Создание и внедрение в промышленное птицеводство системы комплексного серологического мониторинга инфекционных болезней на основе иммуноферментного анализа
На правах рукописи
МУДРАК НАТАЛЬЯ СТАНИСЛАВОВНА СОЗДАНИЕ И ВНЕДРЕНИЕ В ПРОМЫШЛЕННОЕ ПТИЦЕВОДСТВО СИСТЕМЫ КОМПЛЕКСНОГО СЕРОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ НА ОСНОВЕ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА 03.02.02 «Вирусология»
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Владимир - 2010 2
Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГУ «ВНИИЗЖ») Министерства сельского хозяйства Российской Федерации.
Научный консультант: Дрыгин Владимир Викторович, доктор биологических наук, профессор
Официальные оппоненты:
Смоленский Владимир Иванович, доктор биологических наук, профессор Цыбанов Содном Жамьянович, доктор биологических наук, профессор Мищенко Владимир Александрович доктор ветеринарных наук, профессор
Ведущая организация: ФГУ «Всероссийский научно-исследовательский и техно логический институт биологической промышленности» (ФГУ «ВНИиТИБП»)
Защита состоится « 2010 г. в 1000 часов на заседании диссертационного » совета Д 220.015.01 при ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГУ «ВНИИЗЖ») по адресу: 600901, г. Владимир, мкр. Юрьевец.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственно го учреждения «Федеральный центр охраны здоровья животных» (ФГУ «ВНИИЗЖ»)
Автореферат разослан « 2010 г.
»
Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Пономарев А.П.
1.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. В связи с интенсивным развитием промышлен ного птицеводства, возникновением новых и изменением уже известных ин фекционных болезней птиц, против которых проводится профилактическая вакцинация, требуется разработка чувствительных, высокоспецифичных и поддающихся автоматизации методов оценки иммунного статуса птиц. Свое временный мониторинг инфекционных болезней птиц является неотъемле мой частью комплекса мероприятий, направленных на профилактику этих заболеваний, что предусматривает внедрение в практику диагностических исследований, отвечающих современному уровню развития науки.
Несмотря на то, что традиционные иммунологические методы по прежнему широко используются в ветеринарной практике, метод иммуно ферментного анализа (ИФА) занял ведущее место при проведении рутинных исследований. Преимущества ИФА как метода (скорость, чувствительность, специфичность, безопасность, возможность автоматизации процесса), широ кое применение коммерческих наборов для ИФА в национальных программах борьбы с инфекционными болезнями птиц во многих странах Западной Ев ропы и Америки определяют его одним из ведущих диагностических тестов.
Высокая эффективность мониторинга инфекционных заболеваний может быть достигнута только в том случае, когда методы диагностики доступны для региональных и производственных лабораторий и широко применяются в их практической работе.
В течение последнего десятилетия в промышленном птицеводстве бы ли предприняты попытки модернизации серологической диагностики с при менением иммуноферментного анализа. Для увеличения количества тести руемых проб и уменьшения расхода реактивов и трудозатрат была проведена оценка различных методик определения в ИФА титров антител при исследо вании проб сывороток крови птиц в одном разведении. (Snyder D. B., 1984, 1985;
Penzes Z., 1992).
Крупнейшие фирмы производители иммуноферментных наборов для диагностики болезней птиц (IDEXX (США), Synbiotics (КPL,США), Guildhay (Великобритания), Biochek (Голландия)) при постановке реакции в одном разведении для расчёта титра антител в сыворотке крови выбрали линейную зависимость логарифма титра (lg T) от величины логарифма S/P отношения (отношение оптической плотности испытуемой пробы к оптической плотно сти положительного контроля).
Применение измерительного оборудования, в частности, спектрофото метров для считывания значений оптической плотности в микропланшетном формате, позволило разработать методологию тестирования большого коли чества проб сывороток одновременно против нескольких антигенов. Это, в свою очередь, привело к созданию и внедрению в ветеринарную практику специализированных компьютерных программ не только для перевода опти ческой плотности в числовое значение точного титра, но и для автоматиче ской обработки, хранения и создания баз данных (Snyder D.B, 1984).
Наиболее актуальным для промышленного птицеводства является мо ниторинг списочных (особо опасных) и экономически значимых болезней кур - ньюкаслской болезни (НБ), гриппа птиц (ГП), инфекционной бурсаль ной болезни (ИББ), инфекционного бронхита кур (ИБК), синдрома снижения яйценоскости-76 (ССЯ-76), реовирусной инфекции птиц (РВП), инфекцион ного энцефаломиелита птиц (ИЭП), респираторного микоплазмоза и мико плазменного синовита, вызываемых Mycoplasma gallisepticum (МГ) и Mycop lasma synoviae (МС), которые определили перечень создаваемых отечествен ных диагностических тест-систем.
Гибель птиц при вспышках НБ и ГП, особенно молодой, может дости гать 100%. По данным МЭБ, с июля 2008 по июль 2009 гг. официально заре гистрированы вспышки ньюкаслской болезни в 87 странах мира (OIE, www.oie.int), в том числе и в России. По данным Россельхознадзора, всего с 2005 по 2008 гг. в России было выявлено 179 очагов высокопатогенного гриппа Н5N1 в 20 субъектах, суммарные потери от которого составили 2, млн. голов птицы.
С середины 70-х гг. ИББ и ИБК широко распространены практически во всех странах с развитым промышленным птицеводством. При вспышках ИББ заболевание охватывает практически все поголовье, летальность может достигать 90% (Chette N., 1989), при этом переболевшие птицы приобретают восприимчивость к большинству инфекционных болезней вирусной и бакте риальной этиологии (Rosenberger J., 1978). Экономические потери при ИБК складываются в основном из снижения яичной и мясной продуктивности, вынужденной выбраковки заболевшей птицы, высокой летальности молодня ка до 30-дневного возраста. Ситуация осложняется регулярным появлением новых вариантов вируса ИБК с низким уровнем родства к традиционным вакцинным штаммам. (Bochkov Y. A. e.a., 2006, Torregino C. e.a., 2008) Реовирус птиц вызывает развитие теносиновита, малабсорбционного синдрома, заболевания респираторного и кишечного трактов. Ежегодный ущерб, наносимый птицеводству в США от болезней скелета у домашних птиц, основными возбудителями которых являются в равной степени реови рус и M.synoviae, составляют от 80 до 120 млн. долларов (Sullivan T.V.,1994).
Экономический ущерб от болезней, вызываемых M.gallisepticum и M.synoviae, складывается из потерь, связанных с гибелью эмбрионов и цып лят, снижением массы тела птиц, уменьшением яйценоскости, оплодотворяе мости яиц, выводимости цыплят (Ley et al., 2003, Kleven S.H., 2003).
В крупных птицеводческих хозяйствах синдром снижения яйценоско сти -76 приносит ущерб из-за снижения яичной продуктивности и качества товарного яйца. (Eck J.H.,1982).
Инфекционный энцефаломиелит вызывает заболевание кур, которое охватывает практически все поголовье в промышленном птицеводстве как мясного, так и яичного направления, причем летальность может составлять 20-50%. (Calnek B.W, 1997, 1998) Необходимость анализа результатов исследования значительного числа проб при массовом обследовании поголовья, а также хранения полученных данных делает актуальной задачу автоматизации учета результатов ИФА.
Существующие программы компьютерной поддержки ИФА, как правило, разрабатываются фирмой-изготовителем диагностикумов и предназначены для работы только с наборами данной фирмы. Таким образом, возникла не обходимость разработать универсальную компьютерную программу, в кото рой предусматривалась бы возможность работы с наборами для ИФА и спек трофотометрами-ридерами разных производителей.
Применение в диагностических исследованиях наборов и реактивов за рубежного производства существенным образом отражается на стоимости анализов и делает отечественную ветеринарию зависимой от импортных по ставок и состояния мирового рынка. В этом аспекте разработка отечествен ных высокочувствительных, надежных и относительно недорогих диагности кумов является важной задачей.
Объем проводимых мониторинговых исследований болезней птиц с каж дым годом увеличивается и требует принципиально новых подходов к техноло гии тестирования. За рубежом в ведущих ветеринарных диагностических лабо раториях, в частности референтных по особо опасным болезням, в последние годы активно внедряются новые методы постановки ИФА, включая основанные на технологии высокопроизводительного скрининга (Сheu M., 2001, McGiven J., 2007) с применением роботизированных устройств. Замена «ручных» техноло гий серологических исследований на автоматизированные позволяет достичь повышения воспроизводимости результатов, стандартизации процесса исследо ваний и их автоматического поддержания на соответствующем уровне, повыше ния производительности и безопасности работы персонала.
Цели и задачи исследования. Основной целью наших исследований было создание системы комплексного серологического мониторинга на осно ве иммуноферментного анализа для выявления и количественной оценки специфических антител к возбудителям девяти наиболее экономически зна чимых инфекционных болезней кур (НБ, ГП, ИББ, ИБК, ССЯ-76, РВП, ИЭП, МГ, МС) при исследовании проб сывороток крови в одном разведении и ее внедрение в промышленное птицеводство.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
-усовершенствовать методики очистки и концентрирования антигенов возбудителей НБ, ГП, ИБК, ИББ, ССЯ-76, ИЭП, РВП, МГ, МС, используемых в качестве компонентов иммуноферментных тест-систем;
-оптимизировать схемы иммунизации кур для получения специфиче ских контрольных положительных сывороток;
-разработать иммуноферментные тест-системы для выявления и количе ственного определения уровня антител в сыворотках крови кур к возбудите лям НБ, ГП, ИБК, ИББ, ССЯ-76, ИЭП, РВП, МГ, МС при тестировании в од ном разведении;
-определить чувствительность и специфичность при сравнительном ана лизе данных, полученных с помощью разработанных тест-систем на основе ИФА, базовых реакций и коммерческих иммуноферментных наборов зару бежных производителей, зарегистрированных на территории РФ;
-определить диагностическую значимость результатов, полученных с ис пользованием разработанных тест-систем на основе ИФА, для изучения эпи зоотической ситуации в птицехозяйствах и оценке иммунитета после приме нения живых и инактивированных вакцин;
- разработать научно-техническую документацию и регламенты для опытно-промышленного производства коммерческих наборов в двух вариан тах: для визуальной детекции (на 40 проб) и инструментального учета (на проб);
-разработать универсальную компьютерную программу регистрации, сбора, анализа и хранения результатов с учетом возможности использования наборов для диагностики болезней птиц отечественных и ведущих зарубеж ных фирм-производителей;
-разработать технологию производства коммерческих наборов с вне дрением автоматизированных роботизированных устройств;
-провести оценку качества разработанных тест-систем в сравнительных испытаниях, проводимых международными референтными лабораториями МЭБ и ФАО;
-внедрить в работу ветеринарных лабораторий и птицефабрик ком плексную систему серологической оценки иммунного статуса кур разного возраста, основанную на ИФА, с использованием комплекта стандартизиро ванного оборудования и универсальной компьютерной программы обработки и хранения полученных результатов.
