Разработка системы технологических решений для конструирования рекомбинантных белковых антигенов

На правах рукописи

ЛУНИН ВЛАДИМИР ГЛЕБОВИЧ РАЗРАБОТКА СИСТЕМЫ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ РЕШЕНИЙ ДЛЯ КОНСТРУИРОВАНИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВЫХ АНТИГЕНОВ Специальность 03.01.06 – Биотехнология (в том числе, нанобиотехнологии) Диссертация в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва – 2010 1

Работа выполнена в Государственном научном учреждении «Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии» Россельхозакадемии (г. Москва) и Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (г. Москва).

Карягина–Жулина Анна

Научный консультант:

доктор биологических наук Станиславовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Поляков Владимир Юрьевич доктор биологических наук, профессор Морозов Сергей Юрьевич доктор биологических наук, профессор Патрушев Лев Иванович

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН

Защита состоится _ 2011 г. в _ на заседании диссертационного совета Д 006.027.01 при Всероссийском научно– исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии по адресу: 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, д. 42;

тел.: (495) 976–65–44;

факс: (495) 977–09–47;

e–mail: [email protected]

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно– исследовательского института сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН.

Автореферат разослан «_» 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 006.027.01, кандидат биологических наук Меликова С.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Получение дешевых, высокоочищенных и стабильных препаратов биологически активных белков, важных для медицинской и сельскохозяйственной практики, является одной из основных задач биотехнологии. Для эффективного решения этой задачи в качестве продуцентов целевых белков чаще всего используют лабораторные штаммы Escherichia coli. Применение генно-инженерных методов в сочетании с микробиологическим синтезом позволило получить целый ряд биологически активных препаратов: гормоны, интерфероны, цитокины, ферменты и т.д.

Однако для многих белков–антигенов, вакцинно–ценных белков, белков различной природы, имеющих большую молекулярную массу, используемые на ранних этапах подходы генной инженерии оказались неэффективны. С их помощью не удавалось освободиться от примесей токсичных липополисахаридов, хозяйской ДНК и решить проблему рефолдинга или восстановления нативной структуры синтезируемого бактериями белка. Эти проблемы были частично решены путем использования эукариотических систем наработки рекомбинантных белков. Однако в реальной практике белковые продукты, получаемые в культурах эукариотических клеток, обладали высокой стоимостью за счет дороговизны питательных сред, сложности оборудования для культивирования клеток эукариот, высоких требований к стерильности, медленного роста культур и т.д. Таким образом, разработка новых технологических решений и подходов, позволяющих получать различные рекомбинантные белки, является актуальной задачей современной биотехнологии.

Целью данной работы являлась разработка системы новых технологических решений для создания универсальной технологии получения рекомбинантных белковых антигенов и других белков, имеющих практическое значение для медицины и сельскохозяйственной биотехнологии, с помощью методов генной инженерии и микробиологического синтеза. Использование данных разработок должно приводить к повышению эффективности создаваемых бактериальных продуцентов, упрощению технологических подходов, снижению себестоимости и повышению качества получаемых белковых препаратов.

Целью работы было также получение на основе разработанных решений новых биотехнологических продуктов, обладающих уникальными свойствами: стимуляторов роста сельскохозяйственных животных, систем доставки лекарственных препаратов, антигенов, кандидатных вакцин.

Для выполнения работы были поставлены следующие ЗАДАЧИ:

Разработка системы технологических решений для создания 1.

универсальной технологии получения рекомбинантных биологически активных белков, приводящей к повышению эффективности создаваемых бактериальных продуцентов, упрощению технологических подходов, снижению себестоимости и повышению качества получаемых белковых препаратов.

На основе разработанной системы технологических решений создание 2.

препаратов рекомбинантных двух– и мультидоменных биологически активных белков, антигенов, ферментов, в том числе, иммобилизованных на различных сорбентах за счет аффинного домена, с целью разработки проточных биореакторов, диагностикумов, кандидатных вакцин, стимуляторов роста сельскохозяйственных животных и других биотехнологических продуктов для применения в сельскохозяйственной и медицинской практике.

Основные положения, выносимые на защиту.

Научно–обоснованная система технологических решений, 1.

направленная на создание универсальной технологии получения рекомбинантных белковых антигенов и других белков, имеющих практическое значение для медицины и сельскохозяйственной биотехнологии, приводящая к повышению эффективности создаваемых бактериальных продуцентов, упрощению технологических подходов, снижению себестоимости и повышению качества получаемых белковых препаратов.

Разработка мультидоменных белковых нанотранспортеров, 2.

обеспечивающих специфичную доставку лекарственных средств в клетки мишени, интернализацию в них, выход из внутриклеточных везикул и доставку в ядро.

Разработка препарата–стимулятора роста с/х животных IV поколения 3.

«CAT-Сом», основанного на использовании двухдоменного гибридного белка, включающего соматостатин и белок-носитель для иммунокоррекции.

Нанобиотехнологический подход, основанный на получении 4.

гибридных белков, состоящих из домена целевого белка и аффинного домена, позволяющий повысить устойчивость целевого продукта к протеазам, существенно увеличить выход целевого белка, осуществлять самопроизвольное специфическое связывание с матрицей, высокоэффективную очистку, концентрирование, иммобилизацию и рефолдинг целевого белка на поверхности сорбента.

Разработка препаратов рекомбинантных двух– и мультидоменных 5.

антигенов, биологически активных белков и ферментов, иммобилизованных на различных сорбентах за счет аффинного домена, с целью создания проточных биореакторов, диагностикумов, кандидатных вакцин, и других систем для использования в сельскохозяйственной и медицинской практике.

Научная новизна работы:

В настоящем исследовании разработана система научно–обоснованных технологических решений, использование которых позволяет в минимальные сроки получать эффективные биологически активные препараты на основе рекомбинантных белков, а именно: разработаны схемы направленной контролируемой полимеризации и сборки генно-инженерных конструкций, обеспечивающих синтез белков с повторяющимися последовательностями или мультидоменных белков с заданными свойствами;

создана коллекция белков–носителей и векторов, включающих гены данных белков, адаптированных для клонирования в них целевых фрагментов ДНК;

разработана оригинальная технология аффинной самосборки рекомбинантных белков на полимерных матрицах, обеспечивающая высокоэффективную одностадийную очистку, рефолдинг и специфическую сорбцию целевых белков.

Практическая реализация вышеперечисленных технологических решений привела к получению ряда новых биотехнологических продуктов.

Впервые генно–инженерным способом созданы мультидоменные белки (нанотранспортеры), обеспечивающие распознавание и доставку лекарственных средств, включая фотоактивные соединения, в раковые клетки. Методом микробиологического синтеза создан высокоэффективный рекомбинантный препарат – стимулятор роста сельскохозяйственных животных IV поколения «CAT-Сом», применяемый для иммунокоррекции ингибитора роста животных соматостатина. Аналогов данного препарата в России и в мире не существует. Проклонированы новые гены белков бактерий и эукариот, кодирующие аффинные домены с уникальными свойствами (высокая термостабильность, специфичность, высокая константа связывания, по параметрам приближающаяся к ковалентному взаимодействию). Полученные на основе данных технологических решений содержащие аффинные домены гибридные белки, такие, как бета галактозидаза, различные антигены, факторы роста и цитокины, полностью сохраняют свою специфическую активность и могут быть использованы в самых различных областях практического применения.

