Механизмы возникновения и свойства промежуточных, неправильно свернутых и агрегированных форм белков

На правах рукописи

КУЗНЕЦОВА Ирина Михайловна МЕХАНИЗМЫ ВОЗНИКНОВЕНИЯ И СВОЙСТВА ПРОМЕЖУТОЧНЫХ, НЕПРАВИЛЬНО СВЕРНУТЫХ И АГРЕГИРОВАННЫХ ФОРМ БЕЛКОВ 03.00.03 – Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Санкт-Петербург 2006 1

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Вопрос о том, как белки сворачиваются в уникаль ное, компактное, высокоорганизованное, функционально-активное состояние, являет ся одним из центральных вопросов современной молекулярной и клеточной биоло гии. По современным представлениям аминокислотная последовательность каждого конкретного белка, возникшая в результате эволюционного отбора, такова, что в ней запрограммирована структура нативного состояния, путь ее достижения и существо вание свободноэнергетического барьера между нативным и денатурированным со стояниями белка. Последнее означает, что макромолекула белка может находиться либо в нативном, либо в денатурированном состоянии. При этом все макромолекулы нативного белка идентичны, если не считать различий структуры, обусловленных броуновским движением входящих в их состав атомов. Денатурированных состояний может быть несколько. Идентичность всех молекул каждого конкретного белка в на тивном состоянии исключительно важна для его правильного функционирования.

Каждому денатурированному состоянию отвечает ансамбль молекул, отличающихся друг от друга по структуре.

Хотя в клетке имеется много факторов, вовлеченных в процесс правильного сво рачивания полипептидной цепи (ферменты, ответственные за цис-транс изомериза цию пролина и образование "правильных" дисульфидных связей, и шапероны), ни один из этих факторов не несет той информации, которая необходима для приобрете ния полипептидной цепью уникальной нативной структуры, и присутствие этих фак торов не всегда является необходимым условием правильного сворачивания белка.

Многие белки могут правильно сворачиваться из полностью развернутого состояния in vitro. Несмотря на огромное число работ, посвященных фолдингу белков, вопрос о том, каким образом в аминокислотной последовательности белка закодирована его уникальная третичная структура (то, что называют иногда второй частью генетиче ского кода), остается открытым. Основным подходом к решению проблемы фолдинга белков является изучение процессов их разворачивания–сворачивания и характери стика возникающих при этом промежуточных денатурированных частично-сверну тых и неправильно свернутых состояний. Большинство исследований по изучению фолдинга белков выполнено на небольших однодоменных белках, для которых про цесс разворачивания является обратимым. Актуальным является изучение путей раз ворачивания–сворачивания более сложных мультидоменных белков, выяснение во проса о том, насколько одностадийность и обратимость разворачивания коррелирует Принятые сокращения: АНС – 1-анилинонафталин-8-сульфонат, CD – круговой дихроизм, GdnHCl – гуанидинхлорид, ФКТ – фосфоресценция при комнатной температуре.

с размером и мультидоменностью белка, а также то, насколько путь разворачивания, последовательность образования и число возникающих денатурированных чистично свернутых состояний белка зависит от характера денатурирующего воздействия.

Долгое время процессам агрегации белков при фолдинге не уделялось должно го внимания. В настоящее время совершенно очевидно, что изучение агрегации бел ков в процессе фолдинга имеет не только фундаментальное научное, но и большое практическое значение. Оказалось, что биотехнологический процесс получения ре комбинантных белков очень часто осложнен возникновением аморфных агрегатов, накапливающихся в телах включения [1-3]. Возникновение упорядоченных агрегатов – амилоидных фибрилл, является причиной так называемых "конформационных бо лезней" – многих тяжелых заболеваний, таких как нейродегенеративные болезни Альцгеймера и Паркинсона, прионные заболевания и др. [4 -12].

Успех исследований всегда в значительной степени зависит от наличия хорошо отработанных и адекватных методов. Флуоресцентный краситель тиофлавин Т спе цифически взаимодействует только с белками в состоянии амилоидных фибрилл, и при этом интенсивность его флуоресценции возрастает на несколько порядков. Бла годаря этим уникальным свойствам тиофлавин Т является прекрасным средством для диагностики возникновения амилоидных фибрилл в различных тканях и органах и, кроме того, для изучения фибриллозенеза и свойств амилоидных фибрилл in vitro [13, 14, 15]. Однако свойства этого красителя остаются мало изученными (см. Воро пай и др., 2003)1. В связи с этим представлялось чрезвычайно актуальным выполнить исследования спектральных свойств этого красителя, которые бы позволили понять причины существенного (на несколько порядков) увеличения интенсивности флуо ресценции тиофлавина Т при его инкорпорации в амилоидные фибриллы.

Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в изучении особенностей разворачивания–сворачивания однодоменных и двухдоменных белков и свойств воз никающих при этом промежуточных состояний, а также агрегированных форм бел ков, приводящих к необратимости процесса их денатурации. Для достижения постав ленной цели необходимо было решить ряд конкретных задач:

1) Выяснить, насколько одностадийность и обратимость разворачивания– сворачива ния коррелирует с размером и мультидоменностью белка. С этой целью изучить про цессы разворачивания–сворачивания ряда двухдоменных белков (глобулярного акти на, креатинкиназы, дисульфидизомеразы С, глутамин-связывающего белка) и одно доменного белка – карбоангидразы II;

Здесь и далее в круглых скобках приводятся ссылки на работы, представленные в списке публикаций по теме диссертации.

2) Выяснить, насколько путь разворачивания каждого конкретного белка, последова тельность и число возникающих денатурированных частично-свернутых состояний зависит от характера денатурирующего воздействия;

3) Изучить кинетику разворачивания–сворачивания глобулярного актина, механизмы образования инактивированного актина, охарактеризовать свойства кинетических ин термедиатов, возникающих в процессе разворачивания этого белка;

4) Исследовать, на примере глутамин-связывающего белка, роль лигандов в стабили зации структуры белков к денатурирующему воздействию GdnHCl и нагревания;

5) Выяснить, на примере флуоресцентных белков EGFP, DsRed и их мутантных форм, особенности процессов разворачивания–сворачивания белков типа -бочонка и роль четвертичной структуры в стабилизации белков этого класса;

6) Осуществить разработку новых методических подходов для изучения процессов разворачивания–сворачивания белков и для исследования свойств возникающих при этом интермедиатов и агрегированных форм белков и, в частности, выяснить причи ны существенного возрастания квантового выхода флуоресценции тиофлавина Т при взаимодействии с амилоидными фибриллами.

Научная новизна. Ряд результатов, полученных при изучении процессов разворачи вания–сворачивания конкретных белков, получен впервые, в частности, впервые ус тановлено одностадийное, обратимое разворачивание дисульфидизомеразы С, муль тистадийное, но обратимое разворачивание креатинкиназы и глутамин-связывающего белка под действием GdnHCl. Физико-химическими методами впервые прямо показа ны изменения структуры креатинкиназы под воздействием небольших концентраций GdnHCl (0.1 M), ранее обнаруженные по изменению каталитической активности фер мента. Предложена и обоснована принципиально новая схема процессов разворачи вания–сворачивания актина, учитывающая существование вновь обнаруженных ки нетических интермедиатов N* и U*, а также то, что инактивированный актин, ранее считавшийся интермедиатом на пути разворачивания белка, на самом деле является монодисперсным ассоциатом, образование которого препятствует правильному сво рачиванию белка in vitro. Впервые на примере инактивированного актина показано, что GdnHCl может, при определенных условиях, вызывать агрегацию белков. Впер вые флуоресцентные свойства тиофлавина Т (низкий квантовый выход в водных и спиртовых растворах и существенное возрастание квантового выхода при инкорпо рации в амилоидные фибриллы) ассоциированы с принадлежностью этого красителя к классу соединений, известных как молекулярные роторы.

Основные положения, выдвигаемые на защиту.

1. Путь разворачивания, последовательность образования и число возникающих дена турированных частично-свернутых состояний каждого конкретного белка не зави сит от характера денатурирующего воздействия и стабилизации структуры белка при связывании лиганда.

2. Способность белков к одностадийному обратимому разворачиванию нельзя одно значно связывать с их размером и мультидоменностью.

3. Вновь обнаруженные промежуточные состояния актина N* и U* являются кинети ческими интермедиатами на пути разворачивания–сворачивания актина, в то вре мя как инактивированный актин, ранее считавшийся промежуточным состоянием белка, на самом деле является монодисперсным ассоциатом, образование которого препятствует правильному сворачиванию белка in vitro. На основании этих данных предложена принципиально новая схема процессов разворачивания–сворачивания глобулярного актина.

4. Четвертичная структура зеленых и красных флуоресцентных белков EGFP (зелено го мономера), zFP506 (зеленого тетрамера), mRFP1 (красного мономера), “dimer2” (красного димера) и DsRed1 (красного тетрамера) не является единственным фак тором, определяющим различия в их стабильности.

5. Химический денатурант GdnHCl, часто используемый при изучении фолдинга бел ков, может, при определенных условиях, вызывать агрегацию белков.

6. Причиной существенного возрастания квантового выхода флуоресценции тиофла вина Т при его инкорпорации в амилоидные фибриллы является жесткость окру жения, препятствующая повороту бензтиазольного и аминобензольного колец друг относительно друга в возбужденном состоянии. Флуоресцентные свойства тиофла вина Т характерны для соединений, относящихся к классу молекулярных роторов.

Теоретическая и практическая значимость. Сформулированная на основе полученных в работе экспериментальных результатов концепция универсального ха рактера механизма разворачивания–сворачивания каждого конкретного белка, со гласно которой путь разворачивания, последовательность образования и число возни кающих денатурированных частично-свернутых состояний белка не зависит от харак тера денатурирующего воздействия, а также заключение о том, что способность бел ков к одностадийному и обратимому разворачиванию нельзя однозначно связывать с их размером и мультидоменностью обогащают представления о процессах разворачи вания–сворачивания белков и могут быть использованы при дальнейших исследова ниях процесса их фолдинга.

