Механизмы микроэволюции вируса клещевого энцефалита
На правах рукописи
Карганова Галина Григорьевна МЕХАНИЗМЫ МИКРОЭВОЛЮЦИИ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА 03.00.06 – вирусология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
МОСКВА - 2009 2
Работа выполнена в Государственном учреждении Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П. Чумакова РАМН
Научный консультант:
доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН Лашкевич Василий Андреевич
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор, академик РАМН Зверев Виталий Васильевич, доктор биологических наук, профессор Гараев Мансур Мухамедович, доктор биологических наук, старший научный сотрудник Калинина Наталья Олеговна
Ведущая организация: Государственное учреждение научно исследовательский Институт вирусологии имени Д.И. Ивановского РАМН
Защита состоится «19» июня 2009г. в часов на заседании диссертационного совета Д 001.026.01 при Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова РАМН по адресу 142782, Московская обл., п/о Институт полиомиелита.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Института полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М. П. Чумакова (142782, Московская обл., п/о Институт полиомиелита).
Автореферат разослан «» _ 2009 г.
Ученый секретарь диссертационного совета к.б.н. /Медведкина О.А./
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Высокий риск инфицирования, широкое распространение и тяжесть заболевания делают клещевой энцефалит (КЭ) одной из самых актуальных природно-очаговых вирусных инфекций в России. Для заболеваемости этой инфекцией характерна цикличность, и с 2000 года наблюдается снижение числа регистрируемых случаев КЭ по сравнению с 1999 годом, когда в России было зарегистрировано 10000 случаев. Несмотря на это, эпидемиологическая ситуация остается напряженной. КЭ распространен на территории 50 субъектов РФ. Число регистрируемых случаев в последние годы превышает 2000, около трети которых протекает с остаточными осложнениями разной степени тяжести, часто приводящими к инвалидности. У 1-5 % пациентов КЭ переходит в хроническую форму. Предыдущие 20 лет характеризовались повсеместным увеличением численности клещей-переносчиков вируса КЭ (ВКЭ), расширением ареала инфекции, увеличением группы риска за счет городских жителей до практически всего населения, проживающего на эндемичных территориях, а также большим числом смешанных вирусных и бактериальных переносимых клещами инфекций.
Цикличность и географическая неравномерность заболеваемости КЭ определяются многими факторами, в том числе числом и видом клещей переносчиков, их зараженностью ВКЭ, числом и видами прокормителей, количеством восприимчивого населения, свойствами циркулирующего вируса и наличием в клещах возбудителей сопутствующих инфекций.
Постоянный комплексный мониторинг эпидемиологической и эпизоотологической ситуации в очагах и понимание связи эпизоотологических характеристик и заболеваемости КЭ могут дать информацию, позволяющую делать как краткосрочные прогнозы, так и разрабатывать сценарии изменения риска заболеваний КЭ в зависимости от изменения климата, проведения профилактических мероприятий, антропогенного и других воздействий на биоценоз, а также предсказать появление новых эпидемически важных вариантов ВКЭ. Очевидно, что для этого необходимо изучение механизмов взаимодействия всех звеньев паразитарной системы: прокормитель-клещ-вирус.
В последнее время, благодаря усилиям нескольких научных коллективов отмечаются большие успехи в области молекулярной эпидемиологии КЭ.
Установлены ареалы трех генотипов ВКЭ, получены предварительные данные, указывающие на возможную циркуляцию в природе новых генетических вариантов этого вируса. Тем не менее, полученной информации недостаточно для объяснения различных уровней заболеваемости в разных регионах России, остаются открытыми вопросы о том, какие факторы определяют активность очагов, цикличность подъема заболеваемости, и существует ли связь между уровнем заболеваемости и вирулентностью циркулирующих вариантов ВКЭ в данном регионе.
Современный прогресс в молекулярной биологии и вирусологии позволяет изучать вирус на популяционном уровне, оценивать гетерогенность популяции и влияние этой гетерогенности на основные характеристики вируса, в том числе и патогенетические.
Настоящая работа посвящена изучению механизмов микроэволюции ВКЭ.
Популяционный подход при изучении арбовирусов, специфики поведения вирусной популяции при чередовании хозяев (членистоногие-прокормители) дает новую информацию, позволяющую объяснить зависимость вирулентности вируса и активности очагов от различных характеристик биоценоза.
ЦЕЛЬ РАБОТЫ: изучение механизмов микроэволюции популяции ВКЭ.
ЗАДАЧИ РАБОТЫ:
- на основе данных филогенетического анализа оценить основные факторы, определяющие эволюцию ВКЭ;
- на модели одного штамма ВКЭ изучить геном и свойства вариантов вируса, имеющих селективные преимущества при репродукции в клещах и млекопитающих;
- исследовать начальные этапы взаимодействия ВКЭ с клетками и их роль в изменчивости этого вируса;
- описать патогенез и формирование иммунного ответа при инфекции, вызванной вариантами вируса, адаптированными к клещам и млекопитающим;
- описать механизмы изменения генетической структуры популяции при смене хозяина.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА Впервые показано, что на поверхности клеток существует два типа рецепторов для ВКЭ, обеспечивающих высоко- и низкоаффинное связывание вирионов.
Впервые изучены молекулярные основы адаптации ВКЭ к клещам и млекопитающим и предложена схема, объясняющая быструю переадаптацию вируса при чередовании хозяев. Впервые показано, что адаптация ВКЭ к клещам связана с появлением мутаций в белке Е, приводящих к комплексному изменению антигенной структуры основного гликопротеина Е и повышающих аффинность связывания вирионов с гликозаминогликанами (ГАГ) на поверхности клетки, которые служат низкоаффинным рецептором для вирионов ВКЭ.
Впервые изучены механизмы восстановления низкой аффинности связывания вирионов с ГАГ у мутантов ВКЭ с ГАГ-связывающим фенотипом.
Впервые показано, что при репродукции вируса с ГАГ-связывающим фенотипом в клетках млекопитающих могут возникать варианты ВКЭ, способные вызывать все формы инфекции (инаппарантную, острую и персистентную).
В результате проделанной работы впервые в экспериментах на мышах охарактеризована инаппарантная форма КЭ, вызванной периферическим введением адаптированного к клещам варианта ВКЭ с ГАГ-связывающим фенотипом. При данной инфекции нет виремии, не выявляется вирус и вирусная РНК в центральной нервной системе (ЦНС), не выявляются антитела (АТ) к основному гликопротеину Е при синтезе в небольших количествах АТ к неструктурному белку NS1 и формируется длительный протективный иммунитет.
НАУЧНО-ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ Настоящая работа является первым комплексным исследованием, позволяющим оценить поведение популяции переносимого клещами арбовируса при чередовании хозяев (клещ-млекопитающее). Для экспериментально полученных вариантов ВКЭ, имеющих селективное преимущество при размножении в клещах и млекопитающих, проведено сравнение геномов, свойств вирионов, характеристик репродукции в клетках, патогенетических характеристик и особенностей иммунного ответа в экспериментах на лабораторных мышах и показаны механизмы изменения структуры популяции ВКЭ при смене хозяина.
Выявлено, что адаптация ВКЭ к клещам может приводить к значительному изменению антигенной структуры белка Е. Это необходимо учитывать при разработке и применении вакцинных препаратов, а также при оценке природной изменчивости антигенной структуры ВКЭ.
Показано, что при переадаптации ВКЭ от клещей к млекопитающим в популяции вируса появляются варианты, различающиеся по патогенетическим характеристикам.
Накопленная информация показывает, что длительная циркуляция ВКЭ в организме клеща может приводить к селекции низковирулентных вариантов, обеспечивающих скрытую иммунизацию млекопитающих против вирулентного вируса без синтеза АТ к белку Е. Полученные данные следует учитывать при создании диагностических препаратов, при прогнозировании тяжести течения и исхода заболевания, а также при изучении уровня сероконверсии у людей и прокормителей.
Приведенные данные относятся к изучению механизмов микроэволюции ВКЭ и патогенеза при разных формах КЭ с учетом гетерогенности популяции, которое являются одним из приоритетных направлений фундаментальных исследований в области инфекционной патологии.
ВНЕДРЕНИЕ Материалы исследований были использованы при составлении Санитарно эпидемиологических правил 3.1.3.2352-07 «Профилактика клещевого вирусного энцефалита», включены в программу лекций на кафедре вирусологии биологического факультета МГУ им. М.И.Ломоносова.
Определена первая полная нуклеотидная последовательность генома штамма ВКЭ прибалтийской группы сибирского генотипа (GenBank http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank, № DQ486861).
Разработан корректный методический подход, позволяющий оценить наличие персистенции вируса в ЦНС (Вопросы вирусологии, 2006).
ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:
- на поверхности клеток существует два типа рецепторов для ВКЭ, обеспечивающих высоко- и низкоаффинное связывание вирионов;
- популяция ВКЭ испытывает разное селективное воздействие при репродукции в клещах и млекопитающих, адаптация ВКЭ к клещам связана с появлением мутаций в белке Е, повышающих аффинность связывания вирионов с гликозаминогликанами (ГАГ) на поверхности клетки, которые служат низкоаффинным рецептором для этого вируса;
- адаптированный к клещам вариант ВКЭ с ГАГ-связывающим фенотипом при периферическом введении лабораторным мышам вызывает инаппарантную инфекцию, которая характеризуется формированием длительного протективного иммунитета без выраженного синтеза антител (АТ) к основному вирусному гликопротеину Е;
- варианты одного штамма ВКЭ, полученные на разной стадии адаптации к клещам и переадаптации к млекопитающим, могут вызывать все формы КЭ:
острую, инаппарантную и хроническую;
- ВКЭ может существовать в виде гетерогенной стабильной по составу популяции, содержащей варианты, обладающие селективным преимуществом при репродукции либо в клещах, либо в млекопитающих, соотношение которых в популяции меняется при чередовании хозяев в процессе циркуляции;
- при определенных условиях в популяции ВКЭ могут быстро (за один пассаж) возникать новые мутанты с более высокой приспособленностью к репродукции в данной системе, при этом скорость изменения генетической структуры популяции ВКЭ и разнообразие мутантов определяется характеристикой хозяина и наличием эффекта "бутылочного горлышка".
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Работа была апробирована на заседании межлабораторного Ученого совета ГУ ИПВЭ им. М.П.Чумакова РАМН 20 февраля 2009 года.