Впервые показано, что иммобилизация вакцинно–ценных белков на полисахаридных сорбентах приводит к улучшению их иммуногенных свойств. Используемая технология иммобилизации полностью сохраняет антигенные свойства целевого белка. При этом обеспечивается укрупнение, полимеризация антигена, полисахаридный сорбент выступает в роли адъюванта при иммунизации и стимулирует развитие более длительного и напряженного иммунного ответа на вводимые белки.

Впервые разработаны основанные на принципе самосборки подходы для получения субъединичных генно-инженерных микро- и нановакцин. На основе этих подходов впервые получены кандидатные субъединичные генно–инженерные вакцины для профилактики туберкулеза, туляремии и лептоспироза.

Научно–практическое значение работы:

Получены мультидоменные белки, обеспечивающие адресную 1.

доставку лекарственных соединений в раковые клетки. Практическим применением данных белков может быть создание на их основе нового поколения лекарственных препаратов, обладающих низкой токсичностью и высокой эффективностью в отношении распознавания и уничтожения опухолевых клеток.

Создан препарат «CAT-Сом» – высокоэффективный стимулятор роста 2.

IV поколения, обеспечивающий ускорение роста, увеличение привесов, надоев, размера шкуры и повышение коэффициента мясности сельскохозяйственных животных.

Показана перспективность использования двухкомпонентных белков, 3.

обладающих способностью к аффинной сорбции на целлюлозе и ферментативной активностью термостабильной –галактозидазы, для создания проточных реакторов, позволяющих проводить эффективный ферментативный гидролиз лактозы на глюкозу и галактозу. Полученная технология может быть внедрена и использована в пищевой промышленности для получения безлактозного молока и утилизации подсырной и творожной сывороток. Данная технология может быть адаптирована для белков с другой ферментативной (синтетазной или гидролитической) активностью.

Получены препараты ряда важных для медицины и 4.

сельскохозяйственной биотехнологии ростовых факторов и цитокинов:

эпителиального фактора роста, фактора роста фибробластов, интерферона бета. Специфическая сорбция на аффинных матрицах обеспечивает одностадийную очистку препаратов белка до 95% чистоты.

Получены препараты гибридных белковых антигенов, соединенных с 5.

аффинными доменами, таких, как ESAT6, CFP10, Ag85A из Mycobacterium tuberculosis, TUL4 из Francisella tularensis, домены 1, 4 и 5 белка LigA из Leptospira interrogans, RTA и RTB рицина, иммобилизованных на аффинных матрицах. Эти препараты могут быть использованы в диагностических наборах различного формата: плашечном, сферических и планарных биочипах и т.д. На основе данных рекомбинантных антигенов разработана технология получения субъединичных генно–инженерных микро- и нановакцин. Вакцины основаны на самосборке белковых антигенов на микро- и наночастицах полисахаридных матриц, которые выполняют функцию носителя, депо и адъюванта одновременно. Полисахаридный носитель обеспечивает укрупнение и полимеризацию антигена, и стимулирует развитие более напряженного и длительного иммунного ответа на вводимые белки. Иммунизация такими кандидатными вакцинами обеспечивает индукцию синтеза цитокинов, высокий титр специфических антител и формирование эффективного Th-1 или Th-2 ответа, в зависимости от природы специфического антигена. На основе данной технологии разработаны кандидатные субъединичные генно–инженерные вакцины для профилактики туберкулеза, туляремии и лептоспироза.

Апробация диссертации. Разработанный препарат «CAT-Сом» – стимулятор роста сельскохозяйственных животных IV поколения на основе рекомбинантного соматостатина – в настоящее время внедрен на крупных животноводческих, свиноводческих и птицеводческих комплексах РФ.

Основные результаты работы доложены на 10 всероссийских и международных конференциях, конгрессах, форумах, сессиях и совещаниях по фундаментальным и прикладным аспектам биотехнологии.

Объем и структура работы. Диссертация в виде научного доклада изложена на 56 страницах, иллюстрирована 10 таблицами и 18 рисунками, состоит из разделов «

Общая характеристика работы

», «Результаты исследований», «Заключение», «Выводы», списка работ по теме диссертации, включающего 51 статью в ведущих российских и зарубежных рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, 16 авторских свидетельств и патентов, 1 заявку на патент, на которую получено положительное решение Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Разработка системы технологических решений для повышения 1.

эффективности создаваемых продуцентов, упрощения технологических подходов, снижения себестоимости и повышения качества получаемых белковых препаратов.

Полимеризация генов или их фрагментов обеспечивает возможность получения белков, имеющих повторяющиеся участки, что может повышать иммуногенность полученных препаратов. Одним из важнейших направлений современной биотехнологии является конструирование мультидоменных белков с использованием технологии рекомбинантных ДНК посредством соединения нескольких отдельных модулей в общую конструкцию. Важным моментом при этом является необходимость полимеризации/cборки фрагментов ДНК в заданной ориентации и правильной последовательности.

Это может быть достигнуто, например, при использовании несимметричных липких концов, образующихся при гидролизе некоторыми рестриктазами (например, AvaI и BbvII), или при использовании специальных адапторов для полимеризации. В данном исследовании разработаны протоколы клонирования фрагментов ДНК, основанные на направленной контролируемой полимеризации/сборке фрагментов ДНК с идентичными липкими концами, которые образуются некоторыми парами эндонуклеаз рестрикции, узнающими различающиеся последовательности ДНК, например, BamHI и BglII.

Разработанные протоколы клонирования позволяют получать любые мультимодульные конструкции генов. Конечная конструкция собирается из модулей следующей структуры:

X сайт — BamHI сайт — модуль (фрагмент ДНК) — BglII сайт — Y сайт.

Поскольку липкие концы ДНК, образующиеся в результате гидролиза эндонуклеазами рестрикции BamHI (5’–GGATCC–3’) и BglII (5’– AGATCT–3’), одинаковы, модули можно соединять в любой последовательности. Например, если нужно добавить новый модуль со стороны BglII конца фрагмента ДНК, его обрабатывают эндонуклеазой рестрикции BglII. Присоединяемый фрагмент обрабатывают BamHI. После лигирования образуемый гибридный сайт BglII/BamHI (5’–AGATCC–3’) не может быть гидролизован ни BglII, ни BamHI. Повторение этой процедуры приведет к конструированию мультимодульного гена с необходимым количеством модулей в нужной последовательности их расположения друг относительно друга.

Другие пары рестриктаз, имеющие различные сайты, но одинаковые липкие концы, которые также могут быть использованы для направленной контролируемой полимеризации фрагментов ДНК, это пары XhoI – SalGI, NheI – XbaI и др.

При создании мультидоменного белка возможно взаимное влияние составляющих его модулей друг на друга, приводящее к нарушению третичной структуры и, как следствие, изменению исходных свойств белка:

снижению или потере каталитической активности, иммуногенности, способности связываться с рецепторами и т.д. Для решения этой проблемы используются спейсерные последовательности, которые располагаются между модулями белка. В результате перебора большого количества различных спейсеров был сформирован набор спейсеров, наиболее часто обеспечивающих получение биологически активных мультимодульных белков. К ним относятся гибкие спейсеры, состоящие из чередующихся аминокислотных остатков Gly и Ser – (Gly–Ser)5 или (Gly–Gly–Gly–Gly–Ser)4, а также жесткие (Arg–Pro)1,2,4,8 и (Lys–Pro)4. Как правило, спейсеры, которые рассматриваются как отдельный модуль при конструировании двух- и мультидоменных конструкций, фланкированы сайтами BamHI и BglII. Для увеличения вариантов присоединения нестандартных модулей получены также варианты фланкирования спейсеров сайтами SmaI и EheI или сайтом Eco47III.

