Фотодинамическая инактивация микроорганизмов: фундаментальные и прикладные аспекты
На правах рукописи
Страховская Марина Глебовна ФОТОДИНАМИЧЕСКАЯ ИНАКТИВАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ:
ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ Специальность: 03.01.02 – биофизика 03.02.03 – микробиология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Москва –2010 2
Работа выполнена на кафедре биофизики биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова
Научный консультант:
доктор биологических наук, член-корр. РАН, профессор Рубин Андрей Борисович
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Красновский Александр Александрович доктор биологических наук, профессор Потапенко Александр Яковлевич доктор биологических наук Прохоренко Изабелла Рувимовна
Ведущая организация: Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН
Защита состоится «23» декабря 2010 года в 14 часов на заседании Диссертационного совета Д 501.001.96 при Московском государственном университете имени М.В.Ломоносова по адресу: 119992 г, Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет, кафедра биофизики.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова Автореферат разослан «»2010 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор Кренделева Т.Е.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Одна из центральных задач фотобиологии и биофизики состоит в выяснении фундаментальных основ чувствительности организмов к оптическому излучению различных диапазонов, в том числе к повреждающему действию света. В зависимости от спектрального состава свет может индуцировать протекание прямых и/или сенсибилизированных деструктивных процессов. Высокая биологическая активность коротковолнового (УФС, 200-290 нм) и средневолнового (УФВ, 290-320 нм) ультрафиолета определяется прямым поглощением квантов излучения этих диапазонов важнейшими клеточными компонентами. Повреждающее действие длинноволнового ультрафиолетового (УФА, 320-380 нм) и видимого (380 750 нм) света на живые организмы обусловлено протеканием сенсибилизированных процессов. При этом в качестве фотосенсибилизаторов могут выступать как эндогенные природные клеточные метаболиты (например, порфирины), так и различные экзогенные красители, применяющиеся в косметике, пищевой и легкой промышленности, лекарственные препараты и др. Помимо индукции прямых окислительных деструктивных процессов в биомолекулах и биоструктурах [Halliwell and Gutteridge, 1984;
Epe et al., 1993;
Davies, 2004. Girotti and Kriska. 2004], генерируемые фотосенсибилизаторами активные формы кислорода опосредуют сигнальные пути стрессовых воздействий на клеточную стенку [Levin, 2005], модифицируют активность генов, активируя защитные механизмы в ответ на окислительный стресс [Storz et al., 1990;
Gasch et al., 2000;
Ziegelhoffer and Donohue, 2009].
В фотодинамических реакциях, относящихся к фотоокислительным процессам II типа, происходит триплет-триплетный перенос энергии от возбужденного фотосенсибилизатора на молекулярный кислород, находящийся в основном триплетном состоянии, с образованием его синглетного возбужденного состояния 1 gО2 ( О2) [Lu and Ogilby, 1987;
Girotti, 1992;
Josefsen and Boyle, 2008].
Фотодинамические реакции все шире применяются в медицинской практике: лежат в основе противоопухолевой фотодинамической терапии (ФДТ) [Dougherty et al., 1998], фотодинамического обеззараживания препаратов крови от вирусных контаминаций [Wainwrigh, 1998]. В последние годы все большее внимание привлекают исследования по фотодинамической инактивации бактерий и грибов [Hamblin and Hasan, 2003], которые имеют выраженную практическую направленность. Это обусловлено ростом устойчивости патогенных микроорганизмов к традиционной химиотерапии и необходимостью разработки альтернативных способов их инактивации.
В отличие от противоопухолевой ФДТ, основанной преимущественно на использовании тетрапиррольных фотосенсибилизаторов (порфирины, хлорины, фталоцианины), в антимикробной ФДТ до недавнего времени основной упор делался на сравнительно низкомолекулярные красители - фенотиазины [Usacheva et al., 2001] и акридины [Wainwright et al., 1997]. Несмотря на то, что фенотиазины (метиленовый синий, толуидиновый синий) обладают широким спектром антимикробного действия, их применение в целях ФДТ имеет ряд недостатков. В первую очередь, это недостаточная активность в отношении бактерий и грибов и необходимость применения высоких (до 200 мкМ на моделях in vivo [Zolfaghari et al., 2009]) токсичных для животных концентраций. Одно из основных преимуществ антимикробной ФДТ над антибиотикотерапией заключается в множественном характере окислительной деструкции микробных клеток-мишеней, что затрудняет выработку устойчивости к последующим циклам фотодинамических воздействий [Jori and Brown, 2004]. Однако, в отношении фенотиазинов, это преимущество может быть поставлено под сомнение, поскольку мутанты бактерий с повышенным уровнем экспрессии белков-помп множественной лекарственной устойчивости проявляют более высокую устойчивость к фотосенсибилизации фенотиазинами по сравнению с дикими штаммами [Tegos and Hamblin, 2006]. Применение акридинов может сдерживаться наличием у этой группы красителей мутагенных свойств [Gasc and Sicard, 1978]. В этой связи несомненный интерес представляет изучение антимикробной активности других типов фотосенсибилизаторов, в том числе на основе тетрапиррольных структур.
Эффективное применение красителей в медицинских целях невозможно без глубокого понимания механизмов фотосенсибилизации биологических объектов различного происхождения. В этой области исследований существуют две основные группы проблем. Первая связана с изучением природы действующих фотосенсибилизаторов, механизмов их взаимодействия с клетками и субклеточными структурами. Вторая – с исследованием фотоиндуцированных повреждений клеточных мишеней, приводящих к развитию сенсибилизированных поражений.
Направленная доставка фотосенсибилизиторов к таким мишеням, например, к ядру раковой клетки [Sobolev, 2008], позволяет на порядки увеличить эффективность фотоинактивации.
В фундаментальном аспекте одной из основных задач при изучении механизмов фотосенсибилизации бактерий является установление причин низкой чувствительности объектов, относящихся к грамотрицательным видам. Важнейшей структурой, отвечающей за общую устойчивость грамотрицательных бактерий к различным внешним агентам (антибиотикам, детергентам, красителям), является наружная мембрана, входящая в состав клеточной стенки. Перспективным подходом к повышению чувствительности грамотрицательных бактерий является их обработка с помощью заряженных поликатионных структур. Под воздействием поликатионов происходит высвобождение отрицательно заряженных липополисахаридов наружной мембраны и ее дезинтеграция. Поликатионы могут быть также использованы как наноносители фотосенсибилизаторов, повышающие избирательность их действия за счет электростатического взаимодействия с клеточной стенкой бактерий. В то же время и сами молекулы красителей могут выступать в качестве носителей положительно заряженных групп, повышающих эффективность их взаимодействия с бактериальной клеткой, и представляют значительный интерес в качестве фотосенсибилизаторов для антимикробной фотодинамической терапии. Однако практическое использование фотосенсибилизаторов в этом направлении требует разработки систем скрининга красителей, изучения закономерностей проявления активности красителей в зависимости от знака заряда и количества заряженных заместителей в молекулах, определения спектров антимикробного действия.
Механизмы фотодинамической инактивации дрожжевых грибов изучены недостаточно, на ограниченном круге красителей. Мало внимания уделялось исследованию процессов взаимодействия красителей с клеточной стенкой и плазматической мембраной, целостность которых играет важнейшую роль в жизнеспособности дрожжей.
Исходная внутриклеточная локализация и отсутствие необходимости преодолевать клеточные барьеры проницаемости составляют важное преимущество эндогенных порфириновых фотосенсибилизаторов. У микроорганизмов деструктивные реакции, сенсибилизированные эндогенными порфиринами, изучались, в первую очередь, на объектах бактериальной природы. Результаты фундаментальных исследований в этой области нашли практическое применение. Так, препараты на основе низкомолекулярного предшественника эндогенных порфиринов - 5’-аминолевулиновой кислоты (АЛК), в настоящее время успешно применяются для лечения бактериальных кожных инфекций. На грибах деструктивное действие видимого света, опосредованное эндогенными порфиринами, изучалось крайне мало.
В основном работы касались исследований фоточувствительности клеток и фотоингибирования митохондриального дыхания дрожжей Saccharomyces cerevisiae, мутантных по различным стадиям биосинтеза гема. Однако, как было показано Фрайкиным с соавт. [1985-1988], свет видимого диапазона способен оказывать летальное действие и на клетки диких штаммов дрожжей. Особенностью эффектов инактивации видимым светом является сильная кислородная зависимость, что свидетельствует о фотодинамическом характере наблюдаемых эффектов. Структура спектра действия фотоинактивации позволила предположить, что процесс опосредуется эндогенными соединениями порфириновой природы. Однако, несмотря на возможное участие эндогенных порфиринов в летальных эффектах видимого света у дрожжей, способов, направленных на создание их повышенной внутриклеточной концентрации, аналогично действию АЛК у бактерий, не разработано.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в исследовании фотодинамической активности эндогенных и экзогенных тетрапиррольных соединений при действии видимого света на дрожжевые грибы и бактерии. С целью расширения сферы применения фотосенсибилизаторов, развития методов фотодинамической терапии локальных микробных заражений и фотообеззараживания, основной задачей работы являлось изучение факторов, способствующих увеличению локальной концентрации фотосенсибилизаторов в микробных клетках-мишенях и достижению высокой эффективности фотоинативации.
Были поставлены следующие экспериментальные задачи:
- выявление эндогенных порфириновых фотосенсибилизаторов, определяющих чувствительность дрожжей к видимому свету;
- разработка способов модификации метаболизма митохондриальных порфиринов у дрожжей с целью повышения их локальной внутриклеточной концентрации;
- изучение механизмов фотоинактивации клеток дрожжей в условиях накопления эндогенных порфиринов;
- определение типов внутриклеточных повреждений при фотодинамической инактивации дрожжей, опосредованной хлоринами и фталоцианинами;
- исследование связывания замещенных катионных металлофталоцианинов с клетками энтеробактерий как представителей группы грамотрицательных видов и связи этого процесса с эффективностью фотосенсибилизации;
- разработка лабораторной бактериальной тест-системы для отбора перспективных красителей, обладающих фотобактерицидной активностью;
- оценка спектра антимикробного действия наиболее перспективного фотосенсибилизатора в системах in vitro на различных видах микроорганизмов, в том числе антибиотикоустойчивых штаммах, а также испытание in vivo на животной модели.
