным, что структурная гетерогенность H. pylori определяет процессы адаптации H. pylori к локально измененной среде желудка при раннем раке.
A Б В Г Д Е Рис. 7. Дифференциальный экспрессионный анализ H. pylori выделенных из разных отделов желудка при раннем раке (А,Б,В) и хроническом гастрите (Г,Д,Е).
А – H. pylori, выделенный из свода (Су5) и антрального отдела (Су3) желудка;
Б – H. pylori из тела (Су5) и антрального отдела (Су3) желудка;
В – H. pylori из тела (Су5) и свода (Су3) желудка, Г – H. pylori из свода (Су3) и антрального отдела (Су5) желудка;
Д – H. pylori из тела (Су3) и антрального отдела (Су5) желудка и Е – H. pylori из тела (Су5) и свода (Су3) желудка.
Анализ функциональной гетерогенности H. pylori при раннем раке желудка. Для решения поставленных задач необходимо было выяснить: 1) как изменяется экспрессионный профиль H. pylori штаммов внутри одного желудка при отсутствии генетической гетерогенности штаммов и 2) идентифицировать белки, экспрессия которых достоверно различается между НрХГ и НрРР. В результате проведенного анализа было обнаружено, что при раннем раке желудка количество белков, экспрессия которых различается в H. pylori изолятах (32 пятна) в пределах одного желудка, превышает количество аналогичных белков в H. pylori при гастрите (14 пятен). Вполне вероятно, что степень функциональной гетерогенности H. pylori штаммов характеризует состояние слизистой желудка. Об этом свидетельствуют данные корреляционного анализа экспрессионных профилей H. pylori, составленные из сигналов интенсивностей идентифицированных белков. При гастрите все H. pylori изоляты имеют достаточно близкий профиль (коэффициент корреляции Пирсона 0.90 r 0.96), тогда как изоляты HpРР имеют более разнообразный экспрессионный профиль (0.77 r 0.85). Следует отметить, что функциональная гетерогенность H. pylori штаммов в обоих случаях обнаружена на фоне структурной (нуклеотидной) идентичности штаммов в пределах одного желудка. Вероятно, что необходимо разграничить два процесса:
1) адаптацию микроорганизма к морфологически разным по строению отделам желудка – антрум, тело и свод;
и 2) адаптацию микроорганизма к патологическим процессам (неопластический процесс vs хроническое воспаление), протекающих на слизистой желудка.
Как известно, свод и тело желудка анатомически похожи друг на друга и формируют фундальный отдел желудка, в котором находятся главные клетки, выделяющие желудочный сок с пепсином, и обкладочные клетки, непосредственно продуцирующие Н+ и Сl–. В антральном отделе обкладочных клеток нет и находятся гастрин-продуцирующие пилорические железы. рН антрального отдела выше, чем в фундальном отделе желудка. Для проверки зависимости экспрессионных профилей от анатомического строения желудка, мы сравнили экспрессионные профили всех H. pylori штаммов, составленные из белков, встречающихся во всех изолятах. В результате проведенного анализа было обнаружено, что корреляция экспрессионных профилей между H. pylori изолятами, выделенными из свода и тела желудка, как при раннем раке желудка (r = 0.89), так и при гастрите (0.99) несколько выше, чем корреляция экспрессионных профилей штаммов из антрального отдела с изолятами из тела (0.85) и свода желудка (0.90). С другой стороны, экспрессионный профиль НрРР изолята, выделенного из антрального отдела оказался даже более схож с соответствующим НрХГ изолятом (r = 0.89), чем с НрРР изолятами выделенными из тела и свода желудка (r 0.79). На наш взгляд, эти данные свидетельствует о том, что анатомические особенности желудка в некоторой степени предопределяют фенотипическую вариабельность H. pylori.