Материалы диссертации представлены на заседании Ученого совета ГУ ИПВЭ им. М.П.Чумакова РАМН (2007), на научной конференции, посвященной 90-летию со дня рождения М.П.Чумакова (Москва, 1999), на региональных научно-практических конференциях (Якутск, 2007;
Красноярск, 2008;
Пермь, 2008), на Всесоюзных и Всероссийских научно-практических конференциях (Иркутск, 1990;
Алма-Ата, 1991;
Ярославль, 1992;
Ижевск, 1998;
Новосибирск, 2002;
Пермь, 2003;
Самара, 2004;
Красноярск, 2005), на Международных конференциях по арбовирусам и арбовирусным инфекциям (Москва, 1989), по проблемам инфекций в клинической медицине (Санкт-Петербург, 2002), по ликвидации и элиминации инфекционных болезней (Санкт-Петербург, 2003), по возникающим болезням и выживанию (IMED Вена-Австрия, 2007), на VIII и Х Международных конгрессах по вирусологии (Берлин-Германия, 1990;
Иерусалим-Израиль, 1996), на III Совместном совещании европейского общества борьбы с вирусными заболеваниями и европейской группы по быстрой вирусной диагностике (Страсбург-Франция, 1991), на V Интернациональном симпозиуме по (+)РНК содержащим вирусам (Флорида, 1998), на IV Конгрессе Европейского общества по инфекционным болезням (ESEI Лиссабон-Португалия, 2007);
на VIII Всероссийском съезде эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2002), и на IV Всероссийском съезде общества паразитологов (Санкт Петербург, 2008);
на расширенных пленумах проблемных комиссий по клещевым и другим вирусным энцефалитам (Москва, 2003) и арбовирусам (Астрахань, 2006), на Бюро Отделения профилактической медицины РАМН (Москва, 2008).
ПУБЛИКАЦИИ По результатам работы опубликовано 14 статей в реферируемых научных журналах, из них 3 за рубежом, 1 монография и 10 статей в научных сборниках.
СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ Диссертация изложена на 385 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего 511 источников. Работа иллюстрирована 21 таблицей и 38 рисунками.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ МАТЕРИАЛЫ Использованные в работе штаммы и варианты ВКЭ были любезно предоставлены в.н.с. ГУ ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН Т.И. Дживанян: штамм Софьин (выделен от больного в 1937 г. на Дальнем Востоке);
штамм Рс (выделен до 1980 г.), штамм Абсеттаров (выделен от больного в Ленинградской области в 1951 г.), штамм ЭК-328 (выделен в 1972 году из клеща I.persulcatus в Эстонии), вариант 718/574, полученный в результате пассажей штамма Эк-328 через клещей Hyalomma marginatum marginatum. Все исследования были проведены с использованием перевиваемой культуры клеток почек эмбриона свиньи (СПЭВ) (Dzhivanyan et al., 1974).
Лабораторная культура клещей Hyalomma marginatum turanicum, Pomeranzev, 1946 была выведена от сытых самок, собранных в Ставропольском крае в 2004 г. Все работы по определению клещей, их содержанию и заражению были проведены в.н.с. ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН Л.А. Буренковой.
Эксперименты проводили на беспородных (б/п) мышах (6 г, филиал «Андреевка» ГУ НЦ биотехнологий РАМН) и мышах линии BALB/c (6 и 12 г, филиал «Столбовая» ГУ НЦ биотехнологий РАМН).
Гистологическое исследование головного мозга инфицированных ВКЭ мышей было выполнено к.б.н. ст.н.сотр. ГИСК им. Л.А. Тарасевича Н.В.Терешкиной.
В работе были использованы лошадиный -глобулин против ВКЭ (НИИ вакцин и сывороток, г.Томск) и набор моноклональных антител к белку Е, предоставленный заместителем директора ГНЦ вирусологии и биотехнологии «Вектор» (Кольцово) В.Б.Локтевым.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ 1. Особенности эволюции переносимых клещами флавивирусов К началу данного исследования были известны полные геномы только для двух штаммов ВКЭ (Плетнев и др., 1989;
Pletnev et al., 1990;
Mandl et al., 1990, 1991). В настоящее время в Генбанке представлено 28 полных геномов для штаммов этого вируса.
Был проведен филогенетический анализ с использованием известных полных геномов штаммов ВКЭ и переносимых клещом I. ricinus флавивирусов, вызывающих энцефаломиелиты у домашних животных (рис. 1). Вирусы разделились на две группы. В первую группу вошли 5 европейских штаммов ВКЭ в виде одной группы и вирусы шотландского энцефаломиелита овец (ШЭО), испанского энцефаломиелита овец (ИЭО), турецкого энцефаломиелита овец (ТЭО) и греческого энцефаломиелита коз (ГЭК). Для каждого из этих вирусов известен геном только для одного штамма. Вторая группа достоверно разделилась на несколько ветвей. Отдельную ветвь представляют штаммы, относящиеся к сибирскому генотипу, две отдельные ветви - иркутские штаммы 178-79 и 886-84, выделенные в 1979 и 1984 годах, соответственно, и отдельную ветвь формирует дальневосточный генотип вируса.
Дивергенция геномов штаммов внутри европейского генотипа до 3%, внутри дальневосточного - до 6,5%, и до 7,8% - у сибирского генотипа. Обращает на себя внимание, что штаммы, относящиеся к одному генотипу, очень близки между собой, несмотря на большую разницу во времени выделения.
Штаммы, относящиеся в сибирскому генотипу, почти равно удалены от европейского и дальневосточного на 17,1-18,2% и 16,3-17,29%, соответственно.
Штамм ЭК-328, для которого нами была определена последовательность полного генома, принадлежит сибирскому подтипу и образует отдельную ветвь внутри него.
Штаммы 178-79 и 886-84 отличаются друг от друга на 13,2%, и на 12,2 14,3% от представителей ближайшего к ним дальневосточного генотипа. Эти отличия значительно больше, чем между штаммами внутри генотипов ВКЭ, и близки к уровню дивергенции европейского генотипа ВКЭ и вирусов ШЭО и ИЭО. Эти значения и данные филогенетического анализа свидетельствуют о том, что иркутские штаммы представляют собой два новых генотипа. Различия между дальневосточными и сибирскими штаммами превышают или на уровне различий между европейскими штаммами и вирусами ШЭО, ТЭО, ИЭО, ГЭК.
Одним из актуальных в вирусологии вопросов является определение понятия вида. Критериями объединения в один вид считаются следующие факторы: возможность рекомбинации геномов, наличие общего хозяина, данные филогенетического анализа и молекулярной дистанции и др. У флавивирусов, переносимых комарами, была зарегистрирована внутритиповая рекомбинация (Holmes et al., 1999;
Baillie et al., 2008). Проведенный нами анализ 26 геномов штаммов ВКЭ с помощью программы Simplot не выявил признаков рекомбинации.
Grard с соавт. (2007) предложили, чтобы все флавивирусы, переносимые клещами I.ricinus и I. persulcatus, были отнесены к одному виду – вирус клещевого энцефалита. По предложению Kuno с соавт. (1998) у флавивирусов в 10 0. Primorye- Primorye- 100 Primorye- Primorye- 100 Россия, 1986, Primorye- 100 Homo sapiens, мозг Primorye- Япония, 1995, Oshima5-10 Canis familiaris, кровь 205 Россия: Хабаровский край, Россия, 1973, Dalnegorsk 100 Homo sapiens, мозг Primorye- 100 Sofjin-HO Россия: Приморье, 1937, Homo sapiens, мозг Sofjin Glybinnoe/ Россия, 1985, Kavalerovo 95 Homo sapiens, мозг MDJ-01 Китай Senzhang Китай, Россия: Иркутская область, 178-79 1979, I. persulcatus Россия: Иркутская область, 886-84 1984, Clethrionomys rufocanus EK-328 Эстония, 1972, I. persulcatus Vasilchenko Zausaev Hypr 100 Чехия, Brno, 1953, Homo sapiens, кровь Neudoerfl Австрия, Neudorfl, 1971, I. ricinus K23 Германия : Karlsruhe, 1975, I. ricinus 100 Германия: Macaca sylvanus, Salem naturally exposed monkey brain 100 Чехия, Temelin, 1987, I. ricinus 100 SSEV LIV TSEV GGEV Bogolubovka Powassan LB Рис.1. Филогенетическое дерево для полных геномов (без концевых 16 нуклеотидов (нт)) штаммов ВКЭ и вирусов, переносимых клещом I. ricinus: SSEV – вирус ИЭО, LIV – ШЭО, TSEV – вирус ТЭО, GGEV - вирус ГЭК. Алгоритм neighbour joining.
вид объединяются вирусы, имеющие общего переносчика, с процентом гомологии более 84%. Если все вирусы объединить в один вид ВКЭ, уровень дивергенции геномов внутри вида будет достигать 21,5%. С другой стороны, все вирусы можно разделить на два вида: вирусы, переносимые клещом I.persulcatus, и вирусы, переносимые клещом I. ricinus. Уровни дивергенции геномов внутри вида будут достигать 16,4% и 17,1%, соответственно. В это случае, встает вопрос о вариантах ВКЭ, относящихся к дальневосточному и европейскому генотипам и циркулирующих в Юго-Восточной Азии без участия этих видов клещей (Takashima et al., 1997;
Kim et al., 2008).
В любом случае, очевидно, что основным фактором эволюции на уровне вида для переносимых клещами флавивирусов млекопитающих является вид основного переносчика вируса. Независимо от того, как будут названы группы вирусов с разными переносчиками (видом или подвидом), рицинусная группа вирусов, очевидно, состоит из 4 субтипов: европейский генотип ВКЭ, вирус ШЭО, вирус ИЭО и подгруппа, включающая вирусы ГЭК и ТЭО.
Персулькатусная группа также включает 4 субтипа: дальнейвосточный, сибирский и субтипы, представленные штаммами 178-79 и 886-84.
Для многих вирусов основным фактором, определяющими эволюцию внутри вида, является иммунный ответ хозяина. Анализ представленных в Ген банке данных для фрагментов РНК, длиной 1020 нуклеотидов, кодирующих большую часть поверхностного белка Е, который отвечает за формирование гуморального иммунитета при флавивирусной инфекции, показал высокую гомология генов этого белка у штаммов, относящихся к одному генотипу и значительно отличающихся по времени выделения. Например, ген белка Е штамма Эк-328 отличается от эстонского штамма, выделенного через 30 лет, всего 3 нуклеотидными заменами.
При анализе известных 27 полных геномов 25 штаммов ВКЭ мы выявили 40 аминокислотных остатков, различающих рицинусные и персулькатусные вирусы, и всего 4 сайта, которые различаются у вирусов КЭ и вирусов энцефаломиелита домашних животных. Мы не нашли сайты, которые различали бы все рицинусные и персулькатусные субтипы, но выявили 15 сайтов, различающих все три генотипа ВКЭ. Только один из них находится в белке Е.
Это означает, что разделение на генотипы не связано с уходом вируса от гуморального иммунного ответа прокормителей.