Научная новизна. Впервые разработаны отечественные иммунофер ментные тест-системы на основе непрямого варианта ИФА для выявления и количественной оценки специфических антител к возбудителям основных экономически значимых инфекционных болезней кур (НБ, ГП, ИББ, ИБК, ССЯ-76, РВП, ИЭП, МГ и МС) при тестировании проб сывороток крови в од ном разведении.
Впервые в России создана комплексная система серологического мони торинга в птицеводстве, основанная на методологии ИФА с применением отечественных диагностических наборов, сертифицированного оборудования, реагентов и компьютерной программы, которая обеспечивает получение на дежных данных об иммунном статусе птицепоголовья.
Проведена сравнительная оценка чувствительности и специфичности ре акций по результатам, полученным с помощью разработанных тест-систем на основе ИФА, базовых реакций (РДП, РТГА) и коммерческих наборов зару бежных производителей, зарегистрированных на территории РФ.
Определена диагностическая значимость результатов, полученных с применением разработанных тест-систем на основе ИФА при оценке трансо вариального иммунитета, изучении динамики накопления антител после применения живых и инактивированных вакцин в промышленном птицевод стве.
Разработана и сертифицирована компьютерная программа регистрации, анализа и хранения результатов для работы с отечественными и зарубежными иммуноферментными коммерческими наборами ведущих фирм производителей.
Утверждена научно-техническая документация и регламент для опыт но-промышленного производства коммерческих наборов в двух вариантах:
при визуальной детекции и инструментальном учете с применением про граммного обеспечения.
Качество лабораторных исследований с применением коммерческих наборов для ИФА на основе разработанных тест-систем подтверждено ре зультатами международных сравнительных испытаний, проведенных аккре дитованной лабораторией (GD, Голландия) в 2006-2008 гг. при тестировании зашифрованных проб сывороток с разным уровнем антител к НБ, ГП, ИБК, ИББ, МГ и МС.
Научная новизна исследований подтверждена 3 патентами на наборы и свидетельством на компьютерную программу «СИНКО-ИФА», зарегистриро ванную в Российском агенстве по патентам и товарным знакам.
Практическая значимость. Методики, разработанные в ходе научно исследовательских работ по теме диссертации, включены в два сборника:
“Методические указания по диагностике заболеваний сельскохозяйственных животных иммуноферментным методом” (1998 г.) и “Методические указания по диагностике заболеваний сельскохозяйственных животных и птиц с ис пользованием серологических реакций” (2008 г.), утвержденные Россельхоз надзором в качестве пособия для работников ветеринарных диагностических лабораторий.
Результаты экспериментальной работы вошли в нормативные докумен ты по изготовлению и контролю 16 наборов для ИФА, утвержденных Рос сельхознадзором.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 81 научная ра бота, в том числе 22 в изданиях, рекомендованных перечнем ВАК РФ.
Апробация работы. Основные материалы исследований по теме дис сертации опубликованы, доложены и обсуждены: на конференциях, прово димых в ФГУ «ВНИИЗЖ» (г. Владимир, 1995, 1997-2000, 2003, 2008);
на ме ждународной конференции «Птицеводство – мировой и отечественный опыт», Москва, 2002;
на Всероссийском совещании-семинаре директоров ветлабораторий - субъектов РФ «Совершенствование ветеринарной лабора торно-диагностической работы в Российской Федерации», Брянск, 2004;
Ме ждународных ветеринарных конгрессах по птицеводству, Москва, 2005, 2006;
на Международных научных конференциях и конгрессах в Российской Феде рации (Москва, 2001;
Казань, 2005;
Покров, 1999, 2000;
Новосибирск, 2008),в Украине (Харьков, 2001-2003, 2006-2008;
Крым, 2006-2008), Казахстане (Ал маты, 2000), Республике Беларусь (Минск, 2000;
Витебск, 2001), Марокко (Маракеш, 2009), Австрии (Вена, 2009), на заседаниях учёного совета ФГУ «ВНИИЗЖ» в 1995-2009 гг.
Основные положения, выносимые на защиту:
- разработка иммуноферментных тест-систем для выявления и количествен ного определения антител к возбудителям девяти экономически значимых инфекционных болезней кур (НБ, ГП, ИББ, ИБК, ССЯ-76, РВП, ИЭП, МГ и МС) при исследовании проб сывороток крови в одном разведении;
-результаты определения корреляционной зависимости при сравнении дан ных, полученных с использованием разработанных тест-систем, базовых тес тов и коммерческих наборов зарубежного производства;
-программное обеспечение для учета, обработки и хранения результатов ана лиза «СИНКО-ИФА»;
-результаты исследований сывороток крови кур с применением разработан ных наборов для ИФА при ретроспективной диагностике заболеваний и оценке поствакцинального иммунитета после применения живых и инактиви рованных вакцин в птицехозяйствах РФ в 1995-2008 гг.;
-результаты лабораторных исследований в международных сравнительных испытаниях, проведенных аккредитованной лабораторией (GD, Голландия) в 2006-2008 гг.;
Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 322 стра ницах, иллюстрирована 55 таблицами и 41 рисунками. Список цитируемой литературы включает 363 источников, из них 311 иностранных.
Исследования по диссертационной работе выполнены в 1993-2009 гг. в ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» (до 2003 г. «Всерос сийский научно-исследовательский институт защиты животных» (г. Влади мир).
Основные результаты работы получены лично автором, под его руко водством или при его непосредственном участии в планировании, проведе нии и анализе экспериментов. Имена соавторов, выполнявших отдельные этапы работы, указаны в соответствующих публикациях, за что автор выра жает им глубокую благодарность.
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1.Материалы и методы 2.1.1. Материалы Штаммы вирусов и микоплазм:
-штамм вируса ИБК «Чапаевский», Н120 (серотип Массачусетс) из коллекции ФГУ «ВГНКИ»;
-вакцинный производственный штамм «БГ» вируса ИББ (ФГУ «ВГНКИ»);
-производственный штамм Ла-Сота вируса НБ (ФГУ «ВГНКИ»);
-вирус гриппа птиц А/duck/Novosibirsk/2/2005 Н5N1(ФГУ «ВНИИЗЖ»);
- штамм В 8/78 вируса ССЯ-76, адаптированный к утиным эмбрионам (ФГУ «ВГНКИ»);
-вакцинный штамм S1133 реовируса птиц (ФГУ «ВГНКИ»);
- штамм вируса ИЭП «Calnek 1143М» (ФГУ «ВГНКИ»);
-вакцинный штамм 6/85 МГ и штамм WVU1853 МС (ФГУ «ВГНКИ»).
Эмбрионы кур. Использовали куриные эмбрионы (КЭ), полученные от СПФ-кур (фирма Lohmann Tiehrzucht, Германия).
Культура клеток. Использовали перевиваемую культуру клеток МДСК (НИИ гриппа, г. Санкт-Петербург) и первичную культуру фибробла стов эмбрионов кур (ФЭК).
Сыворотки. Вирусспецифические сыворотки крови кур, используемые в качестве положительного контроля, получали путем иммунизации доноров очищенными инактивированными препаратами антигенов выбранных возбу дителей.
В качестве исследуемых проб использовали сыворотки крови кур, экс периментально вакцинированных против возбудителей болезней кур или присланных из более 500 птицехозяйств РФ и других стран СНГ.
Пероксидазный конъюгат. В работе применяли антивидовой коммер ческий конъюгат (НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РФ), представляющий собой глобулиновую фракцию, выделенную из антисыворотки, полученной имму низацией животных-продуцентов IgG курицы, меченную пероксидазой, а также антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против IgG кур производства фирмы KPL (США).
Коммерческие диагностические наборы. Применяли коммерческие наборы для определения антител к возбудителям инфекционных болезней кур (НБ, ГП, ИББ, ИБК, РВП, ИЭП, МГ и МС) в ИФА фирмы Synbiotics (KPL, США), зарегистрированные на территории РФ.
Оборудование. Использовали стандартное лабораторное оборудование и автоматические станции модульного типа FREEDOM EVO-150 фирмы Te can (Австрия) для роботизации отдельных стадий анализа и производства на боров.
Реактивы и растворы. Применяли реактивы отечественного и им портного производства марки «о.с.ч.», из которых готовили растворы, необ ходимые для очистки и концентрирования антигенов. Для постановки ИФА использовали следующие растворы: 0,05 М Трис-НСl с 0,2 М NaCl рН 7,4-7,6;
0,01 М карбонатно-бикарбонатный буфер рН 9,6-9,5;
испытуемые и кон трольные сыворотки и антигены, конъюгаты антивидовых антител разводили в растворе 0,05 М Трис-НСl с 0,2 М NaCl, 0,1% твин-20, для блокировки при меняли раствор 0,05 М Трис-НСl с 0,2 М NaCl, 0,1% твин-20 с 10% сыворот ки крови лошадей;
отмывку сорбента от несвязавшихся компонентов прово дили раствором 0,05 М трис-НСl с 0,2 М NaCl и 0,1% твин 20 рН 7,4-7,6;
в качестве субстрата пероксидазы использовали: 0,04% раствор ортофенилен диамина в фосфатно-цитратном буфере рН 4,9 с 0,04 % перекиси водорода;
2,2’-азино-ди[3-этил]бензтиазолинсульфоновую кислоту(АБТС) с перекисью водорода;
для остановки реакции применяли 10% раствор серной кислоты, а также 5 % раствор додецилсульфата натрия (ДСН).
2.1.2. Методы Получение антигенов вирусов и микоплазм. Проводили согласно ме тодикам, описанным ранее (Бочков Ю.А. и соавт., 1997;
Грибанов О.Г. и со авт., 1997;
Куприянов А.И. и соавт., 2000;
Волкова И.А. и соавт., 2000;
Цива нюк М.А. и соавт., 2007).
Серологические и иммунохимические методы исследования.
Активность гемагглютинирующих вирусов ГП, ССЯ-76 и НБ, а также антигенов M. gallisepticum и M. synoviae определяли в реакции гемагглюти нации (РГА) в планшетах с использованием 1% суспензии эритроцитов кур.