Научная новизна. Разработан способ индукции «протопорфирии» у дрожжей и повышения фоточувствительности клеток за счет увеличения внутриклеточного содержания фотоактивного предшественника гема - протопорфирина в результате нарушения биосинтеза гема при введении хелатора железа 2,2’-дипиридила.
Установлено, что увеличение содержания эндогенного протопорфирина в митохондриях и плазматических мембранах дрожжей приводит к интенсификации в этих структурах фотоокислительных деструктивных процессов.
Впервые выявлена высокая фотосенсибилизирующая активность хлоринов в отношении дрожжевых грибов, при действии которых наблюдается высокая степень везикуляризации и потеря барьерных функций плазматическими мембранами клеток.
Обнаружена фотофунгицидная активность катионных фталоцианинов, проявляющаяся как на клеточных культурах так и на животной модели (кератомикоз кроликов). При проведении электронной микроскопии выявлено нарушение морфологии фотосенсибилизированных катионными фталоцианинами дрожжевых клеток, проявляющееся в потере жесткости клеточными стенками.
С использованием бактериальной биолюминесцентной тест-системы показано увеличение бактерицидной активности фотосенсибилизаторов при переходе от анионных к катионным красителям, а также при возрастании в молекулах количества положительно заряженных заместителей.
Показано, что наличие и количество положительных заряженных заместителей в молекулах фталоцианинов определяет эффективность их связывания с клетками грамотрицательных бактерий и фотобактерицидную активность. Для изучения связывания красителей с бактериальными клетками впервые применен метод флуоресцентной корреляционной спектроскопии.
Научная и практическая значимость работы.
Показано, что внутриклеточная концентрация эндогенных порфириновых соединений является важнейшим фактором, определяющим чувствительность дрожжей к оптическому излучению видимого диапазона спектра.
Получены данные о структурно-функциональных повреждениях в клетках дрожжей при действии эндогенного протопорфирина, а также экзогенных фотосенсибилизаторов - хлоринов и фталоцианинов.
Обосновано применение бактериальной биолюминесцентной тест-системы на основе генно-инженерного штамма Escherichia coli pXen7 для скрининга красителей на фотобактерицидную активность. С использованием этой тест-системы исследован широкий круга сенсибилизаторов - фенотиазинов, порфиринов, хлоринов и фталоцианинов с зарядом молекул от (-8) до (+16).
Высокая эффективность и широкий спектр действия октакатионного фталоцианина цинка подтверждены на типовых и клинических штаммах микроорганизмов, в том числе устойчивых к антибиотикотерапии.
Разработаны новые методы фотодинамической инактивации микроорганизмов, включая патогенные бактерии, дрожжевые грибы рода Candida и вирус «птичьего гриппа» подтипа H5N1.
Разработана система, включающая фотосенсибилизатор из ряда катионных металлофталоцианинов и светодиодный источник красного излучения с соответствующими спектральными характеристиками, которая позволяет эффективно инактивировать широкий спектр патогенных микроорганизмов и может использоваться в фотодинамической терапии грибковых и бактериальных заболеваний.
Научные положения, обоснованные в работе, используются в курсах лекций и практикумах по биофизике для студентов и аспирантов кафедр биофизики и био инженерии биологического факультета МГУ.
Положения, выносимые на защиту.
1. Инактивация дрожжевых грибов видимым светом опосредуется эндогенным порфириновым фотосенсибилизатором(ами). Воздействия, приводящие к внутриклеточному накоплению эндогенного протопорфирина IX, повышают фоточувствительность дрожжевых клеток.
2. У дрожжевых грибов с высоким уровнем содержания эндогенного протопорфирина наблюдаются множественные морфологические и IX функциональные нарушения, затрагивающие митохондриальный и генетический аппараты клеток, а также барьеры клеточной проницаемости.
3. Дрожжевые грибы, включая эталонный и клинические штаммы Candida albicans, представляют собой новые объекты, чувствительные к фотосенсибилизации с хлоринами и поликатионными замещенными фталоцианинами.
4. Бактериальная биолюминесцентная тест-система на основе генно инженерного штамма E.coli pXen7 является эффективным инструментом для качественного анализа фотобактерицидных свойств красителей.
5. Наибольшей фотобактерицидной активностью обладают красители, молекулы которых несут положительный заряд. Эффективность фотодинамической инактивации грамотрицательных бактерий возрастает с увеличением количества положительно заряженных заместителей в молекулах красителей.
6. Эффективность фотодинамической инактивации грамотрицательных бактерий поликатионными замещенными фталоцианинами возрастает с увеличением количества связанного клетками красителя.
7. Поликатионные замещенные металлофталоцианины обладают широким спектром антимикробной активности и являются перспективными соединениями для фотодинамической терапии и фотообеззараживания.
Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на 12-м Международном конгрессе по фотобиологии, Вена (Австрия), 1996;
3-м Съезде по радиационным исследованиям, Пущино (Россия), 1997;
Междунар. симпозиуме “Проблемы и направления фотобиохимии”, Москва (Россия), 1997;
2-ой Междунар.
биофизической конференции, Каир (Египет), 1998;
8-ой Междунар. конференции по спектроскопии и химии порфиринов и их аналогов, Минск (Беларусь), 1998;
2-м и 3-м Съездах биофизиков России, Москва (Россия), 1999 и Воронеж (Россия), 2004;
2-м и 3-м Европейских биофизических конгрессах: Орлеан (Франция), 1997 и Мюнхен (ФРГ), 2000;
1-м, 4-м и 5-м Всероссийских конгрессах по медицинской микологии, Москва (Россия), 2003, 2006, 2007;
11-м Всемирном конгрессе Международной фотодинамической ассоциации (IPA), Шанхай (Китай), 2007;
Научно-практической конференции «Современные методы диагностики и лечения заболеваний роговицы и склеры», Москва (Россия), 2007;
Научно-практической конференции «Лазерные технологии в оториноларингологологии», Тула (Россия), 2007;
6-ой Научно практической конференции «Фармакологические и физические методы лечения в оториноларингологии», Москва (Россия), 2008;
5-м Съезде фотобиологов России, Пущино (России), 2008;
5-ой Международной конференции по порфиринам и фталоцианинам (ICCP-5), Москва (Россия), 2008;
1-ой Междунар. Рабочей Встрече «Применение редокс-технологий в окружающей среде», Стамбул (Турция), 2009;
5-м, 8-м, 10-м и 13-м Конгрессах Европейского общества фотобиологов (ESP): Марбург (Германия), 1993, Гранада (Испания), 1999, Вена (Австрия), 2003;
Вроцлав (Польша), 2009;
15-м Международном конгрессе по фотобиологии, Дюссельдорф (ФРГ), 2009.
Основные результаты доложены и обсуждены на специализированном научном семинаре в Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 56 печатных работ, в том числе 18 статей в изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования и науки;
тезисов докладов в материалах съездов, конгрессов, симпозиумов, Всероссийских, международных и региональных конференций;
получено 8 патентов Российской Федерации.
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 292 страницах, содержит 72 рисунка и 12 таблиц. Она состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей изложение и обсуждение результатов (5 глав), заключения, выводов, приложения, в котором дается описание объектов и методов исследования, и списка цитируемой литературы, насчитывающего 426 наименований, в том числе 72 отечественных и 354 зарубежных авторов.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Глава I. Роль эндогенных порфиринов в сенсибилизации дрожжей к видимому свету Для спектров флуоресценции суспензий целых клеток дрожжей характерно наличие ряда максимумов (табл. 1), сходных с таковыми у бактерий и отражающих наличие эндогенных порфириновых соединений.
Таблица 1. Флуоресцирующие эндогенные порфирины в клетках бактерий (по литературным данным) и дрожжей Эндогенные порфирины Максимумы Максимумы флуоресценции флуоресценции в клетках бактерий, нм в клетках дрожжей, нм Zn-содержащие порфирины 580-592 Mg-содержащие порфирины 587-597 Уро- и копропорфирин 615-622 Протопорфирин IX 630-635 630- В области 580-610 нм расположены главные максимумы флуоресценции металлосодержащих порфиринов [Csatorday et al., 1981;
Johnsson et ql., 1987;
Szocs et al., 2001]. Свободные порфирины флуоресцируют при 615-635 нм [Nitzan et al., 2004;
Askenazi et al., 2003;
Ramstad et al., 2005], вторые, менее интенсивные полосы их флуоресценции лежат в области 680-700 нм.
При исследовании природы фоточувствительности дрожжей необходимо было определить тип(ы) эндогенных порфиринов, опосредующих эффекты видимого света, локализацию фотосенсибилизаторов в клетке, а также зарегистрировать фотосенсибилизированные эндогенными порфиринами морфологические и функциональные нарушения в клетках и субклеточных структурах. С этой целью проведены спектральный и хроматографический анализ экстрактов из целых клеток и фракций субклеточных структур - митохондрий, ядер и плазматических мембран.
Протопорфирин IX является наиболее эффективным фотосенсибилизатором среди эндогенных порфиринов, накапливающихся в дефицитных по биосинтезу гема клетках дрожжей [Zoladek et al., 1996]. В экстрактах из клеток диких штаммов дрожжей нами обнаружен протопорфирин IX в количестве около 3 пмоль/мг белка у Saccharomyces cerevisiae rad+/rad+ и 2 пмоль/мг белка у Candida guilliermondii.
Содержание протопорфирина у дрожжей оказалось значительно меньше по сравнению с животными клетками [Hua et al., 1995]. Это может быть связано с высокой специфической активностью [Hunter et al., 2008] дрожжевой феррохелатазы (катализирует включение двухвалентного железа в протопорфирин IX), в 6-10 раз большей по сравнению с соответствующим ферментом из клеток млекопитающих.