Среди белков идентифицированных нами как дифференциально экспрессирующиеся H. pylori как внутри желудка, так и при двух разных патологических состояниях желудка, основную часть составляют белки-антиоксиданты (SodB, KatA, AphC/TsaA, TrxA, Pfr), белки цикла трикарбоновых кислот (Idh, FrdA, FrdB, FldA AcnB) и белки теплового стресса (GroEL и ClpB). Вариации белков-антиоксидантов SodB, KatA, AphC/TsaA, TrxA, Pfr в H. pylori свидетельствуют о вовлечении активных форм кислорода (АФК) в воспаление, вызываемое микроорганизмом. АФК генерируются в большом количестве фагоцитами, в основном, нейтрофилами и макрофагами, которые инфильтрируют субэпителиальный слой gastric lamina propria при гастрите. Экспрессия онкогенов и клеточная пролиферация также влияет на концентрацию АФК. H. pylori стимулирует гиперпролиферацию клеток желудка, которая является необходимым этапом в развитии аденокарциномы.
В данном исследовании, проведенном совместно с Иванисенко В.А. и Аман Е.Э.
(ИЦИГ СО РАН, Новосибирск), были предприняты попытки реконструкции молекулярно генетических взаимодействий дифференциально экспрессирующихся белков H. pylori при гастрите и раннем раке желудке. Работа проводилась с использованием компьютерной системы AND (Associative Network Discovery), которая включает в себя базу данных ANDCell, содержащую более 5 млн. фактов о молекулярно-генетических взаимодействиях, химических ферментативных реакциях, фактах о генетической регуляции, автоматически экстрагированных из текстов рефератов PubMed и молекулярно-генетических баз данных, а также программу ANDVisio, обеспечивающую доступ к базе данных и представление результатов поиска в виде ассоциативных семантических сетей (рис. 8).
Рис. 8. Ассоциативная сеть генов H. pylori, экспрессия которых изменяется при гастрите (слева) и раннем раке желудка (справа).
Условные обозначения: - ген, - белок, - ассоциация.
Обнаружено, что центральное ядро сети генов H. pylori, экспрессия которых изменяется при гастрите, составляет группа молекулярных шаперонов (groES, groEL, dnaK, TiG, clpB). Отдельный узел сети составляют белки, связанные с тиоредоксинредуктазой (TsaA) и тиоредоксином (ThiO). Этот кластер связан с ядром шапероновых белков через ферменты малатдегидрогеназу и цитратсинтазу. Известно, что GroEL и GroES связываются с этими ферментами и предотвращают их инактивацию под действием температуры. Также имеются данные, что тиоредоксинредуктаза и тиоредоксин обладают шаперонной активностью, способствуя формированию функциональной укладки цитратсинтазы.
Тиоредоксин также способен образовывать слабые связи с малатдегидрогиназой. Таким образом, кластер тиоредоксина, скорее всего, является частью функционального ядра, образованного белками-шаперонами. Еще один кластер сети образуют белки и гены факторы элонгации (Ef-Tu, Ef-G, Ef-Ts, EF-2 (HP1195)). Фактор элонгации Ef-Tu также обладает шаперонной активностью по отношению к ряду белков. Возможно, другие факторы элонгации также способны проявлять такую активность.
Подсеть, объединяющая белки флагеллин А (FlaA), флагелярный адгезин (HpaA) и шаперон ClpB, включает такие компоненты как CagA (cytotoxina ssociated gene), FeoB, участвующий в транспорте ионов железа, UvrA – компонент UvrABC системы, отвечающий за репарацию ДНК, RpoBC – ДНК-зависимую РНК полимеразу и Rpl15 – 50S рибосомальный белок и цитотоксин VacA. Эти белки связаны между собой физическими взаимодействиями, чья функциональная значимость до сих пор не была выявлена и является предметом для дальнейшего исследования.