РТГА и РДП проводили в соответствии с Руководством по диагностическим тестам и вакцинам в отношении наземных животных (МЭБ, 2008).
Электрофорез проводили по Laemmli U.K. (1970) с некоторыми моди фикациями.
Определение относительной специфичности и чувствительности.
Относительную чувствительность и специфичность исследований подсчиты вали по методу, предложенному Hayhow C. S. (1993).
Статистический анализ материалов. Для статистической обработ ки данных использовали компьютерную программу «Statistica» (USA, StatSoft Inc., Release 6.0, 2001) Компьютерный учёт результатов. Учёт результатов непрямого вари анта ИФА, обработку, хранение и воспроизведение полученных данных про водили с использованием разработанной компьютерной программы «СИНКО-ИФА» (ФГУ «ВНИИЗЖ»).
2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.
2.2.1. Усовершенствование методики очистки и концентрирования антигенов вирусов и микоплазм, применяемых в качестве компонентов иммуноферментных тест-систем В качестве исходного материала для получения антигенов вирусов и микоплазм использовали гомогенаты тканей, экстраэмбриональную жидкость (ЭЭЖ) куриных эмбрионов, вируссодержащую культуральную жидкость. При этом осуществляли оптимизацию условий очистки и концентрирования с уче том особенностей морфологии, строения и физико-химических свойств воз будителя.
Вируссодержащие препараты после инактивации очищали от балласт ных белков путём низкоскоростного центрифугирования. Затем проводили очистку высокоскоростным центрифугированием через 20% раствор сахарозы или через линейный градиент CsCl-сахароза.
При концентрировании антигенов вирусов ИББ, ССЯ-76, ИЭП, РВП к инактивированной антигенсодержащей суспензии, после предварительной очистки хлороформом или фреоном 113 (для РВП), добавляли 7-7,5% поли этиленгликоль (М 6000-8000), полученные осадки ресуспендировали в ФБР из расчета от 1/20 до 1/70 от исходного объема.
Полученную биомассу M.gallisepticum концентрировали центрифугиро ванием при 8000 об/мин., для разрушения клеток применяли: ультразвук, ли зирование материала с помощью карбонатно-бикарбонатного буфера (КББ), обработку ДНК-зой и РНК-зой, обработку ДСН. Наилучшие результаты были получены при обработке ДСН. Антигенсодержащее сырье M.synoviae дважды центрифугировали и клеточную массу суспендировали в ФБР с последующей обработкой ДСН.
После ресуспендирования осадков в ФБР получали препараты, cодержащие антигены вирусов и микоплазм с концентрацией белка не менее 1 мг/см3. Для гемагглютинирующих вирусов активность препаратов в РГА составляла 7,0-9,0 log2, в «сэндвич»-варианте ИФА – 1:6400-12800.
В процессе электронно-микроскопических исследований выявляли ви рионы с характерной структурой. Данные электрофореза в 12,5% полиакри ламидном геле свидетельствовали об отсутствии или минимальных количе ствах посторонних белков.
Полученные препараты антигенов и микоплазм сохраняли специфиче скую активность при иммобилизации на планшетах в течение длительного времени (не менее 12 месяцев). При проверке на активность и специфичность в непрямом варианте ИФА с контрольными сыворотками из наборов фирмы Synbiotics (KPL) были получены титры не менее 1:1600 для положительных и менее 1:200 для отрицательных контрольных сывороток со всеми препарата ми антигенов и установлена строгая специфичность в отношении гетероло гичных сывороток.
Очищенные и концентрированные препараты антигенов использовали для получения специфических контрольных сывороток, оптимизировав схе мы иммунизации птицы с учетом особенностей биологии возбудителя.
2.2.2. Разработка тест-систем на основе непрямого варианта ИФА для определения антител к возбудителям болезней птиц Для разрабатываемых тест-систем необходимо было установить опти мальные рабочие разведения сыворотки, коэффициенты уравнения линейной регрессии для количественной оценки, позитивно-негативный порог для ка чественной интерпретации данных, диапазон допустимых значений оптиче ской плотности (ОП) контрольных сывороток.
2.2.2.1. Выбор рабочего разведения сыворотки Задачей данного этапа исследований было нахождение величины раз ведения сыворотки, которая имеет наибольший коэффициент корреляции с экспериментально установленным значением титра. Были использованы про бы специфических сывороток с разным уровнем антител, для которых мето дом последовательных разведений определяли титр (наибольшее разведение, ОП которого равна удвоенному значению ОП отрицательного контроля).
Изучали взаимосвязь между экспериментально полученными значе ниями титров (T), определенных методом последовательных разведений, и величинами (S/P)-отношений, установленных при исследовании сывороток крови кур в разведениях 1:100, 1:200, 1:400 и 10. Для каждого из указан ных разведений между значениями lgT и lg(S/P) определяли коэффициенты корреляции (r), а также коэффициенты (А и В) для уравнения модели связи вида lgT= A + B lg(S/P). Полученные значения r, представленные в табл.1., показывали высокую степень корреляции между исследованными показате лями lgT и lg(S/P) Таблица Коэффициенты корреляции между логарифмами титров (lg T), ус тановленных методом последовательных разведений, и логарифмами S/P – отношения (lg S/P**) для заданных разведений сывороток крови кур Наименование Разведения возбудителя 1:100 1:200 1:400 1: НБ н/и 0.9143 0. 0. ИББ * 0,83 0,95 0, 0, ИБК 0,938 0,945 0, 0, ССЯ-76 н/и- 0,794 0, 0, РВП 0,89 0,94 0, 0, ИЭП 0,86 0,90 0, 0, МГ н/и 0,86, 0,93 0, МС н/и 0,94 0,95 0, ГП н/и 0,92 0,94 0, *Все коэффициенты были получены в результате не менее 60 измерений и имели значи мость (p0,01) ОПисследуемой.пробы - ОП отрицательного контроля **S/P – отношение - ------------------------------------------------------------ ОП положительного контроля - ОП отрицательного контроля Для прогнозирования титра сыворотки по S/P-отношению были исполь зованы регрессионные модели связи для всех испытанных разведений сыво роток. В качестве примера на рис. 1 приведен график зависимостии lg T от lg S/P и соответствующая регрессионная модель для разведения 1:400 в тест системе для выявления антител к вирусу НБ.
Коэффициент ко рреляции: r =. 4. 3. _T 3. LG 2. 2. Regress ion 95% confid.
-1.4 -1.2 -1 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0 0. LG_S/P Рис. 1. График зависимости lg Т антител к вирусу НБ, определённо го методом последовательного разведения от lg S/P в разведении сыво ротки 1: Полученные модели связи, за исключением модели для разведения 1:100, были адекватны (p0,01), однако наименьшую остаточную дисперсию наблюдали в разведении 1:400 для всех антигенов. При достаточном уровне значимости (р 0,05) коэффициентов корреляции и адекватности используе мой модели связи возникала возможность прогнозировать титр, используя S/P-отношение единственного разведения сыворотки.
Уравнения для вычисления логарифмированного значения титра в раз ведении сыворотки 1:400 представлены в табл. 2.
Таблица Уравнения для вычисления логарифмированного значения титра в разведении 1: НБ lg(T) = 1,514 x lg(S/P) + 3, ГП lg(T) = 1,46 x lg(S/P) + 3, ИББ lg(T) = 1,714 x lg(S/P) + 3, ИБК lg(T) = 1,473 x lg(S/P) + 3, ССЯ-76 lg(T) = 2,367 x lg(S/P) + 4, МС lg(T) = 1,375 x lg(S/P) + 3, МГ lg(T) = 1,359 x lg(S/P) + 3, РЕО lg(T) = 1,232 x lg(S/P) + 3, ИЭП lg(T) = 1,1877 x lg(S/P) + 3, 2.2.2.2. Определение диапазона значений показателей оптической плотности для отрицательного и положительного контролей Для получения корректных результатов реакции, при условии неизбеж ного варьирования величин оптической плотности (ОП), необходимо, чтобы оптические характеристики обеих контрольных сывороток были количест венно определены в виде диапазонов допустимых значений. При этом для отрицательного контроля значима верхняя допустимая граница, а для поло жительного - обе границы. Выход за рамки допустимых значений ведет к по лучению в ИФА либо ложноположительных, либо ложноотрицательных ре зультатов.
На планшетах с антигеном ИББ более чем в 50 повторностях исследо вали вариации значений ОП отрицательной и положительной контрольных сывороток в разведениях 1:400. Полученные выборки значений ОП позволи ли расcчитать соответствующие средние величины и их статистические ха рактеристики в виде дисперсий () и 95,5% доверительных интервалов (2).
Для отрицательного контроля в качестве максимально допустимой (порого вой) величины была принята верхняя граница доверительного интервала, ко торая составила 0,144. Было определено, что пороговые значения ОП поло жительного контроля находились в диапазоне от 0,518 до 0,838.
Установленные таким же образом пороговые значения ОП контроль ных сывороток для разрабатываемых тест-систем представлены в табл. 3.
Таблица Пороговые значения оптической плотности положительных и отри цательных контрольных сывороток № п/п Название воз- ОП отрицательного ОП положительного будителя контроля контроля НБ 1 0,150 0,439 – 0, ГП 2 0,160 0,400-0, ИББ 3 0.144 0,518- 0, ИБК 4 0,150. 0,450 - 0, ССЯ- 5 0,150 0,455 – 0, ИЭП 6 0,140 0,450 - 0, РВП 7 0,142 0,412 – 1, МГ 8 0,150 0,450 - 1, МС 9 0,150 0,450 - 1, 2.2.2.3. Определение значений титров для разграничения отрица тельной, сомнительной и специфической реакций Для всех разрабатываемых тест-систем определяли максимальное зна чение S/P, соответствующее неспецифической реакции, и минимальное зна чение S/P для специфической реакции. Для этого, соблюдая ранее вырабо танные условия проведения анализа (рабочее разведение, допустимые значе ния ОП контрольных сывороток), тестировали с каждым антигеном не менее 30 проб сывороток крови, не содержащих специфических антител к выбран ным возбудителям заболеваний, но имеющих определенный уровень неспе цифической реакции, который в среднем превышал ОП отрицательного кон троля.
