Защитное действие гуминовых веществ по отношению к растениям в водной и почвенной средах в условиях абиотических стрессов
На правах рукописи
Куликова Наталья Александровна ЗАЩИТНОЕ ДЕЙСТВИЕ ГУМИНОВЫХ ВЕЩЕСТВ ПО ОТНОШЕНИЮ К РАСТЕНИЯМ В ВОДНОЙ И ПОЧВЕННОЙ СРЕДАХ В УСЛОВИЯХ АБИОТИЧЕСКИХ СТРЕССОВ Специальности 03.00.16 – Экология и 03.00.27 –Почвоведение
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Москва-2008
Работа выполнена на факультете почвоведения МГУ имени М.В. Ломоносова
Научный консультант:
доктор химических наук, профессор Перминова И.В.
Официальные оппоненты:
Доктор биологических наук, академик РАСХН Спиридонов Ю.Я.
Доктор химических наук, член-корреспондент РАН Тарасова Н.П.
Доктор биологических наук, профессор Щеглов А.И.
Ведущая организация: почвенный институт имени В.В. Докучаева РАСХН
Защита состоится 28 ноября 2008 г. в 14-30 на заседании Диссертационного Совета Д 501.001.55 по защите диссертаций на соискание учёной степени доктора наук по адресу: 119992, Москва, Ленинские горы, МГУ имени М.В. Ломоносова, д. 1, корпус 12 (биологический факультет), аудитория 389.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.
Автореферат разослан_
Ученый секретарь Диссертационного Совета, кандидат биологических наук Н.В. Карташева
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы Возрастающая антропогенная нагрузка на окружающую среду обусловила возникновение такой глобальной задачи современности как целенаправленное регулирование нарушенного равновесия в экосистемах. Решение этой задачи включает в себя изучение детоксификации загрязняющих веществ и поиск безопасных средств защиты организмов от повреждающего действия токсикантов. В качестве таких средств защиты могут выступать природные физиологически активные соединения, к которым относятся гуминовые вещества (ГВ), содержащиеся во всех природных средах, включая природные воды, почвы, торфа, сапропели и угли. Образование ГВ представляет собой второй по масштабности после фотосинтеза процесс трансформации органического вещества в природе, в который вовлекается около 20 Гт углерода в год. ГВ выполняют ряд важных экологических функций в биосфере: аккумулятивную, транспортную, регуляторную, физиологическую и защитную. Особую актуальность в последнее время приобретает исследование защитной функции ГВ с целью ее дальнейшего практического применения, так как именно она отвечает за поддержание равновесия в экосистемах, подверженных сильной антропогенной нагрузке. Следовательно, установление механизма защитного действия ГВ позволит более эффективно использовать существующие гуминовые стимуляторы роста растений в сельском хозяйстве, а также указать пути к созданию нового поколения средств защиты растений на основе ГВ, например, гуминовых детоксикантов и биоактиваторов.
В настоящее время общепринятым является положение о том, что защитная функция ГВ в условиях химического стресса обеспечивается их способностью связывать загрязняющие вещества в комплексы, недоступные для живых организмов.
При таком понимании защитного действия ГВ практически игнорируется роль их физиологической активности в процессах детоксификации загрязненных сред. Кроме того, при таком подходе остаётся нерешённой проблема защитного действия ГВ в условиях других абиотических стрессов, таких неблагоприятная температура, недостаток влаги, засоление и др. Причиной этого является отсутствие систематических исследований по роли физиологической активности в защитной функции ГВ. Поэтому целью работы было изучить природу защитного действия ГВ по отношению к растениям во взаимосвязи с их физиологической активностью в условиях различных абиотических стрессов в водной и почвенной средах и предложить пути практического использования полученных знаний для создания средств защиты нового поколения на основе ГВ.
Цель работы Цель работы состояла в изучении природы защитного действия ГВ по отношению к растениям в водных и почвенных средах в условиях различных абиотических стрессов и оценке перспективности применения природных и модифицированных гуминовых препаратов в качестве средств защиты растений. В работе были поставлены следующие основные задачи:
выделить и охарактеризовать ГВ из различных природных сред;
изучить защитное действие ГВ и выявить его основные закономерности в условиях различных абиотических стрессов, включая присутствие токсикантов, железодефицитный хлороз, водный, солевой и температурный стрессы;
изучить взаимодействие ГВ с клетками и растениями и предложить концептуальную модель защитного действия ГВ;
оценить перспективность применения природных и модифицированных гуминовых препаратов в качестве средств защиты растений (детоксикантов, стимуляторов роста, корректоров хлороза, биоактиваторов).
Научная новизна На основании количественной оценки детоксифицирующих свойств ГВ в присутствии токсикантов показано, что защитное действие ГВ в почвенных средах обусловлено, прежде всего, образованием нетоксичных комплексов ГВ-токсикант, тогда как в водных средах значительный вклад может вносить собственная биологическая активность ГВ. В случае высоких констант связывания (тяжёлые металлы), ведущую роль в защитных свойствах ГВ играет образование нетоксичных комплексов ГВ-токсикант, тогда как при слабом химическом взаимодействии (гербициды) основную роль играет собственная физиологическая активность ГВ.
Установлено, что защитное действие ГВ по отношению к растениям в условиях абиотических стрессов более выражено в водных, чем почвенных средах, что связано со снижением доступности ГВ для растений.
Впервые показана перспективность использования модифицированных ГВ в качестве средств защиты растений нового поколения, а именно: хинон-обогащенных гуминовых производных – в качестве детоксикантов почв, гуматов железа – в качестве корректоров хлороза у растений, обогащённых кремнием ГВ – в качестве биоактиваторов.
Впервые проведена численная оценка кинетики поглощения ГВ растениями с использованием меченных тритием препаратов. Показано, что константы Михаэлиса Ментен ГВ лежат в диапазоне, характерном для ионов и индивидуальных веществ, поступающих в растения, а максимальная скорость поглощения ГВ – на несколько порядков ниже. Установлено, что поступление ГВ в растения происходит по механизму активного транспорта и напрямую связано со скоростью метаболизма.
С использованием авторадиографии установлено, что ГВ аккумулируются преимущественно в корнях растений. Показано, что повышенное содержание ГВ наблюдается в апикальных участках корней и побегов.
Установлено, что ГВ, поступившие в растения, аккумулируются в липидной фракции. С использованием метода масс-спектрометрии ионного циклотронного резонанса с Фурье преобразованием впервые показано, что продукты метаболизма ГВ присутствуют в составе ненасыщенных жирных кислот. Предложена концептуальная модель защитного действия ГВ, основанная на их участии в липидном обмене растений.
Практическая значимость Выявленные основные закономерности защитного действия ГВ в условиях абиотических стрессов в водных и почвенных средах могут служить основой для создания нового поколения средств защиты растений на основе ГВ.
Установленные зависимости «структура – детоксифицирующие свойства ГВ» могут быть использованы при выборе гуминовых препаратов, оптимальных для рекультивации почв, загрязненных гербицидами и тяжёлыми металлами.
Показана перспективность использования модифицированных ГВ, искусственно обогащённых кислородсодержащими функциональными группами, для детоксификации сред, загрязнённых тяжелыми металлами.
Продемонстрирована возможность использования гуминовых препаратов, обогащённых железом, для коррекции железодефицитного хлороза.
Показана перспективность использования обогащённых кремнием ГВ в качестве биоактиваторов растений в условиях солевого стресса.
Полученные значения констант связывания атразина ГВ могут быть использованы для расчета форм существования атразина в окружающей среде при построении моделей биогеохимического цикла и оценки степени загрязнения почв.
Полученные данные по взаимодействию атразина с почвами в присутствии лакказы могут быть использованы для разработки биотехнологических подходов к рекультивации почв, загрязнённых гербицидами сим-триазинового ряда.
На примере ГВ предложен способ исследования поглощения и распределениях в растениях сложных высокомолекулярных соединений природного происхождения с использованием меченных тритием препаратов.
Предложен способ обработки данных альгологического тестирования токсичности водных сред, позволяющий учитывать мешающее влияние ГВ.
Положения, выносимые на защиту различие в эффективности защитного действия ГВ по отношению к растениям в условиях различных абиотических стрессов в водных и почвенных средах;
основные закономерности поглощения ГВ растениями и распределения в них;
положение о неспецифической природе защитного действия ГВ и его концептуальная модель;
возможность усиления защитных свойств гуминовых препаратов путем направленного введения функций, способствующих снятию абиотических стрессов.
Апробация Отдельные части работы были представлены на Международных конференциях студентов и аспирантов «Ломоносов-96» и «Ломоносов-98» (Москва, 1996, 1998);
на 16-ом Всемирном конгрессе по почвоведению (Монпелье, 1998), 9-ой ежегодной конференции SETAC-Europe (Лейпциг, 1999);
10, 11, 12 и 13-ой международных конференциях IHSS в 1997 (Анахейм, США), 2000 (Тулуза, Франция), 2002 (Бостон, США) и 2006 (Карлсруэ, ФРГ);
научно-практическом семинаре при поддержке НАТО «Use of humates to remediate polluted environments: from theory to practice» (Звенигород, 2002);
II Московском международном конгрессе по биотехнологии «Состояние и перспективы развития» (Москва, 2003);
научно-практической конференции «Современные проблемы тканевой терапии и перспективы использования БАВ» (Одесса, 2003);
12-м международном симпозиуме по загрязнению окружающей среды (Анталия, 2003);
4-м съезде Докучаевского общества почвоведов (Новосибирск, 2004);
на Международной научной конференции «Современные проблемы загрязнения почв» (Москва, 2004);
Всероссийской конференции «Экспериментальная информация в почвоведении: теория и пути стандартизации» (Москва, 2005);
международной конференции «Biocatalysis-2005:
fundamentals and application» (Санкт-Петербург, 2005);
10 и 11 симпозиумах северного отделения IHSS «Character of natural organic matter and its role in the environment» в 2005 (Рига, Латвия) и 2007 (Йонсуу, Финляндия);
3 и 4 Всероссийских конференциях «Гуминовые вещества в биосфере» в Санкт-Петербурге (2005) и Москве (2007);
Российской конференции по радиохимии (Дубна, 2006);
научной конференции Ломоносовские чтения (Москва, 2006);
VII конгрессе Итальянского отделения IHSS (2007);
на XVIII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Москва, 2007).
Публикации По материалам диссертации опубликовано 59 работ, включая 28 статей (из них 10 в журналах, рекомендованных ВАК), 1 патент и 30 тезисов международных и всероссийских конференций.
Личный вклад автора Диссертационная работа является результатом многолетних (1997-2008 гг) исследований автора. Автору принадлежит решающая роль в выборе направления исследований, развитию и проверке экспериментальных подходов, предложенных в работе, а также в обсуждении, оформлении и обобщении полученных результатов.