Ассоциативная сеть генов H. pylori, экспрессия которых изменяется при раннем раке желудка, содержит большинство белков, генов и связей сети гастрита, однако в ней присутствует ряд новых объектов, прежде всего ферментов, таких как фумаратредуктаза (FfdA), аконитаза (AcoN2), изоцитраддегидратаза (Idh), супероксиддисмутаза (SodF) и метионинаденозилтрансфераза (MetK). Большинство взаимодействий, объединяющих эти ферменты с основным ядром, содержащим шапероновые белки, выявлено с помощью двухгибридной системы, но их функциональная значимость пока не выяснена. Таким образом, сеть взаимодействий генов и белков, экспрессия которых изменяется при раннем раке желудка, включает, с одной стороны, ряд шаперонов, как и в случае с гастритом, а с другой стороны, содержит ферменты, участвующие в цикле трикарбоновых кислот, антиоксидантной защите и метаболизме аминокислот. Вероятно, что изменение экспрессии этих белков обусловлено непосредственной модуляцией жизнедеятельности патогена раковыми клетками, которые характеризуются повышенным метаболизмом по отношению к нормальным клеткам. Например, раковые клетки поглощают из среды в 10–30 раз больше глюкозы, чем нормальные, т.е. H. pylori, находясь в непосредственной близости от раковых клеток, испытывает с одной стороны недостаток глюкозы, а с другой, в среде присутствует избыточное количество ди- и трикарбоновых кислот, образующихся в качестве промежуточных продуктов при распаде и синтезе белков, жиров и углеводов в трансформированной ткани. Вероятно, что изменение экспрессии части ферментов (FrdA, FrdB, Icd, FldA, AcnB), участвующих в цикле трикарбоновых кислот в H. pylori при раке желудка, обусловлено этими процессами. С другой стороны, накопление токсических продуктов в среде при раннем раке желудка может являться причиной изменение экспрессии CadA, который катализирует дисмутацию бензальдегида и снижает концентрацию альдегидов в клетке.
Таким образом, в пределах одного желудка экспрессия белков H. pylori может различаться более чем в два раза, причем, изменение происходит на фоне неизмененной структуры генома штаммов. Экспрессионные профили штаммов, выделенных из разных отделов одного желудка, более схожи между собой, чем экспрессионные профили штаммов, выделенных из разных желудков. Основную часть вариабельных белков H. pylori составляют белки-антиоксиданты, белки цикла трикарбоновых кислот и белки теплового стресса.
2.2. Генерация микровариабельности при адаптации H. pylori к антибиотику Исследованы геномные события, происходящие в геноме H. pylori при его адаптации к рифампицину в качестве стрессового фактора. Рифампицин – антибиотик, который ингибирует РНК-полимеразу прокариот на этапе инициации транскрипции. Генетическая резистентность к рифампицину обусловлена точечными мутациями в rpoB гене, в результате которых фермент сохраняет свои свойства, но теряет способность связываться с антибиотиком. Данное исследование стало возможным благодаря развитию геномных технологий, позволяющих быстро и недорого ресеквенировать целые геномы микроорганизмов. Секвенирование целых геномов позволяет раскрыть новые механизмы адаптации бактерий к различным агентам, в том числе и антибиотикам.
Сравнительный анализ геномов H. pylori. Для оценки влияния рифампицина на возникновение мутаций в геноме H. pylori в качестве контроля был использован штамм 26695, долгое время культивировавшийся на искусственных средах (далее обозначен как 26695m) и два РИФр штамма Р1 и Р2, полученные в результате селекции H. pylori 26695m in vitro на агаре в присутствии 20 мкг/мл рифампицина. Предварительная нуклеотидная последовательность геномов H. pylori 26695m и РИФр штаммов Р1 и Р2 была определена компанией 454 Life Sciences. При сравнительном анализе геномных последовательностей 26695m, Р1, Р2 и Н. pylori 26695 (NC000915) в трех штаммах была выявлена 131 мутация.