Необходимость получения гибридных белков, содержащих, помимо целевого белка, белок–носитель, может быть обусловлена множеством причин, таких как стабилизация целевого белка, повышение уровня экспрессии клонированного фрагмента, обеспечение возможности одностадийной очистки, повышение иммуногенности целевого белка или пептида и т.д. Решение широкого спектра разнообразных биотехнологических задач привело к созданию обширной коллекции белков– носителей и векторов, включающих гены данных белков, адаптированных для клонирования в них нужных фрагментов ДНК. Основными белками– носителями, использованными в работе, являются бета–галактозидаза, хлорамфениколацетилтрансфераза E. coli, карбогидратсвязывающие домены:

целлюлозосвязывающий домен, глюкан-связывающий домен, декстран связывающий домен.

Векторы для получения мультидоменных белков с белком–носителем, как правило, в основе имеют базовую часть одного из векторов системы pQE (QIAGEN, США), и содержат следующие элементы:

Для получения целевого домена в С–концевой ориентации 1.

относительно белка–носителя:

[PT5] – [NcoI – BamHI] – [модуль, кодирующий белок–носитель] – [спейсер] – [BglII] – [stop–кодон] – [сайт другой эндонуклеазы рестрикции (обычно HindIII, Kpn2I или XbaI)].

Для получения целевого домена в N–концевой ориентации 2.

относительно белка–носителя:

[PT5] – [NcoI – BamHI] – [спейсер] – [модуль, кодирующий белок– носитель] – [BglII] – [stop–кодон] – [сайт другой эндонуклеазы рестрикции (обычно HindIII, Kpn2I или XbaI)].

При объединении модулей получаем следующие конструкции:

[PT5] – [NcoI – BamHI] – [модуль, кодирующий белок–носитель] – 1.

[спейсер] – [BglII/BamHI] – [модуль, кодирующий целевой домен] – [BglII] – [stop–кодон], [PT5] – [NcoI – BamHI] – [спейсер] – [модуль, кодирующий 2.

целевой домен] – [BglII/BamHI] – [модуль, кодирующий белок–носитель] – [BglII] – [stop–кодон], где: PT5 – промотор бактериофага Т5, (BglII/BamHI) – гибридный сайт BglII и BamHI, не гидролизуемый ни одним из этих ферментов.

В зависимости от конкретных особенностей собираемой конструкции для сборки могут использоваться вектора с различными модификациями:

отсутствием или введением дополнительных сайтов эндонуклеаз рестрикции, удалением или заменой спейсера. Эти же вектора могут быть использованы для получения мультимодульных конструкций, введения в них дополнительных спейсеров и т.д.

Кроме того, при необходимости, вектор может содержать сайты для специфического гидролиза гибридного белка с целью получения нативного биологически активного продукта, например, сайт AspAspAspAspLys для гидролиза энтеропептидазой.

Если белок-носитель представляет собой аффинный домен, т.е.

белковый модуль, обеспечивающий самопроизвольную сорбцию белка на матрице за счет аффинного взаимодействия, гибридный белок может быть достаточно легко получен в форме иммобилизованного на матрице препарата. Эти же свойства могут быть использованы для разработки простой и эффективной схемы очистки белка на определенном носителе (матрице), применимой для широкого спектра целевых белков, соединенных с одним и тем же аффинным доменом.

Ниже приведена схема иммобилизации на матрице и очистки гибридного белка для системы целлюлозосвязывающий домен/целлюлоза, разработанная и широко используемая в данном исследовании (Рис. 1).

Рис. 1. Схема иммобилизации на матрице и очистки гибридного белка с использованием системы целлюлозосвязывающий домен/целлюлоза.

Данная схема одностадийна, практически безынструментальна, позволяет получать белки высокой степени очистки (до 95-99%), благодаря отсутствию в E. coli белков, способных связываться с целлюлозой. При этом могут быть получены как иммобилизованная, так и свободная формы целевых белков.

Практически та же схема сохраняется для других пар «аффинный домен/аффинная матрица», таких, как глюкан-связывающий домен/1,3-бета глюканы (например, оболочки клеток дрожжей);

декстран-связывающий домен/декстраны (например, различные сефадексы);

коллаген-связывающий домен/коллаген.

Разработанные технологические решения, а именно, направленная контролируемая полимеризация/сборка фрагментов ДНК и система белков– носителей и векторов для конструирования гибридных белков, использованы при создании всех полученных в работе белковых конструкций.

Универсальная схема иммобилизации на полимерной матрице и очистки белков, содержащих аффинный домен, использована при получении препаратов гибридной бета-галактозидазы и различных гибридных антигенов.

Получение рекомбинантных белков – мультидоменных модульных 2.

нанотранспортеров противораковых лекарств, придающих им клеточную специфичность и большую эффективность.

Направленный транспорт лекарственных веществ в очаг развития патологического процесса позволяет добиться повышения эффективности лекарственной терапии. Для нее в настоящее время используют нанокапсулы (например, липосомы) или векторы для генной терапии (вирусные и невирусные). Cуть адресной доставки состоит в том, что само лекарственное вещество, а чаще – средство его доставки, вектор, содержит в своем составе специфические домены (антитела, лиганды), узнающие рецепторы на клетках-мишенях. Присутствие распознающих доменов в векторе позволяет ему сконцентрироваться в заданной области (опухоли, очаге воспаления) и доставить туда лекарственное вещество. В отличие от обычного введения лекарственного вещества и его распространения по всему организму направленная доставка позволяет снизить дозу вводимого препарата и минимизировать его воздействие на другие клетки (побочное действие).

Примером лекарственных препаратов, которые необходимо доставлять в строго определенный компартмент клеток, являются фотосенсибилизаторы (ФС), используемые для фотодинамической терапии ряда болезней, особенно онкологических.

Доставить ФС в ядро можно с помощью специальных белков с заданными свойствами, несущих сигнальные последовательности, которые обеспечивают узнавание определенного типа клеток, направленное движение связанного с ними лекарственного средства в клетке и его проникновение в ядро клетки.

Принципиальная целесообразность использования модульных белков для направленной доставки лекарственных средств была доказана работами коллектива под руководством проф. А. С. Соболева (Институт биологии гена РАН, Москва). Основные работы выполнялись А. А. Розенкранцем, П. В.

Гулаком и Д. Янсом (Department of Biochemistry and Molecular Biology, Monash University, Clayton, Victoria, Australia). Белковые конструкции из трех и четырех блоков получали путем соединения модулей бифункциональными кросс–сшивающими реагентами (подробнее см. Akhlynina et al., 1997;

Akhlynina et al., 1999;

Chopp et al., 1996;

Rosenkranz et al., 2000). Эти молекулярные конструкции, обладающие заданным набором модулей, действительно, обеспечивали специфичную доставку ФС в клетки–мишени, интернализацию в них, выход из внутриклеточных везикул и доставку в ядро.