Конечная стадия образования протопорфирина IX из протопорфириногена проходит во внутренней митохондриальной мембране [Gora et al., 1996]. Во фракции изолированных митохондрий относительное содержание протопорфирина IX было значительно выше, чем в других компонентах клетки: 80 пмоль/мг белка у S. cerevisiae rad+/rad+ и 45 пмоль/мг белка у C. guilliermondii.
Локализация протопорфирина в митохондриях обусловливала IX фотоингибирование потребления кислорода клетками обоих штаммов (рис. 1), эффективность которого была значительно выше у S. cerevisiae, очевидно вследствие более высокого содержания фотосенсибилизатора.
Известно, что при накоплении эндогенного протопорфирина IX в животных клетках может происходить его перераспределение из митохондриальных в плазматическую [Gaullier et al., 1995] и ядерную мембраны [Krammer and Uberriegler, 1996]. Во фракции плазматических мембран, изолированных из дрожжей S. cerevisiae, нами также был обнаружен протопорфирин IX, однако в количестве в 5 раз ниже чем в митохондриях (17 + 3 пмоль/мг белка), в то время как в ядерной фракции дрожжевых клеток порфириновые соединения отсутствовали.
В облученных видимым светом и обработанных флуоресцирующим красителем примулином суспензиях дрожжей при визуальном подсчете в камере Горяева наблюдалось увеличение количества клеток, цитоплазма которых прокрашивалась примулином (рис.1). Возможность визуализации мертвых дрожжевых клеток на основании генерализованной прокрашиваемости примулином [Meissel et al., 1961] связывают с нарушением барьерных свойств плазматических мембран [Graham and Caiger, 1969;
Streiblova et al., 1984], приводящим к появлению их проницаемости для флуорофора. В жизнеспособных клетках дрожжей примулин связан со структурными компонентами клеточных стенок кнаружи от плазматической мембраны.
Рис. 1.
Дозовые зависимости выживаемости дрожжей (1), интенсивности митохондриального дыхания - потребления кислорода суспензиями клеток (2) и прокрашивания клеток флуорохромом 100 Б примулином (3) при 80 облучении суспензий Интенсивность дыхания, % 60 клеток видимым светом Выживаемость, % 400-600 нм.
40 20 C. guilliermondii 0 10 20 30 Доза видимого света, Дж/см Несмотря на большее относительное содержание протопорфирина в изолированных митохондриях по сравнению с плазматическими мембранами дрожжей, накопление ТБК-активных продуктов (см табл. 2 в главе 2), отражающее протекание процессов перекисного фотоокисления липидов (ПФОЛ), протекало в них менее интенсивно. Это может быть связано с высокой активностью локализующихся в митохондриях антиоксидантных систем, что необходимо учитывать при анализе вклада фотоповреждений различных клеточных структур в летальный эффект. Так, интенсивность ПФОЛ в плазматических мембранах в составе интактных дрожжевых клеток может быть существенно снижена по сравнению с изолированными плазматическими мембранами за счет активности цитоплазматических антиоксидантов.
Для морфологической картины (рис. 2) облученных видимым светом клеток дрожжей наиболее характерно изменение структуры митохондрий (потеря формы, набухание, нарушение параллельности крист). В отдельных случаях наблюдалось отслоение протопласта от плазматической мембраны, уменьшение электронной плотности клеточной стенки. В ядрах клеток видимые морфологические изменения выявлены не были.
Рис. 2. Электронная микрофотография контрольных и облученных видимым светом в дозе 22 Дж/см2 клеток Saccharomyces cerevisiae rad+/rad+.
Индуцированные активными формами кислорода повреждения ДНК дрожжей включают апуриновые/апиримидиновые участки и разрывы цепи [Swanson et al., 1999;
Vance et al., 2001], возникающие в ходе эксцизионной репарации окисленных оснований [Girard and Boiteux, 1997]. Репарация двухцепочечных разрывов ДНК у дрожжей осуществляется путем негомологичной и гомологичной рекомбинации [Shrivastav et al., 2008]. Последняя представляет RAD52-зависимый тип репарации [Symington, 2002] и функционирует, например, при повреждении дрожжевых клеток экзогенной перекисью водорода [Ragu et al., 2007]. Однако в наших экспериментах, клетки мутантного штамма S. cerevisiae rad52, дефицитные по пострепликативной рекомбинационной репарации и чувствительные к образованию разрывов ДНК, инактивировались видимым светом с той же эффективностью, что и дикий штамм.
Это указывает на отсутствие или малый вклад повреждений ДНК в летальный фотодинамический эффект и согласуется с тем фактом, что в ядерной фракции порфирины обнаружены не были. Фотосенсибилизированная инактивация дрожжей видимым светом принципиально отличается, таким образом, от таковой на длинноволновом ультрафиолете (УФА) с участием другого эндогенного фотосенсибилизатора – НАДН [Фрайкин с соавт., 1987;
1991]. Ядерная локализация НАДН определяет высокую чувствительность штамма S. cerevisiae rad52 к УФА диапазону.
Порфириновое производное П675. В отличие от S. cerevisiae, в плазматических мембранах C. guilliermondii протопорфирин IX обнаружен не был, однако найдено эндогенное порфириновое производное (по нашей оценке в количестве около пмоль/мг белка), условно обозначенное П675. Это производное обладало сдвинутым в длинноволновую область максимумом флуоресценции (683 нм в составе мембран и 675 нм в экстрактах, рис. 3), что отличало его от протопорфирина IX (630-635 нм).
Интенсивность флуоресценции, о.е.
675 нм Рис. 3. Спектры возбуждения флуоресценции (-) и флуоресценции (- - -) этилацетатного экстракта из изолированных плазматических мембран дрожжей C. guilliermondii.
400 500 600 Длина волны, нм Форма с близкими спектральными характеристиками была зарегистрирована нами также в процессе фотовыцветания эндогенного протопорфирина IX у дрожжей S. cerevisiae (см главу II), а также у животных клеток, где она была идентифицирована [Bagdonas et al., 2000] как фотопротопорфирин - окисленная форма протопорфирина хлоринового типа.
На клеточном уровне у облученных дрожжей C. guilliermondii наблюдали как по появлению проницаемости для флуорохрома примулина, так и увеличению микровязкости плазматических мембран протопластов (рис. 1 и 4). При этом увеличение степени эксимеризации зонда пирена в облученных протопластах дрожжей наблюдалось при двух длинах волн возбуждающего света ( возб 323 нм и 285 нм) (Рис. 4), что связывают [Владимиров и Добрецов, 1980;
Орлов с соавт, 1981] с фотоиндуцированным увеличением микровязкости в липидном бислое и области липид-белковых контактов.
2, Рис. 4. Дозовые зависимости фотоиндуцированного возб. флуор-и пирена увеличения микровязкости Iфл 450 нм / Iфл 373 нм при 285 нм плазматических мембран 2, протопластов дрожжей C. guilliermondii, измеренной по отношению интенсивности флуоресценции эксимеров и 1,5 мономеров зонда пирена (Iфл 450 нм / Iфл 373 нм) при возб 285 нм или 323 нм.
возб. флуор-и пирена при 323 нм 1, 0 4 8 Доза 400-600 нм, Дж /см Эффективность ПФОЛ, что видно по накоплению ТБК-активных продуктов в плазматических мембранах C. guilliermondii, снижалась в присутствии азида натрия, имеющего максимальную из всех известных соединений константу тушения синглетного кислорода – порядок 109 М-1сек-1, и повышалась в D2O, где время жизни синглетного кислорода увеличивается более чем на порядок (рис. 5). То есть, в соответствии с имеющимися в литературе представлениями, эндогенный П аналогично протопорфирину IX индуцировал фотодинамические реакции второго типа с участием синглетного кислорода.
ТБК-активные продукты, нмоль/мг белка Рис. 5. Влияниие D2O и 4 D2О азида натрия (NaN3, 10 мМ) на перекисное фотоокисление липидов в изолированных 2 плазматических мембранах Н2О C. guilliermondii.
Н2О+NaN 0 10 20 30 40 Доза 400-600 нм, Дж/см Таким образом, инактивация дрожжей видимым светом является результатом протекания окислительных деструктивных процессов в важнейших мембранных структурах клеток. Чувствительность дрожжей к солнечному свету видимого диапазона спектра в естественных условиях невелика. Это может быть обусловлено низким содержанием эндогенного протопорфирина IX и его производных, при котором соблюдается баланс между интенсивностью образования окислительных фотоповреждений субклеточных структур и активностью антиоксидантных защитных систем [Гесслер с соавт, 2007]. При увеличении содержания эндогенного протопорфирина IX следовало ожидать возрастания фоточувствительности клеток.
Нами была предпринята попытка смоделировать подобную ситуацию, индуцируя в дрожжевых клетках аналог «протопорфирии».
Глава II. Фотосенсибилизация дрожжей в условиях индуцированного накопления эндогенных порфиринов Исходным материалом для биосинтеза тетрапиррольных соединений являются сукцинил-СоА и глицин, из которых образуется 5’-аминолевулиновая кислота (АЛК), и далее - порфобилиноген и исходный тетрапиррол – уропорфириноген.
Последующие интермедиаты (копро- и протопорфириноген, протопорфирин) становятся все более гидрофобными, непосредственный предшественник гема протопорфирин IX имеет высокое сродство к мембранным липидам и локализуется во внутренних митохондриальных мембранах, где феррохелатаза катализирует включение в него двухвалентного железа.
Накопления эндогенных порфиринов можно ожидать при нарушении регуляторных механизмов биосинтеза гема. Хотя такая регуляция у дрожжей изучена недостаточно, отдельные данные указывали на способность конечного продукта гема влиять на активность АЛК-синтазы по принципу отрицательной обратной связи, так, как это имеет место в большинстве животных клеток. Для индукции накопления протопорфирина у животных наиболее известен прием введения АЛК извне, лежащий в основе фотодинамической терапии с участием эндогенного протопорфирина [Peng et al., 1998]. В то же время, в отличие от животных клеток, у дрожжей стадия образования АЛК из глицина и сукцинил-КоА может не являться лимитирующей вследствие высокого исходного содержания эндогенной АЛК (до 1,5 мМ у S.
cerevisiae) [Labbe-Bois and Labbe, 1990]. Действительно, выращивание культур дрожжей в присутствии АЛК (до 2 мМ) не влияло на содержание в них протопорфирина и фоточувствительность клеток.