Статистические характеристики среднего значения оптической плотно сти для неспецифической реакции вычисляли в виде дисперсии (), на основе которой определяли верхние границы 95% доверительных интервалов. В ка честве примера приведены расчеты определения качественной характеристи ки результатов ИФА для НБ и ИБК. Были использованы результаты выявле ния специфических антител к вирусу НБ в 109 пробах сывороток крови кур параллельно в двух реакциях - ИФА и РТГА. Среднее значение титра антител для сомнительного результата оказалось равным 1:356 при доверительном интервале для Р=95% от 1:250 до 1:500. Для положительного результата средний титр специфических антител оказался равным 1:470 при доверитель ном интервале для Р=95% от 1:418 до 1:528. Таким образом, сыворотки с тит ром антител, равным или выше значения 1:500, считали с достаточной веро ятностью положительными, сомнительный результат реакции характеризова ли величиной интервала 1:250 - 1:500, меньше или равный 1:250 говорит об отсутствии специфических антител к вирусу НБ.
Для установления позитивно - негативного порога (ПНП) 33 заведомо отрицательных к вирусу ИБК сыворотки крови от СПФ-цыплят исследовали методом последовательных разведений. Среднее значение оптической плот ности нормальных сывороток, суммированное с утроенным значением стан дартного отклонения, составило для разведения 1:100 0,3298, 1:200 0,244, 1:400 0,1818, 10 0,1628, 1:1600 0,1366, 1:3200 0,1225, 1: 0,1174. Оптическая плотность, соответствующая минимальному положитель ному титру антител к вирусу ИБК, была равна 0,185. Определялось пороговое значение S/P = (0,185 - 0,106) / (0,703 - 0,106) = 0,1323, lg S/P = -0,8783. По формуле был найден наименьший положительный титр= 362. С учетом воз можных погрешностей, допустимых в пределах одного разведения, где T/ T T 2, выделялась сомнительная зона. Таким образом, титр антител до 361 считался отрицательным, 362 724 сомнительным, от 725 и выше положительным. Вычисленные таким образом значения титров представлены в табл.4.
Таблица Значения титров, соотвествующие отрицательным, сомнительным и по ложительным результатам ИФА (n 30) № Название воз- Отрицательный Сомнительный ре- Положительный п/п будителя результат зультат результат НБ От 1 0 - 250 251 - ГП От 2 0 - 640 641 - ИББ От 3 0 - 245 245 - 0 ИБК От 4 362- ССЯ-76 От 5 0 - 222 223- ИЭП От 6 0 - 405 406 - РВП От 7 0 - 266 266 - МГ От 8 0 -416 417- МС От 9 0 - 425 426 - 2.2.3. Установление корреляции между результатами, полученными с применением разработанных тест-систем, серологических тестов и коммерческих наборов на основе ИФА Важнейшим показателем качества диагностических тест-систем явля ются результаты их применения для анализа проб сывороток крови при срав нении с лучшими импортными аналогами, т.е. с диагностическими тест системами фирм, продукция которых имеет давнюю и устойчивую репутацию на мировом рынке. С этой целью мы сравнивали диагностические возможно сти разработанных тест-систем и коммерческих наборов фирмы Synbiotics (KPL, США).
График зависимости между десятичным логарифмом титра, определен ного с использованием разработанной тест- системы ИФА для НБ, и десятич ным логарифмом титров, определенных с помощью коммерческого набора фирмы «Synbiotics» (KPL), представлен на рис. 2. Коэффициент корреляции между значениями титров антител, определённых в обеих иммунофермент ных тест-системах, составил 0.84.
На основе данных, полученных с использованием разработанной тест системы ИФА и коммерческого набора KPL, были рассчитаны относительная чувствительность (ОЧ) и специфичность (ОС) по отношению к базовой реак ции РТГА. Было исследовано 170 заведомо положительных и 76 отрицатель ных сывороток по результатам РТГА.
LG_ИФА = 1.1971 +.59013 * LG_KPL Коэффициент корреляции: r =. 4. 3. 2. LG_ИФА 1. 0. Regression 95% confid.
0 1 2 3 4 LG_KPL Рис.2. График зависимости значений титров (lg Т), полученных с применением разработанного набора и набора KPL при исследовании сывороток крови кур, вакцинированных против НБ Представленные в табл.5. данные показывают, что разработанная тест система ИФА не уступала по чувствительности и специфичности коммерче скому набору Synbiotics (KPL).
Таблица Результаты ИФА для вычисления относительной чувствительности и специфичности для тест-системы НБ Результаты ИФАА Результаты ИФАБ Качеств. Тест-система Положительные Отрицательные хар-ка ВНИИЗЖ ВНИИЗЖ ВНИИЗЖ KPL KPL KPL Положит. 156 153 151 148 5 Отрицат. 90 93 19 22 71 Всего: 246 246 170 170 76 Примечание: А - «сомнительные» титры ИФА (1:250-1:500) отнесены в группу отрица тельных;
Б – результаты ИФА по отношению к результатам РТГА.
ОЧ (тест-система ВНИИЗЖ)=151/170100%=89%;
ОС (тест-система ВНИИЗЖ)=71/76100%=93% ОЧ (тест-система KPL)=148/170100%=87%;
ОС (тест-система KPL)=71/76100%=93% 59 проб гетерологичных сывороток, референтных сывороток против ГП разных подтипов, сывороток после однократной вакцинации против ГП под типа Н5 были протестированы с применением набора для выявления антител к вирусу гриппа птиц фирмы Synbiotics. Относительная чувствительность тест-системы с использованием антигена вируса ГП подтипа Н5N1 составила 100 %, относительная специфичность – 79 %. Диагностическая чувствитель ность составила 93 %, диагностическая специфичность – 95 %. Результаты, полученные с использованием разработанной тест- системы и коммерческо го, совпадали по качественным характеристикам на 93 %.
Коэффициент корреляции 0.933 (р0,05) характеризовал устойчивую взаимосвязь между тест-системой ИББ и набором Synbiotics.
Относительная чувствительность и относительная специфичность раз работанной тест-системы РВП по отношению к набору фирмы «Synbiotics» составила: для сывороток крови от непривитой птицы: 95,4% и 94,7%;
для сывороток крови вакцинированной против РВП кур - 98,3% и 94,1%, соответ ственно.
С применением тест-системы для выявления антител к вирусу ИБК и набора фирмы Synbiotics было протестировано 518 полевых сывороток. Кор реляция между результатами составила 91%.
После параллельного тестирования с использованием двух наборов проб полевых сывороток чувствительность по отношению к наборам фирмы Synbiotics составила для тест-систем M.gallisepticum - 98%, M.synoviae - 96%;
специфичность была 97% и 90%, соответственно.
В опытах было протестировано 400 полевых сывороток крови кур на наличие антител к вирусу ИЭП. Было установлено, что чувствительность раз работанной тест-системы по отношению к набору фирмы Synbiotics составила 91%, а специфичность - 94%. Таким образом, корреляция между результата ми составила 96%.
Статистический анализ результатов выявления антител к вирусу ССЯ 76 в ИФА и РТГА показал наличие парной корреляции (R=0,863), причем специфичность ИФА была 1,0 (30/30), и, соответственно, чувствительность 1,0 (80/80) или 0,9 (72/80) и 0,93 (102/110), в зависимости от того, были ли сомнительные результаты сгруппированы с положительными или с отрица тельными результатами.
2.2.4. Разработка программного обеспечения «СИНКО-ИФА» для учета, обработки и хранения результатов ИФА в ветеринарии Программа "СИНКО ИФА" по болезням птиц представляет собой мо дульную программную систему, созданную на языке програмирования Visual Basic версии 3.0. Программа позволяет считывать с ридера или вводить с кла виатуры данные по оптической плотности, указывать расположение испы туемых и контрольных проб на планшете, рассчитывать по формулам, пред ложенным разработчиком набора, значения титров или других показателей, принятых для характеристики исследуемых материалов, сохранять как пер вичные (оптические плотности), так и обработанные (значения титров) дан ные.
В 2000 г. программа «СИНКО-ИФА» была зарегистрирована в Россий ском агенстве по патентам и товарным знакам и получено соотвествующее свидетельство. Текущая рабочая версия 2.1C работает в операционной среде Windows 3.X и Windows 9X, позволяет непосредственно из программы под ключаться к различным базам данных и сохраняет подключение к последней базе данных по желанию пользователя. Предусмотрен поиск в базе результа тов теста по дате анализа, исполнителю, хозяйству, производителю наборов, болезням, возрасту птиц. По мере появления новых моделей спектрофото метров-ридеров составляются коммуникационные модули для новых прибо ров. В настоящее время программа совместима с четырнадцатью моделями спектрофотометров-ридеров отечественного и зарубежного производства и предусматривает возможность работы с наборами зарубежных (IDEXX, Syn biotics, Guildhay, BioChek) и отечественных (ФГУ «ВНИИЗЖ») производите лей, в которых используется непрямой вариант постановки реакции при тес тировании проб в одном рабочем разведении.
2.2.5. Практическое использование разработанных тест-систем на основе непрямого варианта ИФА В целях испытания разработанных тест-систем исследовали пробы сы вороток крови кур, направленные для анализа в ФГУ «ВНИИЗЖ» из птице водческих хозяйств России в период 1998-2008 гг. с сопроводительными до кументами, где были указаны сведения об эпизоотической обстановке в хо зяйстве и о мероприятиях по специфической профилактике инфекционных болезней птиц. Наборы использовались для определения уровня гуморальных антител в экспериментальных условиях, при оценке иммунного статуса пого ловья кур на птицефабриках, в частности, при контроле материнского имму нитета у цыплят в первые недели жизни, поствакцинального и постинфекци онного иммунитета. За 1998-2008 гг. были исследованы пробы сывороток крови кур из более чем 500 птицехозяйств России и других стран СНГ.
2.2.5.1. Определение уровня трансовариального иммунитета у цып лят разных пород Исследование уровня пассивного иммунитета при разных болезнях яв ляется важным для корректировки сроков первой вакцинации живой вакци ной, особенно при ИББ. Тестировали сыворотки крови цыплят в возрасте от до 20 дней, полученных от кур яичных и мясных пород, вакцинированных против ИББ. Для каждой породы, с интервалом в 1 день в 3-6 образцах сыво роток определяли значения титров антител. Средний показатель титра сыво роточных антител на первый день жизни цыплят мясной породы составил 1:3890, у цыплят яичной породы - 1:5702. На 20 день средние значения тит ров составили 1 у мясных пород и 1:356 у яичных. Были определены ко эффициенты корреляции между значениями титров и возраста у цыплят мяс ных пород (r=0,928, p0,01) и яичных пород (r=0,954, p0,01). При известном значении исходного титра на основании регрессионного коэффициента, уста новленного для данной породы, уровень гуморального иммунитета у цыплят может быть достаточно надежно предсказан в период между 2-3 и 18-20 сут ками. Падение уровня материнских антител против вируса ИБК наблюдали при анализе проб сывороток крови цыплят в возрасте 1, 7, 14, 18, 21 суток одного и того же птичника на четырех птицефабриках. В результате была вы явлена общая закономерность в динамике снижения уровня антител к вирусу ИБК у цыплят в разные периоды жизни, который к 21 дню был ниже мини мального положительного значения (Т 1:700).