Однако при секвенировании ПЦР продуктов, полученных с праймеров, фланкирующих участки генов, содержащих соответствующие мутации, было подтверждено только мутаций. Среди них 20 мутаций являются общими для всех штаммов, пять идентичных мутаций обнаружено в обоих РИФр штаммах, шесть уникальных мутаций найдено в Р1 и 4 в Р2 штаммах (Рис. 9).
Рис. 9. Распределение мутаций в геномах H. pylori 26695 и РИФр штаммах Р1 и Р2.
Внешнее кольцо – виртуальная хромосома 26695m, среднее кольцо – Р1 и внутреннее кольцо – Р2. Серые треугольники – общие мутации, белые тр-ки – мутации общие для Р1 и Р2 штаммов и черные тр-ки – уникальные мутации.
Сравнительный анализ мутаций в рифампицинустойчивых штаммах H. pylori. В двух РИФр штаммах Р1 и Р2 было обнаружено 11 и 9 мутаций (включая мутации в rpoB гене), соответственно, причем пять мутаций (T389863С, Ins597760T, G748722T, T189153G, Del1487684GA, указаны положение и замены мутаций в геноме бактерий) являются общими.
Мутации обусловлены как инсерцией/делецией нуклеотидов, так и нуклеотидными заменами. Все мутации, за исключением мутации T389863С в гене HP0379 и T1189153G в гене HP1123 в обоих штаммах являются критическими. Мутации ins597760T в НР (общая для Р1 и Р2) и del872293A в proV в Р1 вызывают сдвиг рамки считывания и приводят к преждевременной терминации трансляции. Мутация G748722Т в гене N-methylhydantoinase приводит к образованию стоп-кодона (gAG-tAG) в обоих РИФр штаммах. Остальные мутации являются несинонимичными. Инсерция ins1570087ACT – целого кодона – в HP приводит к вставке аминокислоты Thr. Интересно, что в результате мутации del1487684GA в гене HP1417, который имел аутентичный сдвиг рамки считывания, структура гена восстанавливается.
Если в Р2 штамме была найдена только одна мутация – H540Y (G1275432A) в rpoB гене, – то в Р1 штамме в rpoB гене было обнаружено три мутации – T588I (G1275287A), D530N (C1275462T) и S155I (C1276586A), причем мутация S155I (C1276586A) не относится к мутациям, обусловливающим устойчивость к рифампицину. Мутация T588I в Р1 штамме, по-видимому, компенсирует фитнесс, связанный с РИФр генотипом D530N.
Учитывая, что мутации в НР0379 (fucosyltransferase) – T389863C, НР0565 – Ins597760T, Нр0696 (N-methylhydantoinase) – G748722T, slyD (peptidyl-prolyl cis-trans isomerase, FKBP-type rotamase ) – T1189154G, и HP1417 (Del1487684GA) оказались общими для двух мутантных штаммов, было проверено являются ли эти мутации случайными. С этой целью мы попытались выявить все найденные мутации в других РИФр штаммах (Р3–Р9), полученных в этом же эксперименте. Помимо мутаций в rpoB гене во всех штаммах, часть из которых, по-видимому, являются компенсаторными, в 4 штаммах H. pylori, были обнаружены 4 нуклеотидные замены T389863С, Ins597760T, G748722T, Del1487684GA. В остальных трех штаммах указанные выше мутации были обнаружены частично: в одном выявлены мутации T389863С, Ins597760T, Del1487684GA, во втором – Ins597760T, G748722T, Del1487684GA мутации и в третьем – Ins597760T, Del1487684GA Скрининг общих мутаций в H. pylori, возникающих при адаптации к субмиковым концентрациям рифампицина. Ранее было показано, что в зависимости от концентрации антибиотика инактивируются различные гены H. pylori. Например, при низких концентрациях метронидазола (32 мкг/мл) инактивируются rdxA и frxA нитроредуктазные (nitroreductase) гены, а при высоких концентрациях дополнительно инактивируются ribF (riboflavin kinase/FMN adenylyltransferase), mdaB (quinone reductase), omp11 и fur (Ferric uptake regulation protein) гены.