Обнаружение и характеристика ранее неизвестных интермедиатов, а также вы яснение роли инактивированного актина в процессе разворачивания–сворачивания могут являться основой для понимания процессов фолдинга актина in vivo и для про ведения дальнейших исследований, направленных на поиск путей ренатурации пол ностью развернутого актина in vitro с участием факторов, способствующих сворачи ваниию актина в клетке (шаперонина ССТ и префолдина).

Обнаруженную на примере инактивированного актина способность GdnHCl при определенных условиях вызывать агрегацию белков следует учитывать в дальнейшем при использовании GdnHCl в качестве денатуранта в работах по изучению фолдинга белков.

Механизм существенного возрастания интенсивности флуоресценции тиофлави на Т при его инкорпорации в амилоидные фибриллы объяснен на основании пред ставления о том, что тиофлавин Т относится к классу молекулярных роторов. Этот результат имеет существенное значение при проведении работ по исследованию фиб риллогенеза и изучению свойств амилоидных фибрилл.

Введен в практику исследований фолдинга белков метод, основанный на пара метрическом представлении экспериментальных данных, предложенный еще в 1975 г.

Бурштейном [16-17], но долгое время практически не использовавшийся. Метод уже широко используется не только в нашей Лаборатории, но и в других лабораториях (см. например, [18-19]).

Результаты работы используются при проведении лекционно-практических за нятий для студентов Кафедры биофизики СПбГПУ.

Апробация работы. Материалы работы были представлены на 15 Международ ном симпозиуме биохимиков и молекулярных биологов стран Азии и Океании (FAOBMB) "Биохимия и молекулярная биология 21 века" (Пекин, Китай, 2000);

Ме ждународных симпозиумах "Биологическая подвижность: новые направления иссле дований" (Пущино 2001, 2004);

9-й Международной конференции по спектроскопии биологических молекул (Прага, Чехия, 2001);

Международных научных конферен циях "Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосис тем" (Минск, Беларусь, 2002, 2004);

III Съезде биохимического общества (Санкт Петербург, 2002);

V Съезде белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков (Минск, Беларусь, 2002);

Национальной итальянской конференции по биохимии (Рим, Италия, 2003), III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), II Санкт-Петербургской конференции молодых ученых "Современные проблемы науки о полимерах" (Санкт-Петербург, 2006, пленарный доклад).

Финансовая поддержка работы.

Работа выполнена с использованием обору дования ЦКП "Материаловедение и диагностика в передовых технологиях" при фи нансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проекты 99-04-39106 ГФЕН-Китай, 00-04-49224, 00-04-81082 Бел, 01-04-49308, 02-04- ГФЕН-Китай, 02-04-81013 Бел, 02-04-81018 Бел, 04-04-49290), Программы РАН "Молекулярная и клеточная биология", COBAS, INT-0002341(USA), INTAS (грант 01 2347), NATO Collaborative Linkage Grant PST.NR.CLG 981025 (Italy).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 44 работы, из них 28 статей в рецензируемых журналах (11 – в отечественных и 17 – в международных журналах), а также тезисы 16 докладов на всероссийских и международных конференциях, сове щаниях и съездах.

Структура диссертации. Диссертация состоит из Введения, четырех Глав, Вы водов и Списка цитируемой литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Введение Во введении сформулированы цели и задачи исследований, обоснована их ак туальность, приводятся основные положения, выносимые на защиту, рассмотрен во прос о новизне, теоретической и практической значимости сделанных выводов.

Глава 1. Современные представления о процессах фолдинга белков В этой главе дан краткий обзор современных представлений о фолдинге белков in vivo и in vitro. Рассмотрена роль шаперонов при фолдинге белков в клетке, особое внимание уделено роли АТФ-зависимых шаперонов Hsp70 и шаперонина ССТ в клет ках эукариот. Обсуждаются различные модели сворачивания белка in vitro (модель "нуклеации – роста", "стадийного сворачивания" и модель "энергетической воронки"), роль промежуточных денатурированных частично-свернутых состояний белков и пе реходного состояния в образовании нативного белка. Рассмотрены механизмы воз никновения агрегированных форм белков и, в частности, амилоидных фибрилл (Куз нецова и др., 2005а).

Глава 2. Материалы и методы В этой главе дано краткое описание использованных в работе материалов и ме тодов. Сведения о новых собственных методических разработках, использованных при проведении исследований, а также о тех результатах работы, учет которых может быть полезным при проведении исследований процессов разворачивания– сворачивания белков в дальнейшем, представлены в Главе 4.

Глава 3. Факторы, определяющие стабильность и особенности процессов разво рачивания–сворачивания однодоменных и двухдоменных белков В этой главе приведены результаты исследования процессов разворачивания– сворачивания ряда двухдоменных белков: глутамин-связывающего белка, дисульфи дизомеразы С, актина и креатинкиназы. Цель этих исследований состояла в том, что бы выявить особенности разворачивания–сворачивания этого класса белков и, в част ности, рассмотреть вопрос о том, насколько одностадийность и обратимость развора чивания коррелирует с размером, мультидоменностью и наличием лигандов, стабили зирующих белок. В этой же главе, на примере карбоангидразы II, показана возмож ность мультистадийного необратимого разворачивания белка, имеющего однодомен ную структуру. Результаты исследования процессов разворачивания–сворачивания карбоангидразы II интересны также в связи с тем, что при переходе этого белка в со стояние расплавленной глобулы проявляется эффект агрегирующего действия GdnHCl (см. раздел 4.4). Представлены также результаты сравнительного изучения устойчивости к денатурирующему воздействию GdnHCl ряда зеленых и красных флуоресцентных белков, отличающихся по их принадлежности к различным олиго мерным формам: мономера (EGFP) и тетрамера (zFP506) зеленого флуоресцентного белка, мономера (mRFP1), димера ("dimer 2") и тетрамера (DsRed1) красного флуо ресцентного белка предпринятые для выяснения роли четвертичной структуры в ста билизации белков этого класса.

3.1. Обратимое разворачивание глутамин-связывающего белка. Роль ли ганда в стабилизации структуры. Глутамин-связывающий белок из E. coli относит ся к обширному классу двухдоменных лиганд-связывающих белков периплазмы, уча ствующих в процессе активного транспорта различных молекул через цитоплазмати ческую мембрану. Все белки этого класса имеют сходную структуру. Они состоят из двух глобулярных доменов, между которыми в глубокой щели расположен сайт свя зывания лиганда (рис.3.1.1, вставки).

Равновесные зависимости интенсивности триптофановой флуоресценции и па раметра А, характеризующего положение спектра флуоресценции, от концентрации GdnHCl свидетельствуют о существовании по крайней мере двух переходов в области концентраций от 0 до 3 М GdnHCl (рис. 3.1.2, а). Первый переход начинается при 0. М и заканчивается при 0.7 М, второй – при 1.4 М и заканчивается при 2.1 М GdnHCl.

В то же время величина анизотропии флуоресценции остается неизменной вплоть до 1.4 М GdnHCl, т.е. до начала второго перехода (рис. 3.1.2, б).

Параметрическое представление результатов стационарных измерений зависи мости интенсивностей флуоресценции I320 и I365 от концентрации GdnHCl показало существование двух промежуточных состояний при разворачивании глутамин cвязывающего белка: N I1 I2 U (рис.3.1.1). Существенное увеличение флуоресценции АНС в области первого перехода (рис.3.1.2, г) можно связать с воз никновением состояния типа "расплавленной глобулы". Хотя при переходе N I наблюдается уменьшение эллиптичности в дальней УФ-области спектра, в состоянии Рис. 3.1.1. Параметрические за 0. N висимости между интенсивно 1. стями флуоресценции, измерен 1 ными при длинах волн регист 0. I320, отн.ед.

рации 320 нм (I320) и 365 нм 2 (I365), характеризующие процесс 0.6 0. разворачивания глутамин-свя 1. I I1 1.4 2 зывающего белка (кривая 1, от 1. 0. крытые символы) и его ком плекса с глутамином (кривая 2, 0. открытые символы) под дейст U 3. вием GdnHCl. Параметр – кон 0.0 центрация GdnHCl. Закрытые 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1. символы отвечают процессу ре I365, отн.ед. натурации глутамин-связываю щего белка. Числа – концентра ции GdnHCl.

Вставки: Пространственная структура глутамин-связывающего белка (левый верхний угол) и его комплекса с глутамином (правый нижний угол).

Показаны триптофановые остатки, тирозиновые остатки;

и Lys 166, входящий в состав микроокружения Trp 220, и Gln (сферы). Образование комплекса GlnBP/Gln приводит к схлопыванию макромолекулы белка вокруг Gln и к закрытию щели. Использованы данные Protein Data Bank [20], файлы 1GGG.ent [21] и 1WDN.ent [22]. При подготовке рисунка ис пользованы графические программы VMD [23] и Raster 3D [24].

1. Параметр A 1. 1. 1. Рис. 3.1.2. Конформационные пе 1. реходы глутамин-связывающего 0. а белка (кривые 1) и его комплекса с б 1, 2 0. 0. 0.4 глутамином (кривые 2) под дейст 0. вием GdnHCl.

0. а – изменение параметра A = 0.10 r Эллиптичность, % I320/I365, возб =297 нм;

б – измене 0. 0.06 ние анизотропии флуоресценции, 0.04 60 возб = 297 нм, рег = 365 нм;

в – изменение эллиптичности при Инт.фл. АНС, отн.ед.

в 1 нм;

г – изменение интенсивности 3. флуоресценции АНС, возб = 2.5 0 нм, рег = 480 нм. Открытые сим 2. волы – разворачивание, закрытые 2 г 1. 1. 0. 0 1 2 [GdnHCl], M I1 сохраняется выраженная вторичная структура (рис.3.1.2, в). Несмотря на сложный характер разворачивания глутамин-связвающего белка под действием GdnHCl, его денатурация полностью обратима (рис.3.1.1 и 3.1.2).