Результаты показали, что уровень трансовариального иммунитета варь ирует в зависимости от породы цыплят, вакцин, применяемых для иммуниза ции несушек, графика вакцинации. Показатели материнского иммунитета имеют большое практическое значение, поскольку позволяют рационально планировать сроки вакцинации.
2.2.5.2. Изучение динамики уровня антител в разные сроки после иммунизации живыми и инактивированными вакцинами Использование разработанных тест-систем для контроля гуморального иммунитета позволило наблюдать динамику роста иммунного ответа, судить об эффективности проведенной вакцинации.
Например, цыплят кросса “Родонит” в возрасте 22 дней, не имеющих антител к вирусу ИББ, прививали сухой вирус-вакциной против ИББ из штамма “БГ” в дозе 1000 ЭИД50. В период c 6 по 12 день после иммунизации происходило резкое увеличение средней концентрации антител до 1:4800.
Далее наблюдалось снижение интенсивности прироста иммунного ответа и тенденция к стабилизации средних значений титров. На 18-й день средний титр составил 1:6252. Следует отметить, что динамика роста титров сопрово ждалась уменьшением величины вариации индивидуальных иммунных отве тов в группах вакцинированной птицы (коэффициент вариации убывал от 37% с 6-го дня до 10% в среднем для периода с 12-го по 20-й день).
Для однократной иммунизации вакциной против НБ шт. Ла-Сота с масляным адъювантом в дозе 0,5 см3 внутримышечно были сформированы группы цыплят в возрасте 50 дней, не имеющих специфических антител к ви русу НБ. Кровь отбирали на 7,10,14,21,24,28,31,45 и 52 дни опыта. Для изу чения корреляции между результатами выявления антител к вирусу НБ в ИФА и РТГА значения титров антител были переведены в десятичные лога рифмы и подвергнуты регрессионному анализу.
3. 2. титр(lg) 1. 0. 0 7 10 14 21 24 28 31 45 РТГА су тки ИФА Рис.3. Выявление антител к вирусу НБ в ИФА и РТГА после одно кратной иммунизации цыплят живой вакциной шт. Ла-Сота. (положи тельные результаты: ИФА- 2,4 lg, РТГА- 1,0 lg) Как видно из данных, представленных на рис.3, уровень антител на 7 су тки достигал в ИФА и РТГА положительных значений. Пик выработки анти тел наблюдался в ИФА на 21 сутки и на 14 сутки в РТГА. Титр антител на конец периода наблюдения (52 суток) составил в ИФА- 1:3471, в РТГА – около 3,0 lg (10 log2), коэффициент корреляции между результатами тестов был 0,94.
При вакцинации птицы инактивированным препаратом наибольший титр специфических антител был выявлен в те же дни, что и при иммуниза ции цыплят живой вакциной. Титр антител в день завершения опыта (на сутки) составил в ИФА 1:4071, в РТГА 9,37 log2. В результате проведённого контрольного заражения было установлено, что на 52 день опыта цыплята, привитые вакцинами, имели 100% защиту от инфекции.
Продолжительность иммунитета после двукратной прививки живой вакциной против ИБК изучали, используя группу птиц из одного птичника на птицефабрике в течение 248 дней. Птиц вакцинировали в суточном возрасте спреем и на 30-й день-выпойкой. Сыворотки крови исследовали на 1, 7, 71, 99, 113 и 248 сутки. На 71-е сутки цыплята имели уровень антител с Т = 1:6712, на 99 день титр антител был равен 1:10002. На 113 день наблюдали снижение уровня антител (Т = 1:7339), а на 248 день он достиг порогового значения титра (Т = 1:666).
Для иммунизации инактивированной вакциной против ГП использова ли 60 суточных цыплят без антител к вирусу гриппа птиц. Средние титры приведены по результатам исследования сывороток крови цыплят, иммуни зированных вакцинами 17 серий.
Как представлено на рис.4, уже на 13 день после вакцинации средний титр антител был положительным и составил 1:1818 ± 386. На 28 день после иммунизации средний титр был 1:5354 ± 405. В течение последующих меся цев наблюдали постепенное снижение уровня антител, и через 6 месяцев по сле иммунизации средний титр составил 1:2659 ± 436.
6000 Средний титр в ИФА Средний титр в РТГА, log 4000 2000 0 13 28 60 120 3704± Н-ИФА 1818±386 5354±405 2877±337 2659± 4,80±1,54 6,10±1, РТГА 7,90±1,76 5,30±1,44 5,10±1, Сутки после иммунизации Рис.4. Выявление антител в ИФА и РТГА к вирусу гриппа у цып лят, привитых вакциной против ГП подтипа Н5N В качестве подтверждающего теста использовали РТГА. При исследо вании сывороток крови, полученных на 13 сутки после иммунизации, сред ний титр антител в РТГА к вирусу ГП подтипа Н5 составил 4,8 ± 1,54 log2.
Максимальную величину среднего титра, равную 7,9 ± 1,76 log2,также на блюдали через 28 суток после вакцинации. Через 6 месяцев средний титр со ставлял 5,1 ± 1,37 log2. Результаты, полученные в РТГА и ИФА, коррелирова ли друг с другом.
Для характеристики иммунного фона к M.gallisepticum и M.synoviae у невакцинированной птицы в ИФА были исследованы пробы сывороток крови кур, присланные в 1996-2003 гг. из 291 птицефабрики 56 областей РФ, отно сящихся к 7 регионам, а также из 26 предприятий Украины и Белоруссии.
Были обработаны данные исследований в ИФА 31650 полевых сывороток крови кур на присутствие антител к M.gallisepticum и 22696 – M.synoviae.
Часть этих сывороток была исследована одновременно на наличие антител к обоим возбудителям. Для исследования динамики изменения уровня антител в течение жизни все поступающие пробы из разных птицехозяйств были раз делены по возрастным группам: 1-5, 6-10, 11-20, 21-30, 31-60, 61-90, 91-120, 121-150, 151-200, 201-300, 301-400, 401 и более дней. На основании получен ных результатов были построены графики, которые подтвердили, что к трех недельному возрасту у цыплят полностью исчезают материнские антитела к M.gallisepticum и M.synoviae, уровень которых в суточном возрасте был мак симальным, до пятинедельного возраста антитела отсутствовали, затем начи нался их постепенный прирост к 90 дням, при этом заболевание протекало зачастую субклинически. Однако любой стресс, ведущий к снижению имму нитета, может изменить ситуацию по данным заболеваниям.
Таким образом, определена диагностическая значимость результатов, полученных с применением разработанных тест-систем на основе ИФА при оценке трансовариального иммунитета, изучении динамики накопления анти тел после применения живых и инактивированных вакцин, оценке иммунного фона у птицепоголовья в промышленном птицеводстве.
2.2.6. Создание коммерческих наборов на основе разработанных тест-систем Проведенные исследования по разработке и испытанию иммунофер ментных тест-систем на основе непрямого варианта ИФА явились основани ем для создания коммерческих наборов для выявления в ИФА антител к воз будителям инфекционных болезней птиц. Производство наборов для ИФА представляет собой сложный комплекс взаимосвязанных физических, хими ческих и биологических процессов, включающих разнотипное оборудование и образующих единую технологическую линию (рис.8).
2.2.6.1. Разработка технологии и организация производства ком мерческих наборов и контроль качества с внедрением автоматизирован ных роботизированных устройств В настоящее время в ФГУ «ВНИИЗЖ» выпускается свыше 20 наимено ваний коммерческих наборов для серологической диагностики наиболее зна чимых для промышленного птицеводства болезней. Ключевым моментом при изготовлении наборов на основе непрямого варианта ИФА является подго товка сенсибилизированных антигенами планшетов, поскольку состояние иммобилизованных на планшетах антигенов непосредственно влияет на ре зультативность теста.
Был проведен сравнительный анализ технических характеристик при боров и устройств ведущих фирм-производителей оборудования. Автомати зированный комплекс в виде раскапывающей рабочей станции вместе с дру гими периферическими устройствами фирмы «Tecan» (Австрия) интегриро вали в технологический цикл производства коммерческих наборов ФГУ «ВНИИЗЖ» (рис.5). При этом для проведения и контроля различных этапов сенсибилизации планшетов было разработано программное обеспечение. Бы ло проведено испытание точности внесения разных объемов растворов в лун ки трех планшетов. Сравнение теоретической и реальной массы выбранных объемов показало, что их совпадение составило: для 15 мкл — 96,83 %, 50 мкл — 98,36 % и 100 мкл — 99,35 %., т.е. чем объем был меньше, тем ни же была точность их внесения в лунки. Коэффициент вариации между нако нечниками был очень низким (0,29%), что подтверждало высокую точность модуля.
Рис. 5. Стадии основного технологического процесса при изготовлении диагностических наборов В результате для приготовления планшетов серии наборов одного на именования (в среднем 100 наборов из 200 планшетов) требовалось, в общей сложности, в 3-4 раза меньше времени и трудозатрат по сравнению с «руч ным» способом. Для проверки иммуноспецифических компонентов готовых серий наборов на активность и специфичность с панелью контрольных сыво роток использовали раскапывающую станцию Freedom EVO 150-8. Экспери менты показали, что роботизация отдельных стадий ИФА значительно увели чивает скорость, точность, качество и вопроизводимость результатов теста.
При внедрении роботов на стадии отбора проб, перемешивания, приго товления рабочего разведения, переноса на планшет с антигеном, отмывки, внесения других компонентов реакции производительность повышалась в раза.
2.2.6.2. Проведение оценки качества лабораторных исследований с использованием разработанных тест-систем в международных сравни тельных испытаниях, организованных референтными лабораториями Лаборатория R&D; GD (Dutch Animal Health Service, Deventer, Нидер ланды) официально аккредитована в соответствии с международными требо ваниями ILAC-G13:2007 для проведения международных сравнительных ис пытаний (МСИ) по болезням птиц.