Для проверки предположения, что мутации, найденные во всех выделенных РИФр клонах, являются отражением адаптации H. pylori к рифампицину был поставлен следующий эксперимент. H. pylori инкубировали с различными субингибиторными концентрациями (МИК H. pylori - 1 мкг) рифампицина: 0.2 мкг/мл, 0.4 мкг/мл и 0.8 мкг/мл в течение 48 ч, затем выделяли тотальную геномную ДНК и проводили амплификацию фрагментов, включающих 389863, 597760, 748722, 189153 и 11487684 позиции. Полученные фрагменты клонировали, для каждого фрагмента было получено по ~1200 рекомбинантных клонов, из них для секвенирования было отобрано 96 случайных клонов. В результате проведенного эксперимента нам не удалось обнаружить мутаций T389863С, Ins597760T, G748722T, T189153G, Del1487684GA в H. pylori при субмиковых концентрациях рифампицина.
Следовательно, можно предположить, что наличие данных мутаций в РИФр мутантах не является необходимым условием, обеспечивающим устойчивый фенотип H. pylori к рифампицину. Другими словами, при адаптации H. pylori к рифампицину происходит накопление мутаций не ассоциированных с устойчивостью к антибиотику, и вероятно, являются следствием адаптации бактерии к окружающему стрессу. На следующих этапах работы, мы попытались выявить возможные механизмы генерации генетической вариабельности H. pylori.
2.3. Метилирование ДНК как один из возможных механизмов изменчивости H. pylori Соответствие нуклеотидов между белок-кодирующими последовательностями штаммов H. pylori 26695 и J99. Предполагается, что геномная гетерогенность H. pylori обусловлена высокой частотой межштаммовых и внутригеномных рекомбинационных событий (Suerbaum, 1998). Вместе с тем необходимо отметить, что рекомбинация не приводит к образованию новых полиморфных сайтов, но увеличивает количество уникальных последовательностей при уже существующем полиморфизме нуклеотидов.
Очевидно, что наряду с рекомбинациями, мутации de novo играют значительную роль в формировании генетической гетерогенности H. pylori. Механизмы, обусловливающие повышенную частоту мутаций в геноме хеликобактера, слабо изучены. Вместе с тем известно, что дезаминирование цитозина, скорость которого составляет по некоторым оценкам 3–710–13 с-1 в двухспиральной ДНК, является одним из важнейших источников мутаций у разных организмов. Скорость дезаминирования в случае однонитевой ДНК увеличивается в 140 раз. В результате «спонтанного» гидролитического дезаминирования цитозина образуется урацил, спаривание которого с аденином во время репликации приводит к СТ транзиции. Несмотря на то, что данный процесс нивелируется ферментом урацил ДНК-гликозилазой (UDG), замены CТ являются доминирующими в спектре спонтанных нуклеотидных замен у бактерий и эукариот. Кроме этого, показано, что скорость дезаминирования цитозина возрастает в 2–4 раза при его предварительном метилировании в 5-ом положении. При анализе геномов H. pylori следует принять во внимание, что некоторые клинические изоляты и лабораторные штаммы этого микроорганизма содержат свыше систем рестрикции-модификации II типа, в состав которых, как правило, входят одна или две метилтрансферазы. При этом систем репарации нуклеотидных ошибок в опубликованных геномах H. pylori не аннотировано. Исходя из вышеизложенного, можно предположить, что геном H. pylori является уникальным субстратом для химической модификации, обусловленной процессами метилирования-дезаминирования, результатами которых должна быть высокая частота CT транзиций по сравнению с другими нуклеотидными заменами.
Для изучения асимметрии нуклеотидных вариаций в H. pylori мы исследовали соответствие нуклеотидов между соответствующими ОРС двух штаммов H. pylori 26695 и J99.