Таким образом, для ВКЭ характерно существование стабильных в течение большого периода времени локальных популяций, привязанных к географическому месту, циркуляция нескольких генотипов в одном и том же очаге и незначительное селективное воздействие иммунной системы хозяина на уровне гуморального иммунитета. Об этом говорят следующие данные:
идентичность белков Е вирусов, выделенных на определенной территории с интервалом более 30 лет;
наличие всего 1 позиции в гене белка Е, различающей генотипы ВКЭ;
антигенная близость в серологических реакциях штаммов ВКЭ, принадлежащих к разным генотипам (Clarke, 1960, 1964;
Calisher et al., 1989);
случаи несовпадения принадлежности штаммов ВКЭ к определенному генотипу и серотипу (Злобин и др., 2003;
Погодина и др., 2004);
эффективность инактивированных вакцин на основе дальневосточных и европейских штаммов на всей территории РФ, где в основном представлены другие генотипы вируса (Леонова и др., 2004;
Романенко и др., 2007).
Изменение свойств вируса КЭ при адаптации к клещам и 2.
млекопитающим и выявление хозяин-специфических генетических детерминант Ранее рядом авторов, в том числе и нами, для разных штаммов ВКЭ и вируса Повассан было показано, что репродукция в клещах и млекопитающих оказывает разное селективное воздействие на вирусы (Дживанян и др. 1975;
Чунихин и др., 1975;
Чунихин и Дживанян, 1977;
Khozinskaya et al., 1985;
Дживанян и др., 1986, 1988, 1991;
Чунихин и др., 1986;
Kaluzova et al., 1994;
Labuda et al., 1994). Адаптация ВКЭ к клещам разных видов способствует отбору вариантов, обладающих сниженной нейроинвазивностью (НИ), т.е.
вирулентностью при периферическом заражении мышей, и сниженной гемагглютинирующей активностью (ГА). Репродукция ВКЭ в клетках млекопитающих, напротив, способствует повышению НИ и ГА.
В данной работе использовали штамм ВКЭ ЭК-328 и полученный из него в результате 17 парэнтеральных пассажей на клещах H. m. marginatum вариант М (в оригинальных работах - вариант 718/574) (Чунихин и Дживанян, 1977;
Сhunikhin and Dzhivanyan, 1979;
Дживанян и др., 1986, 1988, 1991). Клон 718/ хранился в течение 10 лет при -200С и прошел еще 2 дополнительных пассажа через мозг б/п мышей. Мы назвали его вариантом М и показали, что по основным свойствам этот вирус не отличается от варианта 718/574. Методы, использованные при изучении вирусов, описаны в работе Romanova et al. (2007).
Основные характеристики штамма Эк-328 и варианта М приведены в табл. 1.
Способ получения и основные свойства варианта М указывают на то, что этот вирус имеет селективное преимущество при репродукции в клещах. В этом заключении мы основываемся на нижеследующих соображениях. 1) В ранней работе в процессе двух независимых линий пассажей на клещах штамма ЭК-328, клонированного и без предварительного клонирования, сначала появлялась примесь мелкобляшечного вируса в популяции, а затем при последующих пассажах происходило вытеснение крупных бляшек мелкими (Чунихин и др., 1977, 1979;
Т.И. Дживанян, личное сообщение). 2) Вариант М имеет более высокие титры при репродукции в клещах, чем родительский штамм ЭК-328. 3) В клетках СПЭВ у варианта М замедленный цикл репродукции, количество вируса, связанного с клетками, выше, чем количество свободного вируса.
Таблица 1. Характеристики родительского штамма ЭК-328 ВКЭ и адаптированного к клещам H. m. marginatum варианта М Характеристики Штамм Эк-328 Вариант М титр вируса в клещах H. marginatum 5,2+0,2 lgБОЕ/клещ 6,9+0,2 lgБОЕ/клещ титр вируса в мозге мышей после 9,0+0,3 7,9+0, интрацеребрального (и/ц) заражения lgБОЕ/мозг lgБОЕ/мозг нейровирулентность для б/п мышей 0,5 БОЕ 0,1 БОЕ (ЛД50 при и/ц введении) нейроинвазивность для б/п мышей 0,8 БОЕ 1000БОЕ (ЛД50 при подкожном введении ) Размер бляшек в культуре клеток 7 мм 1мм+7мм СПЭВ отношение 100: характеристика репродукция в Количество вируса в Замедленный цикл культуре клеток СПЭВ КЖ выше, чем в репродукции, клетках количество вируса в КЖ ниже, чем в клетках соотношение копий РНК к БОЕ для 2,2 lg 2,3lg вируса в КЖ клеток СПЭВ (24 часа) ГА в КЖ клеток СПЭВ + наличие катодного преципитата + вирионов с АТ в РИЭФ наличие преципитата невирионного + + антигена в РИЭФ ЛД –летальная доза;
БОЕ – бляшкообразующая единица;
КЖ – культуральная жидкость;
АТ – антитела;
РИЭФ – ракетный иммунноэлектрофорез.
Поведение штамма ЭК-328 при разных способах заражения мышей и при размножении в культуре клеток показывает, что этот вирус по сравнению с вариантом М имеет преимущества при репродукции в клетках млекопитающих.
В пользу этого свидетельствуют следующие факты: 1) более высокие титры в мозге мышей;
2) крупный размер бляшек в культуре клеток СПЭВ;
3) быстрый, по сравнению с вариантом М, цикл репродукции в культуре клеток СПЭВ, количество свободного вируса в течение всего цикла репродукции выше, чем количество вируса, связанного с клетками.
Были определены последовательности полных геномов данных вирусов. В табл. 2 приведены замены, которые были выявлены в геноме варианта М при сравнении с геномом штамма ЭК-328. Всего было обнаружено 15 н.т. замен, две из которых были в 5'-НТО, 5 - в структурных белках и 8 - в неструктурных белках. 6 н.т. приводили к аминокислотным заменам (а.к.) в сигнальной последовательности белка prМ, а также в белках Е, NS2a и NS4a. Одна из а.к.
замен в белке Е в позиции 426 Thr706Ile расположена в стебле, а вторая - (122) Glu-Gly - в домене II (рис.2). Замены глютаминовой кислоты на глицин в позиции 122 белка Е описана ранее для варианта ВКЭ, полученного при адаптации штамма Найдорф к культуре клеток ВНК21 (Mandl et al.,2001;
Kroschewski et al., 2003). Она приводит к повышению положительного заряда белка Е и повышению аффинности связывания вирионов с ГАГ клетки (Mandl et al., 2001), что сопровождается образованием мелких бляшек в культуре клеток почки эмбриона свиньи и снижением НИ для мышей. Следует отметить, что 122 позиция расположена в районе, непосредственно примыкающем к пептиду слияния белка Е ВКЭ и изменения в этом районе могут прямо влиять на пространственное положение cd-петли (пептида слияния) в составе димера белка Е при физиологических значениях рН и особенно в составе тримера при кислых значениях рН в эндосоме клетки.
Рис. 1. Схематическое изображение структуры белка Е ВКЭ.
Для проверки влияния замены в 122 позиции в контексте структуры белка Е данных вирусов на связывание вирионов с ГАГ клетки мы изучили сорбцию вирионов на гепарин-сефарозе (ГС) – аналоге ГАГ. Для этого вирусы в равной дозе в виде вируссодержащей КЖ инфицированных клеток СПЭВ были Таблица 2. Замены в геноме варианта М по сравнению со штаммом ЭК- аминокислотная заменаа область генома нуклеотидная замена А19 G/A 5-НТО C42A C470U сигнальный пептид prM AlaVal A1337G Glu122Gly C2190U E C2249U Thr426Ile U2362C C3387U NS G3438A G3672U Lys52Asn NS2a G4827A NS A6526G Ser22Gly NS4a G6584A Arg41Lys G7437C NS4b U9888G NS a Аминокислотная позиция в соответствующем белке, нумерация с начала соответствующего белка сорбированы на ГС, инкубированы в течение 1 часа при комнатной температуре при периодическом перемешивании. В отдельных пробирках готовили контрольные вирусы, которые выдерживали в тех же условиях. После адсорбции сефарозу осаждали, супернатант собирали. Полученные пробы несорбированного на сефарозе и контрольного вируса титровали методом бляшек в культуре клеток СПЭВ (Romanova et al., 2007). Сорбция вирионов адаптированного к клещам варианта М на ГС оказалась выше, чем у вирионов штамма Эк-328 (рис.3), т.е. М вариант обладает ГАГ-связывающим фенотипом.
Варианты с подобным ГАГ-связывающим фенотипом описаны для многих вирусов (Byrnes and Griffin, 2000;
Hulst et al., 2000;
Lin et al., 2000), в том числе и флавивирусов японского энцефалита (ЯЭ), лихорадки Западного Нила (ЛЗН) и энцефалита Долины Муррей (ЭДМ) (Lee and Lobigs, 2002;
Lee et al., 2004), в частности ВКЭ (Mandl et al., 2001;
Goto et al., 2003). Для всех подобных вариантов характерна низкая виремия и низкая НИ для лабораторных мышей.
Рисунок 3. Процент вируса, % сорбированного вируса сорбированного на ГС, для штамма ЭК-328, варианта М и клонов 160/57, 116/59 и 103/84.
ЭК-328 вар.М Клон клон клон 160/57 116/59 103/ В наших экспериментах появление вируса с ГАГ-связывающим фенотипом наблюдали при адаптации штамма ВКЭ сибирского генотипа к клещам H. m.
marginatum. Доктор Чунихин с соавт. (1986) адаптировали к клещам H.
anatolicum 4 штамма ВКЭ, выделенных в Сибири и на дальнем Востоке. Во всех случаях в результате пассажей на клещах были получены мелкобляшечные варианты с низкой НИ для мышей. Вирионы всех полученных вариантов, подобно нашему варианту М, не образовывали преципитата с АТ в РИЭФ. Таким образом, разные штаммы ВКЭ имели сходную изменчивость при адаптации к клещам, относящимся к роду Hyalomma, которые не являются переносчиками этого вируса в природных очагах. Доктор Labuda с соавт. (1994) получили сходное изменение свойств ВКЭ при пассировании штамма европейского генотипа к клещам I.ricinus, которые являются основным переносчикам этого вируса. При этом авторы наблюдали снижение НИ вируса и выявили а.к. замену в позиции 84 белка Е, которая приводит к повышению положительного заряда вирионов и может обеспечивать ГАГ-связывающий фенотип полученного мутанта. Все перечисленные факты позволяют предположить, что появление вариантов ВКЭ с ГАГ-связывающим фенотипом является закономерностью при адаптации ВКЭ к клещам.
Для оценки влияния выявленных в белке Е замен на антигенные свойства вирусов были изучены вирионы штамма ЭК-328 и варианта М с помощью моноклональных АТ (моноклонАТ) в иммуноферментном анализе (ИФА) и с использованием преципитации меченых вирусных белков (РИП) из лизатов инфицированных клеток СПЭВ. Для сравнения брали штамм Софьин (дальневосточный генотип) и штамм Рс (европейский генотип) так, чтобы в реакции были представлены все 3 генотипа ВКЭ. ИФА проводили по непрямому методу (Романова и др., 2006). С помощью ИФА определили, что моноклонАТ E6B значительно слабее взаимодействуют с вариантом М, по сравнению со штаммами ЭК-328, Рс и Софьин (табл. 3). E6B является нейтрализующим и обладающим антиГА активностью моноклоном к эпитопу, принадлежащему к антигенному домену е2 белка Е, согласно эпитопной карте Цехановской с соавт.