Начиная с 2006 года, ФГУ «ВНИИЗЖ» (единственный в Российской Федерации) участвовал в испытаниях, проводимых GD лабораторией по вы явлению антител к возбудителям НБ, ГП, ИББ, ИБК, МГ, МС в зашифрован ных пробах сывороток крови кур. Помимо основной задачи - оценки возмож ностей отечественных коммерческих иммуноферментных наборов при диаг ностике болезней птиц, определяются пути решения вопросов, связанных с улучшением их качества. В испытаниях принимали участие от 48 лаборато рий (в МСИ по ИБК) до 60 лабораторий (в МСИ по НБ) из более чем 30 стран Африки, Азии, Центральной Америки, Европы. Следует отметить, что прак тически все лаборатории, включая ФГУ «ВНИИЗЖ», правильно определяли статус сывороток от СПФ-кур во всех МСИ, показывая высокую специфич ность используемых диагностических наборов. С применением коммерческих наборов, созданных на основе разработанных тест-систем, выявлялось от 75% (в МСИ по ИБК) до 87,5 % (в МСИ по МС) проб сывороток с разным уров нем специфических антител. В ходе международных сравнительных испыта ний было выявлено, что, в основном, затруднения возникали при определе нии статуса сывороток крови, отобранных на ранних сроках (7 суток) после иммунизации живыми вакцинами. Судя по отчетам, присылаемым лаборато рией-организатором, такие же проблемы, в большей или меньшей степени, испытывали участники, работавшие с наборами других производителей (IDEXX, Synbiotics, BioChek).
Таким образом, результаты проведенного внешнего контроля по оцен ке качества исследований показали, что наборы производства ФГУ «ВНИИЗЖ» дают достоверные результаты при проведении диагностических исследований.
2.2.7. Внедрение системы комплексной серологической диагностики болезней кур на основе ИФА в промышленное птицеводство Перед нами стояла цель создать комплексную систему серологического мониторинга при определении иммунного статуса птицы и внедрить ее в ла боратории птицеводческих хозяйств. Для опытно-промышленного производ ства коммерческих наборов была подготовлена научно-техническая докумен тация и регламенты. В настоящее время Россельхознадзором утверждены СТО и технический регламент на изготовление свыше 20 диагностических наборов, что позволило наладить их серийное производство.
В течение нескольких лет проводили тестирование существующих на рынке спектрофотометров-ридеров, отмывочных устройств, автоматических дозаторов и расходных материалов как отечественного, так и зарубежного производства, что позволило выбрать оптимальную конфигурацию формиро вания комплектов для постановки ИФА в условиях птицеводческих ветери нарных лабораторий.
В течение 14 лет (1995-2009 гг.) было укомплектовано оборудованием для ИФА свыше диагностических лабораторий научно исследовательских учреждений, диагностических центров, республиканских, краевых, областных ветеринарных лабораторий, а также птицефабрик Рос сии, Р. Беларусь, Украины, Молдовы, Узбекистана, Грузии, Казахстана и Ар мении (рис.6).
Внедрение системы комплексной серологической диагностики на осно ве автоматизированного иммуноферментного анализа для выявления и коли чественной оценки специфических антител к возбудителям экономически значимых инфекционных болезней кур (НБ, ГП, ИББ, ИБК, ССЯ-76, РВП, ИЭП, МГ, МС) позволяет птицеводческим предприятиям отслеживать эпизо отическую ситуацию по наиболее опасным болезням, оценивать напряжен ность поствакцинального иммунитета, оптимизировать схемы вакцинации, что в конечном счете дает возможность повысить сохранность птицепоголо вья.
Рис.6. Регионы России и стран СНГ, где установлены комплекты оборудования и программное обеспечение «СИНКО-ИФА» 3. ВЫВОДЫ 1. Создана система комплексного серологического мониторинга инфек ционных болезней кур в промышленном птицеводстве с применением имму ноферментных тест-систем и компьютерного обеспечения для получения, об работки, учета и хранения данных.
2. Усовершенствованы методики очистки и концентрирования антигенов НБ, ГП, ИБК, ИББ, ССЯ-76, ИЭП, РВП, МГ, МС, используемых в качестве компонентов иммуноферментных тест-систем, определены условия получе ния под контролем электронной микроскопии и электрофореза вирусных белков, при которых выход очищенных препаратов антигенов составлял 1- мг/см3.
3. Отработаны схемы иммунизации кур для получения контрольных по ложительных сывороток с активностью препаратов не менее 1:3200, опреде лены допустимые значения оптических плотностей контрольных сывороток при постановке реакции в одном разведении, находящиеся в диапазоне 0,4 1,050 для положительных контролей и 0,04-0,160 для отрицательных сыворо ток.
4. Разработаны иммуноферментные тест-системы для выявления и коли чественного определения уровня специфических антител к возбудителям НБ, ГП, ИБК, ИББ, ССЯ-76, ИЭП, РВП, МГ, МС в сыворотках крови кур при их тестировании в одном разведении: определены оптимальные концентрации (для антигенов, конъюгата) и условия взаимодействия компонентов реакции;
выбрано рабочее разведение тестируемых сывороток (1:400), установлены критерии качественной и количественной оценки результатов, выведены уравнения линейной регрессии и определены коэффициенты для формулы расчета числового значения титра по одному разведению испытуемых сыво роток.
5. Проведен сравнительный анализ результатов, полученных при иссле довании свыше 3000 проб сывороток с помощью разработанных тест-систем ИФА, базовой реакции РТГА и коммерческих наборов производства фирмы Synbiotics (KPL, США), зарегистрированных на территории РФ. Корреляция составила от 84% до 96 %, относительная чувствительность – от 89% до 98 % и относительная специфичность – от 79% до 94%.
6. За период с 1998 по 2008 гг. разработанные тест-системы проверены при исследовании проб сывороток крови кур из более чем 500 птицехозяйств РФ и других стран СНГ для оценки иммунного статуса поголовья при кон троле трансовариального, поствакцинального иммунитета против возбудите лей экономически значимых болезней кур в промышленном птицеводстве.
7. На основе разработанных иммуноферментных тест-систем для выяв ления и количественного определения уровня антител к возбудителям вы бранных болезней птиц в сыворотках крови кур при их тестировании в одном разведении разработана и утверждена Россельхознадзором научно техническая документация и регламенты для опытно-промышленного произ водства 16 наименований коммерческих наборов в двух вариантах: для визу альной детекции ( на 40 проб) и инструментального учета ( на 180 проб).
8. Создана и зарегистрирована в Российском агенстве по патентам и то варным знакам универсальная компьютерная программа «СИНКО-ИФА» для сбора, анализа и хранения результатов ИФА с учетом возможности работы с иммуноферментными наборами, разработанными в ФГУ «ВНИИЗЖ» и зару бежных фирм-производителей.
9. Разработана технология, организовано опытно-промышленное про изводство и оптимизирован контроль качества 16 коммерческих наборов с внедрением автоматизированных роботизированных устройств.
10. Проведена оценка качества лабораторных исследований с использо ванием разработанных тест-систем в 8 международных сравнительных испы таниях, проводимых аккредитованной референтной лабораторией (Голлан дия) и установлено, что статус зашифрованных проб определяется не менее чем в 75 %.
11. В ветеринарных лабораториях и на птицефабриках РФ внедрена комплексная система серологической диагностики, основанная на постоян ном мониторинге иммунного статуса птицы разного возраста, с использова нием наборов для ИФА, комплекта стандартизированного оборудования для постановки реакции и компьютерной программы для обработки и хранения полученных результатов анализа. В РФ и странах СНГ установлено и исполь зуется свыше 100 комплектов оборудования с универсальной компьютерной программой.
4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ Методики, разработанные в ходе научно-исследовательских работ по теме диссертации, включены в два сборника: “Методические указания по ди агностике заболеваний сельскохозяйственных животных иммуноферментным методом” (1998 г.) и “Методические указания по диагностике заболеваний сельскохозяйственных животных и птиц с использованием серологических реакций” (2008 г.), утвержденные Россельхознадзором в качестве пособия для работников ветеринарных диагностических лабораторий.
Результаты экспериментальной работы вошли в нормативные докумен ты по изготовлению и контролю 16 наборов для ИФА, утвержденных Рос сельхознадзором МСХ РФ: наборы для определения антител к вирусу нью каслской болезни иммуноферментным методом (СТО 00495527-0054-2006 от 29.12.2006) и при тестировании сывороток в одном разведении (СТО 00495527-0043-2006 от 27.06.2007);
наборы для определения антител к вирусу инфекционного бронхита кур иммуноферментным методом (СТО 00495527 0055-2006 от 29.12.2006) и при тестировании сывороток в одном разведении (СТО 00495527-0042-2006 от 27.06.2007);
наборы для определения антител к вирусу инфекционной бурсальной болезни иммуноферментным методом (СТО 00495527-0057-2006 от 29.12.2006) и при тестировании в одном разве дении (СТО 00495527-0044-2006 от 27.06.2007);
наборы для определения ан тител к реовирусу птиц иммуноферментным методом (СТО 00495527-0045 2006 от 21.11.2008) и при тестировании сывороток в одном разведении (ТУ 9388-133-00495527-2005 от 15.02.2006);
наборы для определения антител к вирусу синдрома снижения яйценоскости кур иммуноферментным методом (СТО 00495527-0056-2006 от 29.12.2006) и при тестировании сывороток в од ном разведении (СТО 00495527-0041-2006 от 27.06.2007);
наборы для опре деления антител к вирусу инфекционного энцефаломиелита птиц иммуно ферментным методом (СТО 00495527-0038-2006 от 29.12.2006) и при тести ровании сывороток в одном разведении (ТУ 9388-117-00495527-2005 от 30.05.2006);
наборы для определения антител к возбудителю респираторного микоплазмоза (Mycoplasma gallisepticum) иммуноферментным методом (СТО 00495527-0109-2009 от 31.03.2009) и при тестировании сывороток в одном разведении (СТО 00495527-0111-2009 от 31.03.2009);
набор для определения антител к Mycoplasma synoviae иммуноферментным методом при тестирова нии сывороток в одном разведении (СТО 00495527-0034-2006 от 29.12.2006);
набор для определения антител к вирусу гриппа птиц иммуноферментным методом при тестировании сывороток в одном разведении (СТО 00495527 0086-2008 от 09.12.2008).
