Наноформы бактерий в системе почва - растение
На правах рукописи
Ванькова Анна Андреевна Наноформы бактерий в системе «почва - растение» Специальность 03.02.03. – микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Москва 2013
Работа выполнена на кафедре микробиологии и иммунологии факультета почвоведения, агрохимии и экологии Российского государственного аграрного университета - Московской сельскохозяйственной академии имени К.А.Тимирязева Научные консультанты: доктор биологических наук, профессор Емцев Всеволод Тихонович доктор биологических наук, профессор Шильникова Викторина Кузьминична
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, доцент кафедры биологии почв МГУ им. М.В.Ломоносова Лысак Людмила Вячеславовна доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Института физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН Ананьева Надежда Дмитриевна доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией молекулярной фитопатологии Центра «Биоинженерия» РАН Игнатов Александр Николаевич
Ведущая организация: Институт микробиологии имени С.Н. Виноградского РАН
Защита состоится 13 ноября 2013г. в 14.30 на заседании диссертационного совета Д 220.043.03 при Российском государственном аграрном университете – МСХА имени К. А. Тимирязева по адресу: 127 550, Москва, ул. Прянишникова, 15.(тел./факс:8 (499) 976 24 92) [email protected].
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева.
Автореферат разослан 11 октября 2013г.
Ученый секретарь диссертационного совета, О.В.Селицкая кандидат биологических наук
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Глобальные проблемы ХХI-го столетия – ограниченность энергетических, пищевых, сырьевых ресурсов, загрязнение окружающей среды – способствуют тому, что мысль человека все больше обращается к микроорганизмам, как мощным и многообразным каталитическим системам, способным трансформировать вещества различной природы при относительно небольших затратах энергии и «наличии у них могущественной химической силы» (Вернадский, 1987).
Почвенная микробиология на современном этапе развития решает ряд фундаментальных проблем: участие микроорганизмов в круговороте веществ и превращении энергии в биосфере, роль микроорганизмов в почвообразовательных процессах, взаимодействие микроорганизмов и растений, охрана почв, управление микробными популяциями в почве и др.
Одно из важнейших фундаментальных направлений почвенной микробиологии – исследование биоразнообразия микроорганизмов. Вопрос об исследовании почвенных микроорганизмов, как жизненно необходимых для функционирования и саморегулирования биосферы Земли, особенно остро был поставлен после проведения в Мексике в 1994г. Международного конгресса почвоведов «Почвы и биоразнообразие» (Добровольский, 1996;
Tate, 1997), где почву рассматривали как среду обитания, генератор и хранитель жизни на Земле. «Почвы являются живыми, динамическими, сложными, комплексными системами» (Чернов и др., 2011), обладающими исключительным биологическим разнообразием. Внедрение молекулярных методов исследования в последние десятилетия существенно изменило традиционное представление о микробном разнообразии почв. Было показано, что в 1г почвы может находиться более 10 млрд микробных клеток – от нескольких тысяч до миллиона геномных видов, при том что к настоящему времени охарактеризовано не более 5тыс. видов. Только 0,1 – 1% микроорганизмов почвы представлены культивируемыми видами (Torsvilk et al., 1996). Одним из основных достижений в области изучения биоразнообразия является выявление группы архей как самостоятельного домена живых организмов (Woese et al., 1997;
Воробьева, 2007).
В проблеме биоразнообразия определенное место занимают наноформы (НФ) почвенных бактерий. Проблема существования бактерий в почве в виде НФ, размеры которых значительно меньше размеров обычных бактерий и сопоставимы с размерами вирусов, имеет длительную историю (Новогрудский, 1933, 1935;
Красильников, 1934, 1954;
Никитин, 1964;
Ананьева и др., 1979;
Baath, 1992;
Bae et al., 1972;
Bakken, 1985;
Casida, 1969;
Morita, 1985;
Гузев и др., 2003;
Panikov, 2005;
Дмитриев и др., 2008, Лысак, 2010;
Дуда и др., 2012).
Однако, до сих пор физиологические особенности, таксономия и экологические функции этих бактерий практически не изучены в связи с определенными 1 методическими трудностями. Между тем, знание указанных особенностей необходимо для понимания закономерностей функционирования микробного сообщества почвы. Кроме того, среди представителей НФ встречаются возбудители заболеваний растений, животных и человека, например, микоплазмы или L - формы патогенных бактерий. Эти ультрамикроскопические бактерии традиционно служат объектом пристального внимания медиков, ветеринаров и фитопатологов, но до сих пор не попадали в поле зрения экологов и почвенных микробиологов. Поэтому, вопросы, связанные с их обитанием в почве и циркуляцией в биоценозе остаются практически не изученными.
В связи с вышеизложенным целью работы было изучение численности и разнообразия НФ бактерий в почве и корневой зоне растений, их участия в почвенных процессах и взаимодействия с растениями.
Задачи исследования:
1. Разработка новых методических подходов к изучению НФ бактерий в почве.
2. Исследование динамики численности и разнообразия НФ бактерий в дерново- подзолистой почве и корневой зоне растений люцерны.
3. Изучение влияния железоокисляющих микоплазм на свойства лугово черноземной почвы под культурой риса.
4. Оценка почвы как возможной среды обитания фитопатогенных микоплазм (на примере Acholeplasma laidlawii).
5. Изучение особенностей взаимодействия микоплазм (A. laidlawii) и растений.
Научная новизна. Впервые проведено сравнительное изучение численности мелких и крупных форм бактерий в почве, ризосфере и ризоплане растений. Экспериментально показано, что значительная часть бактерий в дерново-подзолистой почве и корневой зоне растений люцерны имеет ультрамикроскопически малые размеры – средний диаметр клеток составляет 0,31±0,22мкм, длина – 0,55±0,27мкм. Доля НФ от общего числа бактерий в почве в среднем за исследуемый период составляет 65%, в ризосфере и ризоплане – 37% и 43% соответственно. Численность НФ в почве, их процентное содержание от общего числа бактерий, увеличивается в летнее время и снижается в зимний период. Обнаружено, что за время вегетации растений численность НФ и их количественная доля в составе популяций всех изученных групп бактерий (кроме олиготрофов) возрастает в ризосфере и снижается в ризоплане. Впервые методом трансмиссионной электронной микроскопии выявлен микроколониальный характер распространения НФ в почве, адгезированное состояние на поверхности почвенных частиц, наличие в клетках запасных веществ, что свидетельствует об их физиологической активности.
2 Из лугово-черноземной почвы под культурой риса выделены 8 новых штаммов микоплазм, отнесенных на основе проведенной идентификации к р. Siderococcus. Установлено, что бактерии интенсивно окисляют железо, которое откладывается на поверхности их клеток в капсулах, и служат «центрами осадкообразования» этого элемента в почве, повышают эффективную растворимость его гидроокиси, не вызывая при этом значительных изменений окислительно-восстановительного состояния окружающей среды. Выявлена способность изученных бактерий к образованию комплексных соединений с железом.
Впервые предложены селективные приемы выделения микоплазм из почвы, заключающиеся в ее механической обработке, использовании селективной среды и повышенной температуры инкубации посевов. Впервые охарактеризовано поведение интродуцированной популяции микоплазмы A.
laidlawii в различных типах почв. Показано двумя параллельными методами (микробиологическим посевом и ПЦР), что интродуцированная популяция микоплазмы A. laidlawii сохраняется в черноземной почве в течение 15 суток, а в дерново-подзолистой – 1 сутки. Численность интродуцированной популяции не стабилизируется. Время выживания определяется исходным уровнем обилия популяции и факторами окружающей среды.
Впервые экспериментально установлено, что почва может играть роль естественного резерватора и источника фитопатогенных микоплазм. Показано, что A. laidlawii способна проникать из почвы в растения через неповрежденную корневую систему, мигрировать в наземные органы, длительно персистировать в них и вызывать специфические морфологические изменения.
Впервые изучено влияние микоплазм на формирование и эффективность бобово-ризобиального симбиоза. Разработана лабораторная модель взаимодействия растений, микоплазм и клубеньковых бактерий Установлено, что влияние A laidlawii на гомеостатичную симбиотическую систему Medicago sativa - Rhizobium meliloti выражается в задержке инфицирования ризобиями растения-хозяина и стимулирующем действии на нитрогеназную активность сформировавшейся системы.
Практическая значимость работы. Разработаны методические подходы для выявления и количественного учета микоплазм в почве, заключающиеся в способе десорбции микробных клеток с поверхности почвенных частиц, использовании селективных сред, режиме инкубации, проведении ПЦР.
Показано, что для проведения ПЦР в черноземной почве целесообразно использовать непрямой способ выделения ДНК, так как при непосредственном ее экстрагировании происходит ингибирование реакции. Разработанные методы могут быть использованы в экологических исследованиях микоплазм в почве, что расширит имеющиеся представления об этой малоизученной группе бактерий.
3 Полученные экспериментальные доказательства того, что почва может играть роль естественного резерватора и источника фитопатогенных микоплазм, обнаружение ранее неизвестного пути проникновения бактерий через корневую систему обозначает направление поиска новых подходов к решению проблемы борьбы с микоплазмозами растений и предотвращения эпифитотий.
Для совместного культивирования растений и микоплазм в лабораторных условиях и выделения железоокисляющих микоплазм из почвы предложена питательная среда на основе растительного отвара.
Установлена устойчивость томатов сорта Золотая Капля к A. laidlawii.
Количественная оценка процесса окисления железа микоплазмами, их комплексообразующей способности дает основание для разработки биотехнологических способов регулирования подвижности питательных элементов в корневой зоне растений как приема повышения их продуктивности.
Результаты проведенных исследований используются в лекционных курсах по почвенной микробиологии, биологии почв, читаемых на факультете почвоведения, агрохимии и экологии РГАУ-МСХА им. К.А.Тимирязева.