Эффективным способом индукции накопления протопорфирина у дрожжей оказалось ингибирование заключительной стадии его превращения в фотодинамически неактивный гем. На лабораторных культурах дрожжей это было достигнуто путем выращивания S. cerevisiae в присутствии 0,2 мМ 2,2’-дипиридила, а C. guilliermondii - при сочетанном воздействии 2,2’-дипиридила и 0,2 мМ АЛК.
Потребление кислорода такими клетками было вдвое ниже по сравнению с контрольными, что свидетельствует об ингибировании митохондриального дыхания.
Показано, что у дрожжей S. cerevisiae среди генов, кодирующих ферменты цепи биосинтеза гема, дефицит железа приводит только к репрессии HEM (феррохелатазы) [Hausmann et al., 2007]. Этим объясняется тот факт, что при выращивании дрожжей в присутствии 2,2’-дипиридила протопорфирин (субстрат феррохелатазы) оказался доминирующим флуоресцирующим порфирином в клетках (рис. 6). У S. cerevisiae 2,2’-дипиридил индуцировал увеличение содержания эндогенного протопорфирина в 6 раз до 18 пмоль/мг белка. Это приводило к 7 кратному увеличению фоточувствительности клеток, Д37 снижалась с 20 до 3 Дж/см2.
Необходимость дополнительного введения АЛК для достижения высокого уровня накопления протопорфирина и фотоинактивации у C. guilliermondii может отражать снижение эндогенной активности АЛК-синтазы в присутствии хелатора 2,2’ дипиридила. При дефиците железа у дрожжей включается Cth1/2-зависимый регуляторный механизм, направленный на деградацию мРНК, кодирующих белки, в том числе АЛК-синтазу, участвующие в железо-зависимых метаболических процессах [Puig et al., 2005;
2008].
Индуцированное 2,2 -дипиридилом накопление эндогенного протопорфирина IX у S. cerevisiae наиболее интенсивно протекало в митохондриях, где его уровень повышался более чем в 4 раза, тогда как в плазматических мембранах - в 1,8 раза (табл. 2).
Таблица 2. Влияние 0,2 мМ 2,2 -дипиридила на содержание протопорфирина IX и процессы перекисного фотоокисления липидов в митохондриях и плазматических мембранах дрожжей S. cerevisiae rad+/rad+ при облучении видимым светом в дозе 7,2 Дж/см2 (р0,05;
n=3) Условия Протопорфирин IX, нмоль/мг ТБК-активные продукты, выращивания белка нмоль/мг белка клеток митохондр. плазм. митохондр. плазм.
мембраны мембраны Без добавок 0,080+ 0,015 0,017 + 0,003 0,20+ 0,05 0,50+ 0, + 0,2 мМ 0,340+ 0,035 0,030+ 0,005 2,00+ 0,25 1,10+ 0, дипиридила 550 600 650 700 350 400 450 500 550 600 0, C. guilliermondii C. guilliermondii S. cerevisiae S. cerevisiae Инт. флуоресценции, о.е.
0, Оптическая плотность 0, 0, 0, 0 0, 10 мкМ КП 1.0 мкМ КП 5 мкМ ПП IX 0.5 мкМ ПП IX 0, 30 мкМ Zn ПП IX 0.5 мкМ Zn ПП IX Оптическая плотность Инт. флуоресценции, о.е.
0, 0, 0, 0, 0, 0 0, 550 600 650 700 350 400 450 500 550 600 Длина волны, нм Рис. 6. Спектры флуоресценции и поглощения хлороформных экстрактов из клеток дрожжей, выращенных с 0,2 мМ 2,2'-дипиридила (S. cerevisiae) или 2,2'-дипиридила и 0,2 мМ 5-аминолевулиновой кислоты (C. guilliermondii), а также некоторых порфиринов в хлороформе. КП – копропорфирин, ПП IX – протопорфирин IX, Zn ПП IX – Zn-содержащий комплекс протопорфирина IX.
Поскольку двухвалентное железо является ингибитором Zn-хелатазной активности феррохелатазы [Camadro and Labbe, 1982], его недостаток может приводить к накоплению Zn-содержащего протопорфирина. В спектрах флуоресценции хлороформных экстрактов из митохондрий дрожжей S. cerevisiae, выращенных в присутствии 2,2’-дипиридила, нами зарегистрировано 10-кратное увеличение интенсивности флуоресценции при 585 нм, характерной для Zn протопорфирина [Csatorday et al., 1981] (рис. 7).
В отличие от митохондрий, в плазматических мембранах Zn-протопорфирин практически не накапливался. Это свидетельствует о низкой способности Zn протопорфирина к перераспределению из митохондрий по другим мембранным клеточным структурам. В ряде работ отмечается малая фотодинамическая активность Zn-протопорфирина [Scott et al., 1990;
Ladan et al., 1993]. Мы индуцировали переход протопорфирина IX в Zn-протопорфирин введением ацетата цинка в растущую с 2,2' дипиридилом культуру дрожжей (рис. 8). Такие клетки действительно оказались более устойчивыми к видимому свету по сравнению с выращенными только с с 2,2' дипиридилом, Д37 - 15 Дж/см2.
В плазматических мембранах дрожжей под воздействием 2,2 -дипиридила содержание протопорфирина IX повышалось в 1,76 раза, а фотоиндуцированное накопление ТБК-активных продуктов - в 2,2 раза (табл. 2).
Инт. флуоресценции (опыт - контроль), о.е.
Интенсивность флуоресценции, отн. ед.
610 нм 630 589 нм 1 585 - 2 - 550 600 650 700 750 550 600 650 Длина волны, нм Длина волны, нм Рис. 7. Спектры флуоресценции ( возб Рис. 8. Разностные (опыт - контроль) 405 нм) хлороформных экстрактов из спектры флуоресценции ( возб. 405 нм) митохондрий дрожжей S. cerevisiae, клеток S. cerevisiae. Контрольные и выращенных без (1) или с 0,2 мМ 2,2'- опытные культуры выращивали 5 ч в дипиридила (2). присутствии 0,2 мМ 2,2'-дипиридила, к опытным за 1 ч до окончания выращивания добавляли 1 мМ ацетата цинка (1) или сульфата магния (2).
У клеток с индуцированным накоплением эндогенного протопорфирина IX:
1) возрастала фоточувствительность;
2) повышался уровень перекисного фотоокисления липидов в субклеточных структурах - митохондриях и плазматических мембранах (табл. 2);
3) усиливались функциональные нарушения (рис. 9) ингибирование потребления кислорода, деструкция барьеров проницаемости плазматических мембран, которую детектировали по появлению прокрашивания цитоплазмы клеток флуорохромом примулином.
Клетки дикого и мутантных по репарации ДНК штаммов дрожжей в присутствии 0,2 мМ 2,2 -дипиридила накапливали примерно одинаковое количество протопорфирина IX. Однако, дефицитные по пострепликативной рекомбинационной репарации дрожжи (штамм rad 52), оказались при этом более чем в 3 раза чувствительнее к повреждающему действию видимого света по сравнению с диким штаммом (см рис. 13, гл. III). Клетки тех же штаммов дрожжей без индуцированного накопления протопорфирина проявляли близкую фоточувствительность (см гл. I).
Это свидетельствует о том, что при индуцированном накоплении протопорфирина IX в фотоинактивацию мутанта rad 52 определенный вклад вносят двухцепочечные разрывы ДНК, индуцированные активными формами кислорода.
клетки с индуц. накопл.
Прокрашенные клетки, % 40 энд. ППIX контрольные клетки 0 5 10 15 Доза 400-600 Дж/см Рис. 9. Фотоиндуцированные инактивация потребления кислорода и увеличение проницаемости к флуорохрому примулину у дрожжей S. cerevisiae rad+/rad+ без и с индуцированным накоплением эндогенного протопорфирина IX (ППIX).
Для морфологической картины облученных клеток дрожжей с высоким уровнем эндогенного протопорфирина IX наиболее характерно образование везикул плазматической мембраны и фрагментация вакуоли (Рис. 10). В отсутствие облучения фрагментацию вакуоли наблюдали у клеток штамма S. cerevisiae sod1, дефицитного по Cu,Zn-супероксиддисмутазе 1 [Coason et al., 1999]. Предполагается, что окислительный стресс играет решающую роль в индукции этого процесса.
Совокупность полученных данных позволяет считать, что фотодинамический летальный эффект у клеток дрожжей с индуцированным накоплением эндогенного протопорфирина IX является результатом взаимодействия деструктивных реакций, протекающих в разных компартментах клетки и затрагивающих различные молекулярные структуры. Рост фоточувствительности плазматических мембран и проявление повреждений генетического аппарата при избыточном накоплении эндогенного протопорфирина может указывать на частичное перераспределение протопорфирина IX из митохондрий в другие субклеточные структуры.
К К Рис. 10. Морфология клеток S. cerevisiae rad+/rad+ с индуцированным накоплением эндогенного протопорфирина IX: слева – контроль (К), без облучения;
справа облучение видимым светом в дозе 3 Дж/см2 (КОЕ – 34%, потребление кислорода – 9% от контроля).
Перераспределение эндогенного протопорфирина может происходит, во первых, в процессе накопления фотосенсибилизатора до облучения. На это указывают наши данные об индуцированном 2,2'-дипиридилом увеличении содержания протопорфирина не только в митохондриях, но и плазматических мембранах клеток дрожжей. Во-вторых, как показано для животных клеток [Rossi et al., 1996;
Moan et al., 1997], релокализация протопорфирина может иметь место в процессе облучения при фотоиндуцированной деструкции митохондрий.