На базе ФГУ «ВНИИЗЖ» внедрена разработанная технология произ водства коммерческих наборов для ИФА в промышленном масштабе с при менением автоматизированных роботизированных устройств. В течение с 1997 по 2009 г.г. было произведено около 21000 наборов для визуальной де текции и свыше 8000 наборов для исследований проб в одном разведении (СИНКО), которые использовались в региональных, областных ветеринарных лабораториях и на птицефабриках.
5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Публикации в изданиях, рекомендованных перечнем ВАК РФ 1. Мудрак Н.С., Дрыгин В.В. Создание иммуноферментных тест систем для серологической диагностики в птицеводстве с применением ком пьютерной программы для учета, обработки и хранения результатов анализа // Ветеринарная патология. – 2006. – № 4 (19). – С. 165-168.
2. Мудрак Н.С. Применение роботизированных автоматических уст ройств в производстве диагностикумов и при проведении ИФА // Российский ветеринарный журн. С.-х. животные. Спец. вып., посвящ. 50-летию ФГУ «ВНИИЗЖ». – 2008. - Сент. – С. 74-78.
3. Мудрак Н.С. Разработка и внедрение комплексной системы сероло гической диагностики болезней птиц в ИФА с компьютерным обеспечением // Российский ветеринарный журн. С.-х. животные. Спец. вып., посвящ. 50 летию ФГУ «ВНИИЗЖ». – 2008. – Сент. – С. 78-80.
4. Иммунитет у кур, привитых инактивированной ассоциированной вакциной / В.Н. Ирза, В.В. Борисов, A.В. Борисов, С.К. Старов, О.А. Борисо ва, Н.С. Мудрак, Н.П. Курлова, А.Б. Сарбасов, Г.И. Кожаева // Ветеринария.
– 2002. – № 4. – С. 21-23.
5. Серологический мониторинг птицехозяйств Российской Федерации по ареовирусной инфекции и синовиальному микоплазмозу / А.И. Куприянов, И.А. Волкова, Н.С. Мудрак, В.В. Шкиря, В.Н. Ирза, С.К. Старов, В.В. Дры гин // Аграрная Россия. – 2002. – № 2. – С. 20-24.
6. Комплексное использование серологических методов для обнаруже ния антител к вирусу гриппа птиц Н5 в сыворотках крови диких и домашних птиц / Н.Н. Луговская, М.А. Циванюк, С.В. Фролов, Н.С. Мудрак, В.В. Дры гин, А.В. Борисов // Ветеринарная патология. – 2006. – №4 (19). – С. 58-62.
7. Формирование гуморального иммунитета к вирусу инфекционного энцефаломиелита у цыплят, вакцинированных живой вакциной из штамма «CALNEK 1143M» / А.Э. Меньщикова, А.Н. Колотилов, Н.В. Беляева, В.Н.
Ирза, В.Н. Решетникова, Н.С. Мудрак // Ветеринарная патология. – 2006. – № 4 (19). – С. 137-139.
8. Определение генотипа и степени патогенности изолята вируса ин фекционного бронхита / О.Н. Чупина, Е.В. Овчинникова, Л.О. Щербакова, Н.С. Мудрак, В.И. Диев, А.В. Борисов // Ветеринарная патология. – 2007. – № 4 (23). – С. 121-126.
9. Разработка конкурентного варианта ИФА для выявления антител к вирусу гриппа подтипа Н5 у различных видов птиц / М.А. Циванюк, Н.Н. Лу говская, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин, Е.В. Белик // Ветеринарная патология. 2007. - №4 (23). - С. 126-132.
10. Непрямой вариант ИФА для выявления и количественного опреде ления антител к вирусу гриппа птиц при тестировании проб в одном разведе нии / М.А. Циванюк, Н.Н. Луговская, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин, Е.В. Белик // Ветеринарная патология. - 2007. - № 4 (23). - С. 132-137.
11. Оценка иммунобиологических свойств изолятов Mycoplasma galli septicum с использованием трахеальных органных культур / И.А. Рунина, О.Н.
Чупина, М.И. Сорокина, Д.Б. Андрейчук, А.В. Спрыгин, Н.С. Мудрак, В.В.
Дрыгин, В.Н. Ирза // Ветеринарная патология. - 2007. - № 4 (23). - С. 171-174.
12. Получение специфических антисывороток и антигенов вируса бо лезни Марека для иммуноферментного анализа / М. А. Волкова, М. И. Шуль пин, Л.О. Щербакова, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин, Ш.К. Куляшбекова // Рос сийский ветеринарный журн. С.-х. животные. Спец. вып., посвящ. 50-летию ФГУ "ВНИИЗЖ". - 2008. - Сент. - С. 69-72.
13. Случай выделения вируса гриппа А подтипа H4N6 в популяциях синантропных птиц в Российской Федерации / И.А. Чвала, А.В. Андриясов, Н.С. Мудрак, В.В. Борисов, В.В. Дрыгин, Л. Ю. Абрамова // Ветеринария. 2009. - №10. - С. 19- 14. Особенности течения гриппа А у уток-крякв, вызванного A/chicken/Primorsky/85/08 H5N1 / И.А. Чвала, Л.О. Щербакова, М.И. Шуль пин, Ю.Ю. Бабин, А.В. Варкентин, М.Ю. Щелканов, Н.С. Мудрак, А.В. Бо рисов, В.В. Дрыгин, Л.Ю. Абрамова, Н.А. Власов // Ветеринария. - 2009. - № 10. - С. 25-26.
15. Detection of antibodies to avian infectious bronchitis virus by a recombi nant nucleocapsid protein-based enzyme-linked immunosorbent assay / N.N. Lou govskaia, A.V. Scherbakov, A.S. Yakovleva, M.A. Tsyvanyuk, N.S. Mudrak, V.V. Drygin A.V. Borisov // J. Virology Methods. – 2006. – Vol. 135. – P. 292 296.
16. Detection and estimation of avian infetious bronchitis virus antigen by a novel indirect liquid-phase blocking enzyme-linked immunosorbent assay using chicken and rabbit affinity purified immunoglobulins / N.N. Lougovskaia, A.A.
Lougovskoi, Y.A. Bochkov, G.V. Batchenko, N. S. Mudrak, V.V. Drygin, A.V.
Borisov, V.V. Borisov // Avian Pathology. – 2002. – Vol. 31, № 6. – P. 549-557.
17. Облучатель рециркулятор ОРУБ-01»КРОНТ» для обеззараживания воздуха в лабораториях ветеринарного профиля / А.В. Спрыгин, И.А. Рунина, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин // Ветеринария. – 2006. – № 9. – С. 36-37.
18. Оценка иммунного ответа у цыплят, привитых мукозальными вак цинами против ньюкаслской болезни / М.А. Волкова, А.В. Ирза, И.А. Рунина, С.В. Фролов, М.Е. Качалова, И.А. Чвала, Е.И. Чубукова, Н.С. Мудрак, В.В.
Борисов, В.В. Дрыгин // Ветеринария. – 2009. – № 10. – С. 20-25.
19. Genetic diversity of Mycoplasma gallisepticum field isolates using partial sequencing of the pvpA gene fragment in Russia / A.V. Sprygin, D.B. Andreychuk, N.P. Elatkin, N.G. Zinyakov, S.N. Kolosov, N.S. Mudrak, V.N. Irza, V.V. Drygin, A.V. Borisov, N.A. Perevozchikova // Avian Diseases. - 2010. - Vol. 54. - P. 899 904.
20. Development of a duplex real-time Tag-Man PCR assay with an internal control for the detection of Mycoplasma gallisepticum and Mycoplasma synoviae in clinical samplex from commercial and backyard poultry / A.V. Sprygin, D.B. An dreychuk, A. N. Kolotilov, M.S. Volkov, I.A. Runina, N.S. Mudrak, A.V. Borisov, V.N. Irza, V.V. Drygin, N.A. Perevozchikova // Avian Pathology. - 2010. - Vol. 39, N 2. - P. 99-109.
21. Выделение аденовирусов 1 группы методом перемежающихся пас сажей / С.П. Лазарева, А.В. Ирза, М.И. Шульпин, Б.Л. Манин, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин // Ветеринарная патология. - 2007. - № 4 (23). - С. 158-162.
22. Непрямой блокирующий вариант иммуноферментного анализа для определения аденовирусов птиц 4 серотипа / М.А. Волкова, В.А. Лобанов, Г.В. Батченко, Н.С. Мудрак, Д.С. Сурнев, В.В. Дрыгин, В.В. Борисов // Ве теринария. – 2003. – № 11. – С. 18-22.
Патенты и свидетельства 23. Набор для определения антител к вирусу синдрома снижения яйце носкости-76 кур: пат. 2167673 Российская Федерация: МПК7 A61K 39/00 / А.В. Борисов, В.Н. Кузнецов, А.А. Гусев, В.В. Дрыгин, Н.С. Мудрак, В.В.
Борисов;
заявитель и патентообладатель ФГУ «ВНИИЗЖ». – Заявл.
04.09.2000;
опубл. 27.05.2001, Бюл. № 15.
24. Набор для определения антител к вирусу инфекционной бурсальной болезни птиц: пат. 2192014 Российская Федерация: МПК7 G01N 33/545 / А.В.
Борисов, В.Н. Кузнецов, А.А. Гусев, В.В. Дрыгин, Н.С. Мудрак, Т.В. Оковы тая;
заявитель и патентообладатель ФГУ «ВНИИЗЖ». – Заявл. 05.02.2001;
опубл. 27.10.2002, Бюл. № 30.
25. Набор для определения антител к вирусу инфекционного бронхита кур: пат. 2189042 Российская Федерация: МПК7 G01N 33/545 / А.В. Борисов, В.Н. Кузнецов, А.А. Гусев, В.В. Дрыгин, Н.С. Мудрак, Н.Н. Луговская, С.В.
Фролов;
заявитель и патентообладатель ФГУ «ВНИИЗЖ». – Заявл.
02.03.2001;
опубл. 10.09.2002, Бюл. № 25.
26. Программа для регистрации, обработки, хранения результатов им муноферментного анализа в ветеринарии / А.А. Гусев, В.В. Дрыгин, Н.С.
Мудрак, Ю.В. Зинковский, С.Н. Колосов. – Свидетельство об официальной регистрации программы для ЭВМ № 2000611338. – М., 2000.
Публикации в других изданиях 27. Оптимизация условий постановки непрямого твердофазного ИФА для выявления антител к вирусу инфекционной бурсальной болезни / Т.В.
Оковытая, К.Ю. Федосеев, Л.О. Щербакова, Н.С. Мудрак, А.В. Борисов // Вирусные болезни с.-х. животных: тез.докл. Всерос. научн.-практ. конф. Владимир, 1995. - С. 245.