Проведение исследований было поддержано проектами ГКНТ СССР «Интербиоазот-2000», Ф-503-35-2А, ФЦНТП «Интеграция», грантом правительства г. Москвы «Земля Москвы», ЗАО ФЦСР.
Основные защищаемые положения диссертации 1. Значительная часть бактерий в почве и корневой зоне растений представлена НФ. Динамика численности НФ в почве, ризосфере и ризоплане, их доля в бактериальном сообществе существенно различаются, отражая экологическую специализацию местообитаний.
2. В структуре бактериального комплекса лугово-черноземной почвы рисовников функционирует группа железоокисляющих микоплазм р. Siderococcus. Окисление железа приводит к увеличению его подвижности, миграции к бактериальной клетке как к «центру осадкообразования» и локальному накоплению в почве.
3. Почва является естественным резерватором и источником фитопатогенных микоплазм (A. laidlawii). Длительность выживания интродуцированной в почву популяции определяется факторами среды и исходным уровнем обилия.
4. Микоплазмы (A. laidlawii) способны проникать из почвы в растения через неповрежденную корневую систему, мигрировать в надземные органы, длительно персистировать в них, вызывать специфические морфологические изменения.
5. При инфицировании растений (Medicago sativa и Lycopersicum esculentum) микоплазмами (A. laidlawii) происходят деградация 4 ультраструктуры клеток листовой ткани, изменения морфогенеза, характерные для микоплазмозов растений в природных условиях,в то же время более интенсивный рост и развитие, стимулирующий (протективный) эффект на нитрогеназную активность.
Апробация работы. Материалы, вошедшие в диссертацию, были доложены на Международной конференции по быстрой диагностике микоплазм (Иерусалим, Израиль, 1991), 4-ой Всесоюзной конференции «Микроорганизмы в сельском хозяйстве» (Пущино, 1992), 9-ом (Эймс, США, 1992) и 12-ом (Сидней, Австралия, 1998) Конгрессах Международного общества микоплазмологов, 6-ом Международном Симпозиуме по микробной экологии (Барселона, Испания, 1992), 1-ой Международной конференции «Устойчивое развитие: загрязнение окружающей среды и экологическая безопасность» (Днепропетровск, 1995), Всероссийской конференции «Микробиология почв и земледелие» (Санкт-Петербург, 1998), 2-ой Международной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2000), Всероссийской конференции «Сельскохозяйственная микробиология в 19 - 21вв.» (Санкт-Петербург, 2001), 11-ом Международном конгрессе по молекулярным взаимодействиям между растениями и микроорганизмами (Санкт-Петербург, 2003), 13-ой Всероссийской школе «Экология и почвы» (Пущино, 2005), Международной научной конференции «С.П. Костычев и современная сельскохозяйственная микробиология» (Ялта, 2007), 6-ой Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии» (Минск, 2008), Международной научно-практической конференции «Проблемы биологии, экологии, географии, образования: история и современность» (Санкт-Петербург, 2008), Международной научно практической конференции «Актуальные проблемы микробиологии и вирусологии» (Алматы, 2009), Международной научно-практической конференции «Люцерна в кормопроизводстве» (Лобня, 2013), научных конференциях РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева (2004, 2007, 2008), заседаниях кафедры микробиологии и иммунологии РГАУ-МСХА им.К.А.
Тимирязева (2009, 2013).
Личный вклад автора в работу. Автор принимал личное участие во всех этапах исследования, ему принадлежит формулирование проблемы, постановка целей и задач, планирование экспериментов. Он участвовал в выполнении экспериментальной работы, обобщении и интерпретации полученных результатов, подготовке научных публикаций. В работе использованы материалы, полученные аспирантами и студентами, выполнявшими свои исследования под руководством автора.
5 Публикации. По теме диссертации опубликовано 32 работы, в том числе 10 – в изданиях, рекомендуемых ВАК, 7 статей в сборниках, 15 тезисов докладов на конференциях.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, глав, заключения, выводов и списка литературы, включающего _ наименований, в том числе _ иностранных источника. Работа изложена на _ страницах, содержит таблиц и рисунков.
Благодарности. Автор выражает глубокую признательность и благодарность научным консультантам проф. В.Т. Емцеву и проф.
В.К. Шильниковой за постоянную поддержку, критические замечания и ценные рекомендации. Автор благодарен своим коллегам и друзьям: П.И.Иванову, Л.В.Васильевой, В.М. Чернову, О.А. Черновой, В.С. Гузеву, Г.Б. Барановой за помощь при выполнении экспериментальной работы, консультации и поддержку, а также аспирантам и студентам, принимавшим участие в проведении экспериментов: Л.А. Свиридовой, Г.А. Мидянник, А.Ю. Погореловой, О.В.Бирюковой, А.А. Куприянову, Г.М. Чергейко, Ю.А. Ледовской. Отдельная благодарность всем сотрудникам кафедры микробиологии и иммунологии за теплую доброжелательную атмосферу и понимание.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Глава 1. Обзор литературы На основании анализа отечественных и зарубежных литературных источников приводятся сведения о наноформах бактерий, истории их изучения, морфологии, экологии, методах исследования;
биологии и систематике микоплазм, сапротрофных микоплазмах и их роли в почвах, микоплазмах – патогенах растений.
Глава 2. Объекты и методы исследования Объектами исследования служили образцы дерново-подзолистой хорошо окультуренной почвы Полевой опытной станции РГАУ-МСХА им. К.А.
Тимирязева под посевами люцерны (Medicago sativa), лугово-чернозёмной почвы рисовых полей Краснодарского края, чернозёма обыкновенного карбонатного (Воронежская область, Таловский район). В опытах использованы микоплазма Acholeplasma laidlawii, штамм 1 (получен из НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН) и штамм 2 (предоставлен лабораторией молекулярных основ патогенеза КИББ КНЦ РАН);
клубеньковые бактерии Rhizobium meliloti штамм 425а (из коллекции ВНИИ СХМ г.Санкт - Петербург);
люцерна посевная Medicago sativa, горох посевной Pisum sativum L. сорт Тан, томат Lycopersicum esculentum Mill., сорта Морковный, Золотая Капля и Манимейкер.
6 Численность наноформ (НФ) и общего числа бактерий определяли по физиологическим группам стандартным методом посева на следующих питательных средах: мясо-пептонном агаре (МПА) - бактерии, минерализующие органические формы азота;
крахмало-аммиачном агаре (КАА) - бактерии, использующие минеральные соединения азота;
на среде Эшби - олигонитрофилы;
на почвенном агаре - олиготрофы. В опытах использовали также среду на основе гидролизата бычьего сердца (ГБС), которую применяют в медицинских исследованиях для выделения и культивирования L - форм бактерий и микоплазм. Целесообразность использования этой среды для изучения экологии почвенных микроорганизмов обоснована в предшествующей работе (Асфур и др., 1992). Почву для анализа отбирали ежемесячно в течение года из междурядий с глубины 5 - 15 см.
Численность бактерий в ризосфере и ризоплане люцерны определяли по методу Теппер (Теппер и др., 2004) в три срока - июле, августе и сентябре. Для получения НФ бактерий использовали метод фильтрации через мембранные фильтры Millipore (диаметр пор 0,22 мкм) на стерильных фильтровальных установках Зейтца под давлением 0,2 атм. Подробная методика приведена в тексте диссертации.
Железоокисляющие бактерии выделяли методом посева на агаризованную среду на основе растительного отвара (Ванькова, 1991). Колонии железобактерий определяли по качественной реакции на Fе3+ с К4[Fе(СN)6].
Идентификацию чистых культур проводили на основании изучения морфологических, культуральных и физиолого-биохимических признаков (Bergey's manual of systematic bacteriology, 1989). Содержание железа определяли на атомно-абсорбционном спектрофотометре Perkin Elmer-503 и колориметрически, pH и Eh - потенциометрически по общепринятым методикам. Образцы для снятия ИК-спектров получали прессованием таблеток сухой биомассы бактерий с КВr.
Для интродукции в почву использовали маркированную по стрептомицину популяцию микоплазмы A. laidlawii (штамм 1). Выявление и учет A. laidlawii после предварительной десорбции клеток проводили параллельно 2-мя методами: посевом на агаризованную (1,4%) среду Mycoplasma Broth Base (МВ) (Becton Dickinson, USA) со стрептомицином и ПЦР с применением непрямого метода выделения ДНК. Из осажденных центрифугированием клеток выделяли ДНК, которую затем очищали классической процедурой фенольно хлороформной экстракции (Маниатис и др., 1984). В качестве праймеров использовали олигонуклеотиды, синтезированные в НПО «Литех».
Последовательность праймеров составлена на основе опубликованной (Kong et al., 2001) первичной структуры рибосомного оперона A. laidlawii: AF( прямой праймер) – 5’GAG ATC TTT GAA AAG TAG ATA AAT GAT GTC TGA AAA GAA ATA AGG3’, AR (обратный праймер) – 5’CTT CGA CCG ATT TTC CCA 7 CAT CGT TCA TC 3’, фланкирующие ампликон размером 362 п.о. в области межгенного спейсерного района ДНК 16S-23S рРНК. Детальное изложение методик представлено в тексте диссертационной работы.
В модельных опытах с растениями люцерны семена стерилизовали концентрированной серной кислотой (Nutman, 1949), проращивали при комнатной температуре и помещали в стерильные сосуды с агаризованной питательной средой на основе растительного отвара. Инфицирование проростков проводили через 2 недели путем введения в среду суспензии микоплазмы A. laidlawii (штамм 1, 106 КОЕ/мл) или совместно A. laidlawii и клубеньковых бактерий R. meliloti (108 КОЕ/мл). Опыты проводили в люминостате при 12 - часовом световом дне, Т 20° - 22°С, освещенности 4 тыс. лк. Обнаружение микоплазм в тканях инфицированных растений проводили методами ДНК-ДНК гибридизации и электронной микроскопии.