Определенный вклад в фотосенсибилизированное повреждение различных субклеточных структур по-видимому вносят также образующиеся в процессе фотовыцветания протопорфирина его полярные фотопродукты. Так, при образовании фотопротопорфирина - фотопродукта протопорфирина хлоринового типа, который обычно детектируют по характерной флуоресценции при 675 нм, происходит сенсибилизация клеточных мембран раковых клеток [Ma et al., 2001]. В процессе фотовыцветания АЛК-индуцированного протопорфирина в дрожжевых клетках S.
serevisiae мы также наблюдали появление нового максимума флуоресценции при 675 нм (рис. 11), что указывает на возможное образование фотопродукта протопорфирина хлоринового типа. Известно, что этот фотопродукт, как и исходное соединение, обладает фотосенсибилизирующей активностью [Bagdonas et al., 2000], которая может, по-видимому, определять гибель популяции дрожжевых клеток при тех дозах видимого света, когда практически весь пул эндогенного протопорфирина уже обесцвечен. На одну из возможных внутриклеточных локализаций окисленных продуктов протопорфирина хлоринового типа указывает то, что порфириновое производное со сходными физико-химическими свойствами обнаружено нами в плазматических мембранах дрожжей (см гл. I).
Интенсивность флуоресценции, о.е.
0'' Интенсивность флуоресценции, % 620 нм 636 нм 622 5'' 10'' 120" 0,0 0,2 0,4 0,6 0, 550 600 650 Доза 400-600 нм, Дж/см Длина волны, нм Рис. 11. Индуцированное видимым светом 400-600 нм (6 мВт/см2) выцветание флуоресценции (возб. 405 нм) эндогенного протопорфирина IX в суспензиях клеток дрожжей S. serevisiae rad+/rad+. На рисунках приведены результаты характерного эксперимента.
Фотодинамическая активность локализацованного в плазматической мембране эндогенного производного протопорфирина хлоринового типа позволила предположить наличие фотосенсибилизирующего потенциала и у экзогенных красителей этого класса. Ранее сенсибилизация дрожжевых грибов хлоринами не изучалась.
Глава III. Фотодеструктивные процессы в клетках дрожжей, опосредованные экзогенными хлориновыми фотосенсибилизаторами Хлориновые фотосенсибилизаторы (хлорин e6, препарат фотодитазин, хлорин p6, 3-формил-3-девинилхлорин p6) эффективно инактивировали дрожжевые клетки, Д37 составляла менее 1 Дж/см2.
Эксперименты с тушителем синглетного кислорода азидом натрия и антиоксидантом, ингибитором процессов перекисного окисления липидов пропилгаллатом, показали, что оба соединения эффективно защищают дрожжи от сенсибилизированной хлоринами фотоинактивации. Это свидетельствует о фотодинамическом характере индукции процессов перекисного окисления липидов при облучении дрожжей видимым светом в присутствии хлоринов.
При фотосенсибилизации хлоринами дрожжевых клеток наблюдалась высокая степень везикуляризации плазматической мембраны (рис. 12), сопровождающаяся появлением проницаемости для флуорохрома примулина.
А Б Рис. 12. Морфология клеток S. cerevisiae, обработанных 7 мкМ хлорина е6 и облученных видимым светом.
А: КОЕ – 33%, потребление кислорода – 65% от контроля;
Б и В: КОЕ – 10%, потребление кислорода – 37% от контроля.
В Образование отдельных везикул плазматической мембраны дрожжей наблюдали ранее в ответ на окислительный стресс, индуцированный перекисью водорода [Madeo et al., 1999]. Морфологическая картина клеток при фотодинамических воздействиях имела сходство с таковой при действии такого химического окислителя, как перекись водорода, индуцирующей в низких концентрациях (3-5 мМ) апоптический, а в высоких (180 мМ) - некротический тип гибели дрожжей [Madeo et al., 1999;
Phillips et al., 2006]. Как и в случае действия перекиси водорода, фотосенсибилизированная хлоринами гибель дрожжей предотвращалась при предварительном ингибировании биосинтеза белка циклогексимидом, что в литературе рассматривается как свидетельство в пользу активного апоптического пути гибели клеток, для которого необходим синтез белков de novo.
Известно, что под воздействием синглетного кислорода происходит окислительная деструкция такого важнейшего компонента плазматических мембран дрожжей, как эргостерол. Накопление окисленных полярных продуктов эргостерола приводит к изменению физических свойств мембран, способствует увеличению их проницаемости [Bocking et al., 2000]. Снижение содержания эргостерола [Sokol Anderson et al., 1988] или увеличение содержания насыщенных стеролов [Casey and Parks, 1989] приводит к повышению устойчивости дрожжевых грибов к окислительному стрессу. Дефицитные по железу дрожжевые клетки характеризуются низким уровнем содержания эргостерола и увеличением содержания насыщенных жирнокислотных остатков липидов в плазматических мембранах [Ferreira et al., 2004;
Hausmann et al., 2008], что влияет на свойства и функционирование клеточных мембран [Shakoury-Elizeh et al., 2010]. В наших экспериментах дрожжи, в которых дефицит железа создавался хелатором железа 2,2'-дипиридилом, теряли чувствительность к фотосенсибилизации хлоринами. Это указывает на возможность выработки адаптации дрожжевых грибов к фотодеструктивному действию, опосредованному хлориновыми фотосенсибилизаторами.
В отличие от клеток с индуцированным накоплением эндогенного протопорфирина IX при обработке хлоринами фоточувствительность штаммов, дефицитных по репарации ДНК, практически не отличается от дикого (рис.
13). Однако, несмотря на отсутствие повышенной чувствительности мутантных штаммов дрожжей, полностью исключать образование фотосенсибилизированных хлоринами повреждений ДНК нельзя. В пользу возможности образования таких повреждений свидетельствует сходные закономерности остановки деления клеток при фотосенсибилизации хлоринами и при обработке дрожжей менадионом [Flattery O’Brien and Dawes, 1998]. Менадион является генератором супероксидных анион радикалов кислорода и индуцирует остановку деления клеток за счет повреждений ДНК. В обоих случаях имела место остановка деления в фазе G1 клеточного цикла (у дрожжей идентифицируется как клетки без почек [Shapira et al., 2004]).
Рис. 13. Чувствительность к видимому свету 1, Фоточувствительность (1/Д37), см /Дж (400-600 нм) дикого 1,6 контроль (S. cerevisiae rad+/rad+) 0.002 mM хлорин е 1,4 и дефицитных по 0.002 mM энд.ППIX эксцизионной репарации 1, нуклеотидов (rad3) 1, или пострепликативной 0,8 рекомбинационной репарации (rad52) штаммов дрожжей с 0, индуцированным 0, накоплением эндогенного 0,2 протопорфирина IX (ППIX) или экзогенным хлорином е6.
0, Дикий штамм rad3 rad Данные, полученные при исследовании нарушений морфологии клетки, функциональной активности плазматической мембраны, митохондриального и генетического аппаратов при фотосенсибилизации дрожжей экзогенными анионными хлоринами (хлорин e6, препарат фотодитазин, хлорин p6, 3-формил-3-девинилхлорин p6), позволяют считать плазматическую мембрану дрожжевых клеток одной из важнейших мишеней при действии хлориновых фотосенсибилизаторов.
Полученные результаты создали предпосылки для анализа фотобактерицидной активности красителей. Учитывая тот факт, что поверхность бактериальной клетки несет сильный отрицательный заряд, можно было предполагать низкую фотобактерицидную активность у анионных красителей и, напротив, высокую - у катионных.
Глава IV. Антимикробная активность катионных тетрапиррольных фотосенсибилизаторов Среди анионных тетрапиррольных красителей определенной способностью связываться с клетками грамотрицательных бактерий и индуцировать их фотоинактивацию обладает дейтеропорфирин [Nitzan et al., 1994], а также хлорины е и р6 (см ниже табл. 3). Более высокомолекулярные анионные красители, например, Фотофрин (М.в. 1135) [Maisch et al., 2007] не проникают через наружную мембрану и не сенсибилизирует клетки грамотрицательных бактерий E. coli, но активны в отношении грамположительных S. aureus.
Фенотиазины и акридины, проникающие в бактериальные клетки, индуцируют в них фотоповреждения ДНК [Epe et al., 1993;
Bhatti et al., 1998]. При фотосенсибилизации как анионным гематопорфирином так и тетракатионным фталоцианином цинка фотоповреждения в ДНК наблюдаются только при длительных временах (больших дозах) облучения, когда уже имеют место нарушения в клеточных барьерах проницаемости и агрегация цитоплазматических макромолекул [Bertoloni et al., 2000;
Spesia et al., 2009]. Однако, помимо индукции прямых летальных повреждений, окислительный стресс может опосредованно модулировать фоточувствительность микроорганизмов путем активации факторов транскрипции и экспрессии антиоксидантных систем [Rodrigues-Pousada et al., 2004;
Ziegelhoffer and Donohue, 2009]. Предполагается, что эти процессы активируются низкими уровнями повреждения ДНК активными формами кислорода [Rowe et al., 2008]. У бактерий Rhodobacter sphaeroides синглетный кислород активирует экспрессию генов, в том числе cfaS, продукт которого, циклопропан синтаза жирных кислот, участвует в поддержании целостности липидного бислоя мембран и минимизирует чувствительность мембран к окислительной деструкции [Ziegelhoffer and Donohue, 2009].
Условием эффективной прямой фотодинамической инактивации является тесная ассоциация фотосенсибилизатора с биологической мишенью, что следует из малого (10-50 нм) диффузионного радиуса 1О2 в биологической среде [Красновский, 1997;
Ochsner, 1997]. Цитоплазматическая мембрана бактерий отделена от внешней среды клеточной стенкой толщиной от 10 до 80 нм в зависимости от видовой принадлежности. По имеющимся в литературе представлениям [Minnock et al., 1996;
Jori and Brown, 2004], в том числе развиваемым в рамках настоящей работы, отрицательный заряд клеточных стенок грамотрицательных бактерий обусловливает связывание с ними катионных красителей. Справедливость этих представлений была доказана нами на красителях раличных классов: фенотиазинах, порфиринах, хлоринах и фталоцианинах. В этих исследованиях впервые была использована бактериальная биолюминесцентная тест-система на основе генно-инженерного штамма E.coli pXen [Манухов с соавт., 1999].