Экспериментальная работа выполнена автором самостоятельно и в соавторстве с российскими и зарубежными коллегами. В совместных исследованиях личный вклад автора заключался в постановке задачи, в непосредственном участии и руководстве при проведении экспериментальной работы, в интерпретации полученных результатов и оформлении их в виде публикаций.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Глава 1. Выделение и характеристика ГВ различных природных сред Отличительной особенностью ГВ является стохастический характер, обусловленный особенностями их образования в результате отбора биотермодинамически устойчивых структур. Как следствие, к фундаментальным свойствам ГВ относятся нестехиометричность состава, нерегулярность строения, гетерогенность структурных элементов и полидисперсность. Поэтому для ГВ неприменимо понятие молекулы, а вероятную схему их строения представляют с помощью структурной ячейки – минимального по размеру фрагмента молекулы, который содержит все важнейшие структурные единицы. Сложность строения ГВ хорошо иллюстрирует гипотетическая структурная формула ГВ почв, опубликованная в 1970 г. Кляйнхемпелем (рис. 1.1). Указанная формула представляет собой попытку одновременно сохранить детальное описание структуры ГВ и показать ее статистический характер. Это достигается за счет чрезмерной громоздкости формулы, в которой автор приводит практически все возможные элементы структуры и способы их сочленения. Данная формула наиболее полно отражает набор структурных фрагментов ГВ, хотя она неоднократно подвергалась критике, в частности, в связи с чрезмерно высоким содержанием азота.
O OH OH OH COOH OH O HOOC HOOCOH N O HOOC OH OH O OH H 2+ COOH Fe OH COOH O O OH NH NH NH CH2 CH2 NH O NH OH O NH O CH O O O OH NH O H3C NH NH2 OH OH OH CH2 OH NH O OH OCH O O O H OH O OH + CH O O K - O O 2+ O O NH2 O H Fe CH 2OH H NH2 OH O O O OH O O CH3 Si H O COOH O O O HO OH O O N NH CH 2 NH NH CH2 NH OH O CH O C O CH2 CH2 CH N CH 2 O CH2 O Si HO HH H H OH OH OO ON CH2 CH H NH OO O O OH HN N NO + Fe Al Al H 3CO O OH O COOH H NH OO O HN CH CH2 O OH O O O H H CH2OH H O O H H O Si 2+ O Fe O COOH O 2+ O O O Fe H OH OH - O O CH O H O O OH H3 CO OH OH O H NH OH O CH H HO OH O CH2OH CH2OH CH 2OH H HO OH H3C NH O O O O H O O O O OH O O O O O OH HO NH CH2 CH2 OH O CH OH OH HO CH2 CH2 O N OH NO2 OH H 2N OH O O O Рис. 1.1. Гипотетический структурная формула ГВ почв [Kleinhempel D.//Albrecht Thaer-Archiv., 1970, 14(1), pp.3-14.].
Как видно из приведенной структурной формулы, по своей химической природе ГВ представляют собой нерегулярные сополимеры ароматических оксиполикарбоновых кислот с включениями азотсодержащих и углеводных фрагментов. Указанное строение – наличие каркасной части, т.е. ароматического углеродного скелета, замещенного алкильными и функциональными группами, среди которых преобладают карбоксильные, гидроксильные и метоксильные, и периферической части, обогащенной полисахаридными и полипептидными фрагментами, – является общим для ГВ всех источников происхождения.
Отсутствие адекватного аналитического обеспечения и методологических подходов к анализу и численному описанию строения ГВ привело к тому, что, определение класса ГВ до сих пор основано на способе их экстракции из природных объектов, а общепринятая классификация – на процедуре фракционирования. ГВ подразделяют на гумин (нерастворим во всем диапазоне рН), гуминовые кислоты (ГК, нерастворимы при рН 2) и фульвокислоты (ФК, растворимы во всем диапазоне рН).
Последние два класса объединяют под общим названием гумусовые кислоты. Эта схема дополняется иногда также выделением гиматомелановых кислот (ГМК), отделяемых воздействием на сырой осадок ГК этанолом.
В связи с тем, что ГВ характеризуются нестехиометричностью состава, нерегулярностью строения и гетерогенностью структурных элементов, для проведения исследований необходимо было создать представительную выборку препаратов ГВ с широким разнообразием состава и свойств, адекватную стохастическому характеру объекта. Всего в работе было использовано 66 препаратов ГВ из различных природных источников, включая торфа, почвы, угли, природные воды и донные отложения, а также 36 препаратов модифицированных ГВ. ГВ были охарактеризованы методами элементного анализа, 13С ЯМР-спектроскопии и эксклюзионной хроматографии (табл. 1.1).
Исследованные препараты значительно отличались по элементному составу и структурным характеристикам. Наибольшее содержание углерода и наименьшее кислорода было отмечено для ГК углей и торфов. Эти же препараты характеризовались самым высоким содержанием ароматических фрагментов.
Максимальное содержание кислорода было отмечено для препаратов ГВ природных вод, минимальное – для ГВ торфов. Наименьшими молекулярными массами МW характеризовались ГВ природных вод;
наибольшими – торфов.
Табл. 1.1 Химическая характеристика использованных препаратов ГВ Атомные Распределение углерода, % отношения Препараты ГВ MW H/C O/C C/N CC=O CCOO CAr CAlk Гуминовые вещества торфов PHF-T4H94 0.86 0.40 20 22.2 0.5 13.4 46.6 39. PHF-T7H98 0.87 0.48 53 18 3.6 12 35.5 48. PHF-THH 0.87 0.51 36 16.8 1.3 15.5 46.8 36. PHF-TTL 0.83 0.52 24 19 2.4 17 45.6 PHA-T4H98 0.92 0.52 28 3.6 9.9 37.7 48. PHA-T5H98 0.93 0.50 27 28.1 2.3 12.8 38.9 PHA-Sk300 1.15 0.66 17 1.6 17.5 58.5 22. PFA-T4H98 0.86 0.57 127 1.1 12.1 26.5 60. PFA-T5H98 1.02 0.67 28 3 15.2 32.4 49. PFA-T7H98 1.00 0.60 75 9.8 2.2 11.8 34.9 51. PFA-T3L98 0.76 0.66 120 2.7 16.7 37.2 43. PFA-Sk00 0.88 0.74 27 2.6 15 48.6 33. PFA-Sk300 1.18 0.89 27 3.2 16.8 30.0 50. PDOM-THH 0.67 1.18 29 6. PDOM-TTL 0.67 1.27 52 5. Гуминовые вещества почв SHA-Pw94 0.92 0.46 12 19 1 17 46 SHA-Pw96 1.10 0.46 14 19 4 19 34 SHA-Pw98 1.05 0.40 15 2.5 17.7 33.7 46. SHA-PwN 0.93 0.41 17 2 15 43 SHA-Pg94 1.00 0.45 14 22 1.1 15.2 45.6 38. SHA-Pg96 0.93 0.48 16 2 17 42 SHA-Pp94 1.09 0.60 13 21 1.9 15.6 43.8 38. SHA-Pp96 1.11 0.48 11 3 17 31 SHA-Gp94 1.06 0.63 12 22 2 15 46 SHA-Gw94 0.96 0.43 12 21 1 19 48 SHA-Cm94 0.66 0.34 14 21 1.5 14.3 56.8 27. Атомные Распределение углерода, % Препараты ГВ отношения MW H/C O/C C/N CC=O CCOO CAr CAlk SHA-CtV94 0.62 0.42 16 15 3 15 54 SHA-CtL00 0.79 0.35 14 16.3 3.3 15.7 52.0 29. SFA-Pg94 0.92 0.58 18 12. SFA-Pg96 0.88 0.61 19 3.1 18 41.3 37. SFA-Pp94 1.06 0.57 12 10. SFA-Pp96 0.91 0.54 11 2 23 26 SFA-Pw94 0.90 0.60 27 10. SFA-Pw96 0.94 0.58 17 9.0 4 19.5 33.3 43. SFA-Pw98 0.84 0.63 40 3.4 19.8 33.1 43. SFA-Gw94 0.98 0.53 15 SFA-CtL00 0.81 0.52 16 2.2 15.4 49.1 33. SDHF-Pg96 0.67 1.06 146 7. SDHF-Pp96 0.71 1.14 283 7. SDHF-Pw96 0.90 1.15 167 6. Гуминовые вещества углей CHA-AGK 0.79 0.32 112 15.6 0.5 16.9 57.8 24. CHA-ALD 0.81 0.31 77 9.4 1 15 56 CHA-RO 0.78 0.43 55 16.4 2.9 17.7 65.9 13. CHA-Pow 0.93 0.41 53 9.4 3.1 15.2 57.3 24. CHA-GL02 0.72 0.25 23 9.9 2.8 13.9 59.5 23. CFA-GL02 0.89 0.37 35 31.0 5.8 19.8 42.8 31. CHR-GL02 0.76 0.31 26 9.2 2.3 12.3 52.4 CHM-GL02 0.82 0.50 15 20.5 2.6 17.1 51.5 28. CHM-Pow 0.82 0.49 15 5. CHG-GL02 0.74 0.30 31 5.2 1.5 49.3 CHB-GL02 0.69 0.21 26 5.3 15.1 59 20. Гуминовые вещества природных вод AHF-RMX2 0.88 0.55 55 7.3 1.3 17.6 28.1 53. AHA-SR 0.98 0.59 51 12.9 5.0 17.0 28.0 51. AFA-SR 1.08 0.62 88 9.6 6.0 15.0 38.0 36. ADOM-SR 0.96 0.61 56 8 20.0 30.0 42. Гуминовые вещества донных отложений BHA-Sk00 0.42 1.1 17 17 1.6 7.1 36.0 55. BFA-Sk01 0.73 0.79 19 Модифицированные гуминовые вещества CHP-OFr 0.81 0.42 53 3.8 12.8 60.2 23. CHP-RFr 0.81 0.42 54 6.7 13.1 58 22. CHP-OEl 0.85 0.38 53 9.2 14.8 50.3 25. CHP-REl 0.89 0.38 52 8.4 14.5 53.4 23. CHP-OFe 1.18 0.37 52 6 16.1 55.3 22. CHP-RFe 0.85 0.38 53 6.7 16.1 53.3 23. CHP-HQ100 1.18 0.26 53 16.5 8.2 11.3 59.5 CHP-HQ250 1.15 0.34 54 14.0 6.1 8.1 56.6 29. CHP-HQ500 1.20 0.38 55 14.7 4.6 8.3 70.6 16. CHP-PC100 0.76 0.43 52 18.5 8.1 13.1 58.6 20. CHP-PC250 0.80 0.40 53 19.3 6.6 13.2 65.1 15. CHP-PC500 0.81 0.41 52 21.1 4.6 10.1 72.5 12. CHP-BQ100 1.05 0.37 55 20.1 10.5 14.5 61 CHP-BQ250 0.71 0.37 54 20.6 10.7 17.6 40.0 30. Атомные Распределение углерода, % Препараты ГВ отношения MW H/C O/C C/N CC=O CCOO CAr CAlk CHP-BQ500 1.01 0.34 54 18.4 7.5 12.7 62.4 17. CHP-PH-N100 0.41 0.77 54 9. CHP-PH-N250 0.40 0.80 52 9.4 6 17 55 CHP-PH-HQ250 0.40 0.73 53 7.3 5 13 59 CHP-PH-PC250 0.38 0.77 51 8. CHP-PH-HQ250-А 0.85 0.43 53 4 11 55 CHP-PH-PC250-А 0.86 0.45 CHP-HBQ250-5% 0.85 0.36 53 9. CHP-HBQ250-12% 0.89 0.35 54 7. CHP-SA250 0.79 0.44 53 10. CHP-SA250G 0.80 0.44 53 9.7 5 16 54 CHP-SA250A 0.79 0.44 55 9.6 6.6 16.2 49.9 27. CHP-DHBA250 0.77 0.39 52 9. CHP-DHBA250G 0.77 0.39 51 9.9 5.9 16.0 52.3 25. CHP-DHBA250A 0.75 0.39 53 10. Разнообразие свойств использованных в работе препаратов проиллюстровано диаграммой ван Кревелена (рис. 1.2), отражающей распределение ГВ по степени их ненасыщенности (атомное отношение Н/С) и обогащённости кислородом (атомное отношение О/С).