Дот - гибридизацию тотального препарата ДНК, выделенного из листьев люцерны, проводили со следующими ДНК - зондами: рАl32, специфичным к A. laidlawii, рMg16, специфичным ко всем представителям класса Mollicutes (Чернов, 1998). Нитрогеназную активность определяли ацетиленовым методом (Методы почвенной микробиологии и биохимии, 1991).
При проведении модельных опытов с растениями томата инфицирование проводили путем выдерживания 5 - дневных проростков в водной бактериальной суспензии A. laidlawii (штамм 2) с исходным титром 106 КОЕ/мл в течение суток или внесением бактериальной суспензии непосредственно в почву (109 КОЕ/г). Опыты проводили в фитотроне при 18 - часовом световом дне, температуре 22 - 24С°, освещенности 5 тыс. лк. Присутствие микоплазм в тканях растений устанавливали ПЦР (Серебренникова, 2005). Длину эпикотиля и площадь листовой поверхности растений измеряли с помощью фотопланиметра.
Ультраструктуру НФ бактерий, а также клеток растений, инфицированных микоплазмами, изучали с помощью трансмиссионной электронной микроскопии (ТЭМ). При изучении НФ бактериальные клетки из фильтрата почвенной суспензии (разведение 10-2) осаждали центрифугированием.
Препараты готовили по общепринятой методике (Уикли, 1975). Ультратонкие срезы просматривали в электронном микроскопе Hitachi - 500 (Япония).
Биометрический анализ проводили по фотографиям ультратонких срезов бактерий с учетом увеличения микроскопа и при фотографировании. Для изучения клубеньков и утолщений на корнях люцерны использовали сканирующую электронную микроскопию (СЭМ) (Гузев и др., 1984;
2003;
2006).
Статистическую обработку результатов проводили в программе Excel 2007.
8 Глава 3. Наноформы бактерий в почве и корневой зоне растений В течение многих лет микробиологи наблюдают в природных местообитаниях (почва, водоемы, породы и минералы, живые организмы) существование бактерий, обладающих сверхмалыми размерами: диаметром клетки 0,4 мкм, объемом 0,1…0,01 мкм3. Их описывают под различными названиями - ультрамикробактерии, фильтрующиеся или ультраформы, нан(н)обактерии, карликовые бактерии и др. (Новогрудский, 1933;
Крисс и N, млн. N, млн.
30 до фильтрации до фильтрации КОЕ/г. КОЕ/г.
фильтрующиеся формы 25 фильтрующиеся формы почвы почвы 15 VI VII VIII IX X XI XII I II III IV VI VII VIII IX X XI XII I II III IV б месяц а месяц 60 N, млн. N, млн. до фильтрации до фильтрации КОЕ/г. КОЕ/г.
50 фильтрующиеся формы фильтрующиеся формы почвы почвы 30 20 10 0 VI VII VIII IX X XI XII I II III IV VI VII VIII IX X XI XII I II III IV c месяц d месяц 120 N, млн. до фильтрации КОЕ/г.
100 фильтрующиеся формы почвы VI VII VIII IX X XI XII I II III IV e месяц Рис. 1 Численность бактерий в дерново-подзолистой почве до фильтрации и фильтрующихся форм a) олигонитрофильные b) использующие органические формы азота c) использующие минеральные формы азота d) олиготрофы e) учитываемые на среде ГБС др.,1948;
Виноградский, 1952;
Красильников, 1954;
Никитин, 1964;
Ананьева и др., 1979;
Мишустина и др., 1987;
Гузев и др., 2003;
Дмитриев и др., 2008;
Лысак, 2010;
Сузина и др., 2011;
Дуда и др., 2012;
Федотова и др., 2013;
Casida, 1969;
Bae et al., 1972;
Morita, 1985;
Bakken et al., 1987;
Baath, 1992;
9 Panikov, 2005). Физиологические особенности, таксономия и экологические функции этих бактерий до сих пор мало изучены. Между тем, знание указанных особенностей представляет большой общебиологический интерес и имеет практическое значение.
Результаты исследований, проведенных на Полевой опытной станции РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева показали, что численность наноформ (НФ) бактерий в дерново-подзолистой почве высока и колеблется в широком диапазоне значений за исследуемый период времени (рис. 1 a-e).
Наибольшее количество НФ было обнаружено в сентябре (26,0±1,9 50,0±2,8 млн КОЕ/г почвы), наименьшее - в марте (0,04±0,01 – 0,08±0,01 млн КОЕ/г почвы). Динамика численности соответствующих групп бактерий до и после фильтрации имеет, как правило, сходную тенденцию – количество бактерий возрастает в летние и осенние месяцы и снижается зимой и весной.
Максимальные значения численности НФ и общей численности бактерий всех изученных физиологических групп, кроме бактерий, использующих органические формы азота, совпадают и приходятся на сентябрь. Доля НФ от общей численности выявляемых бактерий в среднем за исследуемый период составляет 65%. В отдельные месяцы некоторые физиологические группы представлены преимущественно мелкими формами.
Численность НФ бактерий в ризосфере люцерны в составе всех групп бактерий (кроме олиготрофов) возрастает в течение вегетации растений, вне зависимости от характера динамики общей численности бактерий до фильтрации (табл.1). Неодинаковый характер динамики численности НФ свидетельствует о различиях в закономерностях их развития, проявляющихся в данной среде обитания. Максимальное число НФ выявлено на среде ГБС к концу вегетационного периода – 38,0±2,4 млн КОЕ/г почвы. По-видимому, эта среда для НФ бактерий, использующих органические соединения азота, более благоприятна, чем МПА и позволяет выявить большее их количество. В общей массе бактериальных клеток всех исследованных физиологических групп доля НФ в среднем составляет 37%. В процессе вегетации растений она увеличивается до 73-75%. Выявленные закономерности развития НФ свидетельствуют о возможном стимулирующем действии растений люцерны на образование и функционирование НФ в зоне ризосферы. Известно, что ризосфера характеризуется более высокой численностью и метаболической активностью микроорганизмов благодаря постоянному притоку эксудатов.
Малые размеры дают бактериям биологическое преимущество в конкуренции за питательные вещества с крупными организмами в соответствии с общебиологическим правилом, согласно которому интенсивность обмена веществ обратно пропорциональна величине особи (Стейниер и др., 1979).
Более высокая метаболическая активность бактерий в ризосфере 10 Табл. 1.
Численность бактерий в ризосфере растений люцерны до фильтрации и фильтрующихся форм Июль Август Сентябрь общее общее общее фильтрую- фильтрую- фильтрующиеся Группа бактерий число число число щиеся формы щиеся формы формы бактерий бактерий бактерий млн КОЕ / 1г почвы % млн КОЕ / 1г почвы % млн КОЕ / 1г почвы % Олигонитрофилы 26,0±11,8 1,6±0,3 6 13,1±0,8 3,9±0,8 30 10,0±0,9 4,2±0,4 Использующие органические формы азота 11,0±2,4 0,5±0,1 5 28,0±8,6 4,7±1,0 17 32,0±2,3 5,3±0,4 Использующие минеральные формы азота 42,0±5,5 23,0±2,3 55 38,0±2,4 28,0±3,7 74 35,0±2,0 26,0±2,2 Олиготрофы 69,0±23,0 14,0±1,5 20 40,0±9,3 30,0±3,2 75 12,0±0,8 6,6±0,1 Учитываемые на среде ГБС 67,0±6,7 4,7±0,5 7 34,0±7,8 3,2±0,5 9 52,0±2,9 38,0±2,4 Табл. 2.
Численность бактерий в ризоплане растений люцерны до фильтрации и фильтрующихся форм Июль Август Сентябрь общее общее общее фильтрую- фильтрую- фильтрующиеся число число число Группа бактерий щиеся формы щиеся формы формы бактерий бактерий бактерий тыс. КОЕ / 1г корней % тыс. КОЕ / 1г корней % тыс. КОЕ / 1г корней % Олигонитрофилы 130,0±9,0 53,0±11,8 41 62,9±12,2 41,7±6,8 66 17,0±9,1 15,0±2,5 Использующие органические формы азота 65,0±10,6 16,0±2,8 25 120,0±6,5 12,8±2,9 11 30,0±7,4 3,9±2,1 Использующие минеральные формы азота 120,0±5,7 50,0±7,2 42 10,0±3,1 6,7±1,8 67 62,9±12,2 7,0±1,9 Олиготрофы 99,2±7,2 64,0±11,1 65 10,0±5,6 7,9±6,3 79 700±647 520,0±72,2 Учитываемые на среде ГБС 94,4±5,1 56,0±6,2 59 100,0±11,8 32,5±3,8 3 23,0±8,7 17,0±2,4 11 сопровождается увеличением плотности популяций и уменьшением размера клеток.
Особенностью ризопланы, как экониши бактерий, отличающей ее от ризосферы, является то, что у всех изученных групп бактерий полностью совпадает характер динамики численности бактерий до и после фильтрации.
У бактерий, использующих органические, минеральные формы азота, олигонитрофилов и бактерий на среде ГБС наблюдается уменьшение как общего количества бактерий, так и числа мелких клеток в процессе вегетации. Численность олиготрофов в обоих случаях за тот же период времени возрастает (табл. 2). Доля НФ, использующих органические, минеральные формы азота, и олиготрофов уменьшается в течение вегетационного периода до 8 - 13%. Процентное содержание НФ олигонитрофилов и бактерий на среде ГБС в общей массе бактерий соответствующих групп увеличивается (88 и 74%). Доля НФ от общего числа выявленных бактерий составляет в среднем 43%. Отмечено, что показатели доли НФ и общей численности бактерий в ризоплане изменяются в противофазе: минимальный процент НФ регистрируется в период, когда численность всех бактерий максимальна и наоборот.
Выявленные закономерности свидетельствуют о возможном существовании определенных механизмов регуляции численности мелких форм бактерий в ризоплане растений, отличающих ризоплану от почвы и ризосферы и отражающих их глубокую экологическую специализацию.