Далее с помощью разработанной в данном исследовании направленной контролируемой полимеризации/сборки фрагментов ДНК автором был спланирован и создан набор мультидоменных векторных белковых молекул, состоящих из следующих модулей: интернализуемого лигандного домена, обеспечивающего «узнавание» клетки–мишени и последующий рецептор– опосредованный эндоцитоз мультидоменного белка внутрь не;

эндосомолитического домена, обеспечивающего выход из эндосом;

сигнала ядерного транспорта (NLS, Nuclear Localization Signal), обеспечивающего взаимодействие с импортинами – цитозольными белками, осуществляющими активное перемещение в ядро;

домена–носителя для связывания доставляемого лекарственного вещества (Таблица 1).

Таблица 1.

Характеристика мультидоменных белков-нанотранспортеров.

Назва- Структура Молеку Уровень Раствори– Биологи– ние мультидоменного белка лярная экспрес– мость, ческая плаз- масса, сии, % актив– % миды кДа ность pR751 HMP–NLS SV40–DTOX– 75,1 30 60 + EGF pR752 HMP–NLS SV40–DTOX– 76,3 30 60 + (Gly–Ser)5–EGF pR754 HMP–NLS SV40–DTOX– 71,9 8 20 + (Gly–Ser)5–SOM pR755 HMP–NLS SV40–DTOX– 70,7 15 20 + SOM pR522 HMP–NLS SV40–MSH 50,1 20–30 70 + pR523 Gala–HMP–NLS SV40–MSH 52,6 5–8 70 + pR676 DTOX–HMP–NLS SV40– 69,5 20–30 70 + MSH pR695 NLS VirD2–HMP–DTOX– 72,1 10 30–40 + MSH pR914 DTOX–HMP–NLS–IL3 84,4 10 30–40 + Примечания. Специфические лиганды: SOM – соматостатин;

EGF – эпидермальный фактор роста;

MSH – –меланоцитостимулирующий гормон;

IL3 – интерлейкин. Сигналы ядерного транспорта: NLS SV40 – сигнал ядерного транспорта из Т–антигена вируса SV–40;

NLS VirD2 – сигнал ядерного транспорта из белка агробактериальной трансформации VirD2. HMP – порфирин– связывающий белок – гемоглобиноподобный белок (haemoglobin–like protein) E.

coli. DTOX – эндосомолитический модуль – транслокационный домен (Т) дифтерийного токсина с прилегающим к нему природным спейсером, разделяющим Т и L домены нативного дифтерийного токсина. Gala пептид – мембраносорбирующий модуль – фрагмент белка оболочки вируса Synday. (Gly– Ser)5 – спейсер.

В качестве интернализуемых лигандных модулей в полученных конструкциях использовали –меланоцитостимулирующий гормон (MSH) и эпидермальный фактор роста (EGF), взаимодействующие с меланокортиновыми–1 рецепторами, сверх-экспрессированными на клетках меланомы человека и мышей, или рецепторами ErbB1, сверх экспрессированными на клетках рака головы и шеи, рака пищевода, мочевого пузыря и др., а также интерлейкин-3 (для клеток острого миелоидного лейкоза со сверхэкспрессией рецепторов к интерлейкину-3) и соматостатин (SOM) (для клеток нейробластомы со сверхэкспрессией соматостатиновых рецепторов) (Sobolev A.S., 2008).

В качестве сигнала ядерного транспорта использовали оптимизированную последовательность NLS большого Т–антигена вируса SV40. Гемоглобиноподобный белок НМР E. coli использовали в качестве домена–носителя. В качестве эндосомолитического модуля использовали транслокационный домен дифтерийного токсина (DTox) (Rosenkranz et al., 2003;

Розенкранц и др. 2003;

Gilyazova et al., 2006).

Функциональность каждого из доменов полученных мультидоменных белков была исследована с помощью различных экспериментальных подходов, разработанных в лаборатории проф. А.С. Соболева (Соболев, 2009;

Sobolev, 2009).

В результате проведенных экспериментов было показано, что все модули в составе мультидоменного белка сохранили заложенные в них функции, что позволило достичь основной цели – доставки мультидоменного белка в ядро клетки–мишени. Кроме того, лекарственное вещество, ФС, ковалентно присоединенное к мультидоменному белку, не утратило способность генерировать цитотоксический компонент этого типа лекарств – активные формы кислорода.

Была исследована опосредуемая мультидоменными белками внутриядерная и специфическая для заданного типа клеток доставка противоопухолевых лекарств. В опытах на клетках эпидермоидной карциномы человека А431 (Gilyazova et al., 2006), сверх–экспрессирующей рецепторы ErbB1, выявилось резкое, более чем в 1000–3000 раз, усиление цитотоксического действия ФС хлорина е6 и бактериохлорина р, доставляемых мультидоменными белками в ядра клеток, по сравнению с эффектом свободных ФС;

оценка была сделана по соотношению ЕС50, т.е.

концентраций ФС, обеспечивающих полумаксимальный эффект. Более того, мультидоменный белок обеспечивал ФС клеточную специфичность: хлорин е6 практически в одинаковой степени поражал как клетки–мишени (А431), так и клетки, экспрессирующие малое число рецепторов ErbB1 (клетки NIH 3T3), тогда как в комплексе с мультидоменным белком этот ФС был неэффективен для клеток NIH 3T3 в диапазоне концентраций, убивающих клетки–мишени А431. Аналогичные результаты (Rosenkranz et al., 2003) были получены с использованием MSH–содержащих мультидоменных белков на клетках мышиной меланомы B16–F1, сверх-экспрессирующих рецепторы к МСГ.

Эксперименты in vivo были проведены на мышиной модели меланомы кожи (Gilyazova et al., 2006). MSH–содержащий мультидоменный белок, введенный внутривенно мышам C57/black с сингенной меланомой B16–F (инокулированной подкожно), уже через 3 часа начинал накапливаться в клетках опухоли и их ядрах. Бактериохлорин р сам по себе не влиял ни на скорость роста опухоли, ни на среднюю продолжительность жизни мышей с меланомой, тогда как те же дозы этого ФС, вводимые по такой же схеме, но транспортируемые МНТ, достоверно ингибировали рост опухолей и увеличивали среднюю продолжительность жизни мышей.

Таким образом, созданы мультидоменные белки-нанотранспортеры, обеспечивающие «узнавание» нужной эукариотической клетки–мишени и последующий направленный транспорт лекарственных соединений в клеточное ядро. Полученные в работе мультидоменные белки обеспечивают клеточную специфичность и высокую эффективность противоопухолевым лекарственным веществам. Модульная система строения мультидоменных белков позволяет легко заменять одни модули на другие, обладающие другим набором свойств, и получать транспортеры с новой специфичностью в отношении лекарственных средств и клеток–мишеней.

Разработка стимулятора роста сельскохозяйственных животных IV 3.

поколения, основанного на рекомбинантном гибридном белке, включающем белок-носитель и соматостатин.

Соматостатин – биологически активный тетрадекапептид, который вырабатывается в гипоталамусе и желудочно–кишечном тракте.

Соматостатин синтезируется в виде белка предшественника, который в результате созревания процессируется в две формы – соматостатин–14 и соматостатин–28. Последовательность соматостатина–14 очень консервативна у позвоночных, а у млекопитающих вообще не имеет видовой специфичности. Соматостатин оказывает сильное ингибирующее действие на широкий круг гормонов и связанные с ними функции организма:

соматотропин, тиреотропный гормон, панкреатические гормоны (инсулин, глюкагон и др.), гормоны желудочно-кишечного тракта (секретин, гастрин, пепсин и др.), липазу, секрецию желудочных кислот, абсорбцию глюкозы, триглицеридов и аминокислот.