Возможность применения данной тест-системы для скрининга красителей основана на установленной нами прямой пропорциональной зависимости между фотосенсибилизированным тушением биолюминесценции культуры E. coli pXen7 и уменьшением в ней количества колониеобразующих единиц (КОЕ) (рис. 14).
Разработанная биолюминесцентная бактериальная тест-система позволила в рамках настоящей работы оценить закономерности фотодинамической инактивации в присутствии более чем 50 красителей, относящихся к разным классам соединений и имеющих различные физико-химические свойства. В целом наблюдалось хорошее соответствие данных о фоточувствительности типового штамма E. coli, полученных стандартным методом определения КОЕ, и E. coli pXen7 по тесту тушению биолюминесценции (табл. 3).
Рис. 14. Зависимость интенсивности биолюминесции от выживаемости клеток E. coli КОЕ E.coli pXen7, % TG1 (pXen7), преинкуби рованных 25 мин с 7 мкМ фотодитазина и облученных видимым светом в дозах 10- кДж/м2. Облучение видимым светом до 45 кДж/м2 не влияло на выживаемость и интенсив 1 ность биолюминесценции контрольных, не обработанных 1 10 фотодитазином, клеток.
Биолюминесценция E. coli pXen7, % Таблица 3. Фоточувствительность бактерий E.coli к различным тетрапиррольным фотосенсибилизаторам по тесту тушения биолюминесценции штамма E.coli pXen7 и по колониеобразующей способности типового штамма E.coli ATCC Фотосенсибилизаторы Фоточувствительность бактерий (1/Д50, см2/Дж) по тесту по колониеобразующей биолюминесценци способности и E.coli ATCC E.coli pXen Эндогенный протопорфирин IX 0,12±0,032 0,07±0, Фотогем, 20 мкМ 0,02±0,003 0,02±0, Хлорин p6, 20 мкМ 0,10±0,01 0,11±0, Хлорин е6, 20 мкМ 0,19±0,020 0,22±0, Гидразид циклоимид 0,48±0,050 0,52±0, бактериохлорина, 10 мкМ Тетрайодид тетракис 5,10,15,20-(4-три 0,67±0,080 0,72±0, метиламинофенил)порфирин, 10 мкМ Среди исследованных групп красителей наибольшей фотобактерицидной активностью обладали поликатионные замещенные металлофталоцианины. При этом фотобактерицидным действием по тесту тушения биолюминесценции обладали фталоцианины, молекулы которых имеют положительно заряженные заместители (табл. 4).
Таблица 4. Тушение флуоресценции ((F0 –F)/F0) красителей клетками E. coli pXen7 (3 х 107 КОЕ/мл в H2Oдист) и фотоинактивация бактерий белым светом в дозе Дж/см2 по тесту подавления биолюминесценции ((B0 – B)/B0) в присутствии фталоцианинов с различными ионными заместителями и квантовыми выходами генерации синглетного кислорода ( ). Измерения интенсивности флуоресценции и биолюминесценции проводили через 10 мин после добавления 1 мкМ красителей и инкубации при 20-220С.
(F0 –F)/F0,, % (B0 – B)/B0, % Фталоцианины ( )* AlPc3- 2,8±0, (0,38) AlPcPym4+ 47,0±3,0 17±2, (0,20) AlPcPym8+ 80,0±6,0 52±5, (0,37) ZnPc8- 4,3±0,5 2±1, (0,57) ZnPcPym4+ 20,5±1,5 29±3, (0,10) ZnPcPym8+ 77,0±5,0 63±5, (0,45) ZnPcChol8+ 98,0±2,0 87±6, (0,65) * Значения приведены по данным Н.А.Кузнецовой с соавторами [Кузнецова с соавт., 2002;
Kuznetsova et al., 2003;
Makarov et al., 2007] Из сравнения фотобактерицидной активности красителей AlPc3-, AlPcPym4+ и AlPcPym8+, а также ZnPc8-, ZnPcPym4+ и ZnPcPym8+, следует, что наличие положительно заряженных групп на периферии макроцикла оказывает решающее влияние на фотоинактивацию бактерий E. coli pXen7. Возрастание фотобактерицидной активности красителей при увеличении количества положительно заряженных заместителей с 4 до 8 (сравните AlPcPym4+ и AlPcPym8+, ZnPcPym4+ и ZnPcPym8+) может быть обусловлено как возрастанием, так и эффективности связывания с бактериальной клеткой.
Первичной и критической стадией антимикробного действия поликатионных фталоцианинов, аналогично катионным антимикробным пептидам, может являться электростатическое взаимодействие с липополисахаридами клеточных стенок грамотрицательных бактерий. При ассоциации катионных красителей акридинового оранжевого и сафранина О с изолированными липополисахаридами происходит тушение флуоресценции красителей [Panda and Chakraborty, 1997]. При исследовании связывания фталоцианинов с бактериальными клетками (табл. 4), а также изолированными липополисахаридами E. coli мы также наблюдали падение сигнала флуоресценции у катионных соединений.
Для анализа процессов связывания красителей с бактериями в настоящей работе впервые применен метод флуоресцентной корреляционной спектроскопии (ФКС), позволяющий следить за изменением подвижности объектов, размер которых меньше размеров конфокального объема (несколько фемтолитров), определять яркость частиц и концентрацию флуоресцирующих частиц в суспензии [Перевощикова с соавт., 2009]. Данный метод успешно используется для исследования взаимодействий лиганд-рецептор [Briddon and Hill, 2007], связывания флуоресцирующих молекул с надмолекулярными комплексами, процессов агрегации, функционального состояния митохондрий.
Измерение методом ФКС автокорреляционной функции G - параметра, отражающего количество флуоресцирующих частиц - N (прокрашенных клеток) в конфокальном объеме ( G ( ), показало, что в случае анионного красителя 0) N т.е. AlPc3- практически не добавление бактерий не приводит к изменениям G взаимодействует с клетками (рис. 15). Напротив, в случае AlPymPc4+ и AlPymPc8+ при добавлении бактерий амплитуда функции G существенно возрастала. Полученные данные свидетельствуют, что бактериальные клетки практически не связывают анионный краситель, но прокрашиваются катионными.
Рис. 15. Характерные 0, Значение автокорреляцинонной функции автокорреляционные функции G() для суспензии клеток E. coli pXen7 (3,3 х 107 КОЕ/мл) в 0, присутствии 1 мкМ красителей (1-3), а также контрольные кривые для красителей в отсутствие 1, 4, 5, 0, бактериальных клеток (4-6):
1, 4 - AlPc3-;
1E-6 1E-5 1E-4 1E-3 0,01 0,1 1 10 2, 5 - AlPymPc4+;
Время,c 3, 6 - AlPymPc8+ Количество прокрашенных клеток N было примерно на 50% выше для окта- по сравнению с тетракатионным фталоцианином алюминия, и в 5 раз для окта- и тетракатионных фталоцианинов цинка (рис. 16). Это в целом соответствует данным по тушению флуоресценции этих красителей бактериями E. coli pXen7 (см табл. 4), которое, как мы предполагаем, обусловлено именно связыванием красителей с клетками. Эффективность тушения была в 1,7 раза выше для окта- по сравнению с тетракатионным фталоцианином алюминия, и в 3,8 раза для окта- и тетракатионных фталоцианинов цинка.
Рис. 16. Зависимость количества прокрашенных клеток E. coli pXen (флуоресцирующих частиц в конфокальном объеме, N) от 20 заряда молекул поли N катионных замещенных фталоцианинов алюминия или цинка.
AlPcPym4+ AlPcPym8+ ZnPcPym4+ ZnPcPym8+ В суспензии клеток с постоянной плотностью с увеличением общей концентрации октакатионного красителя до 1 мкМ наблюдался практически линейный рост интенсивности флуоресценции отдельных частиц (прокрашенных клеток), что может отражать заполнение красителем мест связывания на бактериальной клетке. По нашим расчетам, одна бактериальная клетка E. coli может связать около миллиона молекул октакатионного фталоцианина.
Присутствие в среде солей магния или кальция вызывало уменьшение фотодинамического подавления биолюминесценции, т.е. защиту бактерий от инактивации (рис. 17). Это может быть связано, с одной стороны, с прямым конкурентным взаимодействием поликатионов фталоцианинов и бивалентных катионов с центрами связывания на поверхности бактериальной клетки (например, отрицательно заряженными группами ЛПС), а с другой - с повышенной проницаемостью клеточной стенки для красителей в отсутствии стабилизирующих катионов Mg2+ и Ca2+.
Электростатическое связывание с липополисахаридами наружной мембраны грамотрицательных бактерий является первичной стадией антимикробного действия различных катионных соединений, в том числе антимикробных пептидов [Glukhov et al., 2005]. Однако, с применением ЛАЛ-теста (Лизат Амебоцитов Лимулюс тест) нами показано, что в отличие от действия антимикробных пептидов, поликатионные фталоцианины не вызывали высвобождения липополисахаридов или их нейтрализацию. Фотодинамическая обработка также не приводила к выбросу липополисахаридов из клеточных стенок инактивированных бактерий и не влияла на нативность этих бактериальных эндотоксинов в бесклеточной среде, а также в составе клеток.
Рис. 17. Защитное действие солей на фото инактивацию (ФИ) E. coli pXen7по тесту CaCl подавления Защита от ФИ, отн.ед.
биолюминесценции.
MgCl Соли вносили в суспензию бактерий за 5 мин до добавления 0,5 мкМ ZnPcChol8+, инкубировали NaCl 10 мин и облучали белым светом в дозе 6 Дж/см2.
За единицу принят эффект 0 2 4 6 8 защиты в Концентрация соли, мМ дистиллированной воде.