(1993). МоноклонАТ Е4А, не обладающие нейтрализующими и антиГА свойствами, также различили штамм ЭК-328 и вариант М.
Таблица 3. Сравнение антигенной структуры вирионов штамма Эк-328 и варианта М с помощью набора моноклональных АТ к белку Е.
Характеристика Антигены Сыворотка и моноклонАТ* моноклональные РНБ РНБ РНБ Эк- Вариант Софьин Рс АТ М ИФА Контр.сыворотка к 1600 800 1600 ВКЭ 25600 25600 Е4А н.о.
- - 25600 25600 е EB1 - - е E6B + + 640 25600 Иммунопреципитация радиоактивно меченных белков е1-е2 0,90,2 0,50, 6B9 - - 0,20,1 0,50, е 7F10 - - 1,40,3 0,70,2 0,20,3 0,20, е 4C7 - + 0,70,2 0,60,3 0,00,1 0,30, е 10H10 - + 1,70,3 1,90,3 2,70,4 1,30, е 13F2 - - 0,10,1 0,20,1 0,10,2 0,40, * по опубликованным данным (Гайдамович и др., 1990;
Протопопова и др., 1996, 1997).
В РИП оценивали количество белка, которое преципитируют моноклонАТ из лизатов клеток СПЭВ, инфицированных вышеперечисленными штаммами, по отношению к количеству белка, преципитированного из этого лизата глобулином против ВКЭ (Романова и др., 2006). МоноклонАТ 7F10 к эпитопу в домене е1 статистически достоверно более активно преципитировали белок Е штамма ЭК-328, по сравнению с вариантом М.
МоноклонАТ, различившие в данной работе белок Е варианта М и исходного штамма ЭК-328, связываются с эпитопами в разных антигенных доменах белка Е.
Следовательно, изменение антигенной структуры у варианта М затрагивает удаленные эпитопы этого белка.
3. Взаимодействие вирионов ВКЭ с рецепторами на поверхности клеток Представленные выше данные показывают, что адаптация к клещам приводит к селекции вариантов ВКЭ с ГАГ-связывающим фенотипом. В связи с этим мы попытались более подробно изучить адсорбцию вирионов ВКЭ на клетках с целью лучше понять, какую роль в процессе проникновения вирионов в клетку могут играть ГАГ. К началу данного исследования сведения о природе рецепторов на поверхности клеток для флавивирусов и, в частности, для ВКЭ отсутствовали.
Для анализа связывания вирионов ВКЭ использовали штамм Софьин.
Вирионы метили по РНК при выращивании в клетках почек зеленых мартышек 46-47 в присутствии [Н3]-уридина (Timofeev et al., 1991). Меченые вирионы концентрировали с помощью ультрацентрифугирования и использовали для экспериментов по адсорбции на клетках СПЭВ. Клетки выращивали в 96 лучночных пластинах. К монослоям добавляли возрастающие концентрации меченого вируса. Проводили адсорбцию в течение 2 часов при +40С. После адсорбции собирали не связавшийся с клетками вирус, промывали клеточный монослой средой и собирали клетки. Определяли количество связавшегося и свободного вируса. Полученные результаты представляли в координатах Скэтчарда (Scatchard, 1949). Взаимодействие лиганда с одним рецептором в этих координатах описывается прямой линией, которая отсекает на оси ординат константу связывания, а на оси абсцисс – количество рецепторов данного типа.
Если лиганд связывается с двумя или большим количеством типов рецепторов, то в данной системе процесс описывается гиперболой или линией более высокого порядка. Асимптоты к плечам гиперболы характеризуют соответствующие типы рецепторов, которые различаются аффинностью связывания с лигандом. Под одним типом рецепторов могут выступать химически разные молекулы.
Как видно на рис. 4, в координатах Скэтчарда взаимодействие вирионов ВКЭ с клетками описывается гиперболой. Один из рецепторов характеризуется высокой константой связывания и представлен небольшим количеством на поверхности клеток. Второй, низкоаффинный рецептор, связывает практически все вирионы ВКЭ. Таким образом, адсорбция вирионов ВКЭ на клетках обусловлено взаимодействием с двумя типами рецептором: высокоаффинными и низкоаффинными.
+ - экспериментальные 0, данные;
— 0, аппроксимированная Отношение связанного вируса кривая;
0, — асимптоты к к свободному, % аппроксимированной 0, кривой.
Аппроксимированная 0, кривая рассчитана методом наименьших 0, квадратов. Асимптоты рассчитаны, согласно 0, работе Варфаламеева и 0 100 200 300 400 500 600 700 др. (1980).
Связанный вирус, dpm Рис.4. Результаты связывания меченных [3H]-уридином вирионов ВКЭ на монослое клеток СПЭВ, выраженные в координатах Скэтчарда.
Для выяснения природы клеточных рецепторов, обуславливающих вышеописанные взаимодействия вирионов ВКЭ с клетками, клетки СПЭВ обрабатывали раствором ТРСК-трипсина в течение 15 минут при комнатной температуре и проводили адсорбцию меченого вируса. Обработка клеток трипсином полностью блокировала высокоаффинное связывание вирионов с клетками. Эти данные позволили сделать предположение о белковой природе высокоаффинного рецептора.
Для более детального изучения предполагаемого клеточного белкового рецептора была получена антиидиотипическая сыворотка к поверхностному гликопротеину Е ВКЭ. Для этого мыши были однократно иммунизированы 50мкг очищенного белка Е (Timofeev et al., 1991). Для получения сыворотки у мышей была взята кровь из супраорбитальной вены на 9 (нормальный иммунный ответ на введение антигена) и 35 сутки после иммунизации (время максимального накопления антиидиотипических антител). Сыворотка мышей, взятая на 9 сутки после иммунизации, преципитировала из лизата клеток СПЭВ, инфицированных ВКЭ, белок Е. Сыворотка, взятая у тех же мышей на 35 сутки после иммунизации белком Е, содержала антиидиотипические антитела к этому белку, поскольку в ИФА при взаимодействии с иммуноглобулином против ВКЭ вела себя, как антиген.
Обработка клеток сывороткой с антиидиотипическими антителами перед адсорбцией вируса практически полностью блокировала связывание вирионов ВКЭ на высокоаффинном рецепторе. Данная сыворотка в РИП белков, меченных смесью [C14]-аминокислот или [C14]-глюкозамином, из лизатов незараженных клеток СПЭВ преципитировала только гликопротеин с мол. массой около кДа.
В последствие появился ряд работ, в которых с помощью антиидиотипических поликлональных и моноклонАТ был выявлен целый набор претендентов в рецепторы для вирионов ВКЭ (Протопопова и др, 1996, 1997;
Kopecky et al., 2005). С помощью моноклонАТ к нейтрализующим моноклонАТ к белку Е (в том числе к использованным в данной работе Е6В) из нескольких культур клеток были выделены белки с мол. массами 43, 67, 110, 210 кДа (Протопопова и др., 1996, 1997). Было показано, что белок 110 кДа является 1 цепью, а белок 210 кДа –3-цепью интегрина. Для вирусов ЛЗН и ЯЭ так же показано, что v3-интегрин является общим для этих вирусов рецептором на поверхности клеток Vero, HeLa, N2A (клетки мышиной нейробластомы) (Chu and Ng, 2004), и этот рецептор опосредует проникновение вирионов в клетку.
Выявленный белок с мол. массой 67 кДа оказался - ламининсвязывающим белком (ЛСБ) и был предложен авторами в качестве рецептора для ВКЭ с константой связывания 2,5х107 М-1, т.е. низкоаффинного рецептора (Protopopova et al., 1997;
Локтев и др., 2002). Представленные данные позволяют высказать предположение, что на поверхности белка Е ВКЭ есть участок, структурно близкий рецепторной области ламинина, который может взаимодействовать с разными типами рецепторов для ламинина. Таким образом, взаимодействие ЛСБ и ГАГ с белком Е ВКЭ может иметь сходный механизм, поскольку ГАГ могут выполнять функции ко-рецепторов для ламинина.. Выявленная нами замена в позиции белка Е глутаминовой кислоты на глицин, повышает положительный заряд белка Е и приводит к повышению связывания с ГАГ клетки. В наших экспериментах, в отличие от родительского штамма ЭК-328 вариант М, имеющий такую замену, слабо взаимодействует с моноклонАТ Е6В к эпитопу белка Е ВКЭ, отвечающему за связывание с ЛСБ на поверхности клетки. Это позволяет предположить, что ГАГ и ЛСБ могут служить в качестве одного из ко-рецепторов для разных вариантов ВКЭ, при этом адаптация к новому хозяину может сопровождаться изменением связывания с этими рецепторами.
Таким образом, нами впервые было показано, что ВКЭ имеет два типа рецепторов на поверхности клетки: высокоаффинный, по-видимому, белковой природы, с которым связывается менее 1% сорбированных вирионов, и низкоаффинный, с которым связывается основная масса вирионов ВКЭ.
4. Изменение патогенетических характеристик ВКЭ при адаптации к клещам и переадаптации к млекопитающим Сравнение вирулентности штамма Эк-328 и варианта М проводили на мышах линии Balb/c разного возраста, которые были инокулированы и/ц и интраперитонеально (и/п). Для сравнения использовали штамм Абсеттаров ВКЭ, обладающий высокой нейроинвазивностью для мышей этой линии.
Как видно из табл. 4, все изученные вирусы обладали близкой нейровирулентностью для мышей 6 и 12 г. В экспериментах на взрослых мышах штамм Эк-328 продемонстрировал несколько меньшую НИ, чем штамм Абсеттаров, исходя из данных о количестве БОЕ, необходимых для того, чтобы вызвать 50% гибель животных. НИ варианта М была в 10000 раз ниже, чем у штамма ЭК-328.
Таблица 4. Вирулентность штамма Эк-328, варианта М и штамма Абсеттаров ВКЭ для мышей BALB/c разного возраста и/ц заражение и/п заражение Мыши 5-7г Мыши 12 г Мыши 5-7г вирусы ЛД50(БОЕ) СПЖ(сутки)* ЛД50(БОЕ) ЛД50(БОЕ) СПЖ(сутки)** Абсеттаров 4,2±0, 0,1 0,1 3 9,90, ЭК-328 5,0±0, 0,5 0,5 18 121, Вариант М 5,1±0,3 5 месяцев *** 0,4 2,5 250 * доза заражения 5,5 lg ЛД50;
** доза заражения 10 ЛД50;
*** - период наблюдения.
Для характеристики инфекции мыши линии Balb/c 12г были инокулированы и/п 1000 БОЕ данными вирусами. Ежедневно у 3-х мышей брали кровь и органы, содержание инфекционного вируса в которых определяли методом бляшек. На 7-8 день по три мыши для каждого вируса были использованы для патоморфологического исследования.