Широкий спектр действия соматостатина на факторы, контролирующие рост и усвоение пищи, открывает значительные перспективы его использования для регуляции роста животных, снижения экономических затрат на корма и содержание животных и т.д. Необходимый эффект может быть получен в результате аутоиммунной реакции на введенный в организм препарат соматостатина, приводящей к снижению концентрации пептида в крови за счет связывания с антителами (иммунокоррекции) и, как следствие, индуцирующей анаболические процессы и ускоренный рост животных.

Подход, основанный на иммунокоррекции, позволяет получать экологически чистые продукты, т.к. он не связан с применением стероидных гормонов и антибиотиков, а основан на незначительных изменениях концентраций анаболических факторов.

Соматостатин является низкомолекулярным белком, время жизни которого в кровотоке составляет несколько минут. Поэтому для иммунизации соматостатином необходимо его применять в комплексе с носителем, например, в составе химерного белка, полученного с помощью генно–инженерного подхода.

Для эффективного воздействия стимуляторов, использующих принцип гормональной иммунокоррекции, важно добиться иммунодоминантного положения антигенной детерминанты в составе гибридного белка для иммунокомпетентных клеток. Другой важной задачей при создании таких препаратов является достижение достаточной иммуногенности целевого белка, что во многом обусловлено выбором белка-носителя антигенной детерминанты.

Одним из способов повышения выхода препарата и, как следствие, его удешевления, является высокоэффективная экспрессия белка в бактериальных клетках с его накоплением в виде малорастворимых телец включения.

Для отбора наиболее эффективного варианта химерного белка, несущего в своем составе последовательность соматостатина, обеспечивающего высокий выход целевого компонента, а также получаемого в форме нерастворимых телец включения, было синтезировано более генно–инженерных конструкций, включающих различные варианты носителей, лигандов и соединяющего их спейсера (Рис. 2, А). Полученные конструкции экспрессировали в различных штаммах E. coli, исследовали растворимость химерных белков и их устойчивость к протеолизу.

Обобщенные результаты проведенных экспериментов представлены на рис.

2, Б.

Показано, что лучшими свойствами – наименьшей растворимостью и подверженностью протеолизу в процессе выделения и очистки – обладают белки, содержащие в качестве носителя последовательность хлорамфениколацетилтрансферазы (САТ) с делетированными десятью аминокислотными остатками на C–конце.

А Б Рис. 2. Структура генно–инженерных конструкций с геном соматостатина, включающих различные варианты носителей, лигандов и соединяющих их спейсеров (А);

растворимость и устойчивость к протеолизу гибридных белков, содержащих последовательность соматостатина, включающих различные домены, обеспечивающие функцию носителя (Б). * – при полимеризации последовательности, кодирующие соматостатин, разделяются спейсером SerSerSer(Arg–Pro)7. LacZ – последовательность, кодирующая ген –галактозидазы, DHFR – последовательность, кодирующая ген дигидрофолатредуктазы, САТ – последовательность, кодирующая ген хлорамфениколацетилтрансферазы, САТm – последовательность гена хлорамфениколацетилтрансферазы с мутацией, введенной для элиминации сайта EcoRI из гена, САТ (–10)m – хлорамфениколацетилтрансфераза без последних 10–ти аминокислотных остатков с мутацией в сайте EcoRI.

Таблица 2.

Влияние выбора промотора и штамма-продуцента E. coli на экспрессию генно–инженерных конструкций, содержащих ген соматостатина.

Промотор Штаммы E. coli Уровень экспрессии Промоторы конститутивного синтеза HB101, 8012, 8017, МКД3207 до 5% Pcat Промоторы индуцибельного синтеза СА161, MC1857 до 10% PR до 30% Ptrp KN M15[pRep4], DH5–, XL–1blue до 30% PT Примечания. Pcat – промотор гена хлорамфениколацетилтрансферазы, PR – правый промотор бактериофага лямбда, Ptrp – промотор триптофанового оперона E.

coli, PT5 – промотор бактериофага Т5. Уровень экспрессии измеряли в процентах от тотального белка клетки.

Экспрессия полученных конструкций в различных штаммах E. coli при клонировании под разными промоторами приведена в таблице 2.

Максимальный уровень экспрессии – до 30% от тотального белка клетки – достигался при использовании промотора Ptrp и штамма E. coli KN126, а также промотора PT5 и штаммов E. coli M15[pRep4], DH5–, XL–1blue.

Изучение взаимодействия исследуемых белков в иммуноблоттинге со специфической САТ-соматостатиновой сывороткой фирмы Amersham (Великобритания), меченной [125I], показало наличие специфического связывания рекомбинантных белков, содержащих последовательность соматостатина, и отсутствие такого взаимодействия без соматостатина.

Для более детального анализа иммунологической активности рекомбинантных белков была разработана тест–система радиоиммунного анализа (РИА) соматостатина. В конкурентном РИА исследовалось взаимодействие меченого [125I] соматостатина, полученного пептидным синтезом, стандарта соматостатина (Вектор–Биопродукт, Россия), гибридных белков с последовательностью соматостатина и САТ-соматостатиновой сыворотки фирмы Amersham. В результате измерений в белках, полученных с помощью генно–инженерного подхода, показано наличие антигенных детерминант, проявляющих присущую соматостатину иммунореактивность.

Исследования с целью оценки возможности использования препаратов химерных белков с последовательностью соматостатина в качестве стимуляторов в животноводстве проводили на поголовье крупного рогатого скота черно–пестрой породы и поголовье свиней породы крупная белая.

Иммунизацию нетелей проводили препаратами химерных белков с последовательностью соматостатина, содержащими в качестве носителя хлорамфениколацетилтрансферазу и дигидрофолатредуктазу. Полученные данные свидетельствуют о достоверном (p0,05) повышении уровня лактации первотелок в результате введения рекомбинантных белков с последовательностью соматостатина.

Величина надоев в группе, иммунизированной белками с последовательностью соматостатина, по сравнению с неиммунизированной группой была выше в течение 60 дней со дня отела. Превышение контрольного уровня было максимальным (около 20%) на 30–35 день, далее сохраняясь на уровне 9–10%, постепенно снижаясь к 60–му дню.

Максимальные надои наблюдались в группах, иммунизированных нерастворимыми белками.

Как в динамике роста, так и в абсолютной величине наблюдалось достоверное (p0,05) увеличение веса телят, рожденных от матерей, иммунизированных химерными белками с последовательностью соматостатина по сравнению с телятами от матерей неиммунизированной группы. Превышение наблюдалось в течение 50 дней, достигая максимального значения на 25–28 день. Сходный результат получен при иммунизации супоросных свиноматок.

Во всех экспериментальных группах не наблюдалось никаких патологий протекания беременности и родов у матерей, а также мертворожденности и врожденных патологий у потомства. При развитии телят и поросят отклонений от физиологических норм не наблюдалось.

Раздой первотелок проходил в пределах нормы.

Данные по введению белковых конъюгатов с соматостатином беременным животным хорошо согласуются с результатами других исследований (Spencer G.S.G., 1984, Fadlalla et al., 1985), где наблюдался усиленный рост потомства от иммунизированных матерей (до 20% в возрасте трех недель у коз) по сравнению с контрольными животными.