ГВ торфов H/C 1. ГВ почв ГВ углей ГВ природных вод Модифицированные ГВ 0. O/C 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1. Рис. 1.2. Диаграмма ван Кревелена для исследованных в работе препаратов ГВ.
Как видно из представленных на рис.1.2 данных, ГВ, выделенные из углей и природных вод, характеризуются достаточно узкими диапазонами значений H/C и O/C и образуют достаточно хорошо обособленные группы. ГВ почв и торфов, напротив, образуют смешанную группу с широким разбросом этих показателей. В целом можно отметить, что использованные в работе ГВ характеризовались разбросом значений атомных отношений H/C и O/C 0.62-1.20 и 0.21-1. соответственно, что позволяет сделать вывод о представительности созданной выборки препаратов.
Глава 2. Исследование защитного действия ГВ методами биотестирования:
метрологическая характеристика и количественное описание детоксифицирующих свойств 2.1. Метрологическая характеристика использованных методов биотестирования Несмотря на высокий уровень существующих в настоящее время инструментальных методов, при проведении исследований, связанных с биологическими объектами, неизбежно применение биотестирования, позволяющего получать интегральную оценку воздействия на живые организмы различных факторов окружающей среды. При использовании методов биотестирования необходимо принимать во внимание нерешенную проблему достоверности получаемых результатов, связанную с неизбежной погрешностью метода и высокой гетерогенностью свойств, характерных для биологических объектов. Получение надёжных, научно обоснованных результатов было достигнуто правильным планированием структуры исследования. Одним из обязательных этапов является планирование объема выборки, позволяющего получать данные, отвечающие заданной точности. Выбор необходимого размера выборки n проводили как:
s t 2 (1 + 1 2m) n= x P 2 (2.1) IP где s – стандартное отклонение, tP – коэффициент Стьюдента для вероятности P и объеме выборки в предварительных экспериментах m, IP выбираемая экспериментатором максимальная разница между истинным и выборочным средним, выраженная в процентах. Для наших исследований необходимые объемы выборки рассчитывали для Ip = 5 и 10% и P = 90, 95 и 99%. Результаты расчётов для основных методов биотестирования, использованных в работе, приведены в табл. 2.1.
Табл. 2.1. Необходимые объемы выборки при проведении биотестирования использованными методами при различных значениях максимально допустимого отклонения среднего значения от истинного Ip и вероятности P Ip = 5% Ip = 10% Тест-отклик P = 99% P = 95% P = 90% P = 99% P = 95% P = 90% Биотестирование в водных средах Метод проростков Побеги 104±58 62±34 44±25 26±14 15±9 11± Корни 143±31 85±19 61±13 36±8 21±5 15± Альгологическое биотестирование Fv/Fm 12±3 8±2 5±2 2±1 2±1 2± Биотестирование в почвенных средах Лабораторно-вегетационные эксперименты Длина побегов 88±18 54±15 39±10 50±10 20±3 14± Масса побегов 90±12 58±10 40±10 54±9 23±5 17± Полевые эксперименты Масса побегов 1646±125 994±74 713±29 900±51 370±45 251± При проведении биотестирования в работе использовали объёмы выборок, рассчитанные для Ip = 5% при вероятности P = 99%. Исключение составили полевые эксперименты, для которых рассчитанные необходимые объёмы выборки колебались в пределах от 251 до 900 даже при Ip = 10%. Поэтому определение объёма выборок при проведении полевых экспериментов осуществляли на основании производственных возможностей.
2.2. Количественное описание детоксифицирующих свойств ГВ Защитное действие ГВ по отношению к живым организмам в присутствии токсикантов различных классов, т.е. явление детоксификации, ранее отмечалось многими исследователями. Тем не менее, большинство работ посвящено исключительно констатации наблюдаемого явления, в то время как проблема его количественной характеристики, направленная на поиск его взаимосвязи со структурными параметрами ГВ, их собственным действием на организмы и связующей способностью по отношению токсикантам практически не проводились.
Для количественной оценки защитных свойств ГВ в присутствии токсикантов (обычно в данном случае используют термин «детоксифицирующих») нами был использован подход, основанный на использовании коэффициента детоксификации D и константы детоксификации KOCD, определяемых из данных токсикологических экспериментов. Достоинством коэффициента детоксификации D является то, что он отражает изменение уровня токсичности Т в присутствии ГВ (ТТ+ГВ) по сравнению с токсичностью Т в их отсутствие (ТТ), учитывая при этом возможное изменение тест отклика под влиянием собственного воздействия ГВ. Принимая, что:
R0 RТ ТТ = (2.2) R и R ГВ RТ + ГВ Т Т + ГВ = (2.3) R ГВ где R0 – тест-отклик в контроле (без токсиканта и ГВ);
RТ – тест-отклик в присутствии Т;
RГВ тест-отклик в присутствии ГВ;
RТ+ГВ тест-отклик в присутствии токсиканта и ГВ, получаем:
Т Т Т + ГВ Т D= Т = 1 Т + ГВ (2.4) ТТ Т ГВ При условии, что чувствительность тест-организмов к собственному действию ГВ не изменяется в присутствии токсиканта, использование коэффициента D позволяет охарактеризовать детоксифицирующий эффект ГВ, обусловленный только связыванием токсиканта в нетоксичные комплексы, на фоне их стимулирующего воздействия на тест-объект. Поэтому, зная зависимость коэффициента D от концентрации ГВ (т.н. кривую детоксификации), можно рассчитать константу детоксификации KOCD. Преимущество данного параметра при оценке детоксификации по сравнению с коэффициентом D состоит в том, что если последний позволяет получить точечную оценку детоксификации, то KOCD является характеристикой детоксифицирующей способности ГВ во всем диапазоне концентраций. При этом его физический смысл аналогичен константам связывания, определяемым в химических экспериментах. Для вывода уравнения данной константы запишем уравнение связывания токсиканта ГВ:
T + ГВ Т ГВ (2.5) Долю токсиканта, находящегося в свободном состоянии, можно выразить через соответствующую константу связывания:
[Т ] = = (2.6) [Т ] + [Т - ГВ] 1 + С ГВ KOC В условиях, когда токсичность раствора прямо пропорциональна концентрации токсиканта, токсичность в его присутствии будет выражаться следующим образом:
TТ = k CТ (2.7) где k – коэффициент пропорциональности.
Токсичность токсиканта в присутствии ГВ аналогично можно записать как:
TТ + ГВ = k [T] (2.8) Подставляя (2.7) и (2.8) в уравнение (2.8), получаем:
[T] D = 1 = 1 (2.9) CТ Выражая долю несвязанного токсиканта через концентрацию ГВ на основании зависимости KOC от (2.6), получаем:
K OC D C ГВ D= (2.10) 1 + K OC D C ГВ Фигурирующую в данном уравнении константу, определяемую видом зависимости эффекта детоксикации от концентрации ГВ, мы назвали константой детоксификации – KOCD. Она будет эквивалентна константе химического связывания в случае, если величина эффекта детоксикации D зависит только от концентрации свободной формы токсиканта. На практике KOCD можно рассчитать путем аппроксимации экспериментальных зависимостей D от концентрации ГВ уравнением (2.10). Поэтому результаты всех токсикологических экспериментов представляли в виде соответствующих кривых детоксификации.
Глава 3. Защитное действие ГВ в условиях гербицидного стресса 3.1. Защитное действие ГВ в условиях гербицидного стресса в водной среде В качестве модельного гербицида для создания гербицидного стресса использовали атразин – представитель класса сим-триазиновых гербицидов, ингибиторов фотосинтеза. Выбор был обусловлен высокой устойчивостью этого гербицида в окружающей среде.
Изучение связывающей способности ГВ по отношению к гербициду показало, что диапазон изменения констант связывания атразина ГВ составил 110–575 л/кг ОC (табл. 3.1), что хорошо согласуется результатами предыдущих исследований и свидетельствует о незначительном взаимодействии атразина с ГВ.
Табл. 3.1. Константы связывания KOC атразина ГВ различного происхождения Препарат KOC, л/кг ОС Препарат KOC, л/кг ОС ОВ водного экстракта торфа ГК дерново-подзолистых почв PDOM-THH SHA-Pw 87±5 380± ФК почв SHA-Pp94 400± SFA-Pw96 SHA-Pw 192±12 281± SFA-Pp96 SHA-Pp 110±10 181± SFA-Pg96 SHA-Pg 275±17 380± Сумма ГК и ФК торфов ГК серых лесных почв и черноземов PHA-HTO SHA-Gw 300±20 575± PHF-T498 SHA-Cm 377± 404± ГК бурого угля SHA-CtV94 501± CHA-AGK SHA-PwN 575±35 444± Полученные значения KОС использовали для выявления взаимосвязи между связывающей способностью и структурой ГВ (табл. 3.1 и 1.1). Корреляционный анализ показал наличие связи KОС с CAr и CAr/CAlk – параметрами, характеризующими степень ароматичности ГВ. Коэффициенты корреляции r для пар переменных «CAr KОС» и «CAr/CAlk - KОС» составили 0.91 и 0.87. Наличие данной взаимосвязи подтверждает важную роль ароматических фрагментов ГВ в процессе взаимодействия с атразином. Коэффициент корреляции между MW препаратов ГВ и KОС составил 0.73. Это может свидетельствовать о преимущественном связывании атразина с высокомолекулярными фракциями ГВ.