У мышей, инфицированных штаммом Абсеттаров, после и/п введения БОЕ инфекция протекала остро. Все животные заболели на 6-7 сутки и к 9 дню погибли. Гистологическое исследование выявило характерную для ВКЭ картину менингоэнцефалита. У животных наблюдали двухволновую виремию с более выраженным вторым пиком (табл. 5). В мозгу вирус появлялся, начиная с 5 суток.
Таблица 5. Динамика появления инфекционного вируса (lgБОЕ/мл 10% суспензии) в крови органах и противовирусных АТ (ИФА) в сыворотках мышей после и/п введения 1000 БОЕ штаммов Абсеттаров, Эк-328 и варианта М штамм Абсеттаров дни после начала инфекции 1 2 3 4 5 6 7 Кровь* 2 2,7 2,7 0 2 4 2,7 4, мозг 0 4,8 6,6 7,8 7, 0 0 л/у 0 0 2 0 0 3 0 селезенка 0 4,7 2,4 3,9 4,9 4 0 5, 0 0 0 160 160 320 320 AT штамм ЭК- дни после начала инфекции 1 2 3 4 5 6 7 Кровь 2,3 4,3 4,1 0 2,3 2 0 мозг 0 0 0 3,2 4,3 4,7 6,8 7, л/у 0 0 0 0 0 0 3 селезенка 2 3 3,2 3,7 3,4 2,7 0 4, 0 0 0 160 160 160 320 AT вариант М дни после начала инфекции 1 2 3 4 5 6 7 Кровь 0 0 0 0 0 0 0 мозг 0 0 0 0 0 0 0 л/у 0 0 2 0 0 0 0 селезенка 3** 2,7** 0 0 0 0 0 АТ 0 0 0 0 0 0 0 * для титрования использовали сгустки крови;
** популяция вируса была представлена характерными для варианта М точечными бляшками и бляшками с диаметром 5-6 мм, соотношение 1:1. 0 – титр вируса 1,4 lgБОЕ/мл, титр АТ менее 1:8.
При инфицировании мышей 1000 БОЕ штамма Эк-328 наблюдали также острую инфекцию с двухволновой виремией с более выраженным первым пиком.
В мозге мышей вирус появлялся на сутки раньше, чем при инфекции вызванной штаммом Абсеттаров, однако животные заболевали только на 8-9 сутки, погибая к 11 дню. При гистологическом исследовании был обнаружен менингоэнцефалит.
Введение 1000 БОЕ варианта М и/п не вызвало никаких признаков заболевания у 49 из 50 зараженных животных. Гистологический анализ не обнаружил каких-либо специфических повреждений в ЦНС инфицированных животных. Нам не удалось выявить инфекционный вирус в крови мышей, инфицированных вариантом М, в лимфоузлах и селезенках был найден вирус в невысоких титрах. У одной мыши из 50 на 7 сутки после начала инфекции наблюдали типичную для КЭ картину заболевания.
Сыворотки мышей, инфицированных штаммами Абсеттаров, Эк-328 и вариантом М были проверены на наличие противовирусных антител с помощью ИФА. При острой инфекции в сыворотках мышей, инфицированных шт.
Абсеттаров и Эк-328, противовирусные АТ появлялись на 4 сутки после начала инфекции (табл. 5). При инаппарантной инфекции, вызванной вариантом М, нам не удалось с помощью ИФА выявить противовирусные АТ.
Сыворотки мышей, инфицированных штаммом Абсеттаров и вариантом М, полученные на 6 сутки после заражения, были проанализированы с помощью РИП вирусных белков из лизатов инфицированных клеток. Сыворотка мышей, зараженных штаммом Абсеттаров, преципитировала белок Е и высокомолекулярные неструктурные белки NS1, NS3 и NS5 из лизатов клеток СПЭВ, инфицированных как штаммом Абсеттаров, так и вариантом М. С помощью сыворотки мышей, зараженных вариантом М, никакие вирусные белки выявлены не были. С помощью лизата клеток СПЭВ, инфицированных дефектным аденовирусом Rad51, несущим ген белка NS1 вируса КЭ (Timofeev et al., 1998), мы выявили в небольших количествах АТ к белку NS1 в сыворотках мышей, инфицированных вариантом М, взятых на 7 и 28 дни инфекции.
Через 3 недели и 5 месяцев после и/п введения 1000 БОЕ варианта М мыши были умерщвлены, у них были взяты головной мозг, селезенки, лимфоузлы, а также были получены сгустки крови. Ни в исходных гомогенатах органов, ни в материалах после двух слепых пассажей этих гомогенатов в культуре клеток СПЭВ инфекционный вирус не был обнаружен. На эти сроки в мозге и селезенках мышей, инфицированных вариантом М, на фоне введения циклофосфана не удалось выявить вирусную РНК с помощью предложенного нами варианта ОТ-ПЦР с внутренним контролем (Романова и др., 2006).
В те же сроки через 3 недели и через 5 месяцев после и/п введения 1000 БОЕ варианта М мыши были разрешены 100 ЛД50 штамма Абсеттаров. Все мыши, предварительно инфицированные вариантом М, были защищены от последующего введения вирулентного вируса КЭ. Формирование длительного протективного иммунитета после и/п введения варианта М было показано в трех независимых экспериментах.
Отсутствие клинических признаков заболевания и повреждений в ЦНС показывают, что вариант М при и/п введении мышам вызывает инаппарантную форму инфекции, характеризующуюся отсутствием вируса в крови и ЦНС, хотя чувствительность использованного метода (45 БОЕ в пробе) не позволяет полностью исключить попадание небольшого количества вируса и его персистенции в ЦНС.
Для ГАГ-связывающих мутантов переносимых комарами флавивирусов ЯЭ и ЭДМ было показано, что после внутривенного введения вируса они быстро попадают в печень, где, по-видимому, элиминируются макрофагами печени (Lee and Lobigs, 2003). Вирионы могут попадать в печень в свободном состоянии или связанными с клетками крови. Мы проверили сорбцию вирионов изучаемых вирусов на эритроцитах мыши. Для этого у здоровых мышей были взяты эритроциты, к эритроцитам были добавлены вирусы. После инкубации несвязавшийся с клетками вирус был собран, и были определены титры свободного и связанного с эритроцитами вируса. На рис. 5А представлена динамика сорбции вирионов родительского штаммов Абсеттаров, ЭК-328, и варианта М на эритроцитах мыши. Насыщение эритроцитов вирионами происходит в первые 10 мин после добавления вируса. На рис. 5Б показана доля связанного вируса при разных соотношениях эритроцитов и вирионов. В любых условиях доля вирионов варианта М, связанных с эритроцитами, в 50-100 раз больше, чем этот показатель для штаммов Эк-328 и Абсеттаров.
Для оценки активации раннего неспецифического противовирусного иммунного ответа проводили определение содержания /-ИФН, ФНО-, ИЛ- и ИЛ-12 в крови мышей на начальных этапах инфекции после и/п введения БОЕ вирусов в виде вируссодержащей мозговой суспензии или КЖ инфицирпованных клеток СПЭВ.
Содержание /-ИФН в сыворотках крови, взятых от трех мышей через разные сроки после начала инфекции, определяли по подавлению цитопатического действия (ЦПД) вируса энцефаломиокардита мышей (ЭММ) (Бабаянц и др., 1985). В качестве контроля использовали сыворотку от трех мышей, которым вместо вируса вводили мозговую суспензию (МС) от здоровых мышей в соответствующем разведении. В сыворотке крови контрольных мышей через 5 часов после введения МС от здоровых мышей обнаружили /-ИФН в титрах 1:8, который отсутствовал в пробе, взятой через следующие 5 часов. Как представлено на рис. 6, штамм ЭК-328 оказался слабым индуктором ИФН 1 типа.
Рис. 5.
Б. Адсорбция вирусов на эритроцитах при разных дозах Характеристика вируса адсорбции штаммов Абсеттаров, Эк-328 и варианта М на % связанного вируса эритроцитах 1БОЕ/клетку мыши.
0,1 0,1БОЕ/клетку 0,01БОЕ/клетку 0, 0, М вариант Эк-328 Абсеттаров А. Динамика насыщения эритроцитов вирусами % связанного вируса 0, 10' 1 час 0, 0, Мвариант Эк- Абсеттаров Штамм Абсеттаров и вариант М индуцировали /-ИФН в сопоставимых титрах, но при инфекции, вызванной вариантом М, ИФН появлялся в крови животных уже через 5 часов, а у мышей, зараженных штаммом Абсеттаров, только через 10 часов после введения вируса.
Уровень остальных ключевых цитокинов в сыворотках крови животных, зараженных и/п 1000 БОЕ штаммов Абсеттаров, ЭК-328 и варианта М в виде КЖ инфицированных клеток СПЭВ, устанавливали с помощью коммерческих наборов для определения соответствующих цитокинов методом ИФА. Количество цитокинов в сыворотках крови инфицированных мышей сравнивали с уровнем цитокинов в контрольных сыворотках, полученных от животных, которым и/п была введена питательная среда 199.
Рис. 6.
Динамика появления ИФН-1типа в сыворотках титр ИФН (log2 Ед) мышей, и/п 5 часов инфицирован 10часов 3 24часа ных штаммами Абсеттаров, Эк-328 и вариантом М в контроль абсеттаров Эк-328 Мвариант дозе 1000БОЕ.
В первые часы после заражения животных изучаемыми штаммами ВКЭ мы наблюдали повышение в крови уровня ФНО- и ИЛ-10. ФНО- является провоспалительным цитокином (табл. 6). Его появление в крови свидетельствует об активации макрофагов и нейтрофилов. ФНО- индуцирует синтез ИЛ-10, а ИЛ-10 в свою очередь, подавляет синтез ФНО- (van der Pool et al., 1994). В нашем эксперименте ИЛ-10 выявляли одновременно с ФНО-, после чего концентрация ФНО- в крови животных понижалась до уровня контроля.
Известно, что ИЛ-10, являясь регулятором иммунных реакций, подавляет продукцию таких основных провоспалительных цитокинов, как ИЛ-6, ФНО-, экспрессию на клеточной мембране МНС-II и антигенпрезентирующую способность моноцитов/макрофагов, продукцию цитокинов Тh-1 лимфоцитами (-ИФН, ИЛ-2), продукцию цитокинов натуральными киллерами (НК), пролиферацию Т-лимфоцитов (Кашкин, 1998). Таким образом, ВКЭ, попадая в организм мыши, индуцирует состояние иммунодепрессии у инфицированных животных в первые часы после заражения, при этом штаммы ВКЭ могут различаться по выраженности и длительности вызываемой ими иммунодепресии.