28. Расчет титра сывороток по одному разведению при иммунофер ментной диагностике инфекционного бронхита кур / Н.Н. Луговская, Н.С.
Мудрак, А.В. Борисов, В.В. Дрыгин // Проблемы инфекц. патологии с.-х.
животных: тез. докл. конф., посвящ. 100-летию открытия вируса ящура. Владимир, 1997. - С. 161.
29. Оптимизация условий постановки непрямого твердофазного ИФА для выявления антител к вирусу инфекционного бронхита кур / Н.Н. Лугов ская, Н.С. Мудрак, А.В. Борисов, В.В. Дрыгин // Проблемы инфекц. патоло гии с.-х. животных: тез. докл. конф., посвящ. 100-летию открытия вируса ящура. – Владимир, 1997. – С. 160.
30. Оптимизация метода выделения и очистки вируса болезни Ньюкас ла / О.Г. Грибанов, Н.С. Мудрак, И.Я. Курман, Н.Н. Дрягалин // Проблемы инфекц. патологии с.-х. животных: тез. докл. конф., посвящ. 100-летию от крытия вируса ящура. – Владимир, 1997. – С. 164.
31. Количественная оценка концентрации антител к вирусу инфекцион ной бурсальной болезни в сыворотках крови кур по одному разведению в иммуноферментном тесте / Т.В. Оковытая, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин, А.В.
Борисов // Проблемы инфекц. патологии с.-х. животных: тез. докл. конф., по свящ. 100-летию открытия вируса ящура. - Владимир, 1997. - С. 162-163.
32. Антигенные, иммуногенные и реактогенные свойства живой сухой вакцины против инфекционного бронхита кур / А.В. Борисов, А.А. Гусев, С.В. Фролов, Н.С. Мудрак, Т.В. Хлыбова, Т.В. Никитина // Проблемы ин фекц. патологии с.-х. животных: тез. докл. конф., посвящ. 100-летию откры тия вируса ящура. - Владимир, 1997. - С. 147-148.
33. Сравнительная оценка ИФА и РЗГА в диагностике синдрома сни жения яйценоскости / М.А. Волкова, О.А Борисова, Н.С. Мудрак, Т.И.Назарова, В.В. Борисов, В.В. Дрыгин // Проблемы инфекц. патологии с. х. животных: тез. докл. конф., посвящ. 100-летию открытия вируса ящура. Владимир, 1997. - С. 158.
34. Разработка иммуноферментной тест-системы для количественного определения антител к вирусу ССЯ-76 в сыворотках крови кур методом одно го разведения / М.А. Волкова, Н.С. Мудрак, В.В.Борисов, В.В.Дрыгин // Со временные аспекты ветеринарной патологии животных: материалы конф., посвящ. 40-летию ВНИИЗЖ. – Владимир, 1998. – С. 224-235.
35. Сравнительная оценка пассивного иммунитета против ИББ у цып лят, полученных от непривитых и вакцинированных кур / С.А. Гусев, Т.В.
Оковытая, Н.С. Мудрак, А.В. Борисов, К.Ю. Федосеев, З.Я. Михалишина, М.В. Гирин, А.А. Гусев, В.В. Дрыгин // Современные аспекты ветеринарной патологии животных: материалы конф., посвящ. 40-летию ВНИИЗЖ. - Вла димир, 1998. - С. 192-196.
36. Расчёт титра антител в сыворотках крови кур при тестировании в одном разведении для иммуноферментной диагностики ССЯ-76 / М.А. Вол кова, Н.С. Мудрак, О.А. Борисова, В.В. Борисов, В.В. Дрыгин // Производ ство и контроль мед., ветеринарных препаратов, опыт применения и реализа ция их в странах СНГ: тез. докл. конф., посвящ. 30-летию ПЗБ. - Вольгин ский, 1999. - С. 83.
37. Изучение антигенной активности ассоциированной инактивирован ной вакцины против ССЯ-76, ИБ и ИББ у кур / О.А. Борисова, В.В. Борисов, Н.С. Мудрак, С.А. Гусев, А.В. Борисов, З.Я. Михалишина // Производство и контроль мед., ветеринарых препаратов, опыт применения и реализации их в странах СНГ: тез.докл. конф., посвящ. 30-летию ПЗБ. - Вольгинский, 1999. С. 53.
38. Получение антигена реовирусной инфекции птиц для постановки непрямого варианта ИФА / А.И. Куприянов, Д.Б. Андрейчук, Н.С. Мудрак, Г.М. Фалина, С.К. Старов, В.В. Дрыгин // Актуальные проблемы патологии с.-х. животных: материалы междунар. науч.-практ. конф. - Минск, 2000. - С.
131-132.
39. Разработка непрямого варианта ИФА для количественного опреде ления антител к возбудителю ареовирусной инфекции в сыворотках крови кур методом одного разведения / А.И. Куприянов, Н.С. Мудрак, С.К. Ста ров, В.В. Дрыгин // Достижения молодых ученых - в ветеринарную практику (Материалы конф. молодых ученых). - Владимир, 2000. - С. 173-179.
40. Разработка иммуноферментной тест-системы для определения ан тител к вирусу инфекционного бронхита кур / Н.Н. Луговская, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин, С.В. Фролов, А.В. Борисов, В.В. Борисов // Достижения моло дых ученых - в ветеринарную практику (Материалы конф. молодых ученых).
- Владимир, 2000. - С. 140-144.
41. Разработка иммуноферментной тест-системы для выявления и ко личественной оценки антител к вирусу ньюкаслской болезни методом одного разведения / Т.Б.Манин, Н.С. Мудрак, С.К. Старов, В.В. Дрыгин, М.И. Мар кина // Достижения молодых ученых - в ветеринарую практику (Материалы конф. молодых ученых). - Владимир, 2000. - С. 165-170.
42. Применение набора по определению антител к вирусу инфекцион ного бронхита кур иммуноферментным методом при тестировании сывороток в одном разведении для контроля материнского иммунитета и поствакци нального иммунитета / Н.Н. Луговская, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин, А.В. Бо рисов // Достижения молодых ученых - в ветеринарную практику (Материалы конф. молодых ученых). - Владимир, 2000. - С. 150-155.
43. Набор для определения антител к вирусу инфекционного бронхита кур: специфичность, чувствительность, воспроизводимость результатов, ста бильность антигена при хранении / Н.Н. Луговская, Н.С. Мудрак, В.В. Дры гин, А.В. Борисов // Достижения молодых ученых - в ветеринарную практику (Материалы конф. молодых ученых). - Владимир, 2000. - С. 145-150.
44. Компьютерная программа «Иммуноферментный анализ» / Ю.В.
Зинковский, С.Н. Колосов, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин // Достижения моло дых ученых - в ветеринарную практику (Материалы конф. молодых ученых).
- Владимир, 2000. - С. 197-198.
45. Выбор оптимальных условий очистки антигена возбудителя респи раторного микоплазмоза птиц для непрямого варианта ИФА / И.А. Волкова, Н.С. Мудрак, М.В. Гирин, В.В. Дрыгин // Достижения молодых ученых - в ветеринарную практику (Материалы конф. молодых ученых). - Владимир, 2000. - С. 200-201.
46. Разработка диагностической тест-системы на основе непрямого ва рианта ИФА и ее применение для эпизоотологического мониторинга реови русной инфекции птиц / А.И. Куприянов, Н.С. Мудрак, В.И. Шкиря, С.К.
Старов, В.В. Дрыгин // Роль ветеринарной науки в развитии животноводства:
материалы Междунар. науч.-произв. конф. – Алматы, 2000. – С. 124-126.
47. Применение иммуноферментной тест-системы для выявления и оценки антител к вирусу ньюкаслской болезни для контроля напряженности поствакцинального иммунитета / Т.Б. Манин, Н.С. Мудрак, С.К. Старов, В.В. Дрыгин // Роль ветеринарной науки в развитии животноводства: мате риалы Междунар. науч.-произв. конф. – Алматы, 2000. – С. 144-146.
48. Контроль иммунного статуса поголовья кур на птицефабриках с применением иммуноферментного набора для определения антител к вирусу инфекционного бронхита / Н.Н. Луговская, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин, А.В.
Борисов // Роль ветеринарной науки в развитии животноводства: материалы Междунар. науч.-произв. конф. – Алматы, 2000. – С. 137-138.
49. Изучение основных характеристик иммуноферментного набора для определения антител к вирусу инфекционного бронхита / Н.Н. Луговская, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин, С.В. Фролов, А.В. Борисов // Роль ветеринарной науки в развитии животноводства: материалы Междунар. науч.-произв. конф.
– Алматы, 2000. – С. 141-142.
50. Определение напряженности иммунитета против ньюкаслской бо лезни с помощью непрямого варианта ИФА и РТГА / Т.Б. Манин, Н.С. Муд рак, С.К. Старов, В.В. Дрыгин // Диагностика, профилактика и меры борьбы с особо опасными, экзот. и зооантропоноз. болезнями животных: Сб. статей Междунар. науч.-практ. конф. – Покров, 2000. – С. 170-172.
51. Сравнительная оценка РТГА и непрямого варианта ИФА при опре делении антител к Mycoplasma gallisepticum / И.А. Волкова, Н.С. Мудрак, М.В. Гирин, В.В. Дрыгин, А.В. Борисов // Совершенствование методов кон троля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов: тез. докл. – М., 2001. – С. 123-124.
52. Разработка тест-системы на основе непрямого варианта ИФА для определения антител к Mycoplasma gallisepticum при тестировании сывороток в одном разведении / И.А. Волкова, Н.С. Мудрак, В.В. Дрыгин, М.В. Гирин, А.В. Борисов, В.Н. Ирза // Ученые записки Витебской гос. акад. ветеринар ной медицины. – Витебск, 2001. – Т. 37, Ч. 2. – С. 23-24.
53. Применение коммерческих тест-систем на основе РТГА и ИФА для выявления антител и оценки поствакцинального иммунитета к вирусу нью каслской болезни / Т.Б. Манин, Н.С. Мудрак, С.К. Старов, Н.Н. Дрягалин, Г.И. Кожаева, Т.Л. Лядская, В.В. Дрыгин // Проблеми зооiнженерii та ветеринарноi медицини: зб. наук. праць «Ветеринарнi науки». – Вип. 7(31).
Материалi 5-го з`iзду паразитоценологiв в Украiни. – Харкiв, 2001. – С. 122 125.