При электронномикроскопическом исследовании НФ установлено, что диаметр прошедших через мембранный фильтр клеток варьирует от 0,15 до 1,50 мкм, длина от 0,21 до 1,75 мкм (рис. 2 а-е). Наиболее часто встречаются клетки с диаметром в интервале 0,20 - 0,35 мкм и длиной в интервале 0,45 0,80мкм. Средний диаметр и длина клеток - 0, 31±0,22мкм и 0,55±0,27мкм.
Выявлено значительное разнообразие морфотипов НФ: сферические, овальные и палочковидные бактерии с Г+ и Г- типом строения клеточной стенки, лишенные ригидной клеточной стенки, цистоподобные клетки. В некоторых клетках НФ бактерий выявлены включения липидов (рис. 2 в, д), и полифосфатов (рис. 2 б, г, д). Большинство наблюдаемых на электронограммах клеток находится в адгезированном состоянии на поверхности почвенных частиц (рис 2 в) и имеет микроколониальный характер распространения, что свидетельствует об их физиологической активности в природной среде.
Таким образом, биометрический анализ НФ бактерий показал, что их средний диаметр составляет 0,3 мкм, а длина - 0,6 мкм. Редукция размеров почвенных бактерий, их тенденция к карликовости, по-видимому, являются общим законом микробной жизни в условиях почвы и характерной чертой 12 а б в г д е Рис. 2 Ультраструктура фильтрующихся форм почвенных бактерий. Размер масштабной линейки 0, мкм. природных форм почвенных микроорганизмов. В то время как у одних организмов малые формы наследственно закреплены, у других они, возможно, носят модификационный характер. Высокая численность НФ бактерий в почве и корневой зоне растений, их морфологическое 13 разнообразие, физиологическое состояние позволяют предположить, что уменьшение размеров почвенных бактерий имеет адаптивное значение и связано с их большей устойчивостью к условиям окружающей среды.
Глава 4. Железоокисляющие микоплазмы.
Самыми мелкими из известных организмов, имеющих клеточную структуру, являются микоплазмы (Борхсениус и др., 2002;
Чернов, 1998;
Razin et al., 1998). Они представляют собой простейшие лишенные клеточной стенки прокариоты, способные к самостоятельному воспроизведению.
Малый размер генома и ограниченные биосинтетические возможности обусловили их сосуществование с клетками высших эукариот. Большинство микоплазм, встречающихся в природе, относят к паразитам растений, животных и человека, способным вызывать заболевания (Тимаков и др., 1973;
Власов и др., 1985;
Скрипаль, 1988;
Коромыслов и др., 1987;
Прозоровский и др., 1995;
Раковская, 1999;
Чернова, 1999;
McCoy et al., 1989;
Taylor-Robinson et al., 1997). Менее изучены свободноживущие сапротрофные микоплазмы, обитающие в почвах, сточных водах, донных отложениях, вулканических материалах, характеризующиеся хемоорганогетеротрофным типом метаболизма и способностью откладывать на поверхности клеток окислы железа, марганца или алюминия (Перфильев и др., 1964;
Заварзин, 1968;
Мирчинк и др., 1970;
Балашова, 1974;
Болотина, 1975;
Дубинина, 1977;
Аристовская, 1980;
Пиневич, 2005;
Кутузова, 2011).
Ограниченные метаболические возможности являются причиной методических трудностей, возникающих при культивировании микоплазм на искусственных питательных средах. Эти бактерии находятся «на грани культивируемости».
Для изучения железоокисляющих микоплазм в лугово-черноземной почве рисовников Краснодарского края впервые была предложена плотная питательная среда на основе растительного отвара с щавелевокислым железом (II) и витамином В12.
Данная среда позволила оценить общую численность железоокисляющих бактерий, которая оказалась сопоставима с таковой других групп, традиционно изучаемых в затопленных почвах рисовых полей (маслянокислых, ацетонобутиловых, железо- и сульфатредуцирующих), и составила в среднем 10,2 - 14,0 млн. КОЕ/г почвы, а также выделить 8 новых штаммов, отнесенных на основании проведенной идентификации к сапротрофным микоплазмам р. Siderococcus.
Выделенные чистые культуры образуют характерные для микоплазм точечные двухфазные колонии, напоминающие "яичницу-глазунью", которые отличаются по цвету и размеру у разных штаммов. С помощью 14 электронной микроскопии установлено, что клетки лишены клеточной стенки и вследствие этого крайне полиморфны - варьируют по форме от овальных и более или менее правильной формы палочек до сильноизогнутых, бобовидных и нитей разной длины (рис. 3).
Рис.3 Ультраструктура железоокисляющих бактерий, х Диаметр клеток 0,3 - 1,2мкм, длина 0,9 - 3,0мкм. Присутствуют НФ, округлые или неправильно округлые, диаметром 0,1 - 0,2мкм. Выделенные культуры не способны расти на богатых органических средах (МПБ, МПА), но хорошо развиваются на КАА и картофельном агаре с образованием пигмента от розового до кирпично-красного цвета, среде Тилера и голодном агаре. Использование простых сахаров в качестве единственного источника углерода выявлено у штаммов 2, 5 и 8. Исследуемые культуры проявляют большую потребность во влаге, обладают каталазной активностью, микроаэрофилы, мезофилы. Все изучаемые штаммы способны к окислению железа, которое откладывается на поверхности клеток в капсулах.
Результаты исследований показали, что окисление железа штаммами идёт с различной интенсивностью (табл. 3). Наибольшей активностью обладает штамм 9. Процесс окисления идёт практически без изменения рН и окислительно-восстановительного потенциала (Eh) в среде. Степень окисленности системы - rH2 (Орлов, 1985) в целом несколько увеличивается.
Для оценки деятельности железоокисляющих микоплазм в почве необходимо знать механизмы их взаимодействия с субстратом. Влияние железобактерий на состояние соединений железа в почве обусловлено выделением в окружающую их среду специфических продуктов обмена. На основании изучения морфологии и физиологии выделенных штаммов бактерий можно предположить несколько вариантов их воздействия на 15 субстрат, в результате которого происходит окисление железа и его отложение на поверхности клеток.
Табл. 3.
Влияние железобактерий на содержание закисного железа, pH и Eh в питательной среде Содержание Fe2+ в среде Eh, мВ по № штамма pH rH %к ХСЭ мг/л контролю Контроль 16,50 7,97 279 25, 1 12,83 78 7,96 305 26, 2 19,33 117 8,38 287 26, 3 11,33 69 7,78 278 24, 4 14,00 85 8,16 265 25, 5 10,58 64 7,90 267 24, 7 15,83 96 8,46 266 25, 8 10,41 63 8,40 267 25, 9 8,66 53 8,53 265 25, НСР 3,02 0,41 17, Большинство выделенных штаммов обладает каталазной активностью, поэтому отложение окислов железа на поверхности клеток может происходить в результате взаимодействия перекиси водорода, конечного или промежуточного продукта окисления органических веществ, с ионами железа в реакции сопряжённого окисления с участием каталазы (Дубинина, 1977).
Гетеротрофный тип питания выделенных бактерий позволяет также предположить их способность разлагать железоорганические Рис.4 ИК-спектры биомассы штаммов 4, 5, 9, выращенных при концентрации соединения с последующим лимоннокислого железа (II) в среде 10мг/л использованием органической части в (верхняя кривая) и 100мг/л (нижняя кривая).
метаболических процессах и 16 отложением окисного железа в капсулах или на поверхности клеток (Аристовская, 1980).
При наличии на поверхности клеток соединений с отрицательным зарядом: мукополисахаридов, полисахаридов и фосфолипидов возможна физико-химическая адсорбция железа (Дубинина, 1977). Поскольку большинство изученных штаммов имеет слизистую капсулу, присутствие на поверхности их клеток перечисленных выше органических соединений весьма вероятно. Кроме того, осаждение железа в виде гидроокиси на клетках возможно в связи с локальным повышением окислительно восстановительного потенциала или рН, вследствие выделения бактериями щелочных продуктов обмена, временного избытка ионов (Mn4+, SO42- NO3- и др.) или молекулярного кислорода. Весьма динамичное окислительно восстановительное состояние поверхности клеток бактерий вполне допустимо, если принять во внимание отсутствие у большинства штаммов истиной клеточной стенки и учесть специфические условия их местообитания. Одним из механизмов накопления железа бактериями может быть процесс комплексообразования, который сводится к выделению в окружающую среду специфических хелатообразующих соединений, своеобразных "переносчиков" железа к клетке (Ratledge et al., 1976).
Комплексообразующая способность выделенных штаммов тем более вероятна, что процесс окисления ими железа практически происходит без изменения окислительно-восстановительного потенциала и кислотности среды. У одного организма вполне вероятно существование одновременно нескольких механизмов осаждения или накопления железа. Преобладание одного или совместное функционирование нескольких механизмов зависит от конкретных условий среды обитания и физиологических особенностей бактерий. В конечном итоге рассмотренные выше процессы приводят к миграции железа из среды к бактериальной клетке как к «центру осадкообразования» и локальному его накоплению.
Изучение механизма связывания железа проводили методом ИК спектроскопии сухой биомассы чистых культур, выращенных при контрастных концентрациях железа (II) в питательных средах. ИК-спектр является "отпечатком пальцев" молекулы: поглощение в ИК-области характерно для отдельных атомных группировок, при этом интенсивность поглощения прямо пропорциональна их концентрации. Сравнение характеристичных пиков ИК-спектров (Кончиц, Черников, 1990) биомассы штаммов, выращенных при различных концентрациях (10 и 100мг/л) лимоннокислого железа (II) в среде показало, что при увеличении концентрации железа доля свободных карбоксильных, спиртовых и фенольных функциональных групп сокращается, что свидетельствует об их 17 возможной заблокированности катионом металла и позволяет предположить способность исследуемых штаммов к комплексообразованию (рис. 4). Для проверки гипотезы о возможной способности клеток железобактерий или их метаболитов вступать в реакции хелатизации с железом в модельном опыте была проведена оценка комплексообразующей способности бактерий по эффективной растворимости гидроокиси железа Fе(OН)3 при внесении их в раствор в различной концентрации (103 и 105 клеток/мл). Результаты опыта показали, что штаммы 1, 2, 4, 5 повышают эффективную растворимость гидроокиси железа и обладают комплексообразующей способностью (КС) (Савич и др., 1988) по отношению к железу. Штаммы 3 и 7 проявляют лишь тенденцию к увеличению содержания растворимого железа в среде (табл. 4).