Для исследования детоксифицирующей способности ГВ по отношению к атразину в водной среде были выбраны препараты ГВ торфов (PHF-TTL, PHF-THH) и ОВ водных экстрактов этих же торфов (PDOM-TTL, PDOM-THH), что было обусловлено максимальными различиями в свойствах данных препаратов. При биотестировании в качестве тест-объекта использовали растения мягкой пшеницы Triticum aestivum L., а в качестве тест-отклика – интенсивность фотосинтеза растений, которую оценивали по отношению Y100/Yn замедленной флуоресценции (ЗФ), характеризующему скорость транспорта электронов, где Y100 – интенсивность ЗФ при интенсивности возбуждающего света 100%, Yn – интенсивность ЗФ при интенсивности возбуждающего света n%.
Проведенные эксперименты показали, что внесение ГВ и ОВ водных экстрактов торфов в биотестируемую систему способствовало снижению токсичности атразина во всех исследованных концентрациях. Однако наблюдаемые эффекты были невелики: значение коэффициента D варьировалось в пределах 0.2-0.6, т.е полного снятия токсичности не наблюдали. Значения констант связывания KOCD, рассчитанные на основании полученных данных согласно уравнению (2.10), приведены в табл. 3.2.
Табл. 3.2. Эффективные константы связывания KOCD атразина ГВ в водной среде KOCD, л/кг ОС Препарат ГВ PDOM-THH 918± PDOM-TTL 957± PHF-THH 632± PHF-TTL 440± Как видно из табл. 3.2, значения KOCD в 2-10 раз превышали значения KOC (табл. 3.1), причем для препаратов ОВ водного экстракта торфа это различие было более выражено, чем для препаратов ГВ. Кроме того, значения KOCD возрастали при уменьшении MW препаратов ГВ, в то время как для значений KOC была отмечена обратная тенденция. Таким образом, несмотря на близкие значения, константы взаимодействия KOC и KOCD по-разному зависели от свойств ГВ, т.е. детоксификация и связывание атразина определялись различными процессами. Подтверждением этому является также установленная взаимосвязь для пар переменных «О/С – KOCD» и «Н/С – KOCD», коэффициент корреляции для которых составил 0.94 и 0.96, соответственно, в то время как для KOC подобной взаимосвязи отмечено не было.
На основании полученных данных можно высказать предположение, что связывание атразина ГВ не является основным фактором, определяющим детоксификацию атразина. Для установления причины детоксификации атразина ГВ необходимо было провести дополнительные эксперименты, при этом в качестве тест объектов следовало выбрать более простую, чем целый организм, систему. Поэтому для оценки защитного действия ГВ в качестве тест-объекта была использована одноклеточная водоросль Chlorella pyrenoidosa. Тест-откликом служили показатели Fi/Fm и Fv/Fm кривой индукции флуоресценции, характеризующие фотосинтетическую активность водоросли. При этом первый показатель зависит только от концентрации специфических ингибиторов фотосинтеза (т.е. атразина), а изменение отношения Fv/Fm может происходить вследствие широкого ряда причин и характеризует состояние водоросли в целом. Так как ГВ обладают собственной флуоресценцией, а их присутствие существенно сказывается на величинах Fv/Fm, предварительно были проведены эксперименты, направленная на оценку мешающего влияния ГВ. На основании полученных данных был предложен способ расчёта показателей Fi/Fm и Fv/Fm кривой индукции флуоресценции с учётом собственной флуоресценции ГВ.
Согласно нашим первоначальным предположениям, связывание атразина ГВ должно было привести к снижению концентрации свободного гербицида и, как следствие, уменьшению токсичности атразина. Для проверки этой гипотезы первоначально регистрацию токсичности атразина проводили сразу после внесения предварительно приготовленной смеси атразина с ГВ. Время взаимодействия ГВ и атразина составляло от 1 ч до 7 с. Было установлено, что присутствие ГВ не влияло на показатель Fi/Fm, т.е. взаимодействие атразина с ГВ в условиях эксперимента крайне незначительно или отсутствует.
В связи с тем, что детоксификация в присутствии ГВ может быть обусловлена не только связыванием токсиканта, но также их собственным действием на организмы, то необходимо было провести эксперименты с ненулевой экспозицией. Проведение таких экспериментов позволило регистрировать «суммарную» детоксификацию атразина в присутствии ГВ, обусловленную вышеупомянутыми причинами. В качестве тест-отклика использовали показатель Fv/Fm. Было установлено, что внесение ГВ приводило к снижению токсичности атразина (рис. 3.1). В большинстве случаев кривые детоксификации имели S-образную форму с выходом на плато при концентрации ГВ 30 мг/л. Исключение составили препараты водных экстрактов из торфа PDOM-THH и PDOM-TTL, для которых наблюдали линейную зависимость D от концентрации ГВ.
D 1. PDOM-THH 1. PHF-TTL 0. SHA-Pp 0. SHA-PwN 0. SHA-Pw 0. SHA-Gp 0. 0 10 20 30 40 50 Концентрация ГВ, мг/л Рис. 3.1. Кривые детоксификации атразина ГВ различного происхождения.
Рассчитанные значения KOCD атразина ГВ (табл. 3.3) варьировались в пределах 5.0104–1.9106 л/кг ОС, превышая на 2 порядка аналогичные величины, полученных в экспериментах с растениями. ГВ водных вытяжек почв обладали наибольшей детоксифицирующей способностью по отношению к атразину. Близкими к ним значениями KOCD характеризовались ГК угля и чернозема. Препараты ФК почв практически не снижали токсичность атразина.
Сравнение KОС и KОСD (табл. 3.1) показало, что KОСD в среднем на два-три порядка превышали KОС, при этом коэффициент корреляции между ними составлял 0.12. Кроме того для KOC наиболее тесную корреляцию наблюдали с содержанием CAr в ГВ, тогда как для KОСD такая взаимосвязь отсутствовала. Найденная закономерность увеличения защитного действия ГВ при переходе от использования в качестве тест объекта многоклеточного организма (растения) к одноклеточному (водоросли) позволяет предположить наличие взаимосвязи между защитными свойствами ГВ и их поглощением тест-организмами. Действительно, для KОСD нами была установлена значимая взаимосвязь с содержанием низкомолекулярной фракции 5 КДа – предела проницаемости клеточных мембран (r = 0.93). Установленные закономерности свидетельствует о том, что связывание и детоксификация атразина ГВ в водной среде определяются различными процессами, а ведущую роль в проявлении защитных свойств ГВ по отношению к растениям в данном случае играет собственная физиологическая активность ГВ. Однако, как показали проведенные эксперименты, в выбранных нами условиях ГВ в целом не обладали стимулирующим действием по отношению к культуре водоросли (рис. 3.2.).
Табл. 3.3. Эффективные константы связывания KOCD атразина ГВ в водной среде.
Тест-культура Chlorella pyrenoidosa KOCD, л/кг ОС KOCD, л/кг ОС Препарат Препарат Сумма ГК и ФК природных вод ГК почв ГК дерново-подзолистых почв AHF-RMX2 2. 5.8105 1. PDOM-TH SHA-Pw 1. PDOM-TL SHA-Pp 4. 2.1106 1. SDHF-Pw96 SHA-Pg 1.8106 5. SDHF-Pp96 SHA-Pw 5. SDHF-Pg96 SHA-Pp 1. ФК почв 5. SHA-Pg ГК серых лесных почв 1. SFA-Pg 2. SFA-Gw94 SHA-Gw 5. 1. SFA-Pw96 SHA-Gp 5. ГК черноземов 5. SFA-Pp 2. SFA-Pg96 SHA-Cm 6. Сумма ГК и ФК торфов 3. SHA-CtV 5.7105 7. PHF-THH SHA-PwN ГК бурого угля 1. PHF-TTL 7. PHF-T498 CHA-AGK 8. Погрешность определения KOCD составила 15% Сумма ГК и ФК природных вод Fv/Fm, % от контроля водн. экстрактов почв и торфов ГК почв ФК почв ГК торфов и угля SHA-Cm PHF-T SHA-CtV PHF-HTL PHF-TTL SDHF-Pw SDHF-Pp SHHF-Pg SFA-Gw SHA-Gw SHA-Gp AHF-RMX SFA-Pg SFA-Pw SFA-Pp SFA-Pg SHA-Pw SHA-Pp SHA-Pg SHA-Pw SHA-Pp SHA-Pg PDOM-TH CHA-AGK PDOM-TT SHA-PwN Рис. 3.2. Влияние ГВ на фотосинтетическую активность Ch. pyrenoidosa.
Концентрация ГВ 50 мг/л. Время экспозиции 3 ч.
Можно предположить, что стимулирующая активность ГВ проявляется только в стрессовых для организмов условиях. Действительно, в ряде экспериментов нами было отмечено значительное увеличение фотосинтетической активности хлореллы при внесении ГВ. При этом обязательным условием проявления стимулирующего действия ГВ являлось негативное изменение условий культивирования (например, снижение температуры) (рис. 3.3). Наиболее выраженное защитное действие было отмечено для препаратов ГВ, характеризующихся высоким содержанием кремния.
Fv/Fm, % от контроля 80 При оптимальных условиях 60 SDHF-Pw96 SDHF-Pg При неблагоприятных условиях SDHF-Pw96 SDHF-Pg 0 10 20 30 40 50 Концентрация ГВ, мг/л Рис. 3.3. Влияние ГВ на фотосинтетическую активность Ch. pyrenoidosa при оптимальных (37°С) и неблагоприятных (25°С) условиях.
Полученные результаты свидетельствуют о зависимости физиологической активности ГВ от внешних условий, описанную ранее другими исследователями.
Таким образом, наблюдаемую детоксификацию атразина ГВ в водной среде следует объяснять действием ГВ на тест-организмы, а не связыванием атразина в нетоксичные комплексы.
3.2. Защитное действие ГВ в условиях гербицидного стресса в почвенной среде Для изучения связывающей способности ГВ по отношению к атразину была создана выборка образцов из 3 почв различных почвенно-географических зон. Она включала в себя образцы дерново-подзолистой, серой лесной почвы и чернозёма. В связи с тем, что на адсорбционно-десорбционное поведение атразина могут оказывать влияние также и почвенные ферменты, часть экспериментов была проведена в присутствии лакказы – широко распространённой в почве оксидоредуктазы, уникальной особенностью которой является широкая субстратная специфичность, высокая термо- и рН-стабильность и высокая активность в почве в течение круглого года. Целью проведения экспериментов в присутствии лакказы являлась оценка возможности взаимодействия атразина с ГВ по механизму окислительного связывания, приводящего к необратимому включению гербицида в структуру ГВ с образованием ковалентных связей. Возможность детоксификации ксенобиотиков по указанному механизму в настоящее время показана для веществ фенольной и аминной природы, но не изучена для атразина, в отношении которого существуют лишь отдельные противоречивые данные. Адсорбционно-десорбционное поведение атразина в присутствии лакказы изучали с использованием фермента из базидиомицета Coriolus hirsutus.