Так как глутамин-связывающий белок является двухдоменным, нельзя не учи тывать возможность того, что домены разворачиваются последовательно. В то же время, переход N I1 нельзя объяснить разворачиванием малого домена (который не имеет триптофановых остатков), так как он сопровождается существенными изме нениями флуоресцентных характеристик. С помощью метода FTIR была показана бо лее низкая термочувствительность -спиралей белка по сравнению с -листами [25].

Возможно, -спирали глутамин-связвающего белка также менее устойчивы к денату рирующему действию GdnHCl. Таким образом, мы можем предположить, что в на I1 сопровождается разворачиванием -спиралей, тогда как шем случае, переход N переход I1 I2 связан с разрушением -листов.

Связывание лиганда приводит к тому, что изменения в структуре белка начи наются при гораздо больших концентрациях GdnHCl. Создается впечатление, что разворачивание комплекса происходит с образованием лишь одного (второго) проме жуточного состояния (рис. 3.1.2). Параметрическая зависимость, построенная для комплекса белка с лигандом, однако, однозначно свидетельствует о том, что развора чивание комплекса происходит по такому же сценарию с образованием двух проме жуточных состояний, что и для глутамин-связвающего белка. Таким образом, разво рачивание глутамин-связвающего белка под действием GdnHCl является трехстадий ным и обратимым. Связывание лиганда (Gln) приводит к тому, что структура стано вится более устойчивой к денатурирующему действию GdnHCl. Это, в свою очередь, приводит к кооперативному разворачиванию структуры по достижении соответст вующей концентрации денатуранта (Степаненко и др., 2005а;

Staiano et al., 2005).

3.2. Множественные денатурированные частично-свернутые состояния креатинкиназы. Креатинкиназа, относящаяся к классу фосфотрансфераз, играет важную роль в быстрой регенерации АТР в клетках. Цитоплазматическая креатинки наза из мышц кролика – димер. Мономер белка состоит из двух доменов:

-спираль ного N-концевого домена из 100 аминокислотных остатков и большого С-концевого домена из 250 аминокислотных остатков, соединенных между собой длинным лин керным участком (рис.3.2.1). Интерес к исследованию креатинкиназы был обусловлен тем, что изменение ферментативной активности этого белка [29] начинается при кон центрациях денатурирующих агентов значительно меньших чем те, при которых бы ли зарегистрированы изменения структуры фермента физико-химическими методами.

Поэтому при изучении процессов разворачивания–сворачивания предполагалось об ратить особое внимание на изменения структуры белка при малых концентрациях 0 - []204, deg cm2dmol- []222, deg cm2dmol- 20000 - - - [], deg cm dmol - [], deg cm2 dmol- []280, deg cm2dmol- - -7500 - - -10000 - - - - 0 1 2 3 4 5 [GdnHCl], M - -120 - 0 1 2 GdnHCl, M - 260 280 300 320 Длина волны, нм 190 200 210 220 230 240 Рис. 3.2. Длина волны, нм Рис. 3.2. % 4. 2. 3. 1. 2. 0.5 0. 1. 0. Инт. фл., отн.ед.

0. 1. 0.05 Рис. 3.2.7.

0.8 Рис. 3.2.1 0. 2 4 [GdnHCl], M 0. Рис. 3.2. 0. 320 340 360 380 U 4. Длина волны, нм 1. 3.0 1. Рис. 3.2.2 0.7 0. 0. 1.5 2. 1.25 0.8 0.5 I 2.5 1. I 1. 60 0. I365, отн.ед.

A r 1.3 1.5 0. 6. 0. 6.4 M GdmCl 1. 50 1.0 0. 0. RS, Е Absorbance 2. OD 2.4 M GdmCl 1.1 2 0. 0. 0. 0. 0.5 M GdmCl N 1.0 0 1 2 3 40 0. 0. 0. [GdnHCl], M 0.0 M GdmCl 5 volume (ml) 5 10 0 Elution 10 15 20 0. 0. I1 0. Объем элюции, мл 0 1 2 3 4 5 6 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1. I320, отн. ед.

[GdnHCl], M Рис. 3.2. Рис. 3.2. _ Рис. 3.2.1. Пространственная структура макромолекулы креатинкиназы. Показана локали зация триптофановых и тирозиновых остатков. Использованы данные Банка белковых струк тур [20], файл 2CRK.ent [28]. Для построения изображений использовали графические про граммы VMD [23] и Raster3D [24].

Рис. 3.2.2. Спектры флуоресценции креатинкиназы при различных концентрациях GdnHCl.

возб = 297нм. Числа – концентрации GdnHCl.

Рис. 3.2.3. Изменение спектра CD креатинкиназы в ближней УФ-области при денатурации GdnHCl. Спектры измерены при 0.00, 0.50, 0.75, 1.15, 1.35, 1.60, 1.90, 2.20, 2.60, 2.90, 3.25, 3.60, 4.00, 4.50, 5.00, 5.50, 6.00 и 6.50 M GdnHCl. Вставка: зависимость величины эллиптич ности при 222 нм от концентрации GdnHCl. Закрытые символы – денатурация, открытые – ренатурация.

Рис. 3.2.4. Изменение спектра CD креатинкиназы в дальней УФ-области при денатурации GdnHCl. Спектры измерены при 0.00, 0.12, 0.29, 0.39, 0.49, 0.63, 0.92, 1.50 и 2.30 M GdnHCl.

Вставка: зависимость величины эллиптичности при 280 нм от концентрации GdnHCl. Закры тые символы – денатурация, открытые – ренатурация.

Рис. 3.2.5. Изменение гидродинамических размеров креатинкиназы под действием GdnHCl.

Вставка: характерные профили элюции. Числа - концентрации GdnHCl.

Рис. 3.2.6. Параметрическая зависимость между интенсивностями флуоресценции креатин киназы, измеренными при 320 нм (I320) и 365 нм (I365), построенная на основании стационар ных зависимостей изменения интенсивности флуоресценции от концентрации GdnHCl. За крытые и открытые символы соответствуют процессам денатурации и ренатурации, соответ ственно. Параметр – концентрация GdnHCl. Показаны флуоресцентные характеристики, со ответствующие нативному (N), промежуточным (I1 и I2) и полностью развернутому (U) со стояниям. Числа – концентрации GdnHCl. Вставка: Зависимость параметра A = (I320/I365) (1) и анизотропии флуоресценции (2) от концентрации GdnHCl.

Рис. 3.2.7. Зависимость содержания -спиралей (кривая 1), -структур (кривая 2) и бесструк турных областей (кривая 3), определенного на основании анализа спектров CD, измеренных при разных концентрациях GdnHCl.

_ денатуранта. К моменту начала проведения этой работы в литературе не было едино го мнения относительно числа и свойств промежуточных состояний, возникающих при разворачивании креатинкиназы под действием GdnHCl. В то же время было из вестно, что процесс разворачивания креатинкиназы осложнен ассоциацией частично свернутых интермедиатов. В связи с этим одна из задач работы состояла в том, чтобы выявить и охарактеризовать возникающие в процессе разворачивания–сворачивания промежуточные состояния и агрегированные формы белка (см. Kuznetsova et al., 2002a).

Даже беглый взгляд на изменение спектра флуоресценции креатинкиназы под действием GdnHCl (рис.3.2.2) позволяет судить о сложности происходящих в белке структурных превращений. На основании анализа изменений величины CD в ближ ней и дальней УФ-областях спектра (рис. 3.2.3 и 3.2.4) и изменения гидродинамиче ского объема (рис.3.2.5), происходящих под действием GdnHCl, можно сделать за ключение о том, что процесс разворачивания–сворачивания креатинкиназы происхо дит с образованием по крайней мере двух частично-свернутых промежуточных со стояний. Первый интермедиат возникает в области 0.5-0.6 М GdnHCl. Белок в этом состоянии элюирует с колонки одним пиком, отвечающим радиусу Стокса Rs=33.7, в то время как нативная креатинкиназа также элюирует с колонки одним пиком, соот ветствующим Rs=35.3, что хорошо согласуется с литературными данными (см.

Kuznetsova et al., 2002a ) и подтверждает данные о том, что в нативном состоянии креатинкиназа является димером. Изменение радиуса Стокса при денатурации GdnHCl объяснено диссоциацией белка на мономеры, имеющие больший объем, чем в составе димера нативного белка. Белок в этом состоянии является компактным ин термедиатом, имеющим вторичную структуру, сходную со вторичной структурой на тивного белка, но несколько нарушенную третичную структуру, т.е. напоминает ин термедиат типа расплавленной глобулы. Интересно, однако, отметить, что криатин киназа уже в нативном состоянии связывает АНС и интенсивность флуоресценции красителя лишь незначительно возрастает при увеличении концентрации GdnHCl, причем максимальная интенсивность АНС наблюдается в растворах 0.3 М GdnHCl.

Второй интермедиат наблюдается в области 2.0-2.5 М GdnHCl и характеризуется на рушением вторичной структуры и увеличением Rs, т.е. имеет свойства, характерные для состояния типа "предшественник расплавленной глобулы".

C помощью метода собственной УФ-флуоресценции удалось также зафиксиро вать изменения структуры белка при небольших концентрациях денатуранта (0.1 М GdnHCl). Зависимости величины параметра А и анизотропии флуоресценции (рис.

3.2.6, вставка) свидетельствуют о существовании двух интермедиатов I1 и I2 при 0.1 и 0.6 М GdnHCl, соответственно. Обращает на себя внимание тот факт, что с помощью метода собственной УФ-флуоресценции впервые удалось показать возникновение промежуточного состояния под действием малых концентраций GdnHCl, ранее за фиксированного по изменению каталитической активности фермента [29], но не уда лось зарегистрировать промежуточное состояние в области 2.0-2.5 М GdnHCl, суще ствование которого было показано с помощью методов CD и гельпроникающей хро матографии. Однако все три промежуточных состояния креатинкиназы удалось за фиксировать с использованием метода, основанного на построении параметрических зависимостей (рис.3.2.6).