Табл. 4.
Комплексообразующая способность железоокисляющих микоплазм 103 клеток/мл 105 клеток/мл № штамма Fe3+ мг/л Fe3+ мг/л pH Eh, мВ КС pH Eh, мВ КС Контроль 4,63 363 0,27 1,0 4,63 363 0,27 1, 1 4,71 345 0,48 10,2 4,84 367 0,44 7, 2 4,81 365 0,48 10,2 4,83 395 0,34 2, 3 4,77 372 0,09 0,01 4,82 405 0,30 1, 4 4,77 362 0,10 0,02 4,91 391 0,37 3, 5 4,82 361 0,42 5,87 5,00 401 0,30 1, 7 4,8 359 0,34 2,52 4,93 384 0,29 1, 8 4,73 379 0,13 0,05 4,93 388 0,22 0, 9 4,72 348 0,20 0,30 4,75 408 0,26 0, НСР 0,04 9 0,13 0,06 10 0, ОО 0,01 3 0,05 0,02 3 0, Таким образом, в лугово-черноземной почве рисовников выявлены железоокисляющие микоплазмы р. Siderococcus, составляющие значительную часть микробного сообщества. Бактерии интенсивно окисляют железо, не вызывая при этом значительных изменений окислительно восстановительных условий в окружающей среде. Одним из механизмов окисления железа микоплазмами является комплексообразование.
Способность бактерий образовывать комплексы с железом облегчает мобилизацию этого элемента из труднорастворимых природных соединений.
Известно, что в составе комплексных и внутрикомплексных (хелатных) 18 соединений железо теряет свойства характерные для катиона: образование труднорастворимых фосфатов, осаждение в виде гидроокиси и др. (Кононова и др., 1961;
Кауричев и др.,1961;
Антипов-Каратаев и др., 1966). Благодаря хорошей растворимости, устойчивости и высокой подвижности в широких пределах рН, железоорганические комплексы имеют большое значение в выветривании, миграции элементов в почвенном профиле, снабжении растений микроэлементами и поливалентными катионами.
Глава 5. Почва как среда обитания фитопатогенных микоплазм Большинство известных микоплазм относят к симбионтам (паразитам) высших эукариот, понимая под симбиозом (Стейниер и др., 1979) биологическое явление тесной и длительной ассоциации различных организмов и расценивая паразитизм как один из множества вариантов симбиоза, при котором паразит физиологически зависит от своего хозяина, а его репродуктивный потенциал выше, чем у последнего. Микоплазмы вызывают более 600 заболеваний растений 96 семейств. Микоплазмозы растений широко распространены в регионах интенсивного возделывания сельскохозяйственных культур – Воронежской, Орловской, Волгоградской, Саратовской, Астраханской областях, Краснодарском крае и наносят существенный ущерб сельскому хозяйству России, снижая урожай пшеницы на 80-90%, картофеля – на 18-20%, томатов и других пасленовых на 25-38% (Власов и др., 2000;
Скрипаль, 1988;
Борхсениус и др., 2002). Потери от микоплазмозов растений ежегодно возрастают, что связывают с увеличением антропогенной нагрузки на экосистемы. Одна из самых распространенных в природе микоплазм Acholeplasma laidlawii впервые была выделена из сточных вод и отнесена к сапротрофам. Однако, в настоящее время известно, что многие штаммы A. laidlawii являются возбудителями микоплазмозов растений, животных и человека. Источником биозагрязнения агроценозов служат сточные воды, которые используются для орошения сельскохозяйственных угодий, бытовые и сельскохозяйственные отходы, микробные производства. Для обеспечения экологической безопасности продукции необходимо разработать эффективные методы контроля и меры по предотвращению данного вида загрязнения. Решение этой проблемы невозможно без знания экологии и особенностей циркуляции возбудителя.
Основную роль в распространении микоплазмозов растений традиционно отводят насекомым-переносчикам (Власов и др., 1985;
Богоутдинов, 2001). В то же время, в условиях in vitro экспериментально подтверждена возможность проникновения A. laidlawii в надземную часть растений через неповрежденную корневую систему (Иванов, 1992;
Чернов, 1998). Этот факт позволяет иначе взглянуть на пути циркуляции A. laidlawii в природе, 19 экологию этой бактерии, предположить возможность проникновения микоплазм в растения непосредственно из почвы. Однако служит ли почва средой активной деятельности возбудителя или играет роль резерватора – промежуточной среды, где возбудитель лишь сохраняется в жизнеспособном состоянии, носит гипотетический характер. Для разрешения выдвинутой гипотезы был применен экспериментальный популяционный подход – прямой способ оценки приспособленности конкретного микроорганизма к определенному местообитанию. Критерием оценки почвы как возможной среды обитания какого-либо организма является поведение интродуцированной популяции этого организма в почве (Кожевин, 1989).
Исследованию интродуцированной в почву популяции A. laidlawii предшествовала разработка эффективных селективных методов выделения и количественного учета микоплазм, так как методические приемы работы с этой группой бактерий в условиях почвы отсутствуют.
Для изучения поведения фитопатогенного штамма A. laidlawii (штамм 1) в почве использовали генетически маркированную по стрептомицину популяцию, которую получили методом "приучения" исходной культуры к возрастающей концентрации антибиотика путем постепенного отбора резистентных форм (Звягинцев, 1987). Идентичность полученного стрептомицинустойчивого штамма A. laidlawii исходному штамму подтверждена с помощью иммунофлюоресцентного (ИФ) и ПЦР анализов.
Для оценки численности интродуцированной популяции A. laidlawii в почве необходимо было подобрать питательную среду, на которой бы микоплазмы при выделении из почвы хорошо развивались. При этом необходимо учесть, что микоплазмы чрезвычайно требовательны к компонентам питательной среды (Раковская, 1999;
Борхсениус и др., 2002) в значительной степени из-за ограниченных биосинтетических способностей.
Для культивирования и выделения из почвы A. laidlawii испытывали среды ГБС (pH 6,5) (НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН), Mycoplasma Broth Base (МВ) (Becton Dickinson, USA) (pH 8,0), и среду на основе растительного отвара (Ванькова, 1991). По совокупности показателей наилучшей была признана среда МВ. Важным преимуществом выбранной среды является то, что на ней выявляется гораздо меньше почвенных микроорганизмов, особенно грибов, что, очевидно, связано с ее щелочной реакцией. Рост A. laidlawii изучен в различных по плотности средах МВ. В жидкой среде это слабое равномерное опалесцирующее помутнение. В полужидкой (0,3% агара) - колонии появляются на 3 - 4 сутки и имеют вид белых полупрозрачных сфер диаметром 0,5 - 1,5 мм. На плотной (1,4% агара) среде вырастают округлые, точечные колонии (0,1 - 1,0 мм) в виде яичницы глазуньи с приподнятым центром и плоским ободком. При культивировании 20 стрептомицинустойчивого штамма A. laidlawii и высеве его из почвы на плотную среду МВ наблюдалось явление диссоциации популяции: кроме классических колоний в виде яичницы-глазуньи развивались атипичные колонии двух видов - без плоского периферического ободка "пузырчатые" и шероховатые. Колонии диссоциантов меньше классических. Идентичность типичных колоний и диссоциантов исходному штамму подтверждена методом ПЦР.
Оптимальная температура роста A. laidlawii составляет +20 - +40оС (Определитель бактерий Берджи, 1997). В результате сравнения различных температурных режимов в данном диапозоне установлено, что оптимальная температура культивирования стрептомицинустойчивого штамма A. laidlawii в жидкой среде составляет +28оС, а инкубирования посевов из почвы - +37оС.
Относительно высокая температура угнетает рост большинства почвенных микроорганизмов, колонии же микоплазм развиваются быстрее, что дает возможность для их более полного учета. Поэтому температуру 37оС приняли как "элективную" для выделения A. laidlawii из почвы.
Для максимального выявления интродуцированной популяции A. laidlawii необходимо было выбрать наиболее эффективный метод десорбции. Клетки ахолеплазм обладают капсулой (Борхсениус и др., 2002), поэтому можно предположить, что они будут легко адгезироваться почвенными частицами. Испытания различных общепринятых (Звягинцев, 1987) способов десорбции показали, что наибольшее количество клеток выделяется при встряхивании почвенной суспензии в колбе на механической качалке в течение 10 мин (табл. 5).
Для идентификации микоплазм в черноземной почве с помощью ПЦР отработан метод выделения ДНК, поскольку в литературе данный метод не был найден. Испытывали 2 известных способа выделения ДНК:
непосредственное экстрагирование ДНК из почвы (прямой метод) и экстрагирование ДНК из предварительно выделенных клеток микроорганизмов (непрямой метод). Прямой метод дает более достоверный результат, так как экстрагируется вся ДНК, находящаяся в почве, независимо от того, в каком состоянии находятся бактерии в данный момент адгезированы ли они почвенными частицами или находятся в некультивируемом состоянии. Однако при использовании прямого метода происходило ингибирование ПЦР вследствие присутствия примесей, вероятно гуминовых кислот, очистить от которых ДНК не удалось. Поэтому для детекции микоплазм в почве был принят непрямой метод выделения ДНК с использованием классической процедуры фенольно-хлороформной экстракции (Маниатис и др., 1984). Детальное описание метода представлено в диссертационной работе.