Наблюдаемые эффекты более выражены при введении нерастворимых форм рекомбинантных белков по сравнению с растворимыми, что, вероятно, обусловлено более высокой иммуногенностью, более сильным взаимодействием с иммунокомпетентными клетками и усилением адъювантных свойств препаратов белков с низкой растворимостью.

Затухание эффектов примерно через 60 дней после последнего введения, вероятно, обусловлено сроком жизни иммунокомпетентных клеток и антител, т.е. эффективных компонентов иммунной системы.

Наилучшие результаты в экспериментах на крупных сельскохозяйственных животных обеспечивала конструкция САТ(–10)m– (Arg–Pro)4–SOM. В силу малой растворимости этот белок может быть очищен с помощью простой технологической схемы. Дополнительным преимуществом данного белка является его низкая токсичность для бактерий, используемых для микробиологического синтеза, и, соответственно, повышенный выход продукта.

Крупномасштабные испытания препарата на основе конструкции САТ(–10)m–(Arg–Pro)4–SOM, получившего название «CAT-Сом», проводились ООО "НПК "Современные биотехнологии".

В 2005-2006 годах препарат использовали для повышения молочной продуктивности коров в семи субъектах России в 27 хозяйствах различных форм собственности. В таблице 3 в качестве примера приведены результаты применения препарата CAT-Сом в семи хозяйствах Пестовского района Новгородской области.

Таблица 3.

Результаты применения препарата CAT-Сом в хозяйствах Пестовского района Новгородской области.

Наименование Кол-во коров Выход телят, % Сервис-период, Дополнитель хозяйства сутки ный надой на корову в год Всего В т.ч. Всего В т.ч. Всего В т.ч. с при с с CAT применении Сом CAT- CAT CAT-Сом, кг Сом Сом К-з «Смена» 75 20 91 95 91 90 К-з «Красное знамя» 175 24 73 100 87 75 К-з «Красная звезда» 80 8 75 89 93 70 К-з «Прогресс» 165 19 66 95 87 75 К-з «За мир» 103 36 88 100 75 70 К-з «Путь Ленина» 87 15 100 100 65 60 КФХ «Бойцовой» 106 10 74 100 70 53 Результаты применения препарата свидетельствуют о его высокой эффективности для повышения молочной продуктивности коров.

Специалисты хозяйств, в которых применяли препарат CAT-Сом, указывают на существенное снижение яловости коров, иммунизированных препаратом, а также на увеличение содержания белка в молоке в среднем на 0,2%.

Всего за период 2005-2007 гг. в хозяйствах, в которых применяли препарат CAT-Сом, получено дополнительно 52000 тонн молока.

Применение препарата на всем поголовье дойного стада, находящегося в животноводческих хозяйствах России, позволит увеличить эти показатели до 3,6 миллионов тонн в год.

Применение препарата в 6 хозяйствах Белоруссии и 3 хозяйствах Узбекистана повысило молочную продуктивность коров в среднем на 9% по отношению к молочной продуктивности животных контрольных групп.

Эффективность применения препарата CAT-Сом при откорме крупного рогатого скота изучалась в 5 хозяйствах Кировской, Белгородской и Калужской областей в период 2001-2004 гг. Результаты научно производственных опытов, проведенных в 2001-2004 гг., представлены в таблице 4.

Таблица 4.

Эффективность применения препарата CAT-Сом при откорме молодняка КРС.

№ Хозяйства Количество Началь- Средне- Средняя Дополни животных в ный суточ- живая тельно группах, возраст ные масса получено гол. живот- привесы животного продукции ных, при сдаче по отноше мес. нию к г кг %к % конт- контролю, кг ролю Агрофирма 150 - опыт 3,0 620 112 296 112 «Дороничи», Ленинский р-н 150 3,0 552 100 263 100 контроль Кировской обл.

Учхоз 105 - опыт 2,0 677 109 398 107 ВГСХА «Чистые пруды», Ленинский 105 2,0 619 100 370 100 р-н контроль Кировской обл.

Колхоз им.

180 - опыт 2,5 852 112 365 112 «М.А.

Гурьянова», Жуковский 180 р-н 2,5 760 100 325 100 контроль Калужской обл.

Хозяйства 4 280 - опыт 3,0 702 108 301 108 Бабынинско го р-на 280 3,0 646 100 278 100 Калужской контроль области Колхоз им.

5 5, 30 - опыт 969 109 174 109 «Фрунзе», (телки) Белгородс кий р-н 30 - 5, 884 100 159 100 Белгород- контроль (телки) ской обл.

Показано, что оптимальным является применение препарата CAT-Сом при выращивании животных до 12-13 месячного возраста. В течение 2005 2007 гг. препарат CAT-Сом применяли в животноводческих хозяйствах в различных регионах России. При откорме 129413 бычков и телок получены дополнительно десятки тонн мяса, и прибыль хозяйств составила 1200 млн.

рублей.

Хорошие результаты получены также при применении препарата CAT Сом при откорме поросят, а также в бройлерном птицеводстве. В настоящее время препарат CAT-Сом внедрен на крупных животноводческих, свиноводческих и птицеводческих комплексах. Постановлением Правительства Российской Федерации от 10 марта 2009 г. за разработку научных основ и внедрение ресурсосберегающей технологии повышения рентабельности мясного и молочного животноводства, бройлерного птицеводства, коллективу разработчиков, в том числе, автору настоящего исследования, присуждена премия Правительства Российской Федерации в области науки и техники.

Разработка проточного реактора для гидролиза лактозы в 4.

молочных продуктах на основе двудоменного белка, состоящего из бета– галактозидазного и целлюлозосвязывающего доменов белков термофильных микроорганизмов.

Присутствие лактозы в молочной подсырной сыворотке является основным фактором, затрудняющим ее переработку и возможность дальнейшего использования в пищевых целях. Промышленная переработка сыворотки выгодна и с экологической точки зрения, поскольку при ее сбрасывании в окружающую среду, наряду с потерей ценных пищевых веществ, возникает проблема загрязнения сточных вод.

Улучшить технологические и диетические свойства сыворотки и молока возможно путем ферментативного гидролиза лактозы на составляющие моносахариды — глюкозу и галактозу. Наиболее перспективными считаются ферментативные способы гидролиза лактозы иммобилизованными бета–галактозидазами (Nakkharat et al., 2006, Neuraus et al., 2006).

Для молочной промышленности перспективными являются бета– галактозидазы термофильных микроорганизмов, обладающие повышенной термостабильностью, высоким сродством к субстрату, способностью эффективно работать при рН молочной сыворотки (Neuhaus et al., 2006;

Ladero et al., 2003). В качестве такого фермента в работе была использована бета–галактозидаза из Thermoanaerobacter ethanolicus (LAC). Для конструирования гибридных двудоменных белков, состоящих из термостабильной бета-галактозидазы и термостабильного (LAC) целлюлозосвязывающего домена (CBD) эндоглюканазы CelD Anaerocellum thermophilum, использованы разработанные в данном исследовании векторы.

Получены две двухмодульные конструкции со спейсером с различным порядком расположения доменов: рLACspСBD и pCBDspLAC, а также плазмида с геном бета-галактозидазы рLAC.