Известно, что у грамположительных бактерий клеточная стенка более просто устроена по сравнению с грамотрицательными видами. Экзогенные красители, которые не активны в отношении грамотрицательных бактерий, фотосенсибилизируют грамположительные [Jori and Brown, 2004]. В то же время тейхоевые и липотейхоевые кислоты создают на клеточных стенках грамположительных бактерий определенную плотность отрицательных зарядов, и, следовательно, могут служить центрами связывания катионных красителей аналогично липополисахаридам грамотрицательных бактерий. Действительно, как показано нами с применением модифицированного латекс-теста, октакатионный фталоцианин цинка опосредует фотосенсибилизацию локализованных в клеточной стенке факторов патогенности золотистого стафилококка, белка А и клампинг фактора В (связанной коагулазы). В то же время анионный краситель такой активностью не обладает (рис. 18).
Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что фотоинактивация бактерий, особенно грамотрицательных видов, в первую очередь определяется эффективностью связывания молекул фотосенсибилизаторов с клетками-мишенями.
Фталоцианины с анионными заместителями (например, октакарбоксифталоцианин цинка), являются эффективными генераторами синглетного кислорода, однако практически не связываются с грамотрицательными бактериями и обладают слабой фотосенсибилизирующей активностью. Фотобактерицидная активность замещенных металлофталоцианинов определяется наличием катионных заместителей на периферии молекул. Высокое сродство катионных фталоцианинов к клеткам грамотрицательных бактерий наиболее вероятно обусловлено отрицательным зарядом липополисахаридов – основного компонента клеточных стенок.
1 Рис. 18. Результаты агглютинационного PASTOREX STAPH-PLUS теста на связанную коагулазу (ClfB) и белок А S. aureus (109 КОЕ/мл):
1 – контроль;
2 – инкубация 10 мин с 1 мкМ AlPc3- и облучение 3 в дозе 9 Дж/см2;
3 –инкубация 10 мин с 1 мкМ ZnPcChol8+ и облучение белым светом в дозе 6 Дж/см2;
4 –то же и облучение в дозе 9 Дж/см2.
Сродство фталоцианинов к бактериям позволяет качественно прогнозировать наличие у них фотобактерицидной активности. Иными словами, только тот краситель, который связался с бактериальной клеткой, обладает способностью ее инактивировать.
Клеточная стенка грибов рассматривается как одна из важнейших мишеней при действии фунгицидов [Carrillo-Munoz et al., 2006]. На ряде катионных соединений показано, что их активность определяется способностью связываться с полифосфатами [Иванов с соавт, 1996] и фосфоманнанами [Harris et al., 2009], несущими отрицательно заряженные остатки фосфорной кислоты, и зависит от их содержания в клеточной стенке дрожжей. С использованием анионных и катионных замещенных металлофталоцианинов нами было установлено, что фотофунгицидная активность зависит от заряда молекул этих фотосенсибилизаторов. Фотодинамическая инактивация дрожжевых грибов наблюдалась только в присутствии тех металлофталоцианинов, молекулы которых несут положительно заряженные заместители. Потеря жесткости клеточных стенок является характерным для фотосенсибилизации дрожжей катионными металлофталоцианинами морфологическим изменением (рис. 19). В отличие от действия хлориновых фотосенсибилизаторов образование везикул плазматической мембраны не наблюдается.
Глава V. Фотосенсибилизаторы для антимикробной фотодинамической терапии и фотообеззараживания В последние годы большое значение придается разработке новых способов борьбы с патогенными микроорганизмами, что обусловлено увеличением количества штаммов, устойчивых к действию традиционных антимикробных препаратов [Cunha, 1998;
Yoshikawa, 2002]. Одним из таких способов может стать фотодинамическая терапия (ФДТ), которая до недавнего времени применялась для деструкции опухолей.
Учитывая высокую активность поликатионных красителей на бактериальной биолюминесцентной тест-системе, а также фотофунгицидную активность хлоринов на лабораторных штаммах дрожжей, представляло интерес оценить возможности практического использования этих групп красителей в антимикробной ФДТ.
А Б В Рис. 19. Морфология клеток C. guilliermondii, обработанных 2 мкМ ZnPcChol8+.
А: без облучения, КОЕ – 95%;
Б: облучение видимым светом, КОЕ – 50%;
В: облучение видимым светом, КОЕ – 10%.
Фотодинамическая активность одного из наиболее перспективных соединений октакатионного замещенного металлофталоцианина (октакис-(холинил)фталоцианина цинка) была подтверждена на 20 эталонных и клинических штаммах бактерий.
Однако при этом обнаружена значительная гетерогенность эффективности фотодинамической инактивации (рис. 20), которая наблюдалась как между штаммами одного вида (эталонный штамм АТСС 25922 и клинический изолят E. coli), так и между различными видами.
Среди энтеробактерий имеется значительная гетерогенность строения олигосахаридов липида А и кора ЛПС. Модификация ЛПС является одним из важных механизмов выработки устойчивости грамотрицательных бактерий к катионным антимикробным пептидам [Weise et al., 1998;
Fresno et al., 2006]. Бактерии P. mirabilis проявляют высокую устойчивость к полимиксину В и протегринам, что связывают с присутствием в ЛПС положительно заряженных молекул аминоарабинозы [MacCoy et al., 2001]. Сходная закономерность наблюдается и в отношении устойчивости этих энтеробактерий к фотодинамической инактивации. Cреди 4-х клинических изолятов из группы энтеробактерий наиболее устойчивыми к фотодинамической инактивации оказались P. mirabilis. Эффективность фотоинактивации E. coli и S. enteritidis была на порядок, а S. marcescens на 2 порядка выше. При этом клетки P. mirabilis связывали ZnPcChol8+ в гораздо меньшей степени по сравнению с E. сoli и S. enteritidis (рис. 21).
Полученные данные свидетельствуют, что, видовая принадлежность бактерий является важнейшим фактором, определяющим эффективность фотодинамической инактивации.
Рис. 20.
КОЕконтр / КОЕопыт, отн. ед.
Эффективность фотодинамической инактивации по тесту уменьшения колониеобразующей способности (КОЕконтр/ КОЕопыт) различных штаммов энтеробактерий после 10 мин инкубации суспензий с исходной Proteus mirabilis Serratia marcescens Salmonella enteritidis Escherichia coli ATCC Klebsiella pneumoniae Campylobacter jejuni NCTC Pseudomonas aeruginosa ATCC Escherichia coli плотностью 108 КОЕ/мл в 0,9% NaCl с 1 мкМ ZnPcChol8+ и облучения белым светом в дозе 9 Дж/см Рис. 21. Связывание октакис (холинил)фталоцианина цинка клетками энтеробактерий (108 КОЕ/мл в 0,9% NaCl).
Количество связанного красителя [ZnPcChol8] связ рассчитано по разнице поглощения красителя (683 = 190000 М-1. см-1) в фильтратах его бесклеточных растворов - [ZnPcChol8] общ и клеточных суспензий после мин инкубации - [ZnPcChol8] своб.
Практическое использование фотодинамической инактивации микро организмов невозможно без разработки эффективных и недорогих источников излучения. Совместно с НПО «Астрофизика» нами создан образец светодиодного источника (JET680-1) с максимумом испускания при 684 нм, что практически совпадает с длинноволновой полосой поглощения октакис-(холинил)фталоцианина цинка (рис. 22), шириной спектральной полосы 25 нм и интенсивностью около мВт/см2 на расстоянии 5 см от линзы излучателя.
Рис. 22. Спектры поглощения 1 мкМ октакис (холинил)фталоцианина цинка ZnPcHol8 и испускания светодиодного источника Светодиодный источник был успешно испытан в целях инактивации широкого круга грамотрицательных и грамположительных бактерий, в том числе метициллин устойчивого штамма S. aureus – 664 MRSA. Исследования по фотодинамической инактивации бактерий легли в основу новых способов лечения гнойных заболеваний лор-органов, разработанных в лабораториях А.В. Решетникова (патент РФ № 2228775) и А.С. Лапченко (патенты РФ № 2282647 и 2361633).
Фотосенсибилизация грибов ранее преимущественно изучалась с применением фенотиазинов (метиленовый синий, толуидиновый синий), отдельных порфиринов и фталоцианинов [Ito and Ito, 1984;
Bertoloni et al., 1992]. В настоящей работе впервые выявлена высокая фотофунгицидная активность амфифильных хлориновых фотосенсибилизаторов, а также поликатионных фталоцианинов.
Большое практическое значение имеет обнаруженная высокая эффективность хлориновых фотосенсибилизаторов в инактивации одного из основных возбудителей кандидозов - C. albicans, как эталонного, так и клинических штаммов. На основании этих исследований разработан новый способ фотоинактивации патогенных грибов (патент РФ № 2230110).
Среди исследованных хлориновых фотосенсибилизаторов особый интерес представляют соединения, имеющие длинноволновые максимумы поглощения в области высокой оптической проницаемости биологической среды, например, у 3 формил-3-девинилхлорин p6 - в дальней красной области спектра при 691 нм. Этот фотосенсибилизатор (в концентрации 10 мкМ) в сочетании с источником на основе светодиода IDL-50-M-690 при интенсивности излучения на уровне образца 20 мВт/см проявлял высокую эффективность в фотоинактивации плотных культур дрожжевых грибов, вплоть до концентрации 5х108 КОЕ/мл. В практическом отношении системы на основе красителей с длинноволновыми максимумами поглощения и соответствующих источников излучения могут быть перспективны для фотоинактивации культур микроорганизмов с высокой плотностью клеток, а также биопленок.