Соответствие нуклеотидов между ОРС H. pylori 26695 и J99. Генетическая гетерогенность H. pylori обусловлена не только точечными мутациями, но и процессами рекомбинации. Вероятно, что если две сравниваемые ОРС H. pylori отличаются между собой по длине, то вклад процессов рекомбинации, выражающийся во вставке или делеции нуклеотидов в генах, достоверно исключить нельзя. То есть наблюдаемый полиморфизм в гомологичных генах разной длины в большей степени связан с процессами рекомбинации в H. pylori. Так как целью нашей работы являлось выявление нуклеотидных несоответствий, обусловленных только точечными мутациями, то данные гены исключали из анализа. При сравнении ОРС H. pylori 26695 и J99 выявлено всего 941 одинаковых по длине гомологичных ОРС из 1372.
Первоначально проанализированы частоты соответствий мононуклеотидов по положению в выровненных ОРС обоих штаммов H. pylori. Выявлено, что в спектре нуклеотидных соответствий преобладают соответствия по типу транзиций (более 3%) над трансверсиями (менее 1%). Преобладание соответствий по типу транзиций обусловлено процессами дезаминирования цитозина в кодирующей цепи ДНК (CT (5.3%) и TC (3.5%)) и некодирующей (AG (2.9%) и GА (3.9%)). Доля соответствий по типу трансверсий (АC, AT, CA, CG, GC, GT, TA и TG) не превышала 0.84%.
Cтатистическая значимость обнаруженных различий частот соответствий р 0.01 (t-критерий, в качестве исходных данных использовали множества, элементами (941) которых являлись частоты замен нуклеотидов в паре генов). Интересно, что в кодирующих последовательностях замены CT более часты, чем аналогичные замены на некодирующей цепи. Наблюдаемая асимметрия может быть обусловлена неодинаковой скоростью мутаций связанной с процессами транскрипции (тranscription-associated mutational pressure). Далее мы проанализировали соответствие нуклеотидов в двух выровненных геномных последовательностях H. pylori 26695 и J99, в зависимости от положения нуклеотида в кодоне. В результате обнаружено, что наибольшим вариациям подвержен нуклеотид, находящийся в третьей позиции нуклеотидного триплета. Наиболее часто встречающиеся нуклеотидные соответствия во всех положениях в кодоне: СT, ТС, AG и GА (от 1.9% для AG во втором положении, до 19.5% для СT в третьем). Преобладание транзиций (AG, TC, GA и CT) над трансверсиями (АC, AT, CA, CG, GC, GT, TA и TG) может быть обусловлено синонимичностью или несинонимичностью нуклеотидной замены, однако из представленных данных видно, что в H. pylori транзиции преобладают над трансверсиями также в первой и второй позиции нуклеотида в кодоне, причем доля транзиций превосходит долю трансверсий в несколько раз. Таким образом, можно констатировать, что доминирование транзиций C:GТ:А в спектре нуклеотидных соответствий преимущественно обусловлено высокой скоростью перехода СТ в белок кодирующих нуклеотидных последовательностях H. pylori.
Соответствие нуклеотидов в тетрануклеотидах ОРС H. pylori 26695 и J99.
Изучение вклада процессов метилирования в транзициях CT, оценивая с учетом возможных замен по типу С:GТ:А в сайтах метилирования в геномах штаммов H. pylori 26695 и J99, проводили с помощью предложенного нами метода анализа соответствий тех или иных нуклеотидных мотивов в идентичных геномных последовательностях двух штаммов H. pylori. Для анализа были взяты тетрануклеотидные мотивы GmCGC и AmCGT, сайты модификации метилтрансфераз, обладающих 5mC-активностью. Наиболее значительная доля соответствий между C и T была найдена для мотива ACGT-AТGT (28.3%) по положению, в то же время соответствие между G и А в составе этого же тетрануклеотида ACGT-ACAT также значимо (6.9%). Соответствие между нуклеотидом С в составе GCGC мотивов и T в составе GTGC составило 6.6%, а между G в GCGC и A в GCAG – 4.9%.