Присутствие в структуре модуля CBD позволяет проводить в одну стадию очистку, концентрирование и иммобилизацию гибридного белка на целлюлозном сорбенте. Белки LACspCBD и CBDspLAC обладают способностью необратимо связываться с целлюлозой: не элюируются с сорбента в диапазоне значений pH 4 – 11, температуры 0 – 75°С и концентраций соли 0 – 5 М NaCl. Таким образом, положение СВD в составе гибридного белка не влияет на его субстратсвязывающие свойства.

При изучении энзиматических свойств белков оказалось, что препараты LACspCBD имеют в 3 раза более высокую удельную активность, чем CBDspLAC (Таблица 5). Температурный оптимум иммобилизованного препарата фермента LACspCBD и препарата фермента CBDspLAC в растворе составляет 65 – 70°С, что несколько ниже температурного оптимума термостабильной бета–галактозидазы, не содержащей целлюлозо связывающего домена, соответствующего 75 – 80°С. Оптимальные значения pH для всех трех ферментных препаратов одинаковы и составляют 5,7 – 6,0 в фосфатном буфере при 75°С.

Таблица 5.

Характеристика полученных продуцентов свободной бета галактозидазы и гибридных белков.

Название Молекулярная Уровень Биологическая белка масса белка экспрессии,% активность (кДа) (Vmax, ед./мг белка) LAC 83 5 CBD–sp–LAC 109 5 LAC–sp–CBD 109 5 Примечание. sp – спейсер (Gly–Ser)5.

Для изучения термостабильности препараты иммобилизованных рекомбинантных белков инкубировали при разных температурах без добавления субстрата. Показано, что LACspCBD значительно стабильнее CBDspLAC при t=55°С. При 65°С препарат CBDspLAC сохранял низкую активность (менее 10%) в течение 6 суток, а препарат LАСspCBD был активен в течение 2-х месяцев. Бета–галактозидаза в составе LАСspCBD оказалась более активной и стабильной, поэтому дальнейшие исследования проводились с этим гибридным белком.

На основе хроматографической колонки, заполненной сорбентом с иммобилизованным гибридным белком LАСspCBD, был сконструирован колоночный мини–реактор проточного типа. Была исследована зависимость превращения лактозы от скорости потока раствора субстрата (Рис. 3).

При уменьшении скорости потока происходит более глубокий гидролиз лактозы с увеличеним пиков основных продуктов гидролиза — глюкозы и галактозы. Наряду с основными продуктами наблюдаются три пика, хроматографическая подвижность которых позволяет предположить, что первый из дополнительных пиков является дисахаридом, а два последних — трисахаридами. Наличие дополнительных пиков можно объяснить способностью некоторых бета–галактозидаз переносить остатки галактозы на различные акцепторы, осуществляя либо внутримолекулярное, либо межмолекулярное трансгалактозилирование (Gekas V., Lopez–Leiva M., 1985).

Рис. 3. Хроматографический анализ продуктов гидролиза лактозы (150 мМ, 10 мМ ацетатный буфер рН 6,5) при 45°С и различных скоростях потока (F = 0,108, 0,136, 0,166, 0,197, 0,25, 0,409 и 0,667 мл/мин).

Анализ продуктов гидролиза лактозы проводили также и при других температурах в диапазоне 40 — 70С. На основе полученных данных были подобраны параметры работы реактора, обеспечивающие эффективный и достаточный для улучшения качества сыворотки и молока гидролиз лактозы.

При 70°С реактор, полученный на основе белка LACspCBD, гидролизует 70% исходного раствора лактозы с концентрацией 150 мМ (5%), что соответствует концентрации лактозы в коровьем молоке, при скорости потока раствора субстрата 1,2 объема колонки в минуту. 90% исходного раствора лактозы в тех же условиях гидролизуется при скорости потока раствора субстрата 0,64 объема колонки в минуту. Пропускание через реактор 10000 объемов колонки при скорости потока 1 объем колонки в минуту и температуре 70°С не приводит к снижению эффективности расщепления лактозы. Параметры реактора не менялись при его хранении при комнатной температуре в течение 6 месяцев.

Таким образом, получен гибридный двудоменный белок, состоящий из термостабильной бета-галактозидазы и термостабильного целлюлозосвязывающего домена. Простой одностадийный способ иммобилизации и очистки химерной бета–галактозидазы, а также высокая удельная активность и стабильность этого фермента, делают полученную в работе гибридную термостабильную бета-галактозидазу перспективной с точки зрения ее использования в биотехнологии для гидролиза лактозы в молочных продуктах.

5. Получение двудоменных рекомбинантных антигенов. Разработка подходов к получению диагностикумов и кандидатных генно– инженерных субъединичных вакцин.

5.1. Двудоменные белки антигенов рицина.

Рицин, токсин растительного происхождения из семян клещевины обыкновенной (Ricinus communis), является одним из наиболее сильнодействующих токсинов. Минимальная летальная доза рицина для человека может составлять 5 мкг/кг (Bradberry S.M., 2003). Семена клещевины (касторовые бобы) используют для выделения касторового масла, которое применяется в промышленности, медицине и косметологии. Шрот клещевины, богатый питательными белками, входит в состав комбикормов для сельскохозяйственных животных. Присутствие рицина в семенах клещевины осложняет производство данной продукции. Рицин представляет собой гликопротеин (62 кДа), белковая часть молекулы которого построена из двух субъединиц – каталитической А–субъединицы (RТA, Ricinus Toxin А–chain) и лектиновой В–субъединицы (RTB, Ricinus Toxin B–chain), соединенных одной дисульфидной связью. RТA (30,6 кДа) представляет собой высоко активную N–гликозидазу, отщепляющую консервативный остаток аденина в 28S рРНК эукариот. В результате отщепления остатка аденина рибосомы утрачивают способность связывать факторы элонгации, что ведт к блокированию синтеза новых белков и, как следствие, к апоптозу и гибели эукариотических клеток. RTB (31,4 кДа) представляет собой лектин, выполняющий транспортные функции. Связываясь с остатками D–галактозы и N–ацетилгалактозамина углеводных цепей рецепторных гликопротеинов и гликолипидов поверхности эукариотических клеток, RTB обусловливает эндоцитоз и дальнейший внутриклеточный транспорт токсина (Endo Y. et al., 1987). Благодаря своей потенциальной токсичности, RTA нашла применение в создании иммунотоксинов – конъюгатов, состоящих из токсина и антитела и обладающих направленным токсическим действием, например, в противоопухолевой терапии (Olsnes S. et al., 2001) и терапии ВИЧ (Pincus S.H., 1996). На сегодняшний день не существует препаратов для профилактики и лечения отравлений рицином, поэтому чрезвычайный интерес представляет создание антидотов и вакцин, а также разработка тест систем для экспресс-индикации рицина в окружающей среде и в организме.

Наиболее перспективными представляются антидоты, полученные на основе протективных антител к рицину и тест-системы, основанные на иммунохимических методах. Производство подобных антидотов, тест систем, а также вакцин требует получения антигенов рицина.

Работа с нативным рицином для получения его антигенов крайне сложна ввиду его высокой токсичности. Показано, что рекомбинантные RTA и RTB сохраняют многие эпитопы нативного рицина, в том числе и протективные (Carra J.H. et al., 2007;

McGuinness C.R. et al., 2006;

Maddaloni M. et al., 2004). Поэтому перспективным подходом к получению антигенов рицина является создание рекомбинантных RTA и RTB.