21 Табл. 5.
Влияние способов десорбции на численность интродуцированной в почву популяции A. laidlawii КОЕ/г воздушно № Варианты опыта сухой почвы 1,7· 1 Встряхивание в колбе 10 мин.
1,2· 2 Встряхивание в колбе с 0,01% Tween-60 10 мин.
1,8· 3 Обработка УЗ 0,5 мин.
4,2· 4 Обработка УЗ 1 мин.
4,8· 5 Обработка УЗ 2 мин.
4,5· 6 Обработка УЗ 3 мин.
1,0· 7 Обработка УЗ с 0,01% SDS 0,5 мин.
1,0· 8 Обработка УЗ с 0,01% SDS 1 мин.
3,2· 9 Обработка УЗ с 0,01% Tween-60 0,5 мин 1,4· 10 Растирание в ступке 5 мин.
1,0· 11 Растирание в ступке с 0,01% SDS 5 мин.
Таким образом, разработаны селективные приемы выделения микоплазм из почвы, заключающиеся в предварительной механической десорбции, использовании селективной среды и повышенной температуры инкубации посевов. Показано, что для проведения ПЦР в черноземной почве целесообразно использовать непрямой метод выделения ДНК.
С целью выяснения пригодности почвы как среды обитания фитопатогенных микоплазм стрептомицинустойчивую популяцию A. laidlawii интродуцировали в два типа почвы – дерново-подзолистую и чернозем обыкновенный (109КОЕ/г почвы) и выявляли в динамике посевом на среду МВ со стрептомицином (1,4мг/мл) и методом ПЦР.
Динамика популяции в дерново подзолистой почве и черноземе различалась (рис. 5). В дерново подзолистой почве численность популяции через сутки после интродукции вышла на нулевой уровень. В черноземе популяция Рис. 5. Динамика интродуцированной снижалась постепенно.
популяции A. laidlawii в черноземе и дерново-подзолистой почве 22 Через сутки её численность уменьшилась на 2 порядка относительно исходной, а к 4-ым суткам – ещё на порядок.
При определении срока выживания популяции ахолеплазм в черноземе в более длительном опыте (17 суток) 1 2 3 4 5 6 7 микробиологическим посевом и ПЦР Рис.6. Электрофореграмма результатов жизнеспособные микоплазмы выявлялись в ПЦР по срокам идентификации A. laidlawii в черноземе обыкновенном почве в течение 15 суток (рис.6, 7).
1, 2, 3, 4, 5 - соответственно 1, 5, 10, 15, Итак, методами посева и ПЦР 17 суток после интродукции A. laidlawii подтверждено, что при исходном титре в почву;
6 - положительный контроль (чистая КОЕ/г почвы интродуцированная популяция культура A. laidlawii);
7 - отрицательный A. laidlawii сохраняется в черноземе в контроль (почва без внесения A. laidlawii) жизнеспособном состоянии в течение суток, однако, численность её не стабилизируется и неуклонно снижается. В дерново-подзолистой почве при таком же исходном уровне внесения популяция A. laidlawii не идентифицируется уже через сутки после интродукции в почву.
Полученные результаты согласуются с данными П. А. Кожевина (2000), который изучал динамику интродуцированных популяций в тех же типах почв и наблюдал Рис.7. Динамика численности более резкое сокращение их численности в интродуцированной популяции A.
дерново-подзолистой почве, связанное с ее laidlawii в черноземе неблагоприятной кислотностью. Чернозем обыкновенный, таким образом, более подходящая среда для ахолеплазм, чем дерново-подзолистая почва.
Изучена динамика численности A. laidlawii в черноземе при интродукции популяций с разными исходными уровнями популяционной плотности - 108 109 и КОЕ/г почвы. Численность A. laidlawii в почве снижалась независимо от исходного Рис.8. Динамика численности популяций A.laidlawii в черноземе в зависимости от титра внесения, однако, динамика процесса начального титра при их интродукции различалась (рис. 8.). Чем выше уровень вносимой популяции, тем ниже скорость убывания ее численности и больше время 23 сохранения в почве. При максимальном титре внесения A. laidlawii КОЕ/г почвы микоплазмы изолировали в течение 19 суток (1,2·102 КОЕ/г почвы). По мере снижения популяционной плотности микроорганизмов наблюдается ослабление отрицательных механизмов антибиоза со стороны почвенных микроорганизмов, но это не всегда ведет к стабилизации популяции. Популяции, характеризующиеся высоким уровнем трат на поддержание жизнеспособности в результате внутрипопуляционной конкуренции, могут быстро погибнуть в условиях голодания (Звягинцев, 1987;
Кожевин, 2000) Изучение влияния температуры на поведение популяции в почве показало, что численность ее сокращалась, но динамика этого процесса различна. Наиболее резкое снижение отмечено при +28С - в течение 2 суток почти на 3 порядка (рис. 9). На 6-ой день микоплазмы на среде не были выявлены. Вероятно, высокая температура неблагоприятно влияет на их развитие в почве. Кривые динамики численности при температурах +4С и +20С практически совпадали, на 8-е сутки микоплазмы не удалось обнаружить в обоих вариантах.
Микоплазмы высоко устойчивы к низким температурам (Коромыслов и др., 1987;
Берджи, 1997;
Борхсениус и др., 2002). По численности мере повышения температуры Рис.9. Динамика чернозем окружающей среды их численность интродуцированной в популяции A. laidlawii при различных снижается. Не исключено, что уменьшение температурных режимах количества микоплазм в почве при повышенных температурах связано с их переходом в некультивируемое состояние.
При изучении влияния рН на динамику численности A. laidlawii установлено, что через сутки после интродукции ахолеплазм в дерново подзолистой почве (рНKCl 5,1) они не обнаружены, а в той же почве, нейтрализованной СаО до рНKCl 8,0, выявлены с титром 103 КОЕ/г почвы Рис.10. Динамика численности популяции (рис. 10.). Через 5 суток и в этом варианте интродуцированной Acholeplasma laidlawii в дерново- микоплазмы не высевались на подзолистой почве с внесением СаО и питательную среду. Следует отметить, без внесения что при одинаковых титрах внесения 24 микоплазм и одинаковых значениях рН черноземной и дерново-подзолистой почв длительность выявления A. laidlawii в черноземе составила 15 суток, а в дерново-подзолистой - не более 5. Следовательно, на жизнеспособность микоплазм влияет не только рН, но и другие свойства почвы.
Таким образом, на основании изучения динамики интродуцированных популяций A. laidlawii в дерново-подзолистой и черноземной почвах можно констатировать, что образ жизни и биологические приспособления ахолеплазм достаточно пластичны и варьируют в зависимости от условий среды. Исследование динамики популяций ахолеплазм, внесенных в почву, показало, что с течением времени исходная их численность непрерывно убывает. Продолжительность их жизни ограничена и при максимальной исходной численности популяции, принятой в эксперименте - 1011 КОЕ/г почвы, не превышает 20 суток. Время выживания популяции определяется типом почвы, факторами окружающей среды, а также исходным уровнем популяционной плотности. Чернозем является более предпочтительной средой для ахолеплазм по сравнению с дерново-подзолистой почвой, что объясняется, вероятно, его более благоприятными химическими и физическими свойствами. Сохраняемость популяции в черноземной почве по сравнению с дерново-подзолистой в 15 раз выше и составляет 15 суток при исходном титре 109 КОЕ/г почвы. Повышение кислотности и температуры почвы неблагоприятно для развития микоплазм. Проведенные исследования приводят к заключению о том, что почву нельзя считать средой благоприятной для обитания фитопатогенных микоплазм, но она служит резерватором, где бактерии могут сохраняться определенное время в жизнеспособном состоянии.
Глава 6. Взаимодействие микоплазм с высшими растениями Ключевым вопросом при разработке практических мер профилактики и борьбы с инфекционным заболеванием является вопрос о механизме передачи возбудителя. Полученные результаты дают основание предположить, что микоплазмы могут проникать в растение непосредственно из почвы через корневую систему. Проникновение A. laidlawii в растения через корневую систему изучали из различных сред - водной суспензии, питательной среды и почвы. Возможность проникновения A. laidlawii (штамм 1) в растения люцерны (Medicago sativa) из питательной среды изучали в условиях стерильного модельного опыта. В вариантах совместного культивирования люцерны и микоплазм последние тестировали в тканях растений в концентрации не ниже 0,1-1,0 клеток на одну клетку растения. В контрольном варианте микоплазмы не обнаружены. При электронномикроскопическом исследовании срезов листовых пластин в 25 опытных вариантах в проводящих сосудах выявлены типичные по морфологии и ультраструктуре клетки микоплазм. В контрольном варианте такие структуры не обнаружены.
При изучении способности внедрения A. laidlawii (штамм 2) из водной суспензии в растения томата (Lycopersicum esculentum) результаты ПЦР анализа показали присутствие A. laidlawii в 10-дневных проростках всех исследуемых сортов (рис. 11).
В последующие сроки отбора образцов положительный ответ зарегистрирован в растениях сортов Морковный и Манимейкер. В растениях же сорта Золотая Капля присутствие A. laidlawii не установлено (табл. 6). Это связано, вероятно, с тем, что сорт Золотая Капля обладает устойчивостью к фитопатогену как результат действия механизмов иммунной защиты растения, которые включаются в ответ на проникновение микоплазмы.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Рис. 11. Электрофореграмма продуктов амплификации ДНК надземной части растений томата через 10 дней после инфицирования.
1-4 - растения томата сорта Золотая Капля, инфицированные A. laidlawii (4 повторности).
5 - неинфицированные растения томата сорта Золотая Капля (контроль).
6-9 - растения томата сорта Морковный, инфицированные A. laidlawii (4 повторности).
10 - неинфицированные растения томата сорта Морковный (контроль).