Интересно отметить, что промежуточное состояние, возникающее при 2.0-2. М GdnHCl, обогащено -структурами (рис.3.2.7), наличие которых является явной предпосылкой к образованию агрегатов. Дальнейшее подтверждение существования агрегатов было получено методом гельпроникающей хроматографии (см. Kuznetsova et al., 2002a). Надо подчеркнуть, что агрегация, наблюдаемая при разворачивании креатинкиназы, необычна. Хорошо известно, что агрегация частично-свернутых бел ков является основной причиной того, что процессы денатурации необратимы. Одна ко в случае креатинкиназы показана высокая обратимость процессов разворачивания.

Более того, было установлено, что растворимые агрегаты, накапливающиеся при раз ворачивании креатинкиназы, полностью ренатурируют после удаления денатури рующих агентов.

3.3. Множественность денатурированных частично-свернутых состояний однодоменного белка – карбоангидразы II. Карбоангидраза – небольшой однодо менный цинк-содержащий белок с выраженной -складчатой структурой (рис. 3.3.1), единственная полипептидная цепь которого состоит из 259 аминокислотных остатков.

Карбоангидраза является ферментом, относящимся к классу карбонат-дегидротаз.

Относительно небольшие размеры карбоангидразы (29 кDa), отсутствие дисульфид ных связей и свободных SH-групп сделали карбоангидразу предметом интенсивного изучения процессов разворачивания–сворачивания ([31], см также ссылки в Bushma rina et al., 2001). Изучение разворачивания–сворачивания этого фермента было пред принято, в связи с надеждой выявить (используя параметрическое представление экс периментальных данных по разворачиванию–сворачиванию) новые, ранее неустанов ленные промежуточные состояния и, в частности, состояние, обусловленное стабили зирующим действием на структуру белка малых концентраций GdnHCl, подобно промежуточному состоянию, обнаруженному для креатинкиназы при 0.1 М GdnHCl.

С помощью метода собственной УФ-флуоресценции установлено существова ние трех конформационных превращений карбоангидразы под действием GdnHCl:

N I1 при изменении концентрации GdnHCl от 0 до 0.1 М, I1 I2 при изменении концентрации GdnHCl от 0.1 до 1.0 М, и I2 U в области концентрации GdnHCl от 1.0 до 2.2 М (рис. 3.3.2 и 3.3.3).

Регистрация интенсивности флуоресценции АНС, однако, показала, что разво рачивание карбоангидразы под воздействием GdnHCl в области концентраций 1.0–2. М проходит через образование промежуточного состояния, максимальное содержа ние которого наблюдается при 1.5 М GdnHCl. В этом состоянии белок имеет более высокое значение анизотропии флуоресценции по сравнению с нативным ферментом, A r 1. 1.2 1, 0. 0. Инт. фл. АНС 0.8 0. 0. 0. 0.4 0. 3, 0. 0. 0.0 0. 0. 0 [GdnHCl], М Рис. 3.3.1. Пространственная структу- Рис. 3.3.2. Денатурация карбоангидразы ра карбоангидразы II. II гуанидингидрохлоридом.

Показана локализация триптофано- Показаны изменения параметра А = вых и тирозиновых остатков, а также I320/I365 (кривые 1, 2), анизотропии иона цинка. Использованы данные флуоресценции (кривые 3, 4) и интен Банка белковых структур [20], файл сивности флуоресценции АНС (кривые 1V9E.ent [30]. Для построения изо- 5, 6). Кривые 1, 3, 5 – денатурация (за бражений использовали графические крытые символы), кривые 2, 4, 6 – рена программы VMD [23] и Raster3D [24]. турация (открытые символы).

Рис.3.3.3. Параметрическая зависимость между интенсивностями флуоресценции 1.0 I I320 и I365, характеризующая разворачи 0.1 1 N вание–сворачивание карбоангидразы II I365, отн.ед.

под действием GdnHCl.

0.8 1. U Параметр – концентрация GdnHCl. N – I нативное состояние, I1, I2 и I3 – проме I2 1. жуточные состояния, возникающие при 3.0-6. 0.6 0.1, 1.0 и 1.5 М GdnHCl, U – развернутое состояние при 3.0–6.0М GdnHCl. Закры тые символы – денатурация, открытые и 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 серые – ренатурация из 6.0 М и 1.2 М GdnHCl, соответственно.

I320, отн.ед.

а также существенно (в 100 раз) более высокую интенсивность флуоресценции АНС (рис.3.3.2). Это промежуточное состояние (I3) никак не проявляется на кривых зави симости интенсивностей флуоресценции I320, I365 и параметра А от концентрации GdnHCl, а также при параметрическом представлении изменения интенсивности флуоресценции при длинах волн 320, 365 нм. Последнее, по-видимому, обусловлено тем, что величины характеристик I320, I365 и А для состояния I3 имеют промежуточ ные значения по сравнению с соответствующими значениями для состояний I2 и U (Kuznetsova et al., 2002 b;

Turoverov et al., 2002 b;

Kuznetsova et al., 2004).

3.4. Одностадийный обратимый характер разворачивания–сворачивания дисульфидизомеразы С. Дисульфидизомераза С из Escherichia coli – это раствори мый белок бактериальной периплазмы, который отвечает за образование "правиль ных" дисульфидных связей во вновь синтезированных белках. В связи с этим дисуль фидизомераза С считается бактериальным аналогом изомеразы дисульфидных связей (PDI) эндоплазматического ретикулума эукариот. Подобно PDI, дисульфидизомераза С обладает шаперонной активностью даже более выраженной, чем у PDI (см. ссылки в работах Кузнецова и др., 2005б;

Stepanenko et al., 2004 a). Макромолекула дисуль фидизомеразы С имеет V-образную форму, в которой каждая ветвь представляет со бой одну субъединицу гомодимера. Каждая субъединица состоит из N-концевого до мена, ответственного за ассоциацию субъединиц, и C-концевого тиоредоксинподоб ного (Trx) домена, которые связанны между собой подвижной спиралью [32] – рис.

3.4.1.

Нами было установлено, что стационарные зависимости всех флуоресцентных характеристик дисульфидизомеразы С (I320, I365, А) от содержания в растворе GdnHCl имеют S-образный характер, причем все изменения происходят в узком интервале концентраций денатуранта (рис. 3.4.2) (Stepanenko et al., 2004;

Кузнецова и др. б). Наличие изобестической точки при 340 нм для спектров флуоресценции (рис.

3.4.3), свидетельствует о том, что разворачивание дисульфидизомеразы С под дейст вием GdnHCl является одностадийным.

Для подтверждения этого предположения на основании измерения стационар ных зависимостей интенсивности флуоресценции I320 и I365 от концентрации GdnHCl была построена параметрическая зависимость между интенсивностями флуоресцен ции I320 и I365 (параметр – концентрация GdnHCl). Аналогичная параметрическая зави симость была построена на основании кинетических измерений интенсивностей флуоресценции I320 и I365 при переводе белка в раствор GdnHCl с концентрацией 2. М (параметр – время). Оказалось, что обе параметрические зависимости хорошо ап проксимируются прямыми и совпадают друг с другом (рис. 3.4.4).

1.0 3. I320, отн. ед.

I365, отн. ед.

1 2. 0. 2. 0. 1. 0.4 1. [GdnHCl], M Рис. 3.4.1. Пространственная структура DsbC. Рис. 3.4.2. Денатурация DsbC под Показаны атомы серы дисульфидных связей. При действием GdnHCl.

подготовке рисунка использованы графические Интенсивность флуоресценции, программы VMD [23] и Raster3D [24]. Использо- измеренная при 320 нм (кривая 1) и ваны данные Банка белковых структур [20], файл при 365 нм (кривая 2).

1EEJ.ent [38].

1.0 3. 0. Инт.фл., отн.ед.

2. I365, отн.ед.

0. 2. 0. 1. 0.2 1. 320 340 360 380 400 0.4 0.6 0.8 1. Длина волны, нм I320, отн.ед.

Рис. 3.4.3. Изменение спектра флуо- Рис. 3.4.4. Параметрическая зависи ресценции DsbC при денатурации мость между I320 и I365 нм DsbC.

GdnHCl. Открытые символы – данные ста 1- усредненный спектр флуорес- ционарных зависимостей интенсивно ценции при 0.0, 0.25, 0.50, 0.75, 1.00, сти флуоресценции от концентрации 1.25, 1.50 и 1.75 M GdnHCl;

2, 3, 4, 5 GdnHCl. Точки – данные кинетиче и 6, спектры флуоресценции при 2.0, ских зависимостей интенсивности 2.2, 2.4, 2.6 и 2.8 M GdnHCl, соответ- флуоресценции под действием 2.4 M GdnHCl (параметр – время). ex = ственно;

7 - усредненный спектр флуоресценции при 3.0, 4.0, 5.0 и 6.0 нм.

M GdnHCl. ex = 297 нм.

Эксперименты по ренатурации дисульфидизомеразы С свидетельствуют об об ратимом характере процесса денатурации. Таким образом, денатурация этого двух доменного димерного белка под действием GdnHCl является обратимой и осуществ ляется по принципу "все или ничего".

3.5. Кинетические интермедиаты на пути разворачивания–сворачивания белков. Новое представление о процессах разворачивания–сворачивания акти на. Актин, один из основных белков системы мышечного сокращения, является гло булярным двухдоменным белком. При низкой ионной силе актин является мономе ром (G-актин), в присутствии нейтральных солей он полимеризуется с образованием двухнитевой спирали (F-актин). F-актин является основным компонентом тонких фи ламентов мышечной ткани. В состав макромолекулы актина входит одна молекула АТФ и прочно связанный двухвалентный катион Ca2+ ([33], рис. 3.5.1).

До недавнего времени считалось, что процесс разворачивания–сворачивания ак тина проходит через стадию образования промежуточного состояния, получившего название инактивированного актина [34-37]. Было показано, что денатурированное состояние, в котором актин не способен к полимеризации (инактивированный актин), возникает при отщеплении катиона кальция, в результате тепловой денатурации, под воздействием умеренных концентраций мочевины или GdnHCl, путем диализа из рас творов 8 М мочевины или 6 М GdnHCl и даже спонтанно при длительном хранении препаратов (см. [37-42]).