На основании полученных данных строили изотермы адсорбции атразина (рис. 3.4) и рассчитывали коэффициент распределения Kd, который в данных условиях эквивалентен константе адсорбции. При расчете константы связывания атразина с органическим веществом KOC проводили нормирование Kd на содержание ОС в почве (табл. 3.4).
Аадс, мМ/кг Дерново-подзолистая Аадс, мМ/кг Дерново-подзолистая Серая лесная 0.25 0.25 Серая лесная Чернозём Чернозём 0.2 0. 0. 0. 0. 0. 0. 0. [A], мкМ [A], мкМ 0 5 10 15 20 0 5 10 15 20 А Б Рис. 3.4. Изотермы сорбции атразина различными почвами в отсутствие (А) и присутствии лакказы (Б).
Табл. 3.4. Коэффициенты распределения Kd и константы связывания KOC атразина исследованными почвами Почва KOC, л/кг ОС Kd Дерново-подзолистая 14.3±0. Серая лесная 3.2±0. Чернозём 9.2±0. Константы распределения атразина в исследованных почвах изменялись от 3. до 14.3 л/кг ОС, что хорошо согласуется с данными предыдущих исследователей.
Максимальное значение этого показателя было зафиксировано для чернозёма, что связано с самым высоким содержанием ОС в этой почве. Полученные значения констант связывания KOC варьировались в пределах 159-379 л/кг ОС и в целом были близки к ранее полученным константам связывания для ГВ в водной среде (табл. 3.1).
Существенное различие величин KOC для дерново-подзолистой и остальных почв указывает на то, что связывание атразина определяется не только содержанием OC в почве, но также и структурными особенностями почвенных ГВ.
Анализ изотерм сорбции в присутствии лакказы (рис. 3.4Б) показал, что внесение фермента приводит к выраженным изменениям процесса сорбции. Вместо линейных изотерм, полученных при изучении связывания атразина почвами без внесения фермента, в начале наблюдали резкое увеличение количества адсорбированного атразина при росте его равновесной концентрации, которое затем сменялось снижением интенсивности адсорбции. Сложный характер адсорбционных изотерм в данном случае свидетельствует о наличии различных механизмов связывания гербицида почвами. При этом наблюдали значимое увеличение параметров, характеризующих связывание гербицида почвой (табл. 3.5).
Табл. 3.5. Коэффициенты распределения Kd и константы связывания KOC атразина исследованными почвами в присутствии лакказы Почва Kd, л/кг KOC, л/кг ОС Дерново-подзолистая 25.9±0. Серая лесная 25.1±0. Чернозём 23.8±0. В присутствии лакказы константы связывания атразина возрастали до 411 1249 л/кг ОС, превышая аналогичные значения без фермента в 1.8-8 раз.
Исследование, направленное на изучение взаимодействия атразина с лакказой показало, что сама лакказа не оказывала влияния на деградацию или сорбционное поведение атразина. Поэтому на основании полученных результатов можно сделать вывод об увеличении связывающей способности почвенного органического вещества в присутствии этого фермента. По аналогии с другими ксенобиотиками можно предположить дополнительное включение атразина по механизму окислительного связывания, являющееся каталитически инициированным ковалентным связыванием ксенобиотиков. В связи с тем, что в результате протекания реакции окислительного связывания ксенобиотик должен включаться в структуру органического вещества необратимо, для проверки предположения о связывании атразина по указанному механизму нами были проведены эксперименты по десорбции атразина. Для численной описания изотермы аппроксимировали уравнением Фрейндлиха, а описание гистерезиса проводили с использованием коэффициента гистерезиса H, представляющего собой отношение степенных коэффициентов изотерм адсорбции nF и десорбции nFd в уравнении Фрейндлиха (табл. 3.6).
Табл. 3.6. Параметры уравнения Фрейндлиха и коэффициенты гистерезиса адсорбционно-десорбционных изотерм атразина исследованными почвами в присутствии и отсутствие лакказы Адсорбция Десорбция Почва Н KF nF KF nFd В отсутствие лакказы Дерново-подзолистая 4.50±0.20 0.72±0.03 0.57±0.03 0.27±0.02 2.7±0. Серая лесная 0.81±0.04 0.56±0.03 1.68±0.08 0.52±0.03 1.1±0. Чернозём 5.55±0.30 0.83±0.04 0.36±0.02 0.23±0.01 3.6±0. В присутствии лакказы Дерново-подзолистая 5.80±0.29 0.60±0.03 0.36±0.02 0.130±0.007 4.6±0. Серая лесная 3.13±0.15 0.56±0.03 0.20±0.01 0.029±0.001 19.3±0. Чернозём 6.79±0.34 0.66±0.03 0.22±0.01 0.060±0.003 11.0±0. Константы адсорбции Фрейндлиха KF для изученных почв в вариантах без лакказы варьировались в диапазоне 0.81-5.55, что хорошо согласуется с данными других авторов. Как и при аппроксимации данных линейной зависимостью (расчёт Kd), внесение лакказы приводило к резкому увеличению адсорбции атразина: KF возрастали до 3.13-6.79, значительно превышая аналогичные значения без лакказы.
Как показывают данные табл. 3.6, связывание атразина почвами характеризовалось значительным гистерезисом. Однако внесение лакказы во всех случаях способствовало резкому снижению количества десорбированного атразина.
Величины гистерезиса для исследованных почв составили 4.6-19.3, что превышало значения H для адсорбции-десорбции без фермента в 2-18 раз.
Основываясь на проведенных экспериментах можно сделать вывод, что внесение лакказы C. hirsutus способствует увеличению связывающей способности почв по отношению к атразину. При этом в присутствии фермента связывание атразина почвами происходит, вероятно, по механизму окислительного связывания, о чём свидетельствует анализ характера изотерм адсорбции и десорбции, а также увеличение количества необратимо связанного гербицида. Высказанную гипотезу подтверждает также тот факт, что в ходе проведения экспериментов нами не было установлено образование метаболитов атразина, т.е. отсутствовали процессы разложения гербицида, которые также могли привести к необратимому выведению атразина из среды. Принимая во внимание тот факт, что токсичностью обладает лишь несвязанная форма гербицида, можно сделать вывод о том, что присутствие лакказы в почве способствует детоксификации атразина в окружающей среде. Полученные данные могут быть использованы для разработки биотехнологических подходов при детоксификации почв, загрязнённых атразином и другими гербицидами сим триазинового ряда.
Как уже говорилось выше, связывающая способность почв по отношению к атразину определяется не только общим содержанием органического вещества, но также и структурными особенностями входящих в его состав ГВ. Для исследования зависимости связывания атразина почвами от свойств ГВ были проведены эксперименты с использованием 11 модельных комплексов ГВ с каолинитом. Выбор каолинита в качестве минеральной подложки был обусловлен тем, что данный представитель группы глинистых алюмосиликатов широко представлен в илистых и коллоидных фракциях всех почв и представляет собой слоистый силикат с нерасширяющейся кристаллической решёткой, что позволило минимизировать влияние на процессы адсорбции свойств самого минерала.
В связи с низким содержанием ГВ (менее 1%) в полученных комплексах (табл. 3.7) для расчёта констант связывания использовали подход, позволяющий учитывать взаимодействие с минеральной фазой адсорбента. Для этого принимали, что наблюдаемый коэффициент распределения зависит от связывающей способности минерала, ГВ, а также их относительного содержания в комплексе:
Kd = fmKm + fOCKOC (3.1) где Km – константа связывания с минералом, fOC – доля ГВ в составе комплекса каолинит-ГВ, m рассчитывали как 1-OC. При этом считали, что Km равна величине Kd исходного каолинита. Характеристику обратимости адсорбции проводили аналогично экспериментам по изучению связывания атразина почвами.
Результаты проведённых экспериментов приведены в табл. 3.7. Там же для сравнения приведены значения констант связывания с ГВ в водной среде.
Табл. 3.7. Содержание ОС и характеристика адсорбции-десорбции атразина модельными комплексами каолинита c ГВ различного происхождения Сорбент OC, кг/кг Kd, л/кг KOC, л/кг ОС KOC(раствор), л/кг ОС H колинит 1. – 1.72±0.09 – 9. AHA-SHo13 0.229±0.003 2.08±0.09 157 – 5. SFA-Pw96 0.165±0.008 1.93±0.09 128 192± 8. SFA-Pg96 0.166±0.009 1.94±0.09 137 275± 7. SHA-Pw94 0.249±0.008 2.20±0.09 194 380± 5. SHA-Pw96 0.264±0.008 2.09±0.07 143 281± 5. SHA-CtV94 0.245±0.009 2.17±0.08 184 501± 7. SHA-Cm94 0.248±0.006 2.17±0.09 184 404± 2. PHA-HTO 0.274±0.009 2.20±0.07 178 300± 3. PHA-H8 0.286±0.009 2.06±0.06 121 – 7. CHA-AGK 0.237±0.005 2.28±0.09 238 575± 5. PHA-RHA 0.240±0.004 2.48±0.09 319 – Как показывают данные табл. 3.7, несмотря на относительно невысокое содержание ГВ в модельных комплексах, величины коэффициентов распределения в присутствии ГВ возрастали с 1.72 до 1.93-2.48 л/кг. При этом значения констант связывания атразина ГВ в составе органоминеральных комплексов были в среднем в полтора-два раза меньше, чем аналогичные величины для ГВ в водной среде. Это свидетельствует о меньшей доступности мест связывания для атразина в ГВ, адсорбированных на каолините. Величины коэффициента гистерезиса H (табл. 3.7) изменялись от 2.31 до 9.24, значительно превышая единицу, что свидетельствует о частичной обратимости адсорбции атразина.
При статистическом анализе данных была обнаружена положительная корреляционная взаимосвязь между KOC и параметрами, характеризующим гидрофобность ГВ CAr/CAlk-O и CAr-H,C (r = 0.90 и 0.76). Аналогичная взаимосвязь ранее нами была отмечена для пары KOC – CAr-H,C (r = 0.95) при исследовании взаимодействия ГВ с атразином в водной среде. Это указывает на гидрофобное взаимодействие как ведущий механизмом связывания атразина ГВ в водных и почвенных средах.
Исследование детоксицирующей способности ГВ по отношению к атразину в почве проводили методом лабораторных вегетационных экспериментов на образцах дерново-подзолистых почв. Тест-объектом служили растения пшеницы, откликом – сырая надземная биомасса.