В отличие от штамма Абсеттаров через 10 часов после заражения штаммом ЭК-328 и вариантом М в крови мышей в высоких концентрациях выявляли ИЛ 12, который на ранних стадиях инфекции свидетельствует об активации антигенпрезентирующих и фагоцитирующих клеток (Хаитов и Пинегин, 2000;
Biron & Sen, 2002). Появление в крови этого интерлейкина и /-ИФН может приводить к активации НК.
Таблица 6. Концентрация цитокинов в сыворотках крови мышей на ранних этапах инфекции после и/п введения 1000 БОЕ шт. Абсеттаров, ЭК-328 и варианта М (пкг/мл) ИЛ-10 ИЛ- ФНО вирус 5ч 10 ч 18 ч 10 ч 18 ч 10 ч К К К Абсеттаров 107±19 301±30 20± К К К ЭК-328 75±10 75±10 352± К К Вариант 116±32 151±20 1 118±21 348± М Примечание: концентрация ИЛ в контрольных сыворотках крови (К), полученных от животных после введения среды 199 на растворе Эрла (пкг/мл): ФНО- - 23±3;
ИЛ-10 – 8±4;
ИЛ-12 - 131±56.
На 4-е сутки у животных, зараженных штаммом Абсеттаров, в сыворотках крови обнаруживали ИЛ-6 и незначительное количество -ИФН (табл. 7). У зараженных шт. ЭК-328, ИЛ-6 и -ИФН появились на сутки животных, раньше. Повышение концентрации ИЛ-6 свидетельствует об активации Th2 лимфоцитов, которые обеспечивают формирование гуморального иммунного ответа. Об этом свидетельствует и появление в это время противовирусных антител в сыворотках крови мышей, инфицированных штаммами Абсеттаров и Эк-328. Продукция -ИФН связана с активностью ИЛ-12. При инфекции штаммом Абсеттаров мы наблюдали однократный подъем уровня ИЛ-12 на сутки, а при инфекции шт. ЭК-328 – двукратный подъем через 10 часов и на сутки после заражения животных. При этом второе повышение количества ИЛ- в крови мышей, инфицированных штаммом ЭК-328, не сопровождалось последующей продукцией -ИФН.
При инфекции вариантом М на 3 сутки в крови животных повысился уровень ИЛ-2 и -ИФН. Это говорит об активации Th1-лимфоцитов, которые обеспечивают развитие клеточного иммунитета. -ИФН в крови животных далее выявлялся на протяжении всего срока наблюдения.
На 7 сутки после заражения в крови мышей, инфицированных штаммом Абсеттаров, обнаружили в высоких титрах ИЛ-10, -ИФН, ИЛ-6 и ФНО-. В эти же сроки отмечали выраженные симптомы заболевания, высокий титр инфекционного вируса в крови и мозге, развитие менингоэнцефалита. Уровень ИЛ-6 в сыворотке крови животных, заболевших на 7-е сутки после и/п введения 1000 БОЕ штамма ЭК-328, также был высоким. Появление провоспалительных цитокинов в крови инфицированных животных в высоких титрах на этой стадии острого заболевания КЭ свидетельствует о выраженном патологическом процессе в ЦНС и нарушении гематоэнцефалического барьера.
Таблица 7. Концентрация цитокинов в сыворотках крови мышей после и/п введения 1000 БОЕ штаммов Абсеттаров, Эк-328 и варианта М (пкг/мл) штамм Абсеттаров Цитокины Срок после заражения животных 1 сут 2 сут 3 сут 4 сут 5 сут 6 сут 7 сут К К К К К К ФНО- К К К К К ИЛ-10 4514 -ИФН К К К К 275 К К К ИЛ-12 н/и н/и н/и К К К К К ИЛ-6 699 К К К К К К К ИЛ- штамм ЭК- Цитокины Срок после заражения животных 1 сут 2 сут 3 сут 4 сут 5 сут 6 сут 7 сут ФНО- К К К К К н/и К К К К К К ИЛ-10 331 -ИФН К К К К н/и 302 К К К ИЛ-12 н/и н/и н/и К К К К К ИЛ-6 746 К К К К К К ИЛ-2 н/и вариант М Цитокины Срок после заражения животных 1 сут 2 сут 3 сут 4 сут 5 сут 6 сут 7 сут ФНО- К К К К К К К К К К К ИЛ-10 78 121 -ИФН К К 965 428 11667 10114 К К К ИЛ-12 н/и н/и н/и К К К К К К ИЛ-6 К К К К ИЛ-2 253 416 Примечание: концентрация ИЛ в контрольных сыворотках крови (К), полученных от животных после введения среды 199 на растворе Эрла (пкг/мл):
ФНО- - 233;
ИЛ-10 – 84;
-ИФН - 25±2;
ИЛ-12 - 131±56;
ИЛ-6 - 16±1;
ИЛ-2 – 103. 1 – указаны данные для заболевших животных;
у мышей без клинических проявлений болезни содержание ИЛ в указанный срок было К.
При инаппарантной инфекции, вызванной вариантом М, на 7 сутки после заражения мы наблюдали присутствие в крови в небольших концентрациях ИЛ 2, ИЛ-6 и -ИФН. При этом все животные были клинически здоровы, вирус из головного мозга не выделялся, и патоморфологическое исследование ЦНС не выявило каких-либо изменений. Наличие в крови ИЛ-2, ИЛ-6 и -ИФН свидетельствует о развитии к 7-м суткам после заражения сбалансированного (Th1 и Th2) иммунного ответа при данном типе инфекции.
Таким образом, инаппарантная форма КЭ, вызванная вариантом М, характеризуется развитием более раннего неспецифического иммунного ответа и развитием сбалансированного специфического иммунного ответа. Острая форма КЭ, вызванная штаммами Абсеттаров и ЭК-328, характеризуется более поздней активацией неспецифического иммунитета и преобладанием выраженного гуморального ответа, которого оказывается недостаточно для предотвращения развития заболевания.
5. Поведение популяции ВКЭ при смене хозяина Как было показано в табл. 1, адаптированный к клещам вариант М образовывал мелкие (1 мм) бляшки в культуре клеток СПЭВ, при чем на мелких бляшек практически всегда можно было обнаружить 1-2 крупные бляшки. Из популяции варианта М были клонированы крупная и мелкие бляшки (табл. 8) в культуру клеток СПЭВ. После первого же пассажа клоны, которые были взяты при клонировании как мелкая бляшка, приобретали крупнобляшечный или смешанный фенотип. При следующем пассаже в культуре клеток вирус, образующий крупные бляшки, вытеснял мелкобляшечный вариант.
Для устранения примеси мелкобляшечного вируса были сделаны дополнительные клонирования. При клонировании отбирали крупные бляшки.
Только после 3 клонирований точечные бляшки при титровании перестали появляться. Новые клоны 160/57, 118/58, и 103/84 образовывали в культуре клеток СПЭВ бляшки, похожие на бляшки родительского штамма ЭК-328, которые к 8 дню достигали размера 6-8 мм и продолжали расти в течение всeго периода наблюдения. Клон 116/59 образовывал бляшки диаметром 4-5 мм. В параллельных экспериментах было предпринято клонирование для получения мелкобляшечного вируса. Только в результате четырех клонирований мелких бляшек были получены клоны 424 и 298, которые практически не содержали в популяции крупнобляшечных вариантов.
Оценка свойств вирионов клонов, полученных из популяции варианта М клонированием методом бляшек, показала, что крупнобляшечные клоны Таблица 8. Характеристика клонов, выделенных из популяции варианта М в культуре клеток СПЭВ вирус Диаметр бляшки до Диаметр бляшки, выделения мм на 8 сутки* клон 57 1 мм тчк:4:7=(1:1:7) клон 58 1 мм клон 59 1 мм клон 83 1 мм 7:3:тчк=(2:2:1) клон 84 5 мм тчк:7 = (2:1) клон 86 5 мм ЭК-328 вариант М тчк:7 = (100:1) * - в скобках указано соотношение бляшек разного размера;
тчк - точечного размера, т.е. 1мм.
восстановили свойства родительского штамма ЭК-328, а мелкобляшечные клоны сохранили характеристики варианта М. Вирионы клонов 160/57, 118/58, 103/84 и 116/59 обладали ГА, а также образовывали преципитат с АТ в РИЭФ, направленный к катоду (рис. 7). Клоны 424 и 298, подобно варианту М, не обладали ГА и в РИЭФ не образовывали подобной ракеты.
Рисунок 8. Анализ с помощью РИЭФ анод антигенных структур ВКЭ, накапливающихся в КЖ клеток СПЭВ, инфицированных клонами из популяции варианта М. 1 – клон 118/58, 2 – клон 116/59, 3 – клон 103/84, 4 – клон 160/57, 5 – клон 298.
катод Для клонов, полученных из популяции варианта М и прошедших 3- пассажа в культуре клеток СПЭВ, была определена нуклеотидная последовательность генов белка Е, а также фрагментов РНК, включающих позиции, где были выявлены различия между штаммом ЭК-328 и вариантом М.
Мелкобляшечный клон 298 сохранил аминокислотные остатки в белке Е, характерные для варианта М (табл.9). Все крупнобляшечные клоны имели треонин в позиции 426, как у штамма Эк-328. Следовательно, эта позиция имеет прямое отношение к реверсии свойств полученных нами клонов.
Таблица 9. Фенотипические и генетические свойства клонов, выделенных из популяции варианта М.
вирус фено кол-во 19нт 42нт 1 64 12 12 2190 42 2362 52 22 тип клониро 5’НТО 5’НТО prM E 2 E 4 E нт E 6 E нт E NS NS NS ваний 2A 4A 4A ЭК-328 Э a c AKEK c T t KS R Вариант M M g/а a V KGK t I c NG K Э а а 160/57 3 V KGE t T c NG K Э а а T с NG 118/58 3 VKEK t K Э T с NG 116/59 3 g a V KGQ t K Э 103/84 1 a a V QGK t T c NG K клон 298 M 4 g a V KGK t I c NG K клон 424 н/о н/о н/о K G K t c н/о н/о н/о M 4 I н/о – не оценивали;
прописные буквы – аминокислоты, строчные – нуклеотиды.
Фенотип: Э - размер бляшек, свойства вирионов, как у штамма ЭК-328;
М - размер бляшек, свойства вирионов, как у варианта М.