Характер равновесных (а точнее квазиравновесных) зависимостей ряда флуорес центных характеристик актина от концентрации GdnHCl, казалось бы однозначно свидетельствует о существовании двух последовательных конформационных перехо дов и о существовании области концентраций GdnHCl, в которой актин находится преимущественно в инактивированном состоянии (рис. 3.5.2.). На основании подоб ного рода данных во всех без исключения работах, посвященных денатурации актина, считалось, что инактивированный актин (I) является промежуточным состоянием ме жду нативным (N) и полностью развернутым (U) состоянием белка: N I U. В эту схему, однако, совершенно не укладывались данные о том, что инактивированный актин является термодинамически стабильным монодисперсным ассоциатом, состоя щим из 15 мономерных единиц [40, 41]. В связи с этим в настоящей работе было предпринято более тщательное, с привлечением новых методических подходов, ис следование равновесных (квазиравновесных) денатурационных зависимостей, а также кинетики разворачивания актина и образования инактивированного актина.

Характер кинетических зависимостей интенсивности флуоресценции (рис.3.5.2), параметра А и анизотропии триптофановой флуоресценции (кривые с минимумом при концентрациях GdnHCl 1.2 – 1.5 М;

свидетельствует о том, что переход из нативного Рис. 3.5.1. Пространственная структура мо лекулы актина.

Показаны триптофановые остатки, тиро зиновые остатки катиона Ca2+ и молекула АТФ. Римские цифры – субдомены актина.

Использованы данные Protein Data Bank [20], файл 1ATN.ent [33]. При подготовке рисунка использовали графические про граммы VMD [23] и Raster 3D [24].

б а I N 0.0 N N 2. 1.0 I 0.7 1. 0.8 U I, отн. ед.

I 1.0 I 300 350 0.6 Длина волны, нм 1. 0.4 1. 1. U U 0. 4. 24 0 100 200 300 400 1234 [GdnHCl], M Время, с ч Рис. 3.5.2. Изменение интенсивности собственной флуоресценции актина при его денатурации (возб = 297 нм;

рег = 320 нм).

а – Кинетика денатурации актина под действием GdnHCl. Числа – концентрации GdnHCl, М;

б – зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации GdnHCl, зарегистрированная после 24 ч инкубации белка в GdnHCl.;

открытые и закрытые символы соответствуют экспе риментам по денатурации и ренатурации, соответственно. Вставка: Спектры флуоресценции нативного (N), инактивированного (I), и полностью развернутого (U) актина. возб = 297 нм.

Рис. 3.5.3. Параметрические зависимости меж N ду интенсивностями флуоресценции I320 и I365, 1. характеризующие кинетику разворачивания на тивного актина под действием GdnHCl.

0.8 Параметр – время, прошедшее после добавле 1.0 ния к нативному актину растворов GdnHCl раз I320, отн. ед.

1.2 личной концентрации;

числа – концентрация I 0. GdnHCl, М. Большая часть экспериментальных 1.5 точек соответствует первым 10 мин после пере 1. 0.4 вода белка в растворы GdnHCl соответствую щей концентрации. Конечные точки (символы большего размера) – зарегистрированы после 0.2 U* U ч инкубации. За единицу принята интенсив ность флуоресценции нативного актина, 0.0 рег = 320 нм.

0.35 0.40 0.45 0.50 0. I365, отн. ед.

состояния в инактивированное осуществляется через некоторое промежуточное со стояние, в котором интенсивность флуоресценции, параметр А и величина анизотро пии флуоресценции меньше, чем в нативном и в инактивированном состояниях:

, где U* существенно развернутый кинетический интермедиат, U флуоресцентные свойства которого сходны со свойствами полностью развернутого актина (Turoverov et al., 2002 a;

Поварова и др., 2005).

Для выяснения природы кинетического интермедиата U*, предшествующего об разованию инактивированного актина, кинетические зависимости интенсивности флуоресценции, измеренные при длинах волн 320 и 365 нм, были использованы для построения параметрических зависимостей (рис. 3.5.3). Характер параметрической зависимости при денатурации актина под действием 1.8 М GdnHCl однозначно свиде тельствует о существовании кинетического интермедиата между нативным и инакти вированным актином. Точка на диаграмме, в которой пересекаются прямые, отве чающие процессу разворачивания нативного актина (N U*) и процессу образова ния инактивированного актина из существенно развернутого состояния (U* I), характеризует свойства кинетического интермедиата (U*). Величина параметра А для кинетического интермедиата U* оказалась выше соответствующей величины для полностью развернутого актина. Этот результат позволил сделать заключение о том, что свойства кинетического интермедиата не идентичны свойствам полностью раз вернутого актина в 6М GdnHCl.

Несколько неожиданным результатом построения параметрических зависимо стей явилось то обстоятельство, что зависимости, отвечающие процессам разворачи вания актина под воздействием GdnHCl различной концентрации, исходят не из од ной точки, соответствующей нативному белку (N), а из разных точек (см. рис. 3.5.3).

Эксперименты по изучению быстрой кинетики структурных превращений актина под действием GdnHCl различной концентрации с использованием оборудования стоп флоу позволили показать существование интермедиата N*, предшествующего обра зованию существенно развернутого кинетического интермедиата U*. Результаты ра боты Альтшулера и др. [18] позволили предположить, что кинетический интермедиат N* – это интермедиат типа расплавленной глобулы, возникающий при диссоциации иона кальция. Тогда U* – это, скорее всего, интермедиат типа "предшественник рас плавленной глобулы" (Kuznetsova et al., 2002 b).

На основании всех экспериметальных данных была предложена следующая схе ма разворачивания актина под воздействием GdnHCl (см. Поварова и др., 2005, Kuznetsova et al., 2002b;

Turoverov et al., 2003):

[GdnHCl] 1.8M [GdnHCl]=0.2M N N* U* I1 … In … I Iaggr.

[GdnHCl] 3.0M I=I15 при [GdnHCl]=0M.

U Согласно этой схеме, вновь обнаруженные кинетические интермедиаты N* и U* являются промежуточными состояниями на пути разворачивания–сворачивания ак тина, в то время как инактивированный актин, ранее считавшийся промежуточным состоянием, на самом деле является монодисперсным ассоциатом, образование кото рого препятствует правильному сворачиванию белка in vitro. Получены новые данные о свойствах инактивированного актина. Показано, что присутствие в растворе не больших концентраций GdnHCl приводит к агрегации инактивированного актина (аг регации ассоциатов) – см. раздел 4.4. Этот эффект, объясненный в работе изменением заряда инактивированного актина за счет взаимодействия катионов GdnHCl (GuH+) с группами C=O, необходимо учитывать в работах по изучению фолдинга белков при использовании GdnHCl в качестве денатуранта.

3.6. Роль четвертичной структуры в стабилизации флуоресцентных бел ков. Термин "флуоресцентные белки" или "GFP-подобные белки" используется для обозначения обширного класса белков, характерной особенностью которых является наличие у них уникального хромофора, образующегося в результате трехстадийной аутокаталитической циклизации трех аминокислотных остатков в положении 65-67.

Все белки этого класса представляют собой цилиндр, образованный 11 -листами ( can), в центре которого проходит -спираль, содержащая хромофор. Большой интерес к флуоресцентным белкам вызван их интенсивным использованием в клеточной био логии в качестве биологических маркеров для изучения динамики генной экспрессии и транспорта белков в живых клетках и тканях ([43];

см. также Степаненко, 2005б;

Verkhusha et al., 2003;

Stepanenko et al., 2004 b).

Измерены кинетические и квазиравновесные зависимости интенсивности флуоресценции от концентрации денатуранта. Показано, что тетрамер зеленого белка (zFP506) обладает большей стабильностью по сравнению с мономером (EGFP). Пока зано также, что димер красного белка (dimer2) обладает меньшей стабильностью по сравнению с тетрамером (DsRed1). Однако стабильность мономера красного белка (mRFP1) оказалась приблизительно такой же, как стабильность тетрамера (DsRed1).

На основании совокупности полученных результатов сделан вывод о том, что, хотя четвертичная структура имеет существенное значение в стабилизации флуоресцент ных белков, она не является единственным фактором, определяющим существенные различия их конформационной стабильности (Степаненко, 2005 б;

Stepanenko et al.,2004 b). Это говорит о том, что стабильность белка может быть значительно уве личена в результате введения соответствующим образом подобранных аминокислот ных замен, при этом нет необходимости сохранять присущую многим флуоресцент ным белкам тетрамерную организацию. Этот результат может представлять интерес при создании новых флуоресцентных биомаркеров.

3.7. Влияние денатурирующего воздействия на процесс разворачивания– сворачивания белка. Результаты, полученные для ряда двухдоменных белков (ак тина, креатинкиназы, дисульфидизомеразы С, глутамин-связывающего белка) и од нодоменного белка карбоангидразы II, свидетельствуют о том, что способность бел ков к обратимому одностадийному разворачиванию нельзя однозначно связывать с их размером и мультиплетностью. В тоже время, если 1) обратиться к истории развития представлений о процессах разворачивания–сворачивания акина;

2) проанализировать результаты изучения разворачивания карбоангидразы II с учетом впервые выдвину того в настоящей работе представления о возможности GdnHCl оказывать агреги рующее действие на белки (раздел 4.4);

3) учесть влияние лигандов на характер про цесса денатурации глутамин-связывающего белка;

4) принять во внимание, что зна чительная по величине интенсивность флуоресценции АНС наблюдается для креа тинкиназы в отсутствие GdnHCl, когда белок является димером, то можно сделать не которые обобщающие заключения.