Эффективность применения катионных фталоцианинов в качестве фотофунгицидов показана на клеточных культурах и, совместно с Институтом глазных болезней РАМН (С.Э. Аветисов с соавторами), в системе in vivo на специально разработанной для этих целей животной модели кератомикоза кроликов (патент РФ № 2346338). Актуальность разработки и использования этой животной модели определяется тем, что в последние годы заметно возросла частота грибковых поражений роговицы. Кератиты данной этиологии вызываются грибами, обитающими в конъюнктиве, слезных путях, в контактных линзах, а также попадающими в глаз при его травме. В случаях кератомикозов наиболее часто выделяются дрожжевые грибы рода Candida. Кератит легкой и средней степени тяжести, т.е. поверхностные язвы роговицы, формировали у кроликов с помощью мягких контактных линз, предварительно инфицированных дрожжевыми грибами C. guilliermondii. В отсутствие лечения у животных в результате ношения инфицированных мягких контактных линз в течение 5 суток развивался эндофтальмит, сопровождающийся расплавлением роговицы, некротическим поражением стромы и потерей глаза.
Применение фотодинамической терапии (обработка поверхности роговицы гелем, содержащим 2 мг/мл Холосенса, и облучение с помощью лазерной установки для ФДТ ЛФТ-630/675-01 «Биоспек») приводило к полному выздоровлению животных и по всем показателям (срокам исчезновения гнойного отделяемого, эпителизации и др.) на 10-40% превосходило консервативную противогрибковую терапию с амфотерицином (патент РФ № 2352367).
Фотодинамическая инактивация может быть использована не только в терапевтических целях, но и для фотообеззараживания различных предметов, сред от патогенных микроорганизмов, в том числе вирусной этиологии. Так, использование данного способа с применением катионных фотосенсибилизаторов позволяет надежно обеззараживать жидкости с высокими титрами вируса гриппа А птиц подтипа H5N (патент РФ № 2361633).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ В клетках различного происхождения функционируют многочисленные защитные системы, которые играют существенную роль в обеспечении устойчивости к повреждающему действию оптического излучения солнца. Хорошо известны антиоксидантные системы (глутатионпероксидаза, каталаза, супероксид- дисмутаза, -токоферол, -каротин и др.), которые тушат активные формы кислорода и возбужденные состояния макромолекул. Пигменты поверхностных слоев клеток, такие как флавоноиды и меланины, экранируют лежащие в глубине ткани от фотоповреждений. Ферменты темновой репарации и фотореактивации устраняют образовавшиеся фотоповреждения ДНК.
Накопление в клетках эндогенных фотосенсибилизаторов приводит к развитию потенциально летальных фотоокислительных процессов. Очевидно, что регуляция биосинтеза эндогенных порфиринов также может рассматриваться в качестве механизма, позволяющего уменьшать эффективность повреждающего действия оптического излучения видимого и, частично, длинноволнового ультрафиолетового диапазонов спектра путем снижения содержания этих фотоактивных соединений.
Существование такой регуляции в клетках различного происхождения (от бактериальных, дрожжевых до животных) указывает на важную роль этого процесса в обеспечении безопасного существования организмов в условиях солнечной инсоляции.
Для оценки биологической роли таких процессов необходимо детальное исследование факторов, вызывающих нарушение регуляции на различных стадиях цепи биосинтеза и приводящих к изменению внутриклеточной концентрации и локализации тех или иных порфиринов с различными физико-химическими свойствами и сенсибилизирующей активностью. К ним относятся различные факторы, в том числе генетические, которые ответственны за недостаточность отдельных ферментов в цепи биосинтеза порфиринов. Сюда относится и естественный или искусственно индуцированный хелаторами дефицит такого важнейшего фактора минерального питания как железо, избыток предшественника порфиринов 5’ аминолевулиновой кислоты. 2,2’-Дипиридил относится к хелаторам фенантролинового ряда, которые ранее использовались в качестве фотогербицидов [Rebeiz et al., 1990]. Наши данные свидетельствуют, что накопление эндогенных порфириновых фотосенсибилизаторов при действии хелаторов железа носит более общий характер и имеет место в клетках различного биологического происхождения, что необходимо учитывать при практическом применении такого рода соединений.
Аналогичная проблема поднята в последние годы группой J. Moan [Juzeniene et al., 2007], обнаружившей увеличение содержания эндогенных порфиринов в клетках кожи при местном применении ряда хелаторов железа, которые входят в состав косметических препаратов, используемых для предотвращения старения кожи под действием солнечного УФ.
В то же время наличие и глубокое понимание механизмов регуляции биосинтеза порфиринов позволяет, направленно увеличивая фоточувствительность клеток, использовать фотосенсибилизированные ими процессы в целях инактивации нежелательных образований. Так, к настоящему времени получила развитие фотодинамическая терапия рака, поверхностных бактериальных заражений и ряда других заболеваний, основанная на индуцированном 5’-аминолевулиновой кислотой биосинтезе эндогенных порфириновых фотосенсибилизаторов. Нами разработан новый метод фотодинамической инактивации дрожжей, в том числе Saccharomyces и Candida, в условиях повышенного содержания в клетках эндогенного протопорфирина IX, стимулированного 5’-аминолевулиновой кислотой и/или хелатором 2,2’-дипиридилом. Дрожжевые клетки с искусственно индуцированной «порфирией» представляют собой удобную модель для исследования локализации и возможного перераспределения порфиринов по субклеточным структурам, а также чувствительных к фотосенсибилизации клеточных мишеней. Тот факт, что митохондрии дрожжей являются мишенью деструктивного действия видимого света особенно ярко проявляется в условиях индуцированного накопления эндогенного протопорфирина IX.
Связывание фотосенсибилизаторов с микробными клетками-мишенями имеет определяющее значение при фотоинактивации, опосредованной экзогенными красителями. Особенностью строения микроорганизмов является наличие у них клеточной стенки, толщина которой составляет от 10-15 нм у грамотрицательных бактерий до 100-250 мкм у дрожжей, т.е. равна или превышает пробег синглетного кислорода в биологической среде. Компоненты клеточных стенок (липополисахариды наружной мембраны грамотрицательных и липотейхоевые кислоты грамположительных бактерий, фосфоманнаны и полифосфаты дрожжей) несут отрицательный заряд. Это препятствует связыванию с микробными клетками липофильных или гидрофильных анионных красителей, что суживает круг фотосенсибилизаторов с потенциальной антимикробной активностью. Как показано в настоящей работе, широким спектром антимикробного действия и наибольшей эффективностью обладают те фотосенсибилизаторы, молекулы которых несут положительно заряженные группы. Наиболее вероятным механизмом, обеспечивающим связывание катионных фотосенсибилизаторов микробными клетками, является электростатическое взаимодействие положительно заряженных заместителей в молекулах фотосенсибилизатора с отрицательно заряженными центрами связывания на клеточных стенках.
Работы по изучению фотосенсибилизирующего потенциала синтетических красителей на клетках различного происхождения, как правило, связаны с решением практических задач. Однако, и в данной области, учитывая разнообразие синтезируемых соединений, исследования фундаментальных механизмов взаимодействия красителей с клетками и клеточной гибели в значительной мере способствуют целенаправленному выявлению эффективных препаратов. Таким образом, исследования сложных и многогранных фотосенсибилизированных процессов в биологических объектах представляют собой пример тесного переплетения фундаментальных и прикладных аспектов.
Автор выражает благодарность Правительству г. Москвы, Российскому фонду фундаментальных исследований и Фонду содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере за финансовую поддержку настоящей работы.
Автор выражает глубокую благодарность А.П. Зарубиной и Т.С. Калебиной (Биологический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова) и В.Г. Жуховицкому (ГКБ им.
Боткина) за плодотворное сотрудничество и помощь в проведении экспериментов, а также сотрудникам ФГУП ГНЦ «НИОПИК» за предоставленные образцы красителей.
ВЫВОДЫ 1. Выявлены эндогенные порфириновые фотосенсибилизаторы, опосредующие деструктивное действие видимого света на дрожжевые грибы. Протопорфирин IX опосредует морфологические нарушения в митохондриях и фотоингибирование потребления кислорода клетками, а также, наряду с производным протопорфирина, фотоиндуцированное увеличение микровязкости плазматических мембран.
2. Для повышения фоточувствительности дрожжей разработан способ индуцированного биосинтеза эндогенного протопорфирина IX. У клеток дрожжей с индуцированной «протопорфирией» имеет место множественный характер повреждений в результате частичного перераспределения протопорфирина IX из центров первичной локализации - митохондрий в другие субклеточные структуры.
Увеличение содержания протопорфирина IX в плазматических мембранах приводит к интенсификации перекисного фотоокисления липидов и проявлению функциональных нарушений (потеря барьеров проницаемости).
3. Выявлена высокая фотофунгицидная активность хлоринов (препараты на основе хлорина е6, хлорин p6, 3-формил-3-девинилхлорин p6) и поликатионных замещенных металлофталоцианинов (октакатионные фталоцианин цинка и алюминия). Эффективность этих типов фотосенсибилизаторов в фотодинамической инактивации дрожжевых грибов показана на эталонном штамме и клинических изолятов Candida albicans, а также, для октакатионного фталоцианина цинка, на разработанной животной модели кератомикоза кроликов, что расширяет спектр фотосенсибилизаторов, перспективных для фотодинамической инактивации грибковых заражений.
4. Разработан экспресс метод определения фотобактерицидной активности красителей на основе бактериальной биолюминесцентной тест-системы с генно инженерным штаммом E.coli pXen7. Способ основан пропорциональном уменьшении интенсивности биолюминесценции и количества колониеобразующих единиц при фотосенсибилизирующих воздействиях.
5. Для проявления фотобактерицидной активности поликатионных замещенных металлофталоцианинов принципиальное значение имеет наличие положительно заряженных заместителей в молекулах. Эффективность фотосенсибилизации возрастает при увеличении количества положительно заряженных заместителей от четырех до восьми.
Фотодинамическая инактивация грамотрицательных бактерий 6.
поликатионными замещенными фталоцианинами опосредована связанными с клетками молекулами красителей. На примере представителей группы энтеробактерий (Escherichia coli, Salmonella enteritidis, Serratia marcescens и Proteus mirabilis) показана видовая специфичность связывания клетками октакатионного красителя (октакис-(холинил)фталоцианина цинка) и чувствительности бактерий к фотодинамической инактивации.