Как говорилось выше, замена в позиции 122 у варианта М приводит к повышению положительного заряда белка Е. У клона 118/58, который, как и штамм Эк-328, образовывал крупные бляшки в культуре клеток СПЭВ и давал преципитат с АТ в РИЭФ, мы наблюдали обратную замену глицина на глютаминовую кислоту. У трех клонов 160/57, 116/59 и 103/84, также обладающих фенотипом штамма ЭК-328, в позиции 122 сохранялся глицин, как у варианта М. Тем не менее, у клона 160/57 появлялась замена лизина на глутаминовую кислоту в позиции 124. У клона 116/59 в той же позиции лизин заменялся на глутамин, а у клона 103/84 аналогичная замена лизина на глутамин появлялась в позиции 64. Эти замены приводят к снижению положительного заряда. Как видно на рис. 3, у крупнобляшечных клонов способность связываться с ГС была даже несколько ниже, чем у штамма ЭК-328. Это свидетельствует о том, что замены в позициях 124 и 64 являются компенсирующими. У всех клонов нуклеотиды в позициях 2190 и совпадали с таковыми у варианта М, т.е. эти клоны являются истинными ревертантами. Вне зависимости от фенотипа все клоны, полученные из варианта М, имели те же аминокислотные остатки в сигнальной последовательности PrM и в белках NS2a и NS4a, что и вариант М, т.е. эти замены, по-видимому, не имеют прямого отношения к описанному фенотипу. Представленные данные не позволяют сделать однозначного заключения о роли замены в позиции 19 в 5' НTO в изменении характеристик варианта М, но очевидно, что эта замены не могут определять свойства вирионов этого вируса.
Таким образом, при репродукции варианта М в культуре клеток СПЭВ образуется большой спектр ревертантов с различными компенсирующими заменами. Анализ ревертантов, полученных при выделении клонов из популяции варианта М, показал, что характерный для адаптированного к клещам варианта М фенотип определяется двумя заменами в белке Е в позициях 122 и 426, а также определенную роль может играть замена в позиции 19 5'-НТО.
Для клонов 160/57, 118/58, 116/59, и 103/84 провели оценку нейровирулентности и НИ для мышей линии BALB/c разного возраста (табл. 10).
Клоны 118/58 и 116/59 восстановили НИ, однако у клонов 160/57 и 103/84 НИ осталась низкой. Клоны 160/57 и 116/59 имеют разные компенсирующие замены в позиции 124, клон 118/58 является обратным ревертантом, а клон 103/84 имеет компенсирующую замену, как клон 116/59, но в позиции 64. При этом, а.к.
замены в других позициях у всех этих клонов одинаковы. Таким образом, отличия в НИ клонов варианта М, обладающих всеми другими фенотипическими признаками, свойственными родительскому штамму ЭК-328, могут быть связаны с конкретной аминокислотной заменой и ее позицией в белке Е, хотя также нельзя полностью исключить связь с заменами в других не изученных нами областях генома. Представленные данные позволяют предположить, что вирулентность вируса может определяться аффинностью связывания вирионов с рецепторами на каких-то определенных клетках, и компенсирующие замены модулируют взаимодействие с этими рецептороми.
Способность высоковирулентных вирусов персистировать в ЦНС была проверена на одном из клонов из популяции варианта М, восстановившим свою НИ. При и/п заражении мышей сублетальной дозой клона 116/59 3 мыши не заболели, а у 2 мышей развились параличи. На 6 неделе они полностью выздоровели. У всех животных, не заболевших и выздоровевших, на фоне иммунодепрессии, вызванной введением ЦФ, развития заболевания не наблюдалось, и инфекционный вирус в мозге не выявлялся. При проверке методом ОТ-ПЦР оказалось, что у всех мышей в мозге присутствует вирусная РНК. Таким образом, учитывая отсутствие клинических признаков заболевания и отдаленные сроки после начала инфекции, можно утверждать, что клон 116/59 в сублетальной дозе вызвал у них персистентную инфекцию.
Таблица 10. Вирулентность клонов варианта М для мышей линии BALB/c разного возраста.
Вирус Вирулентность для мышей Мыши 6 г Мыши 12 г БОЕ /ЛД50 БОЕ /ЛД и/ц и/ц и/п ЭК-328 2 0,5 Вариант M 0,4 2,5 клон 160/57 8 0,3 клон 118/58 1,6 1,6 2, клон 116/59 1 0,3 клон 103/84 6,3 2 Таким образом, мы показали, что варианты ВКЭ, обладающие повышенной аффинностью связывания с ГАГ, а также варианты, ревертировавшие по этому свойству как за счет обратной, так и за счет различных компенсирующих замен, могут вызывать все типы инфекций: инаппарантную, острую и персистентную.
Было изучено поведение популяции варианта М в пассажах in vitro и in vivo. Для оценки стабильности популяции варианта М при пассажах в культуре клеток СПЭВ была выбрана схема, предусматривающая пассирование вируса в двух режимах: три независимых линии вели таким образом, что КЖ инфицированных клеток брали для следующего пассажа до наступления ЦПД (24-36 ч после начала инфекции), а 3 линии – после наступления ЦПД (48-72 ч).
Для всех линий пассажей 2 раза материал был заморожен между пассированием.
Таким образом, было сделано 12 пассажей линий с ЦПД и 20 пассажей для линий без ЦПД. Полученные вирусы были оттитрованы методов бляшек.
Во всех линиях количество крупных бляшек увеличилось уже на первых пассажах до 7-10% и при дальнейшем пассировании колебалось от пассажа к пассажу, но оставалось на данном уровне. Во всех 6 линиях вирус не приобрел способности формировать направленный к катоду преципитат вирионов с АТ в РИЭФ. Для одной из линий, пассированной без выраженного ЦПД, была определена нуклеотидная последовательность в областях генома, где были найдены замены между штаммом ЭК-328 и вариантом М. Только в позиции в 5’НТО у пассированного в культуре клеток СПЭВ вируса наблюдали реверсию к штамму ЭК-328. НИ этого вируса повысилась до 600 БОЕ/ЛД50, однако не достигла уровня, свойственного штамму ЭК-328.
Полученные данные показывают, что в отличие от заражении с низкой множественностью, когда вирус клонировали из бляшки, при пассажах адаптированного к клещам варианта М в культуре клеток СПЭВ без выраженного эффекта "бутылочного горлышка" формируется стабильная гетерогенная популяция с содержанием 7-10% крупнобляшечного варианта.
При пассировании варианта М через мозг юных мышей наблюдали постепенное нарастание количества крупных бляшек. К 12 пассажу соотношение крупных и мелких бляшек было 1:1. Полученный вирус был назван RNm.
Вирионы этого вируса нерегулярно образовывали катодный преципитат с АТ в РИЭФ. Секвенирование фрагмента РНК варианта RNm, кодирующего белок Е, показало, что он сохранил нуклеотидную последовательность варианта М (табл.10). Тогда из популяции варианта RNm были выделены крупнобляшечных клона 46 и 48. Вирионы всех клонов вели себя в РИЭФ, как вирионы штамма ЭК-328. При секвенировании генов Е этих клонов было установлено, что все они имели нуклеотидную последовательность, аналогичную таковой родительского штамма ЭК-328, включая нуклеотиды в позициях 2190 и 2362, по которым вариант М отличается от родительского штамма Эк-328. У этих клонов и в позиции 9888 был уридин, как у штамма Эк 328. Аминокислотные замены могут иметь адаптивный характер и ревертировать при изменении селективного воздействия, однако, реверсия трех н.т. замен в разных частях генома крайне маловероятна, и их можно использовать в качестве маркера, позволяющего различить вариант М и штамм ЭК-328. Таким образом, крупнобляшечные клоны, выделенные из популяции варианта М, переадаптированного к мозгу белых мышей, оказались примесью родительского штамма ЭК-328, сохранившейся в популяции варианта М в процессе 17 пассажей через клещей. Это показывает, что ВКЭ может существовать в виде гетерогенной популяции не только при репродукции в клетках млекопитающих, но и в клещах.
В одном из экспериментов взрослые мыши линии BALB/c были и/п инфицированы 10000 БОЕ варианта М. Несколько мышей заболело. На пике болезни у них были взяты кровь и мозг. При титровании сгустка крови и мозговой суспензии методом бляшек была выявлена гетерогенность вирусной популяции. Соотношение крупных и мелких бляшек было примерно 1:1. Их этих популяций были изолированы крупнобляшечные клоны 51, 53 и 56. Вирионы всех клонов вели себя в РИЭФ как вирионы штамма ЭК-328. Секвенирование гена Е показало, что все эти клоны являются истинными ревертантами.
Аминокислотные остатки в позициях 122 и 426, были как у штамма ЭК-328, но они сохранили н.т. замены, по которым вариант М отличается от штамма ЭК-328.
Это свидетельствует о том, что при репродукции адаптированного к клещам варианта М in vivo изменение структуры популяции может идти за счет появления ревертантов.
Таблица 10. Характеристика ревертантов, появляющихся в популяции варианта М при пассажах in vivo.
Характеристика Размер замены в гене белка Е вируса и источник бляшек вирус РИЭФ* несиноним. синоним.
выделения клонов 122 426 2190 Эк-328 - 5-6 + Glu Thr C T вариант - 1mm - Gly Ile T C M 11 пассажей RNm 5mm:1 +/- Gly Ile T C вариантаМ через мозг mm=1: мышей Клон 46 RNm 5 + Glu Thr C T Клон 48 RNm 5 + Glu Thr C T Клон 51 Кровь от заболевшей 5 + Glu Thr T C мыши после и/п введения варианта М Клон 53 мозг от заболевшей 5 + Glu Thr T C мыши после и/п введения варианта М Клон 56 мозг от заболевшей 5 + Glu Thr T C мыши после и/п введения варианта М *- + - наличие катодного преципитата вирионов с АТ, - отсутствие катодного преципитата вирионов.
Далее мы попытались оценить влияние данных вирусов друг на друга при одновременной репродукции. Для этого клетки СПЭВ были инфицированы раздельно и смесью вирусов, взятых в разных соотношениях. Полученное потомство оценивали по соотношению крупных и мелких бляшек при титровании в культуре клеток СПЭВ, а также по его поведению в РИЭФ. Очевидно, что такой эксперимент может дать только приблизительные данные о соотношении вирусов с разными фенотипами в популяции. Тем не менее, было поставлено 3 подобных эксперимента, и во всех были получены сходные результаты. Данные одного из этих экспериментах приведены в табл. 11. При равном количестве штамма Эк 328 и варианта М в инокуляте при средней множественности заражения вирусы с разным фенотипом не мешают репродукции друг друга, а при низкой множественности титры варианта М даже увеличиваются. При этом при определенных соотношениях вирусов в инокуляте вариант М может снижать титры штамма Эк-328 и наоборот.
Необходимы тщательные исследования по изучению взаимодействия описанных вирусов при смешанной инфекции на генетическом уровне, а также изучение механизмов описанной интерференции и комплементации. Тем не менее, этот эксперимент и результаты обратных пассажей адаптированного к клещам варианта М показывают, что в клетках млекопитающих ВКЭ может длительно существовать в виде стабильной гетерогенной популяции, в которой присутствует как варианты, обладающие селективным преимуществом при репродукции в клетках млекопитающих, так и варианты, имеющие преимущества при репродукции в членистоногих.