D 0. дерново-подзолистая (лес) 0. дерново-подзолистая (огород) 0. дерново-подзолистая (пашня) 0 1 2 3 4 5 Концентрация CHA-AGK10, кг ОС/кг Рис. 3.5. Детоксифицирующая способность препарата ГК угля CHA-AGK по отношению к атразину в условиях вегетационного эксперимента на различных почвах.
Препарат ГК угля CHA-AGK проявил различную детоксифицирующую способность по отношению к атразину на исследованных почвах (рис. 3.5), что связано, с неодинаковой эффективностью гербицида на почвах. Так, внесение атразина в варианте дерново-подзолистой почвы под лесом вызывало 25% снижение биомассы, для пахотной и огородной почв эти величины составили 93% и 80% соответственно. При этом на исследованных почвах биомасса пшеницы в варианте с внесением атразина и CHA-AGK в максимальной дозе составляла 150±6% от варианта с внесением атразина. Рассчитанные константы KOCD составили 2.1104;
0.3104 и 0.7104 л/кг ОС для дерново-подзолистой почвы под лесом, пашней и огородом соответственно и были близки к полученным при изучении сорбции атразина ГВ, адсорбированными на каолините и почвами. Это свидетельствует о том, что в почвенных средах основным фактором, определяющим детоксификацию атразина ГВ, является связывание гербицида, в то время как вклад собственного стимулирующего действия ГВ по отношению к растениям незначителен. Принимая во внимание близость констант связывания KOC, найденных для ГВ в водных и почвенных средах, можно сделать вывод о том, что защитное действие ГВ в водных средах значительно превышает таковое в почвенных средах, что связано, по видимому, с более низкой доступностью ГВ для растений.
Глава 4. Защитное действие ГВ в условиях стресса, вызываемого тяжёлыми металлами 4.1. Защитное действие ГВ в условиях стресса, вызываемого тяжёлыми металлами, в водной среде В качестве модельного тяжёлого металла (ТМ) использовали медь. В связи с тем, что в настоящее время взаимодействие меди с ГВ достаточно хорошо изучено и многочисленными работами показано, что связывание меди ГВ происходит через кислородсодержащие функциональные группы, для проведения исследований использовали препараты модифицированных ГВ с искусственно введенными бензохиноновыми, пирокатехиновыми, гидрохиноновыми и фенольными фрагментами (табл. 1.1), которые, как мы ожидали, должны были обладать повышенной связывающей способностью по отношению к меди. Исследование защитного действия ГВ проводили с помощью биотестирования по методу проростков с использованием пшеницы.
Результаты биотестирования показали, что внесение гуминовых препаратов приводило к снижению токсичности меди уже при концентрации 5 мг/л, а при концентрациях 30 мг/л и выше наблюдали полное снятие негативного действия меди (рис. 4.1). Особо следует подчеркнуть, что при концентрациях ГВ 30 мг/л и выше длина корней в присутствии ГВ превышала даже контрольные значения для проростков, проращиваемых на дистиллированной воде без внесения меди.
Длина корней, % от контроля CHA-Pow CHA-H CHA-Sah 0 10 20 30 40 Концентрация ГВ, мг/л Рис. 4.1. Влияние различных ГК угля на длину корней проростков мягкой пшеницы T. aestivum в присутствии Cu(II).
Защитное действие ГВ, искусственно обогащённых кислородсодержащими функциональными группами, практически во всех случаях было более ярко выражено, чем для исходного препарата ГК (рис. 4.2., табл. 4.1). Это свидетельствует об определяющей роли введённых функциональных групп в реализации детоксифицирующей способности ГВ в присутствии к меди.
CHA-Pow CHA-Pow D D 1. 1.5 CHP-CT100 CHP-BQ CHP-CT250 CHP-BQ 1. 1. CHP-BQ CHP-CT500 0. 0. 0.6 0. 0.3 0. 0.0 0. 0 10 20 30 40 50 0 10 20 30 40 Концентрация ГВ, мг/л Концентрация ГВ, мг/л А Б Рис. 4.2. Кривые детоксификации меди ГВ на примере пирокатехин формальдегидных сополимеров (А) и сополимеров с п-бензохиноном (Б).
Табл. 4.1. Эффективные константы связывания KOCD меди ГК угля и их производными KOCD, л/кг ОС KOCD, л/кг ОС Препарат Препарат Нативные ГВ Пирокатехиновые сополимеры ГВ 5.2104 4. CHA-Pow CHP-CT 1.5105 6. CHA-H80 CHP-CT 6.0104 7. CHA-Sah CHP-CT Гидроксилированные ГВ Сополимеры ГВ с фенолом 3.5105 1. CHP-OFr CHP-PH-N 2.1105 1. CHP-OEl CHP-PH-N 2.5105 3. CHP-OFe CHP-PH-HQ 1.5105 4. CHP-RFr CHP-PH-HQ250A 2.0105 5. CHP-REl CHP-PH-PC 3.0105 6. CHP-RFe CHP-PH-PC250A Сополимеры с салициловой кислотой п-бензохиноновые сополимеры ГВ 6.6105 7. CHP-SA250 CHP-BQ 1.9105 2. CHP-SA250G CHP-BQ 1.1106 2. CHP-SA250A CHP-BQ Сополимеры с 2,3-дигидроксибензойной Гидрохиноновые сополимеры ГВ кислотой 1.4105 1. CHP-DHBA250 CHP-НQ 1.4105 9. CHP-DHBA250G CHP-НQ 4.3105 5. CHP-DHBA250A CHP-НQ 8. CHP-HBQ250-5% 10. CHP-HBQ250-12% Погрешность определения KOCD составила 15% Значения KOCD для природных ГВ варьировались в диапазоне 6.0104– 1.5105 л/кг ОС, что незначительно превышает обычно приводимые в литературе данные по константам связывания меди ГВ (6.3103–3.2104 л/кг ОС). Это позволяет утверждать, что в водной среде защитные свойства ГВ по отношению к растениям в присутствии меди обусловлены, главным образом, связыванием металла в недоступные комплексы.
4.2. Защитное действие ГВ в условиях стресса, вызываемого тяжелыми металлами, в почвенной среде Защитное действие ГВ в присутствии ТМ в почвенной среде изучали в условиях полевых экспериментов с использованием пшеницы в качестве тест-объекта.
Исследованные препараты включали ГК угля CHA-Pow и их гидрохиноновые сополимеры CHP-HBQ250-5%, и характеризовавшиеся CHP-HBQ250-12%, наибольшей величиной защитного действия в водной среде (табл. 4.1). Опыты проводили в Московской обл. (среднее количество осадков 650-700 мм, средняя зимняя и летняя температуры –7 и +19°C) на дерново-подзолистой почве (средний суглинок, рН 5.6, содержание гумуса 3%).
Полученные результаты показали, что, ГВ проявляют выраженное защитное действие в присутствии меди (рис. 4.2Б). При этом, как и в случае экспериментов в водной среде, в отсутствие стресса, вызываемого токсикантом, ГВ и их производные не обладали выраженной стимулирующей активностью (рис. 4.2А).
Вес растений, % от контроля Вес растений, % от контроля 120 80 40 0 1 2 3 4 1 5 2 3 А Б Рис. 4.2. Влияние ГВ и их производных на рост растений пшеницы в отсутствие (А) и присутствии (Б) меди в условиях полевого эксперимента. 1 – контроль;
2– CHA-Pow, 3 – CHP-HBQ250-5%, 4 – CHP-HBQ250-12%, 5 – CuSO45H2O.
Рассчитанные константы связывания меди в почвенной среде были на порядок меньше аналогичных величин, полученных в экспериментах в водных средах, и составили 9.9102, 2.7103, 2.0104 для препаратов CHA-Pow, CHP-HBQ250-5% и CHP HBQ250-12%, что соответствует химическим константам связывания. Высокие константы связывания меди модифицированными ГВ свидетельствуют о перспективности их применения в качестве детоксикантов почв, загрязнённых ТМ.
Таким образом, защитное действие ГВ по отношению к растениям в присутствии ТМ в почвенной среде, как и в водной, обусловлено связыванием токсиканта. При этом, как и в случае гербицидного стресса, наблюдается выраженное снижение защитного действия ГВ при переходе от водных сред к почвенным.
Проведенные эксперименты в условиях стрессов, вызываемых токсикантами, показали, что защитное действие ГВ в почвенных средах обусловлено, прежде всего, связывающей способностью ГВ по отношению к токсикантам. В водной среде, напротив, защитное действие ГВ обусловлено не только их взаимодействием с токсикантами, но также и собственной биологической активностью. В случае высоких констант связывания (ТМ), ведущую роль играет образование нетоксичных комплексов ГВ-токсикант, тогда как при слабом химическом взаимодействии (гербициды) на первое место выходит собственная физиологическая активность ГВ.
Наблюдаемое выраженное уменьшение защитных свойств ГВ при переходе от водных сред к почвенным связано, по-видимому, со снижением их доступности для растений. Целью следующего этапа работы было изучение защитного действия ГВ в условиях абиотических стрессов, когда образование нетоксичных комплексов не может объяснить защитное действие ГВ.
Глава 5. Защитное действие ГВ в условиях железодефицитного хлороза В настоящее время хорошо известно, что ГВ способствуют поступлению в растения различных микроэлементов, недостаток которых вызывает заболевания, известные под названием хлороз. Однако защитное действие самих ГВ в этих условиях изучено недостаточно, что определило направление дальнейших экспериментов: исследование защитного действия ГВ и их комплексов с железом в условиях недостатка железа.
У растений существует два основных способа поглощения железа, обычно называемые стратегиями I и II. Растения со стратегией I (двудольные и однодольные, кроме мятликовых) способны снижать значение рН в области ризосферы, что способствует восстановлению железа из формы Fe(III) в Fe(II). Поступление в клетку осуществляется путём связывания с железовосстанавливающими белками, ассоциированными с клеточными мембранами. Растения со стратегией II (мятликовые) выделяют т.н. фитосидерофоры, которые хелатируют Fe(III). Так как способ поглощения железа мог сказаться на величине защитного действия ГВ, нами были проведены эксперименты с растениями, обладающими как стратегий I, так и II.
5.1. Защитное действие ГВ в условиях железодефицитного хлороза в водной среде Для исследования защитного действия ГВ в условиях железодефицитного хлороза в качестве тест-объектов использовали растения пшеницы (стратегия I) и томатов Lycopersicon esculentum Mill. (стратегия II). Железо вносили в виде сульфата железа хелата железа железа с FeSO4, Fe(III)-ДТПА (комплекс диэтилентриаминопентауксусной кислотой) или в виде совместного раствора ГК угля CHA-Pow с FeSO4. В ходе проведения эксперимента оценивали эффективность фотосинтеза растений, а по окончании – учёт длины и биомассы растений и содержание хлорофилла.