Представления о том, как разворачивается актин сильно изменялось по мере того, как для изучения разворачивания–сворачивания этого белка использовались бо лее адекватные методы исследования. Действительно, измерение стационарных зави симостей интенсивности флуоресценции, параметра А, интенсивности флуоресцен ции АНС, CD в дальней и ближней УФ-областях спектра [40] от концентрации GdnHCl создает полную иллюзию того, что инактивированный актин, образующийся в области концентраций GdnHCl от 0.8 до приблизительно 1.8 М, является промежу точным состоянием со свойствами близкими к свойствам состояния типа расплавлен ной глобулы (Turoverov et al., 2002). Однако, необратимость процесса денатурации актина, существенное возрастание анизотропии флуоресценции в этой области кон центраций GdnHCl, наличие выраженного спектра CD в ближней УФ-области заста вило усомниться в справедливости такого представления [37]. Сочетание метода се диментации и гельпроникающей хроматографии позволило сделать заключение о том, что инактивированный актин является монодисперсным ассоциатом, состоящим из 15 (15±1) мономерных единиц [42].

Измерение кинетических зависимостей интенсивности флуоресценции, пара метра А и анизотропии флуоресценции позволило заключить, что инактивированный актин образуется из нативного через стадию образования существенно развернутого кинетического интермедиата U* (Turoverov et al., 2002). Существенным при проведе нии этих экспериментов было то, что измерялись кинетические кривые при переводе нативного белка в растворы GdnHCl различной концентрации. Изучение кинетики превращения N U при переводе нативного актина в растворы с концентрацией GdnHCl больше 3 М не позволило бы обнаружить интермедиат U*.

Использование параметрического подхода для представления результатов ки нетических экспериментов позволило заключить, что состояние U* отличается от полностью развернутого состояния U (Kuznetsova et al., 2002). Более того, характер параметрических зависимостей, измеренных при переводе белка в растворы GdnHCl различной концентрации, позволил предсказать существование еще одного кинетиче ского интермедиата N*, существование которого затем было подтверждено нами с использованием оборудования типа stopped flow (Поварова и др., 2005), а также в работе Альтшулера и др. [18]. Авторы этой работы считают, что путем использования в экспериментах очень низкой концентрации белка (0.01 мг/мл) им удалось избежать агрегации (ассоциации) продукта, возникающего при отщеплении иона Са под дейст вием ЭДТА. Однако величина параметра А для этого продукта, определенная нами на основании спектра флуоресценции, приведенного в их работе, оказалась равной при близительно 1.3, что соответствует величине, характерной для инактивированного ак тина (ассоциата). Обратимость процесса денатурации актина, о которой сообщают ав торы этой работы, обусловлена, по-видимому, не тем, что удалось получить моно мерный продукт, а присутствием в их системе шаперонина ССТ.

Результаты изучения кинетики разворачивания актина при переводе белка в растворы с различным содержанием GdnHCl позволяют нам заключить, что процесс разворачивания актина при его переводе в раствор GdnHCl с концентрацией более 3М также проходит через стадии образования состояний N* и U*, хотя и создается впе чатление, что этот переход (N U) является одностадийным, поскольку скорости процессов N N*, N* U* и U* U велики. Отщепление иона Са под дейст вием GdnHCl при малых концентрациях денатуранта – медленный процесс (Kuznetso va et al., 2002). Под действием ЭДТА этот процесс будет осуществляться очень быст ро. В то же время, в отсутствие GdnHCl процесс U* I также должен происходить с большой скоростью. Таким образом, хотя разворачивание актина под действием ЭДТА представляется как одностадийный переход N I, на самом деле имеет ме сто мультистадийный процесс N N* U* I. Использование аппаратуры stopped flow позволило наблюдать процесс N N* [18].

Процесс разворачивания карбоангидразы выглядит как одностадийный или как проходящий через образование промежуточного состояния типа расплавленной гло булы в зависимости от того, насколько адекватными были методы, используемые для изучения процессов разворачивания–сворачивания и даже от того, какой денатурант был при этом использован: GdnHCl или мочевина (см. раздел 3.3, Bushmarina et al., 2001). На самом деле процесс разворачивания карбоангидразы под действием GdnHCl, мочевины, а также под действием изменения рН проходит через стадию об разования промежуточного состояния типа расплавленной глобулы (Bushmarina et al., 2001).

Интересную пищу для размышлений дает сравнительный анализ денатурации глутамин-связывающего белка и его комплекса и глутамином. Связывание лиганда стабилизирует структуру белка. Процессы разворачивания структуры белка, по видимому, начинаются после диссоциации комплекса. Это создает иллюзию того, что разворачивание комплекса осуществляется по принципу "все или ничего", хотя на самом деле процесс денатурации комплекса осуществляется по тому же сценарию, что и процесс денатурации глутамин-связывающего белка. Этот пример показывает, что одностадийный характер разворачивания макромолекулы белка может быть ре зультатом того, что в структуре имеется какой-то элемент, удерживающий всю струк туру от разворачивания. В случае комплекса глутамин-связвающего белка с глутами ном, структура "выдерживает" денатурирующее действие GdnHCl до тех пор, пока не происходит диссоциации комплекса. Похожая ситуация известна в литературе, на пример, актин защищает тропомиозин, находящийся на его поверхности, от тепловой денатурации, которая начинается только после диссоциации актина в узком темпера турном интервале [26].

В случае глобулярного актина таким стабилизирующим элементом является ион кальция, присутствие которого, крайне существенно для поддержания структуры и функционирования многих белков [27]. Отщепление иона Са, по-видимому, явля ется тем "спусковым крючком", который запускает цепь конформационных превра щений актина, приводящих к образованию существенно развернутого интермедиата, а затем к образованию инактивированного актина (см. раздел 3.5). Интересно отме тить, что разворачивание дисульфидизомеразы С происходит при достаточно высо кой концентрации GdnHCl (начинается при 1.75 М GdnHCl, в отличие от актина и глутамин-связывающего белка, для которых процесс денатурации начинается при минимальных концентрациях денатуранта) и происходит в узком интервале концен траций денатуранта. Можно полагать, что чем большую концентрацию денатуранта выдерживает белок до денатурации, тем более кооперативно он будет разворачи ваться.

Представленные выше данные позволили нам сформулировать концепцию о том, что путь разворачивания, последовательность образования и число возникающих денатурированных частично-свернутых состояний каждого конкретного белка не за висит от характера денатурирующего воздействия и стабилизации структуры при свя зывании лиганда.

Инактивированный актин оказался исключительно интересной моделью, по зволившей открыть принципиально новое свойство GdnHCl – его способность вызы вать при определенных условиях агрегацию белков (см. раздел 4.4). В случае инакти вированного актина обнаружить факт его агрегации под действием GdnHCl оказалось очень просто ввиду того, что агрегация инактивированного актина (агрегация ассо циатов) приводит к возникновению крупных образований и, как следствие, к сущест венному возрастанию интенсивности светорассеяния. Способность GdnHCl вызывать ассоциацию (агрегацию) актина позволяет по-новому взглянуть на процессы развора чивания–сворачивания других белков.

Наше внимание уже давно привлекал процесс образования под действием GdnHCl состояния типа расплавленной глобулы для карбоангидразы II [31]. По спо собности связывать АНС промежуточное состояние I3 карбоангидразы (см. раздел 3.3) можно считать состоянием типа расплавленной глобулы. Однако очень странно, что образование этого интермедиата сопровождается возрастанием анизотропии триптофановой флуоресценции, если иметь в виду, что одним из основных признаков состояния типа расплавленной глобулы является увеличение подвижности боковых цепей аминокислотных остатков. Учитывая данные, полученные для инактивирован ного актина (см. раздел 4.4), этот эффект можно объяснить ассоциацией молекул карбоангидразы после их перехода в состояние типа расплавленной глобулы. При этом становится понятным, почему растет величина анизотропии триптофановой флуоресценции вплоть до той концентрации GdnHCl, которая отвечает максимально му содержанию молекул в состоянии расплавленной глобулы.

Подтверждением справедливости этого предположения является то, что разво рачивание карбоангидразы под действием мочевины также проходит через образова ние состояния типа расплавленной глобулы [31], хотя в этом случае и не наблюдается увеличения интенсивности флуоресценции АНС. Во всей области концентраций мо чевины от 0 до 8 М для растворов карбоангидразы сохраняется низкий уровень ин тенсивности флуоресценции АНС (Bushmarina et al., 2001).

Интересно отметить, что в случае креатинкиназы значительная по величине интенсивность флуоресценции АНС наблюдается для белка в отсутствие GdnHCl, ко гда белок является димером (Kuznetsova et al., 2002 a). Возрастание интенсивности флуоресценции АНС при разворачивании глутамин-связывающего белка под дейст вием GdnHCl (переход N I1, раздел 3.1), по-видимому, также связано с образова нием ассоциатов макромолекул белка после их перехода в состояние типа расплав ленной глобулы. Об этом свидетельствует тот факт, что анизотропия флуоресценции в этой области концентраций GdnHCl остается неизменной, несмотря на достаточно значительное изменение эллиптичности и величины параметра А (Staiano et al., 2005;

Степаненко и др., 2005 а).

Представленные выше экспериментальные данные позволяют нам выдвинуть гипотезу о том, что АНС, на самом деле, связывается не с гидрофобными кластерами на поверхности белка в состоянии расплавленной глобулы, а с ассоциатами макромо лекул белка в состоянии расплавленной глобулы, образующимися в результате "сли пания" макромолекул за счет гидрофобных взаимодействий в отсутствие электроста тического отталкивания.

Глава 4. Новые методические разработки Большинство исследований выполнено с использованием стандартных физико химических методов: кругового дихроизма в дальней и ближней УФ-области спектра, собственной УФ-флуоресценции (интенсивность и спектр флуоресценции, параметр А = I320/I365, характеризующий положение спектра флуоресценции, анизотропия флуо ресценции, кривые затухания флуоресценции и времена жизни возбужденного со стояния, константы тушения внешним тушителем акриламидом), флуоресценции АНС и тиофлавина Т, гельпроникающей хроматографии. Измерения собственной флуоресценции всегда сочетались с анализом информации о свойствах микроокруже ния и особенностях локализации триптофановых (тирозиновых) остатков исследуе мых белков (Туроверов и др., 2001;

Kuznetsova et al., 2000). При этом была использо вана информация о пространственной структуре белков, содержащаяся в Банке бел ковых структур [20].