11-14 - растения томата сорта Манимейкер, инфицированные A. laidlawii (4 повторности).
15 - неинфицированные растения томата сорта Манимейкер (контроль).
16 - чистая культура A. laidlawii (положительный контроль).
17 - маркер размеров ДНК.
Таблица Идентификация A. laidlawii в различных сортах томата методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) Срок отбора (дни) Сорт томата 10 14 18 22 + + + + + Морковный - - - - + - - - Золотая Капля - - - - + + + + + Манимейкер - - - - инфицированное растение контроль 26 Аналогично при изучении способности A. laidlawii проникать из почвы в растения томата сорта Манимейкер методом ПЦР установлено присутствие микоплазм в растениях на 10, 14, 22, 30 сутки после интродукции (109 КОЕ/г почвы). Проникновение микоплазм происходит через корневую систему томата непосредственно из почвы, так как это единственное звено контакта микоплазм и растений. ДНК A. laidlawii обнаружена как в корнях, так и надземной части томата (рис. 12).
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Рис. 12. Электрофореграмма продуктов амплификации ДНК растений томата сорта Манимейкер.
1-3 – корни + надземная часть растений томата 10 дней после инфицирования A. laidlawii 4-6 - надземная часть растений 14 дней после инфицирования A. laidlawii 7 - корни 14 дней после инфицирования A. laidlawii 8-10 - надземная часть растений 22 дня после инфицирования A. laidlawii 11- корни 22 дня после инфицирования A. laidlawii 12-14 - надземная часть растений 30 дней после инфицирования A. laidlawii 15 - корни 30 дней после инфицирования A. laidlawii 16 - неинфицированные растения томата, отрицательный контроль.
17 – положительный контроль - A. laidlawii.
18 - маркер размеров ДНК.
Однородность результатов, полученных на растениях люцерны и томата, свидетельствуют о том, что корневая система растения как источник питания и сфера обитания благоприятна для A. laidlawii. Микоплазма способна внедряться в неповрежденную корневую систему растения, создавая особую экологическую систему, основными составляющими которой становятся микроорганизм, растение и условия их взаимодействия. Установлена способность A. laidlawii проникать через корневую систему люцерны и томата из водной бактериальной суспензии, питательной среды и непосредственно из почвы. Этот факт позволяет утверждать, что почва может играть роль транзитной среды между зараженными и здоровыми растениями. Микоплазмы способны к миграции от корней в надземные части растений и длительной персистенции в них. Таким образом, можно полагать, что растение служит естественной средой обитания для микоплазм.
В результате экспериментов установлено, что инфицирование M. sativa и L. esculentum клетками A. laidlawii вызывает у растений специфичные морфологические изменения характерные для микоплазмозов, возникающих в природных условиях. Внешние симптомы микоплазменной инфекции у зараженных растений люцерны четко проявились к третьей неделе опыта (табл. 7). Средняя длина инфицированных растений превышала длину контрольных примерно в 2 раза. У зараженных микоплазмами растений 27 наблюдалось утолщение стеблей и изменение их окраски, увеличение числа листьев, ширины листовых пластин, большее число междоузлий и устойчивая тенденция к увеличению их длины. Увеличение ширины листа, то есть формирование более округлой листовой пластины, удлинение междоузлий и повышенная облиственность - характерные внешние признаки проявления микоплазменной инфекции (Власов и др., 1985).
Табл. 7.
Влияние Acholeplasma laidlawii на рост и развитие растений люцерны Биометрические показатели Длина Размеры листа Длина Число Вариант Число междо Число растения, междо длина, ширина, стеблей узлий, листьев см узлий мм мм мм Контроль (растения без 6,3+0,9 1,0+0,3 5,0+0,3 10,8+3,7 5,7+0,3 5,0+0,6 4,4+0, заражения) Растения, инфицированные 11,1+2,7 1,4+0,2 7,9+0,6 18,3+5,9 8,5+0,5 6,1+0,6 5,7+0, A. laidlawii При анализе ультраструктуры клеток листа, в частности фотосинтезирующих клеток мезофилла, у инфицированных растений выявлены серьезные дегенеративные изменения. Клетки контрольных растений имели типичное строение и характерную структуру основных клеточных компартментов (рис.13 б, в). В растениях, инфицированных микоплазмами, клетки сосудистых тканей выглядят "пустыми", что скорее всего связано с изменением степени гидратации цитоплазмы и некрозом части структур. Органеллы плохо различимы и видоизменены (рис.13 г, д).
Среди клеток сосудистых тканей встречаются клетки с отслоившимся протопластом, заполненные типичными по морфологии и ультраструктуре клетками ахолеплазм - сферической или овальной формы с диаметром 0,20 0,25 мкм невысокой электронной плотности и более мелкими, плотными структурами.
Эти клетки не содержат пластид. Число митохондрий в растениях, инфицированных микоплазмами, заметно выше, чем в контрольных, причем структура их в разных клетках изменяется от нормальной до чрезвычайно плотной с пузыревидными кристами и признаками начинающейся деструкции. Встречается эндоплазматический ретикулум везикулярной формы. Плазмодесмы видоизменены.
28 Таким образом, заражение микоплазмами растений люцерны приводит к существенным изменениям в ультраструктуре клеток мезофилла. Очевидно, при этом происходит нарушение пластидогенеза, что ведет к резкому сокращению числа хлоропластов. Клетки мезофилла постепенно утрачивают Рис. 13. Ультраструктура клеток микоплазм (Acholeplasma laidlawii) в жидкой среде (а) и ультраструктурная организация клеток мезофилла листа люцерны (Medicago sativa): б, в – контрольные растения;
г, д – растения, зараженные микоплазмой.
П – пластида;
КС – клеточная стенка;
В – вакуоль;
МТ - митохондрия;
Л – липид;
ПД – плазмодесма, М – клетки микоплазм.
Масштабная линейка 0,5 мкм 29 фотосинтетическую функцию. Локализация микоплазм в сосудистой ткани приводит к закупорке проводящих элементов и нарушению их нормальной функции. Выявленные на ультраструктурном уровне изменения, очевидно, приводят впоследствии к развитию таких характерных для микоплазмоза симптомов как хлороз и увядание.
Инфицирование 5-ти суточных проростков L. esculentum клетками A.
laidlawii выявило сортовые различия в реакциях растений. Результаты биометрических измерений в динамике показали, что длина эпикотиля и площадь листовой поверхности у инфицированных растений томата сортов Морковный и Манимейкер больше, чем у контрольных. У сорта Золотая капля достоверных различий между инфицированными и контрольными растениями по этим показателям не выявлено (рис. 14, 15). Необходимо отметить, что методом ПЦР A. laidlawii была идентифицирована в растениях томата сорта Золотая капля только в 1-й срок отбора проб– на 10-й день после инфицирования проростков. В последующие сроки анализа микоплазмы не выявлялись, в то время как в растениях других сортов положительный ответ регистрировался в течение всего опыта (75 суток) (табл.6).
Длительная персистенция A. laidlawii в вегетирующих растениях томата сортов Манимейкер и Морковный стимулировала их развитие:
активизировала метаболические процессы см сорт Морковный инфицированный и способствовала интенсивному росту сорт Морковный контроль растений, что, очевидно, связано с адаптационными реакциями организма хозяина на инфекционный агент. В течение всего опыта инфицированные растения не 14 18 обнаруживали характерных для дни отбора микоплазмозов симптомов, кроме более Рис. 14. Влияние A. laidlawii на длину интенсивного роста растений.
эпикотиля растений томатa. Ключевую роль в процессах 35 см сорт Морковный инфицированный адаптации в рассматриваемой системе сорт Морковный контроль микоплазма-растение может играть реорганизация геномов взаимодействующих организмов (Чернов и др., 2005;
Мухаметшина, 2006). Известно, что микоплазменные инфекции дни отбора 14 18 индуцируют образование перестроек в Рис. 15. Влияние A. laidlawii на площадь хромосомах растительных клеток.
листовой поверхности растений томата Установлено также, что в процессе взаимодействия происходит трансформация ахолеплазм в некультивируемые 30 формы и наноклетки, сопровождающаяся перестройками в их геноме.
Микоплазмы имеют очень высокий темп мутирования – до 10% в каждой генерации популяции оказываются мутантными. В этой связи персистенция в растительных клетках микоплазм может обусловливать постоянный "всплеск" защитных реакций растения (окислительный взрыв и синтез физиологически высокоактивных соединений), которые и лежат в основе наблюдаемых морфофизиологических изменений.
Что касается сорта Золотая капля, то в данном случае представляется возможным констатировать подавление микроорганизма иммунной системой растения. Отсутствие признаков инфекционного процесса у зараженных микоплазмами растений позволяет заключить, что существенное значение для развития микоплазмоза имеет генотип растений.
В связи с полученными результатами представляло интерес исследование влияния микоплазм на симбиотическую систему. Влияние A.
laidlawii на формирование и нитрогеназную активность бобово ризобиального симбиоза Medicago sativa-Rhizobium meliloti изучали в условиях стерильного модельного опыта. Для совместного культивирования микоплазм, люцерны и клубеньковых бактерий была предложена питательная среда на основе растительного отвара (Ванькова, 1991), которая позволила совместить эти три биологических объекта в единую лабораторную модель. В варианте совместного внесения ахолеплазм и ризобий в среду с предварительно асептически выращенной люцерной первые инфицированные специфически искривленные корневые волоски появились на 23-и сут. что на 16 сут. позже, чем в контрольном варианте (без ахолеплазм) (рис. 16, 17 в, е). Их количество было в 4-5 раз меньшим, чем в контроле и наблюдались они только на главном корне. Начиная с 11 сут., вокруг главного корня отмечалось характерное помутнение питательной среды в виде "белого облака", связанное с развитием ахолеплазм (рис. 17 г).
Первые клубеньки появились на 61 сут.