Как видно из результатов экспериментов (табл. 5.1) в выбранных условиях (высокое значение рН) внесение железа в виде простой соли не влияло на состояние растений из-за окисления железа из формы Fe(II) в форму Fe(III). При добавлении железа в доступной для растений форме (хелаты) было отмечено его положительное влияние. При этом томаты оказались более чувствительными к недостатку железа, о чем свидетельствует более выраженное стимулирующее действие использованных хелатов. Сходным, но менее выраженным эффектом, обладало и совместное внесение железа с ГК угля, что подтверждает данные предыдущих исследователей о способности ГВ образовывать хелатные комплексы с металлами и свидетельствует о перспективности их использования для коррекции железодефицитного хлороза.
Табл. 5.1. Накопление биомассы, эффективность фотосинтеза и содержание хлорофилла в присутствии различных источников железа и ГВ Фотосинтез Хлорофилл Вес Длина Вариант СЭТ Выход Содержание a/b % от контроля (среда Хогланда без железа) Томаты (стратегия I) FeSO4 90±12 97±12 104±11 103±17 142±15 189± Fe(III)-DTPA 4649±35 282±18 179±13 149±15 856±29 208± CHA-Pow 110±11 105±10 200±11 154±21 107±11 156± FeSO4+CHA-Pow 4382±56 265±19 189±15 148±17 819±31 221± Пшеница (стратегия II) FeSO4 101±5 105±12 97±7 100±8 101±11 95± Fe(III)-DTPA 172±12 146±12 218±15 197±12 200±11 205± CHA-Pow 121±15 138±12 344±11 329±13 154±12 130± FeSO4+CHA-Pow 123±15 125±11 212±15 216±14 179±11 198± СЭТ – скорость электронного транспорта, Выход – выход фотосинтеза ± – стандартное отклонение.
Следует отметить, что при внесении ГК угля без железа наблюдали сравнимую, а в случае с растениями пшеницы – большую эффективность самих ГВ, чем их смеси с железом. Так как использованные ГК подвергали предварительному обессоливанию, обеспечивающему удаление обменного Fe, можно предположить, что растения способны использовать эндогенное железо, входящее в состав ГК. В пользу этого предположения свидетельствует также повышенное содержание хлорофилла в присутствии ГК в томатах и пшенице: (107±11)% и (154±12)% соответственно. Более высокая отзывчивость растений со стратегией II (пшеница) объясняется, по видимому, преимущественным присутствием железа в ГК в форме Fe(III), т.е. в форме, в которой происходит его усвоение растениями со стратегией II, но не I.
Проведенные эксперименты продемонстрировали также положительное влияние ГК на фотосинтез растений: скорость электронного транспорта в присутствии ГК для растений томатов и пшеницы возрастала до (200±11)% и (344±11)%, а выход фотосинтеза – до (154±12)% и (329±13)%, что значительно превышало наблюдаемый положительный эффект от внесения железосодержащих препаратов. Это свидетельствует о наличии дополнительного механизма защитного действия ГК в условиях железодефицитного хлороза, чем непосредственно поглощение растениями эндогенного железа из ГК.
Таким образом, нами было показано, что ГК оказывают защитное действие в условиях железодефицитного хлороза по отношению к растениям как со стратегией I, так и II. Полученные эксперименты позволяют высказать предположение о наличии другого, чем поглощение эндогенного железа, механизма защитного действия ГВ.
5.2. Защитное действие ГВ в условиях железодефицитного хлороза в почвенной среде Для изучения защитного действия ГВ в условиях железодефицитного хлороза в почвенных условиях на первом этапе проводили эксперименты с использованием инертного субстрата перлита, что позволило исключить влияние почвенных ГВ. В качестве тест-объектов использовали пшеницу и томаты. Железо вносили в перлит в виде FeSO4, Fe(III)-ДТПА или в виде совместного раствора ГВ с FeSO4. Как показали проведённые эксперименты (табл. 5.2), в целом внесение исследуемых препаратов оказало положительное влияние на растения.
Табл. 5.2. Накопление биомассы и содержание хлорофилла в растениях томатов и пшеницы присутствии различных источников железа и ГК угля в условиях железодефицитного хлороза на перлите Вес Длина Содержание хлорофилла Вариант % от контроля (среда Хогланда без железа) Томаты (стратегия I) FeSO4 111±6 103±2 113± Fe(III)-ДТПА 92±5 104±4 79± CHA-Pow 104±3 107±3 106± FeSO4+CHA-Pow 114±3 110±3 102± Пшеница (стратегия II) FeSO4 – 101±2 101± Fe(III)-ДТПА – 117±7 113± CHA-Pow – 109±7 106± FeSO4+CHA-Pow – 110±4 108± ± – стандартное отклонение Как и в случае проведения экспериментов с водными культурами, растения пшеницы оказались более отзывчивыми к внесению исследованных препаратов с доступным Fe, однако их эффективность на перлите была значительно ниже.
Положительный эффект от Fe-ДПТА на накопление растениями биомассы в условиях водных культур составил (172±12)%, а на перлите – (117±7)% от контроля. В случае ГК аналогичный показатель снизился с (121±15)% до (110±4)%. Для растений томатов снижение эффективности использованных препаратов было ещё более ярко выражено.
Таким образом, на основании проведённых экспериментов можно сделать вывод о том, что защитное действие ГВ по отношению к растениям в условиях железодефицитного хлороза на водных культурах значительно более выражено, чем на перлите. Наблюдаемые эффекты объясняются, по-видимому, меньшим поглощением ГВ и исследованных железосодержащих препаратов в условиях твёрдого субстрата. Так как в экспериментах использовали инертный наполнитель, не обладающий связывающей способностью по отношению к исследованным препаратам, можно предположить, что в почвенных условиях защитное действие ГВ и железосодержащих препаратов будет ещё менее выражено.
Почвенные эксперименты проводили с использованием серозёма – почвы, характеризующейся высоким значением рН и, вследствие этого, незначительным содержанием доступного для растений Fe. Полученные результаты (табл. 5.3) продемонстрировали отсутствие статистически значимого защитного действия использованных препаратов в выбранных условиях.
Табл. 5.3. Длина, вес и содержание хлорофилла в растениях томатов в присутствии различных источников железа и ГК угля в условиях железодефицитного хлороза на почве Вес Длина Содержание хлорофилла Вариант % от контроля (серозём без внесения Fe) Томаты (стратегия I) FeSO4 89±12 100±3 103± Fe(III)-ДТПА 104±4 103±5 116± CHA-Pow 105±5 101±4 109± FeSO4+CHA-Pow 101±4 105±4 102± ± – стандартное отклонение Из всех исследованных препаратов только синтетический хелат железа обладал выраженным положительным действием по отношению к томатам: в его присутствии было зафиксировано значимое увеличение содержания хлорофилла на 16% по сравнению с контрольными растениями. При этом положительного влияния Fe-ДТПА на накопление растениями биомассы или их рост отмечено не было. Отсутствие выраженного положительного влияния вносимых ГВ по отношению к растениям в почвенных условиях можно объяснить присутствием в самой почве значительного количества ГВ. Содержание гумуса в исследованной почве составляло 4.5%, поэтому внесение ГК в дозе 40 мг/кг почвы приводило к увеличению содержания ГВ в почве менее чем на 0.1%. Можно предположить, что положительный эффект ГК нивелировался на фоне действия ГВ, изначально присутствовавших в почве.
Таким образом, эксперименты показали выраженное защитное действие ГВ и их комплексов с железом в условиях железодефицитного хлороза в водных средах. В почвенных средах величина положительного действия ГВ снижается, что связано, по видимому, с меньшим поглощением ГВ в условиях твёрдого субстрата.
Глава 6. Защитное действие ГВ в условиях водного дефицита, солевого стресса и неблагоприятных температур Эксперименты проводили биотестированием по методу проростков с использованием пшеницы.
6.1. Защитное действие ГВ в условиях водного дефицита Для создания водного стресса использовали раствор полиэтиленгликоля с молекулярной массой 6000 Д (ПЭГ 6000) в концентрации 100 г/л, являющегося гиперосмотическим раствором.
Длина побегов, % от контроля Длина корней, % от контроля CFA-GL CFA-GL 120 PFA-Т PFA-Т CHM-GL CHM-GL02 PHA-Т PHA-Т CHA-Pow CHA-Pow 80 SHA-Pw SHA-Pw РНА-Т РНА-Т598 0 10 20 30 40 0 10 20 30 40 Концентрация ГВ, мг/л Концентрация ГВ, мг/л А Б Рис. 6.1. Влияние ГВ на длину побегов (А) и корней (Б) проростков мягкой пшеницы Triticum aestivum L. в присутствии ПЭГ 6000 в концентрации 100 г/л.
Внесение препаратов ГВ способствовало адаптации растений к недостатку воды (рис. 6.1А). При концентрациях 5-10 мг/л было отмечено значимое увеличение длины побегов проростков, которое затем снижалось до контрольных величин.
Максимальное действие было отмечено для ГК и ФК торфа, которые характеризовались как минимальными молекулярными массами, так и наименьшим содержанием карбоксильных и сложноэфирных групп. Минимальные эффекты были зарегистрированы для ГК угля. При этом следует отметить, что ни для одного из исследованных препаратов не было отмечено полное снятие негативного действия ПЭГ 6000 на растения.
В ходе проведения экспериментов было зафиксировано выраженное стимулирующее действие ГВ на корни побегов в присутствии ПЭГ 6000 (рис. 6.1Б), хотя в вариантах без его внесения влияния ГВ на корни и побеги отмечено не было.
Величины максимального наблюдаемого эффекта для всех исследованных препаратов изменялись от (102±3)% до (123±3)% и свидетельствали о способности ГВ стимулировать рост корней пшеницы в условиях водного стресса, вызванного присутствием ПЭГ 6000. Полученные результаты хорошо согласуются с данными других исследователей, наблюдавших увеличение физиологической активности ГВ в стрессовых условиях. Принимая во внимание тот факт, что наблюдаемый положительный эффект от внесения ГВ не может быть обусловлен связыванием препаратов с ПЭГ (все эти вещества представляют собой отрицательно заряженные полиэлектролиты), можно сделать вывод о способности ГВ снижать негативное действие водного стресса благодаря непосредственному влиянию на растения.
6.2. Защитное действие ГВ в условиях солевого стресса Исследование защитного действия ГВ в условиях солевого стресса, создаваемого с помощью 0.15 М NaCl, проводили с использованием природных и силилированных (обогащённых кремнием) препаратов, так как ранее нами было показана высокая защитная активность природных ГВ с высоким содержанием кремния (Глава 3.1, рис. 3.3). Для этой цели в структуру природных ГК угля вводили алкоксисилильные фрагменты (-Si(OCH3)3) для получения производных с различным содержанием кремния. При внесении в водную среду указанные фрагменты гидролизуются с образованием силанольных групп, что позволяет рассматривать полученные препараты в качестве моделей природных органо-минеральных комплексов. Всего было исследовано 5 препаратов модифицированных ГВ с содержанием кремния 2 11%.