Измерение стационарных (равновесных или квазиравновесных) зависимостей различных физико-химических характеристик от концентрации денатуранта сочета лось с изучением кинетики разворачивания и(или) сворачивания белка. Изучение кинетики разворачивания актина под действием GdnHCl позволило, в частности, ко ренным образом пересмотреть представления о роли инактивированного актина в процессах разворачивания–сворачивания этого белка, а также выявить возникающие в процессе разворачивания белка ранее неизвестные кинетические интермедиаты (раздел 3.5). Широко использован при исследовании фолдинга белков и получил су щественное развитие метод, основанный на параметрическом представлении экспе риментальных данных (раздел 4.1). Результаты исследования процессов разворачива ния–сворачивания белков под действием GdnHCl позволили выявить ряд особенно стей во взаимодействии этого денатуранта с белками, которые необходимо учитывать в дальнейшей работе (раздел 4.4). Для развития метода собственной УФ-флуоресцен ции белков существенное значение могут иметь результаты, свидетельствующие о за висимости триптофановой флуоресценции глутамин-связвающего белка от длины волны возбуждающего света (раздел 4.3). В работе продемонстрированы перспективы использования метода триптофановой ФКТ для изучения процессов разворачивания– сворачивания и свойств возникающих при этом аморфных и фибриллярных агрегиро ванных форм белков (раздел 4.2).

4.1. Параметрический метод представления экспериментальных данных по разворачиванию–сворачиванию белков. Впервые подход, основанный на по строении параметрических зависимостей интенсивностей флуоресценции, зарегист рированных при двух длинах волн для изучения конформационных превращений бел ков, был предложен Бурштейном [16, 17] и назван им методом фазовых диаграмм. В последующие годы этот метод использовался крайне редко (см., например, [44]).

Этот метод основан на том, что если переход между состояниями 1 и 2 происхо дит по принципу "все или ничего", т. е. без образования промежуточных состояний, то регистрируемая экспериментально параметрическая зависимость между любыми двумя экстенсивными характеристиками (X и Y) должна быть линейной: Y() = a + b X(), где – любой параметр, в зависимости от величины которого изменяется отно сительная доля компонент 1 ( ) и 2 ( ) в системе, 1 ( ) + 2 ( ) = 1. Если параметри ческая зависимость двух экстенсивных характеристик системы не является линейной, то это однозначно свидетельствует о том, что регистрируемый процесс превращения исследуемого объекта из начального в конечное состояние не является одностадий ным и происходит с образованием одного или нескольких промежуточных состояний (Turoverov et. al., 2002b;

Kuznetsova et al., 2004).

Этот подход был использован нами для доказательства существования несколь ких промежуточных состояний, которые возникают в процессе денатурации карбоан гидразы (Bushmarina et al., 2001), креатинкиназы (Kuznetsova et al., 2002 a) и дисуль фидизомеразы С (Stepanenko et al., 2004a;

Кузнецова и др., 2005б;

Степаненко и др., 2005а) под воздействием GdnHCl. В работе по изучению процессов разворачивания– сворачивания актина этот метод впервые был использован для анализа данных, полу ченных в ходе выполнения кинетических экспериментов (Kuznetsova et al., 2002b;

Turoverov and Kuznetsova, 2003;

Поварова и др., 2005]). В настоящее время метод широко используется уже не только в нашей, но и в других лабораториях (см., на пример, [18, 19]).

4.2. Триптофановая фосфоресценция при комнатной температуре. Перспек тивы использования метода для изучения фолдинга белков. Основным механиз мом тушения фосфоресценции в среде, не содержащей кислорода, является дезакти вация возбужденных триплетных состояний в результате непланарной деформации структуры хромофора при соударении с молекулами окружающей среды. Поэтому фосфоресценцию обычно наблюдают в жестких матрицах при низкой температуре. В то же время установлено, что некоторые белки в растворе фосфоресцируют при ком натной температуре [45, 46]. Это обусловлено тем, что в этих условиях достигается необходимая для возникновения фосфоресценции жесткость микроокружения трип тофановых (тирозиновых) остатков.

В работе показано, что интенсивность ФКТ и время жизни возбужденного три плетного состояния для инактивированного актина (ассоциата, состоящего из 15 мо номерных единиц) больше, чем для нативного актина (Мажуль и др., 2001;

2003;

2005;

Mazhul' et al., 2003), и что образование амилоидных фибрилл на основе -лакт альбумина и инсулина приводит к увеличению жесткости микроокружения трипто фановых и тирозиновых остатков и появлению триптофановой (тирозиновой) ФКТ (Мажуль и др., 2005). Таким образом, было показано, что измерение интегральной интенсивности (относительного квантового выхода) и времени затухания ФКТ есте ственных хромофоров белка – триптофановых и тирозиновых остатков – может стать перспективным методическим подходом для изучения свойств аморфных агрегатов, фибриллогенеза и свойств амилоидных фибрилл.

4.3. Зависимость характеристик триптофановой флуоресценции белка от длины волны возбуждающего света в нативном и развернутом состояниях.

Обычно принимается, что характеристики триптофановой флуоресценции каждого конкретного белка в нативном состоянии не зависят от длины волны возбуждающего света. Это предположение, в частности, лежит в основе существующего подхода оценки вклада тирозиновых остатков в суммарную флуоресценцию белка. Однако для глутамин-связвающего белка оказалось, что интенсивность триптофановой флуорес ценции нативного белка при возб = 280 нм меньше интенсивности флуоресценции, измеренной при возб = 297 нм. Эффект объяснен спектральной зависимостью относи тельного вклада Trp 32 и Trp 220 в поглощение этого белка ([47], Степаненко и др., 2005а;

Kuznetsova et al., 2005). Такая ситуация может иметь место и для других бел ков. Предложена методика нормировки спектров нативного белка, позволяющая учи тывать это обстоятельство. Методика основана на том, что в полностью развернутом белке все особенности микроокружения отдельных триптофановых и тирозиновых остатков нивелируются. Зависимость триптофановой флуоресценции белка от длины волны возбуждения должна приниматься в расчет при оценке вклада тирозиновых ос татков в суммарную флуоресценцию белка.

4.4. Особенности использования GdnHCl в качестве денатуранта. Общепри нятым приемом исследования фолдинга белков in vitro является регистрация процес сов их разворачивания–сворачивания под действием химических денатуранатов – мо чевины или GdnHCl. Результаты настоящей работы свидетельствуют о том, что при использовании в качестве денатуранта GdnHCl необходимо учитывать некоторые особенности его взаимодействия с белками. Ряд полученных нами результатов (см.

также Главу 3) подтверждает литературные данные о том, что GdnHCl при небольших концентрациях может оказывать на белки стабилизирующее действие [48, 49] за счет того, что он снимает существующие напряжения в белке, обусловленные электроста тическим взаимодействием заряженных групп на его поверхности.

Наряду с фактами, свидетельствующими о стабилизирующем влиянии неболь ших добавок GdnHCl на структуру белков, на примере инактивированного актина по казано, что этот денатурант может оказывать на белки агрегирующее действие (Пова рова и др., 2005). Эффект резкого возрастания флуоресценции АНС и интенсивности свето 1. рассеяния для инактивированного актина в Параметр A присутствии небольшой концентрации GdnHCl 1. Инт. фл. АНС, отн.ед.

1.0 (рис. 4.4.1) объяснен взаимодействием катио 0. 0.8 нов GdnHCl (GuH+) с группами C=O остатков 0.6 глутаминовой и аспарагиновой кислот, глута 0. Рассеяние, отн.ед.

1.0 мина и аспарагина макромолекул актина, вхо 0.2 0.8 дящих в состав ассоциата. При этом происхо 0.0 0.6 дит нейтрализация отрицательных зарядов кар 0. боксильных групп глутаминовых и аспарагино 0. 3 вых аминокислот, а в местах локализации 0. амидных групп глутамина и аспарагина возни кают положительные заряды GuH+. С ростом [GdnHCl], M числа ионов GuH+, связанных с ассоциатом, увеличивается количество положительных Рис. 4.4.1. Зависимость величины параметра А (1), интенсивности групп на его поверхности, и при некоторой флуоресценции АНС (2) и свето концентрации GdnHCl в целом исходно отри рассеяния (3) от концентрации цательно заряженный ассоциат (pI = 5.07) ста GdnHCl для исходно инактивиро ванного актина. новится нейтральным. При этом создаются ус ловия агрегации ассоциатов между собой. Это и является причиной возрастания светорассеяния и связывания молекул АНС, кото рые встраиваются в гидрофобные полости между ассоциатами, образующими агрега ты. При дальнейшем увеличении концентрации GdnHCl число положительно заря женных групп на поверхности ассоциата начинает превышать число отрицательно за ряженных групп. Наличие положительно заряженных групп на поверхности ассоциа тов препятствует их агрегации. Агрегаты, возникшие при меньших концентрациях GdnHCl, при этом диссоциируют.

Несомненно, существенную роль при образовании агрегатов инактивирован ного актина в присутствии GdnHCl играют гидрофобные взаимодействия. Интенсив ность флуоресценции АНС в присутствии инактивированного актина приблизительно в 20 раз больше по сравнению с интенсивностью флуоресценции АНС в присутствии нативного актина той же концентрации. Это означает, что инактивированный актин (ассоциат) уже содержит гидрофобные кластеры на поверхности, но при этом эти ас социаты не "слипаются", поскольку этому, на наш взгляд, препятствует отрицатель ный заряд на поверхности ассоциатов. Увеличение интенсивности флуоресценции АНС свидетельствует о связывании большего количества молекул АНС при агрега ции инактивированного актина, что может быть как результатом более сильного экс понирования гидрофобных участков белка, так и возникновением новых гидрофоб ных карманов между ассоциатами, входящими в состав агрегатов инактивированного актина.