культивирования, что на 48 сут. позже, чем в контроле. Более позднее Рис. 16 Влияние А. laidlawii на образование появление инфицированных корневых корневых волосков, меньшее их число, специфически искривленных волосков на растениях Мedicago sativa.
значительная задержка в формировании клубеньков свидетельствуют о том, что микоплазмы тормозят процесс инфицирования растения-хозяина ризобиями.
31 Электронномикроскопическое (СЭМ) изучение клубеньков выявило деформацию их поверхности при инфицировании растений люцерны A.
laidlawii (рис. 18а, б, в). Наблюдаемые изменения, возможно, связаны с внедрением микоплазм в клетки клубеньков или имеют иные, более глубокие причины, обусловленные физиологическими процессами, которые возникают в клетках растений при инвазии микоплазм в корневую систему. На боковых корнях растений, инфицированных ризобиями и A.
laidlawii, с 21 сут. наблюдались кроме того вздутия (утолщения), имеющие гладкую поверхность и аморфную Рисунок 17. а, б - колонии A. lаidlawii штамм А структуру (рис. 18 г).
(мелкие округлые) и R. meliloti штамм 425а при совместном культивировании на питательной Задержка в процессе среде;
в, е -специфически искривленные инфицирования сказалась и на уровне корневые волоски люцерны;
г - эффект «белого облака» вокруг корня;
д - ветвистость корневых азотфиксирующей активности волосков. Размер масштабной линейки – 0, растений. На 10-е сут.
мм.
азотфиксирующая активность в контроле (заражение только R. meliloti) составила 32,8 нМ/ч, в то время как в опытном варианте (заражение ризобиями и ахолеплазмами) активность нитрогеназы не выявлена.
На 170-е сут. культивирования растений люцерны азотфиксирующая активность в контроле осталась практически на том же уровне, в инфицированных микоплазмой Рисунок 18. Сканирующая микроскопия растениях она увеличилась до поверхности клубеньков (а, б, в) и утолщения 14,1 нМ/ч, а к 230-м сут. достигла (г) на корнях растений люцерны. Обозначения:
а - контрольное растение, 61,2 нМ/ч, что более, чем в 2 раза инфицированное только R. meliloti (штамм превышало показания в контроле 425a) б-г - растения, инфицированные (рис. 19).
совместно R. meliloti (штамм 425a) и Полученные результаты A. laidlawii (штамм 1).
свидетельствуют о том, что влияние Размер масштабной линейки - 0,5мм.
32 A. laidlawii на гомеостатичную симбиотическую систему Medicago sativa Rhizobium meliloti выражалось, с одной стороны, в задержке процесса Нитрогеназная активность нМ C H /ч/растение 2 инфицирования ризобиями растения инфицирование R. meliloti хозяина, что с позиции биологической инфицирование R. meliloti + A. laidlawii целесообразности можно объяснить действием независимого фактора регуляции численности чужеродной для системы бактериальной популяции, а именно конкуренцией ахолеплазм с ризобиями на стадии преинфекции за 10 170 растительные эксудаты. С другой Время, сутки стороны, ахолеплазмы, как оказалось, Рис. 19. Влияние A. laidlawii на нитрогеназ- не только не подавляли развития ную активность симбиотической системы растения, но более того - проявляли Medicago sativa – Rhizobium meliloti.
эффект стимулирующего (протектив ного) действия на нитрогеназную активность сформировавшейся системы Medicago sativa - Rhizobium meliloti, что, очевидно, связано с их непосредственным и с косвенным – через метаболизм растения воздействием на ризобии.
Заключение Сравнительный анализ численности НФ бактерий и бактерий обычного размера в почве и корневой зоне растений выявил высокое содержание ультрамикроскопических форм бактерий. Доля НФ от общего числа бактерий в почве в среднем за исследуемый период составляла 65%, в ризосфере и ризоплане – 37% и 43% соответственно, а в отдельные сроки значительно превышала долю бактериальных клеток с обычными размерами. Редукция размеров почвенных бактерий, их тенденция к карликовости, по-видимому, являются общим законом микробной жизни в условиях почвы и характерной чертой природных форм почвенных микроорганизмов. В то время как у одних организмов малые формы наследственно закреплены, у других они носят, возможно, модификационный характер. Уменьшение размера бактериальной клетки сопровождается возрастанием поверхностно объемного коэффициента, что приводит к увеличению скорости обмена веществами с внешней средой. Мелкие клетки обладают повышенной проникающей способностью, что позволяет им осваивать субстраты и экологические ниши, недоступные для бактерий обычного размера.
Уменьшение размеров почвенных бактерий имеет, по-видимому, адаптивное значение и связано с их большей устойчивостью в условиях почвы.
33 Большой экологической пластичностью обладают мельчайшие лишенные ригидной клеточной стенки прокариоты – микоплазмы. Изучение поведения интродуцированной в почву популяции фитопатогенных микоплазм A. laidlawii показало, что длительность сохранения бактерий в почве зависит от условий окружающей среды. Полученные результаты приводят к выводу, что почва не является средой благоприятной для репродукции фитопатогенных микоплазм, то есть средой их обитания, а служит резерватором, где они могут сохраняться определенное время в жизнеспособном состоянии.
Микоплазмы (ахолеплазмы) теснейшим образом связаны с фитобиосферой, поскольку естественная среда обитания для них – растения.
Они способны проникать в растения не только с помощью насекомых переносчиков, но и непосредственно из почвы через корневую систему, мигрировать в надземные органы и длительно персистировать в них.
Колонизация клеток тканей растений микоплазмами может как вызывать, так и не вызывать патологические реакции. Степень проявления патогенеза у разных индивидуумов зависит от генетически детерминированных особенностей взаимодействия паразита и организма-хозяина.
ВЫВОДЫ 1. Установлено, что значительная часть бактерий в почве и корневой зоне растений имеет ультрамикроскопически малые размеры – средний диаметр клеток составляет 0,3±0,2мкм, длина - 0,6±0,3мкм.
Численность НФ колеблется в широких пределах и определяется условиями среды обитания. Доля НФ от общего числа бактерий в почве в среднем за исследуемый период составляла 65%, в ризосфере и ризоплане - 37% и 43% соответственно. В отдельные сроки исследования доля НФ значительно превышала долю бактериальных клеток с обычными размерами. Выявлены существенные различия в динамике численности НФ в почве, ризосфере и ризоплане, отражающие их экологическую специализацию.
2. Выявлено значительное разнообразие морфотипов наноформ почвенных бактерий. Большинство наблюдаемых на электронограммах клеток находится в адгезированном состоянии на поверхности почвенных частиц, имеет микроколониальный характер распространения, содержит включения, что свидетельствует об их физиологической активности в природной среде. Многие НФ лишены клеточной стенки, что позволяет их отнести к L - формам либо микоплазмам.
34 3. Исследованы новые штаммы сапротрофных железоокисляющих микоплазм р. Siderococcus, выделенные из лугово-черноземной почвы рисовников. Показано, что деятельность железоокисляющих микоплазм приводит к увеличению эффективной растворимости гидроксида железа, при этом не происходит существенных изменений окислительно-восстановительных условий в окружающей среде.
Установлена комплексообразующая способность бактерий по отношению к железу.
4. Разработаны селективные методы выделения микоплазм из почвы, включающие процедуру предварительной десорбции клеток, питательные среды и условия культивирования. Установлено, что для проведения ПЦР анализа в черноземной почве целесообразно использовать непрямой метод выделения ДНК, поскольку при прямом экстрагировании ДНК происходит ингибирование реакции.
5. Доказано, что почва не является естественной средой обитания фитопатогенных микоплазм A. laidlawii. Показано двумя параллельными методами (микробиологическим посевом и ПЦР), что популяция A. laidlawii после интродукции не сохраняется в почве длительное время, численность ее не стабилизируется. Время выживания определяется факторами внешней среды и уровнем внесения популяции. В черноземной почве интродуцированная популяция A. laidlawii сохраняется более длительное время (15 суток) по сравнению с дерново-подзолистой почвой (не более суток).
6. Выявлена способность микоплазм, на примере A laidlawii, проникать из почвы через неповрежденную корневую систему, мигрировать в надземные органы растений и длительно в них персистировать.
Установленный факт позволяет утверждать, что почва может играть роль источника инфекции, транзитной среды между зараженными и здоровыми растениями, а растение служит естественной экологической нишей для микоплазм.
7. Прослежены изменения морфогенеза в растениях Medicago sativa и Lycopersicum esculentum при заражении A. laidlawii, характерные для микоплазмозов растений в природных условиях, и процесс деградации ультраструктуры клеток листовой ткани. Выявлено, что инфицированные растения растут и развиваются более интенсивно, что свидетельствует о включении механизмов защиты растений и развитии адаптивных процессов в системе «микоплазма-растение».
8. Установлена сортовая устойчивость томатов сорта Золотая Капля к A. laidlawii.
35 9. Выявлено, что влияние A. laidlawii на гомеостатичную симбиотическую систему Medicago sativa - Rhizobium meliloti выражается, с одной стороны, в задержке процесса инфицирования ризобиями растения-хозяина, с другой стороны – в стимулирующем (протективном) действии на нитрогеназную активность сформировавшейся системы.
Список публикаций основных результатов докторской диссертации в журналах, рекомендуемых ВАК 1. Ванькова, А.А. Морфоцитологические особенности растений люцерны посевной (Medicago sativa L.) и томата (Lyc.esculentum Mill), инфицированных микоплазмами A. laidlawii / Ванькова А.А., Иванов П.И., Серебренникова Л.А. // Известия ТСХА. – 2007. – Вып.4. – С.
142-148.
2. Ванькова, А.А. Взаимодействие между микоплазмами (A. laidlawii) и растениями (Medicago sativa и Lyc. esculentum Mill) / Ванькова А.А., Иванов П.И., Мидянник Г.А., Серебренникова Л.А.// Известия ТСХА. – 2008. – Вып.1. – С. 129-133.