Результаты биотестирования показали, что растения пшеницы, пророщенные в растворах ГВ, обладали большей устойчивостью к солевому стрессу, чем контрольные. При этом было установлено, что защитное действие ГВ возрастает с увеличением содержания в них кремния до 8%, а затем – снижается (рис. 6.2).
Прирост побегов, % от контроля Вес побегов,% от контроля 60 50 40 30 20 0 2 4 6 8 10 12 0 2 4 6 8 10 Содержание Si, % Содержание Si, % Рис. 6.2. Влияние ГВ и их силилированных производных с различным содержанием кремния на прирост корней и сырую биомассу побегов пшеницы.
Проведённые эксперименты показали перспективность дальнейшего исследования силилированных препаратов ГВ в качестве биоактиваторов в условиях солевого стресса.
6.3. Защитное действие ГВ в условиях температурного стресса Для создания температурного стресса чашки семена пшеницы проращивали при температуре 35°С (высокотемпературный стресс) или при 4°С (низкотемпературный стресс). В качестве контрольных использовали проростки, выращенные при 24°С.
Длина корней, % от контроля Длина побегов, % от контроля 150 4С 35С 4С 35С 50 0 0 50 100 150 0 50 100 Концентрация ГВ, мг/л Концентрация ГВ, мг/л А Б Рис. 6.3. Влияние ГК угля CHA-Pow на длину корней (A) и побегов (Б) проростков пшеницы в условиях пониженной и повышенной температуры.
Результаты, представленные на рис. 6.3А, показывают, что в условиях температурных стрессов внесение ГК до концентрации 150 мг/л не оказало значимого влияния на рост корней пшеницы. В то же время, при +35°С было отмечено выраженное положительное влияние ГК на побеги пшеницы (рис. 6.3Б), которое приводило к полному снятию угнетающего действия повышенной температуры. При +4°С защитное действие ГВ было менее выражено.
Наиболее выраженное действие ГВ в условиях температурных стрессов наблюдали при концентрации 100 мг/л, поэтому сравнение защитного действия ГВ различного происхождения проводили при указанной концентрации (рис. 6.4).
Длина, % от контроля Длина, % от контроля Корни Корни Побеги Побеги 120 90 60 30 0 Без ГВ Без ГВ CHA CHA- IHuK- PFA- BFA- IHuK- PFA- BFA Pow USA T798 Sk01 Pow USA T798 Sk А Б Рис. 6.4. Защитное действие ГВ различного происхождения по отношению к проросткам пшеницы в условиях высоко-(А) и низкотемпературного (Б) стрессов.
Как видно из рис. 6.4А, при 35°С внесение ГВ приводило к частичному или полному снятию стресса у проростков пшеницы: в случае с ФК сапропеля наблюдали увеличение длины побегов до 125% от контроля. При этом в целом можно сказать, что ФК оказались более эффективны, чем ГК, а корни – более чувствительны, чем побеги.
В условиях пониженных температур (рис. 6.4Б) защитное действие ГВ было менее выражено, а полное снятие угнетающего действия было отмечено только при использовании ГК угля. Возможно, это связано с тем, что в экспериментах с пониженной температурой величина стресса была значительно выше, чем при повышенной температуре (рис. 6.4). Поэтому дополнительно были приведены эксперименты при температуре 38°С, когда наблюдается более выраженный высокотемпературный стресс. В данных условиях было установлено снижение защитного действия ГВ: максимальное увеличение длин корней и побегов проростков составило всего (6±4)% и (7±4)%.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что ГВ способны частично или полностью нивелировать высоко- и низкотемпературный стрессы, а величина защитного действия ГВ зависит от величины вызываемого стресса. Следует особо подчеркнуть, что в проведенных исследованиях ГВ способствовали адаптации растений к температурным стрессам, вызывающим разнонаправленные ответные реакции в организмах. Например, белки и липиды, адаптированные к высокой температуре, находятся соответственно в денатурированном состоянии и в состоянии твёрдого геля, т.е. в неадаптированном состоянии по отношению к низким температурам. Поэтому полученные результаты свидетельствуют об участии ГВ не в специфических реакциях, характерных для того или иного вида стрессового воздействия, а в общих защитно-приспособительных реакциях растительного организма.
Глава 7. Природа защитного действия ГВ Проведённые исследования показали, что защитное действие ГВ по отношению к растениям в условиях различных абиотических стрессов более ярко выражено в водных, чем в почвенных средах, а величина наблюдаемого действия зависит от величины вызываемого стресса. На рис. 7.1. представлен график, иллюстрирующий полученные результаты по защитному действию ГВ в различных стрессовых условиях в водных средах и показывающий его зависимость от уровня стресса, который рассчитывали как разницу между значением тест-отклика в контрольных (R0 = 100%) и стрессовых условиях (R0-RT). При таком способе расчета 100% стресс означает гибель организма, а нулевой – состояние контроля. Так как действующее начало ГВ неизвестно, для обобщения данных использовали результаты по максимальному наблюдавшемуся эффекту ГВ вне зависимости от концентрации. Из рассмотрения исключали результаты экспериментов с медью, где ведущую роль играла связывающая способность ГВ (Глава 4).
Как видно из рис. 7.1, величина защитного действия ГВ практически не зависела от вида стресса, а определялась, главным образом, его уровнем. Разница между вариантами без внесения ГВ и в их присутствии оказалась практически постоянной величиной, которая составляла (17±4)% при P = 95%.
Тест-отклик, % от контроля В присутствии ГВ Без ГВ y = -1.1x + R2 = 0. 0 20 40 60 80 Стресс, % Рис. 7.1. Зависимость величины защитного действия ГВ от уровня стресса.
Разнообразие стрессовых факторов, при которых регистрируется положительное действие ГВ, а также независимость величины защитного действия ГВ от вида стресса свидетельствует о неспецифической природе защитного действия ГВ. В случае ТМ (или других токсикантов, с которыми возможно интенсивное связывание) указанная закономерность не соблюдается так как эффект неспецифического защитного действия ГВ гораздо меньше, чем эффект химического связывания токсикантов.
При исследовании реакций организмов на стресс принято выделять несколько стадий, таких как первичная неспецифическая реакция и собственно адаптация.
Адаптация подразумевает запуск высокоспецифичных реакций, поэтому следует предполагать участие ГВ именно в каскаде первой группы реакций. В стрессовых условиях наиболее чувствительным компонентом клеточных структур, выполняющим роль пускового механизма, вызывающего последующие изменения в обмене веществ, в большинстве случаев выполняют мембранные системы.
Следовательно, можно предположить, что защитное действие ГВ обусловлено их непосредственным взаимодействием с мембранами и зависит от биодоступности ГВ.
Поэтому далее нами было проведено исследование, направленное на изучение поступление ГВ в клетки и растения и распределения в них. Эксперименты проводили с использованием меченных тритием ГВ.
7.1. Характеристика меченных тритием ГВ Препараты меченных тритием ГВ (3Н-ГВ), предоставленных Г.А. Бадуном (кафедра радиохимии МГУ им. Ломоносова), проверяли на идентичность исходным методом эксклюзионной гель-хроматографии с одновременной детекцией по радиоактивности и УФ-поглощению при 254 нм (рис. 7.2) А254 А254 Радиоактивность - УФ-детекция - Исходные ГВ - - Радио - - Меченые ГВ активность V, мл V, мл Б А Рис. 7.2. Гель-хроматограммы исходных и 3Н-ГВ (А) и 3Н-ГВ с детекцией по УФ поглощению и радиоактивности (Б). На примере CHA-Pow.
Совпадение УФ-гель-хроматограмм 3Н-ГВ и исходных ГВ (рис. 7.2А) свидетельствует о том, что введение метки не приводило к изменению молекулярно массового распределения ГВ. Идентичность гель-хроматограмм 3Н-ГВ с детекцией по радиоактивности и УФ-поглощению (рис. 7.2Б) позволяет сделать вывод об отсутствии деструкции ГВ и равномерном введении метки во все структурные фрагменты ГВ. Всего в работе было использовано 10 образцов 3Н-ГВ, охарактеризованных по поверхностной активности и гидрофобности.
7.2. Поступление ГВ различного происхождения в живые клетки в оптимальных и стрессовых условиях В качестве модели живой клетки использовали грамм-отрицательные бактерии кишечной палочки Escherichia coli XL1. Эксперименты проводили в оптимальных и стрессовых условиях. Использование стрессовых условий было необходимо для проверки гипотезы о нарушении мембранной проводимости в условиях стресса. Эта гипотеза достаточно часто встречается в литературе, однако её экспериментальных доказательств практически не существует. Стресс создавали путём внесения в питательную среду NaCl, получая гиперосмотический раствор (0.15 М). При этом полагали, что если гипотеза об изменении проницаемости клетки верна, то в условиях гиперосмотического стресса будет наблюдаться усиленное поступление ГВ в клетки.
В ходе проведения экспериментов определяли общее количество сорбированных ГВ и количество ГВ, поступивших во внутриклеточное пространство. На основании полученных данных строили изотермы сорбции (рис. 7.3.) и рассчитывали фактор бионакопления ГВ (табл. 7.1) как тангенс угла наклона зависимости количества поглощенных клетками бактерий ГВ от их равновесной концентрации [ГВ].
ГВ поглощённые, мг/кг ГВ поглощённые, мг/кг CHA-Pow SFA-Pg 0 50 0 20 40 [ГВ ], мг/л [ГВ ], мг/л Рис 7.3. Поглощение ГВ клетками бактерий E. coli в оптимальных (сплошная линия) и стрессовых (пунктирная линия) условиях на примере CHA-Pow и SFA-Pg96.
Табл. 7.1. Поглощение ГВ клетками бактерий E. coli в оптимальных и стрессовых условиях ГВ, поступившие в клетку при ГВ Фактор бионакопления, л/кг конц. 50 мг/л, мг/кг клеток Оптимум Стресс Оптимум Стресс CHA-Pow 3.2±0.9 5.0±0.6 14±3 17± PFA-Sk300 1.8±0.7 6.9±0.8 8±1 32± PHA-Sk300 13.1±0.5 130±15 62±12 546± SFA-CtL00 0.9±0.5 1.5±0.5 1±1 3± SFA-Pg96 0.9±0.5 0.2±0.5 4±1 1± SHA-CtL00 2.3±0.6 5.3±0.3 6±1 11± Полученные значения факторов бионакопления ГВ составляли 0.9-13.1 л/кг.