Подобного рода эффект, по-видимому, приводит к ассоциации (агрегации) мо лекул карбоангидразы при переходе в состояние типа расплавленной глобулы и про является в существенном возрастании интенсивности флуоресценции АНС и анизо тропии собственной флуоресценции (Bushmarina et al., 2001, см. также раздел 3.3). В то же время эффект не носит универсального характера для белков, имеющих изо электрическую точку в кислой области рН. Для агрегации необходимо, чтобы име лись гидрофобные кластеры на поверхности, взаимодействие между которыми, по видимому, и приводит к слипанию макромолекул в отсутствие электростатического отталкивания.

4.5. Спектральные свойства тиофлавина Т в растворителях различной вязкости и в составе амилоидных фибрилл. Тиофлавин Т как молекулярный ро тор. Нарушение фолдинга белков в клетке может приводить к возникновению ряда тяжелых заболеваний, которым сопутствует (а, скорее, является причиной) переход определенного белка в особое состояние, обогащенное -структурами, в котором этот белок образует так называемые амилоидные фибриллы. Исследования последних лет показали, что при соответствующих условиях в это состояние могут переходить очень многие белки, в том числе белки, изменение конформации которых пока не связыва ют с какими-либо заболеваниями. Морфологически, амилоидные фибриллы, образо ванные на основе самых разнообразных белков, имеют сходную структуру. Они пред ставляют длинные неразветвленные структуры диаметром несколько нанометров, об разованные перевитыми между собой протофибриллами, в которых -слои ориенти рованы перпендикулярно оси фибриллы [9, 50]. Общепринятым приемом тестирова ния возникновения амилоидных фибрилл стало использование для этих целей флуо ресцентного красителя тиофлавина Т (рис. 4.5.1), образующего с амилоидными фиб риллами интенсивно флуоресцирующий комплекс (см. например, [13];

Воропай и др., 2003, и ссылки в этих работах;

рис. 4.5.2). При этом тиофлавин Т не взаимодействует с белками в нативном, полностью развернутом и денатурированных частично свернутых состояниях типа расплавленной глобулы, а также с аморфными агрегиро ванными формами белков и специфически взаимодействует лишь с белками в состоя нии амилоидных фибрилл. Благодаря уникальным флуоресцентным свойствам тиоф лавин Т используется не только для диагностики возникновения амилоидных фиб рилл в различных тканях и органах, но и при проведении исследования фибриллоге неза и свойств амилоидных фибрилл in vitro (см. например, [14-15, 51-52]).

Остается невыясненным, каков механизм взаимодействия тиофлавина Т с ами лоидными фибриллами и что является при этом причиной существенного возрастания квантового выхода флуоресценции тиофлавина Т. Для того, чтобы ответить на эти вопросы, в настоящей работе было предпринято детальное изучение влияния диэлек трических характеристик и вязкости растворителя на флуоресценцию тиофлавина Т, выполнен квантово-химический расчет геометрии молекулы тиофлавина Т в основ ном и возбужденном состоянии, проведены исследования взаимодействия тиофлави на Т с циклодекстринами, моделирующего встраивание тиофлавина Т в амилоидные фибриллы.

Квантово-химический расчет молекулы тиофлавина Т в основном состоянии показал, что наличие метильной группы, присоединенной к атому азота бензтиазоль ного кольца, препятствует существованию строго планарной конформации колец, обуславливает существование барьера при = 0 (180)° и увеличивает энергию моле кулы тиофлавина Т в основном состоянии, тем самым уменьшая величину энергети ческого барьера при = 90 (270)° между конформациями тиофлавина Т, отвечающи ми минимуму энергии (рис. 4.5.3). При близких к 90 и 270° система сопряженных связей тиофлавина Т распадается на -сопряженные системы бензтиазольного и ами нобензольного колец, которые могут при этом выступать как независимые хромофо ры. Барьер невысок и, поэтому в основном состоянии значительная доля молекул бу дет иметь конформацию с несвязанными бензтиазольным и аминобензольным коль цами. Известно, что по мере увеличения размеров системы -сопряженных связей спектр сдвигается в длинноволновую сторону. Поэтому любой из фрагментов тиоф лавина Т, например бензтиазольное кольцо, должен иметь более коротковолновый спектр поглощения (и флуоресценции) по сравнению с тиофлавином Т.

Значительное содержание молекул тиофлавина Т с нарушенной системой -со пряженных связей в основном состоянии позволяет объяснить ряд, до сих пор не понятых и объясняемых существованием примесей, особенностей спектров возбуж дения флуоресценции и спектров флуоресценции красителя (см., например, Воропай и др. 2003;

[13]). В частности, существование у тиофлавина Т в водном растворе и в спиртах полосы флуоресценции с максимумом около 440 нм, имеющей спектр возбу ждения флуоресценции с максимумом при приблизительно 340-350 нм, а также сложный характер спектра возбуждения флуоресценции при регистрации в области 480 нм (рис. 4.5.4), можно объяснить сосуществованием молекулы тиофлавина Т и ее фрагментов в основном состоянии.

Есть все основания полагать, что низкая величина энергетического барьера при = 90 (270)° между состояниями, отвечающими минимуму энергии в основном состоя нии, будет присуща молекулам тиофлавина Т также и в возбужденном состоянии. В таком случае поворотная релаксация фрагментов молекулы тиофлавина Т друг отно сительно друга в возбужденном состоянии, приводящая к нарушению системы со пряженных связей, должна являться основным процессом безызлучательной дезакти вации возбужденного состояния тиофлавина Т. Молекулы, у которых безызлучатель ная дезактивация возбужденного состояния связана с поворотами фрагментов моле кулы друг относительно друга, получили название молекулярнах роторов.

Константа скорости преодоления активационного барьера внутреннего враще ния в 700 см-1 при Т = 300 К составляет k = 2.18·1011 сек-1, т.е. отдельная молекула преодолевает такой барьер в среднем 200 раз за одну наносекунду. Эта оценка спра ведлива, конечно, только для изолированных молекул в вакууме. В растворителе вращательная релаксации фрагментов молекулы тиофлавина Т друг относительно друга требует одновременного кооперативного движения молекул растворителя, пре пятствующего вращению фрагментов, т.е. будет определяться вязкостью растворите ля и гидродинамическими характеристиками фрагментов тиофлавина Т.

Исследование зависимости квантового выхода флуоресценции тиофлавина Т (Ф) от вязкости () и температуры (Т) позволило определить характерное время дос тижения молекулой конформации с близким к 90 или 270° и энергию активации процесса безызлучательного перехода тиофлавина Т в основное состояние. Для тиоф лавина Т в 99 % глицерине энергия активации E = 4700 ± 300 см-1 оказалась близкой к энергии активации вязкого течения глицерина () = 5200 см-1 [53]. Линейный ха рактер зависимости 1/Ф – 1 для тиофлавина Т в вводно-глицериновых растворах при 293 К от / (рис. 4.5.5) также свидетельствует о том, что константа скорости дос тижения молекулой тиофлавина Т конформации, при которой нарушается единая сис тема -сопряженных связей бензтиазольного и аминобензольного колец, определяет ся не барьером внутреннего вращения, а вязкостью растворителя.

рег=480нм =440нм возб 1. N Инт. фл., отн. ед.

1. Интенсивность фл., отн. ед.

0. 0. 0. N 0. 0. S I II Рис. 4.5.1 0. 0.6 0.00 0.05 0.10 0. [фибрилл], мг/мл 1 0. - o o o o 37 37 0. 35 - E(S0), см 0. 250 300 350 400 450 500 Длина волны, нм Рис. 4.5. - 0 60 120 180 240 300, град 1. Рис. 4.5. 3 0. Инт. фл., отн.ед.

T = 293 K 60 0. 1/Ф - 0. 0. 0. 250 300 350 400 450 500 0 Длина волны, нм 5 10 15 20 25 30 Рис. 4.5. T/, cпз-1 K Рис. 4.5. 1.4 1. 1. 0. 1., нс 0. 0. 1 2 3 0. 0. 3 0. 0. 0. 0. 440 460 480 500 520 540 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2., нс Длина волны, нм Рис. 4.5.7 Рис. 4.5. _ Рис. 4.5.1. Пространственная модель молекулы тиофлавина Т (ThT). Показаны атомы S, C и N. Выделены два фрагмента молекулы ThT: бензтиазольное (I) и аминобензольное кольцо (II). Угол между бензтиазольным и аминобензольным кольцами определяется как угол между плоскостями, в которых лежат атомы 1, 2, 3 и 2, 3, 4.

Рис. 4.5.2. Спектры возбуждения флуоресценции и флуоресценции ThT, инкорпорированно го в амилоидные фибриллы. Представлены спектры возбуждения флуоресценции (рег = нм ) и флуоресценции (возб = 440 нм ) ThT в присутствии инсулиновых фибрилл в концен трации от 0.02 до 0.14 мг/мл с шагом 0.02 мг/мл (кривые 1–7, соответственно). Вставка: зави симость интенсивности флуоресценции (возб = 440 нм, рег = 480 нм ) от концентрации ами лоидных фибрилл. Концентрация ThT – 0.5 мкM.

Рис. 4.5.3. Влияние присоединения метильной группы к атому азота бензтиазольного кольца на зависимость потенциальной энергии молекулы ThT от угла между плоскостями бен зтиазольного и аминобензольного колец. Расчет выполнен с помощью метода AM1 для ThT (1) и для ThT в отсутствие метильной группы (2). Метильная группа придает молекуле ThT свойства, присущие молекулярным роторам.

Рис. 4.5.4. Спектры возбуждения флуоресценции (1– рег = 480 нм;

2 – рег = 440 нм) и флуо ресценции (3 – возб = 340 нм;

4 – возб = 440 нм) ThT и этаноле. Концентрация ThT – 0.5 мкM.

Рис. 4.5.5. Зависимость квантового выхода флуоресценции ThT от вязкости растворителя (водно-глицериновые смеси).