При выделении мелкобляшечных клонов из популяции варианта М, т.е. при создании эффекта «бутылочного горлышка», в результате 1 пассажа в культуре клеток мы получили целый набор ревертантов с обратными и различными компенсирующими мутациями. Это свидетельствует о том, что образование мутантов является при определенных условиях частым событием при репродукции ВКЭ. Нельзя исключить, что подобные мутанты в следовых количествах могут возникать и длительно существовать в любой популяции, тем не менее, за счет интерференции основной популяции они так и остаются в следовых количествах. При клонировании селективное давление основной популяции снижается, и это приводит к резкому изменению структуры популяции с преобладанием более приспособленного к данным условиям варианта вируса.
Очевидным является вопрос. Если адаптация ВКЭ к клещам приводит к появлению таких мутантов с ГАГ-связывающим фенотипом, то подобные вирусы должны постоянно выявляться в клещах. Естественно нельзя ожидать, что все изоляты ВКЭ, выделенные из клещей, должны обладать таким фенотипом, поскольку неизвестно, на какой стадии адаптации в клещам находится этот вирус и как быстро такой вариант может отбираться в клещах в природных условиях, поскольку ВКЭ может длительное время циркулировать в популяции клещей без попадания в млекопитающих на счет трансфазовой или трансовариальной Таблица 11. Характеристика вирусного потомства при смешанной инфекции клеток СПЭВ вариантом М и штаммом Эк-328, взятых в разных соотношениях.
Инокулят-множественность Вирусное потомство заражения (БОЕ/клетку) Общ Эк-328 М вариант Титр вируса lgБОЕ/мл РИЭФ*** ая общий Эк-328* вариантМ** 1,000 1,000 - 7,6 7,6 - + 0,100 0,100 - 7,3 7,3 - + 1,000 - 1,000 6,7 -**** 6,7 0,100 - 0,100 6,7 -**** 6,7 0,010 - 0,010 6,7 -**** 6,7 1,000 0,500 0,500 7,1 7,1 6,7 + 0,550 0,500 0,050 7,1 7,1 5,5 + 0,550 0,505 0,005 6,3 6,3 - + 0,550 0,050 0,500 6,7 6,0 6,7 0,100 0,050 0,050 7,1 7,1 8,5 * - оценивали по количеству крупных бляшек;
** - оценивали по количеству точечных бляшек;
*** - + - наличие катодного преципитата вирионов, - отсутствие катодного преципитата вирионов. В предварительных экспериментах было показано, что вирионы штамма ЭК-328, полученные при концентрировании КЖ, содержащей 6lgPFU, образуют катодный преципитат с АТ в РИЭФ. **** - как отмечалось ранее, так и данном эксперименте, при титровании варианта М иногда на фоне большого количества точечных бляшек можно было выявить 1-2 крупные бляшки.
передачи. Из клещей, собранных в разных регионах России, часто выделяют вирусы с мелкобляшечным фенотипом. Нами были просмотрено более вируссодержащих клещевых суспензий, выделенных в разных регионах РФ.
Более половины имели мелкобляшечный фенотип или представляли собой смешанную популяцию, которая в процессе лабораторных пассажей через мозг белых мышей или в культуре клеток СПЭВ превращались в вирусы с крупными бляшками (Карганова, 1991;
Погодина и др., 1991;
Карганова и др., 1992, 1994;
неопубликованные данные). Часть из них были изучены подробнее, и было показано, что их свойства близки свойствам варианта М, в том числе у этих вирусов отсутствует ГА, вирионы не образуют преципитаты с АТ в РИЭФ.
Естественно, нужны специальные исследования, чтобы установить, что представляют собой изоляты ВКЭ из клещей с мелкобляшечным фенотипом, связана ли мелкая бляшка с особенностями связывания вирионов в ГАГ клетками, и какую роль в их возникновении играет длительность пребывания в клещах. Тем не менее, очевидно, что в природной популяции в клещах циркулируют вирусы, обладающие фенотипом, близким адаптированному в лабораторных условиях к клещам варианту М, который представлен в данной работе.
Полученные данные относятся к лабораторной модели, которая не может быть просто экстраполирована на природную популяцию вируса КЭ. Тем не менее, описанный нами полиморфизм популяции вируса КЭ позволяет объяснить его способность к быстрой адаптации к новому хозяину. Схематично это можно объяснить следующим образом. Быстрое размножение вируса в новом хозяине осуществляется за счет активной репродукции либо уже присутствующих в популяции, либо вновь возникших мутантов, приспособленных к репродукции именно в этом виде хозяина. При этом основная популяция не может подавлять репродукцию этих мутантов, т.к. новый хозяин является для нее непермиссивной системой. При этом, по-видимому, наиболее неожиданные мутанты могут быть получены при репродукции вируса в совершенно новом хозяине, с которым этот вирус еще не встречался. Представленные нами данные показывают, что важную роль в этом играют мутации, определяющие начальные этапы взаимодействия вируса КЭ с клетками. Вероятно, определенное значение могут иметь и мутации, определяющие наиболее эффективное взаимодействие вирусной РНК и белков и клеточных факторов, формирующих репликативный комплекс, или участвующих в подавлении защитных средств клетки, в первую очередь, индукцию ИФН или ИФН сигнальные пути.
ВЫВОДЫ 1. Адаптация штамма ЭК-328 к клещам Hyalomma marginatum marginatum сопровождается набором несинонимических замен в геноме: нуклеотидными заменами в 5'-НТО, аминокислотными заменами в сигнальной последовательности белка prM, в области белков Е, NS2A, NS4A. Замены в белке Е Glu122Gly и Thr426Ile определяют основные свойства адаптированного к клещам варианта М, отличающие его от адаптированного к мышам родительского штамма ЭК-328.
2. ВКЭ имеет два типа рецепторов на поверхности клеток млекопитающих:
высокоаффинный и низкоаффинный. Адаптация ВКЭ к клещам связана с появлением мутаций в белке Е, повышающих аффинность связывания вирионов с гликозаминогликанами на поверхности клетки, которые служат низкоаффинным рецептором для этого вируса.
При репродукции в клетках млекопитающих вариант ВКЭ с ГАГ 3.
связывающим фенотипом восстанавливает способность к низкоаффинному связыванию с ГАГ клеток за счет появления обратных и компенсирующих замен. Свойства ревертантов зависят от характера и расположения компенсирующих замен в белке Е.
Получена модель инаппарантной формы КЭ при периферическом заражении 4.
мышей линии BALB/c адаптированным к клещам вариантом М, которая характеризуется формированием длительного протективного иммунитета без выраженного синтеза антител к основному вирусному гликопротеину Е.
Особенности инаппарантной инфекции определяются быстрым удалением вируса из кровотока за счет повышенной сорбции вирионов на клетках крови, ранней активации неспецифического иммунитета, а также активацией Th1 лимфоцитов.
На экспериментальной модели показано, что ВКЭ может существовать в виде 5.
гетерогенной популяции, содержащей варианты, обладающие селективным преимуществом при репродукции либо в клещах, либо в млекопитающих.
Переадаптация к млекопитающим адаптированного к клещам вируса происходит за счет изменения соотношения этих вариантов в популяции, а также за счет появления новых мутантов с более высокой приспособленностью к репродукции в данной системе.
Скорость изменения генетической структуры популяции ВКЭ и разнообразие 6.
мутантов определяется характеристикой хозяина и наличием эффекта "бутылочного горлышка".
Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Тимофеев А.В., Карганова Г.Г., Мальдов Д.Г., Лашкевич В.А., Эльберт Л.Б.
Обнаружение возможного рецептора для клещевого энцефалита с помощью антиидиотипических антител. //ДАН СССР. – 1990.-т. 315(1).- С. 226-228.
2. Дживанян Т.И., Карганова Г.Г., Соболев С.Г., Королев М.Б., Каштанова Г.М., Чупринская М.В., Лашкевич В.А. Свойства частиц, формирующихся при воспроизведении острой инфекции адаптированного к клещам H.plumbeum вируса клещевого энцефалита. //Вопр. вирусол.-1991.- № 4.- С.297-300.
3. Погодина В.В., Бочкова Н.Г., Дживанян Т.И., Левина Л.С., Карганова Г.Г., Рясова Р.А., Сергеева В.А., Лашкевич В.А. Явление антигенной дефектности у циркулирующих в природе штаммов вируса клещевого энцефалита и его возможная связь с серонегативными формами заболевания. //Вопр. вирусол. 1992.- №2.- С.103-107.
4. Maldov D.G., Karganova G.G., Timofeev A.V. Tick-borne encephalitis virus interaction with the target cells. //Arch. Virology.- 1992.- Vol.127.- P.321-325.
5. Васильев В.В., Злобин В.И., Дживанян Т.И., Карганова Г.Г., Верхозина М.М., Воронко И.В., Гусарова Н.А., Лашкевич В.А. Изучение электрофоретической подвижности вирусспецифических белков штаммов вируса клещевого энцефалита, выделенных в различных регионах СНГ. //Вопр. вирусол.-1993. №1-С.11-16.
6. Дрокин Д.А., Злобин В.И., Карганова Г.Г., Вихорева Т.В., Якименко В.В., Дживанян Т.И., Лашкевич В.А. Изменение геномов штаммов вируса клещевого энцефалита в результате пассажей на мышах. //Вопр. вирусол. 1994.-№1.-С. 160-162.
7. Мальдов Д.Г., Гмыль Л.В., Карганова Г.Г. Изменение активности Na+,K+ АТФазы при репродукции вируса клещевого энцефалита в культуре клеток СПЭВ. //Вопр. Вирусол.-1997.-№1-С. 23-26.
8. A.V.Timofeev, S.G.Ozherelkov, A.V.Pronin, A.V.Deeva, G.G.Karganova, L.B.Elbert and J.R.Stephenson. Immunological basis for protection in a murine model of tick-borne encephalitis by a recombinant adenovirus carrying the gene encoding the NS1 non-structural protein. //J. Gen. Virol.-1998.-Vol.79.- P. 689 695.
9. Тимофеев А.В., Кондратьева Я.Ю., Карганова Г.Г., Стефенсон Дж.
Протективная активность бактериальной плазмиды, несущей ген неструктурного белка NS1 вируса клещевого энцефалита. //Вопр. Вирусол. 2001.- № 1.-С.22-24.
10. Тимофеев А.В., Кондратьева Я.Ю., Орловский В.Г., Локтев В.Б., Карганова Г.Г. Изучение корреляции тяжести течения заболевания клещевым энцефалитом и концентрацией интерлейкинов 2 и 6 в сыворотках больных клещевым энцефалитом. //Терапевтический архив.-2002.-№ 6.-С.22-23.