Для увеличения уровня продукции, стабилизации и устойчивости к протеолизу рекомбинантных антигенов рицина в клетках E. coli антигены рицина были клонированы и экспрессированы с использованием разработанной в данном исследовании системы векторов. В качестве белка носителя был использован целлюлозосвязывающий домен (CBD) эндоглюканазы CelD из A. thermophilum. Были созданы генно–инженерные конструкции pRTAspCBD и pRTВspCBD, содержащие в своем составе нуклеотидные последовательности, кодирующие аутентичные RTA или RTB и CBD, соединенные (Gly–Ser)5–спейсером (sp). Индукция экспрессии рекомбинантных генов в E. coli не привела к накоплению белков RTAspCBD и RTВspCBD ожидаемой молекулярной массы (~52 кДа), поэтому далее было решено добиться накопления в E. coli антигенов рицина с CBD путем их секреции в периплазму. В качестве сигнального пептида использовали сигнальную последовательность L–аспарагиназы II E. coli (Sig), являющуюся гомологичной для клеток E. coli, что должно обеспечивать эффективную секрецию рекомбинантных белков в периплазму и отщепление сигнального пептида. Были получены плазмиды pSigRTAspCBD и pSigRTВspCBD (Рис. 4, А), несущие гены гибридных белков, состоящих из А– или В–субъединиц рицина, (Gly–Ser)5–cпейсера, целлюлозосвязывающего домена и сигнального пептида. Уровень продукции целевых белков в клетках E. coli составил приблизительно 5–10% от общего клеточного белка. Целевые белки накапливались в периплазме, причем исключительно в растворимой форме.

Очистку белков проводили по схеме, разработанной в данном исследовании для гибридных белков, содержащих целлюлозосвязывающий домен (см.

раздел 1). Степень очистки белков RTAspCBD и RTBspCBD составляла не менее 95% (Рис. 4, Б).

А Б Pис. 4. Схемы генно–инженерных конструкций pSigRTAspCBD и pSigRTBspCBD и результаты очистки гибридных белков RTAspCBD и RTBspCBD на целлюлозе. А.

Promoter T5 – промотор бактериофага T5;

SD – последовательность Шайна– Дальгарно;

Sig – нуклеотидная последовательность, кодирующая сигнальный пептид L–аспарагиназы II E. coli;

RТA, RТB – нуклеотидные последовательности, кодирующие A– и B–субъединицы рицина;

sp –спейсер (Gly–Ser)5;

CBD – целлюлозосвязывающий домен;

Terminator – терминатор транскрипции. Б.

Электрофореграмма белков в 10% ДСН–полиакриламидном геле с окрашиванием по Кумасси. 1, 3 –– лизаты клеток штаммов–продуцентов RТAspCBD и RTBspCBD после индукции ИПТГ;

2, 4 – препараты очищенных на целлюлозе белков RТAspCBD и RТВspCBD, соответственно. M – маркеры молекулярной массы.

Отсутствие сигнальной последовательности было подтверждено путем анализа трипсинового гидролизата продуктов с использованием MALDI– TOF–масс–спектрометрии.

Очищенными белками RТAspCBD и RТBspCBD проводили иммунизацию кроликов. Анализ активности и специфичности антител в кроличьих гипериммунных сыворотках проводили методом непрямого твердофазного ИФА, где в качестве сенсибилизирующих антигенов были применены химерные белки RТAspCBD, RТBspCBD и нативный рицин.

Гипериммунные сыворотки, полученные при иммунизации кроликов RTAspCBD и RTBspCBD, проявляли активность в разведении 1:12800 по отношению к соответствующим гибридным белкам и в разведении 1:6400 по отношению к нативному рицину при отсутствии активности предиммунной сыворотки к этим же антигенам (Рис. 5). Наблюдали незначительную перекрестную специфичность (активность в разведении 1:3200) в сыворотках, обусловленную присутствием в составе рекомбинантов общей структуры spCBD. Полученные результаты показали, что химерные белки RTAspCBD и RTBspCBD сохранили антигенные свойства нативного рицина.

Рис. 5. Определение титра и специфичности антител в гипериммунных сыворотках крови кролика методом непрямого ИФА: RTAspCBD, RTBspCBD, рицин – антигены, сорбированные на плашке;

Ns – предиммунная сыворотка;

аА – гипериммунная сыворотка, полученная в ответ на RTAspCBD;

аВ – гипериммунная сыворотка, полученная в ответ на RTBspCBD. Титром антител считали обратную величину последнего разведения, в котором ОП450 исследуемого образца сыворотки в 2 раза превышает ОП450 в отрицательном контроле.

Таким образом, созданы эффективные штаммы–продуценты антигенов рицина RTA и RTB в составе гибридных белков с целлюлозосвязывающим доменом и получены высокоочищенные иммуногенные препараты антигенов рицина. Полученные штаммы–продуценты рекомбинантных белков RTAspCBD, RTBspCBD и разработанный метод выделения, очистки и иммобилизации этих белков на целлюлозе могут найти применение в области промышленной биотехнологии при создании вакцинных препаратов для предотвращения отравлений рицином, тест–систем индикации рицина на основе иммунохимических методов, а также для получения антидотов к рицину на основе протективных антител. В случае сохранения токсичности, связанной с каталитической активностью RTA выщеплять аденин из 28S рРНК эукариот, белок RTAspCBD может найти применение в качестве компонента иммунотоксинов для борьбы со злокачественными опухолями и ВИЧ. Белок RTBspCBD может быть использован в качестве адъюванта субъединичных генно–инженерных вакцин.

5.2.Двудоменные белки основного антигена возбудителя туляремии белка TUL4 и целлюлозосвязывающего домена.

Туляремия является актуальной проблемой для здравоохранения в связи с широким распространением ее природных очагов в странах умеренного климатического пояса (Мещерякова И.С., 1994, 1998;

Morner T.

1992).

Для специфической профилактики туляремии в России применяется живая вакцина (на основе штамма Francisella tularensis 15 НИИЭГ), использование которой позволило снизить заболеваемость этой инфекцией до спорадических случаев или небольших вспышек (Мещерякова И.С., 1998;

Khatenever L.M. et al., 1943;

Sandstrom G. 1994). Данная вакцина не лишена определенных недостатков, важнейшим из которых является значительное сходство геномов вакцинного и дикого штаммов F. tularensis. Поэтому применение живой вакцины для вакцинации людей нежелательно.

Одним из перспективных направлений в области совершенствования и разработки эффективных способов защиты от туляремии является создание иммунопрофилактических препаратов нового поколения на основе антигенных компонентов бактериальной клетки F. tularensis. Такими препаратами, например, могут быть субъединичные вакцины (Arnon R. Et al., 2003;

Dertzbaugh M.T., 1998;

Liljeqvist S. et al., 1999).

Возбудитель туляремии является внутриклеточным паразитом, и основная роль в формировании невосприимчивости к туляремии отводится Т–клеточному иммунитету. Основными известными и широко используемыми в вакцинных препаратах нового поколения Т–зависимыми антигенами возбудителя туляремии являются компоненты внешней мембраны, среди которых лучше всего изучен белок TUL4 и липополисахарид (Khlebnikov V.S. et al., 1996;

Sjostedt A. et al., 1992, 1990).

Традиционный способ получения антигенных компонентов туляремии основан на фракционировании бактериальных клеток F. tularensis с помощью различных физико–химических методов. Такие препараты содержат различные примеси, а многочисленные очистки приводят к снижению протективности антигенного компонента. Попытки экспрессировать белок TUL4 в E. coli стандартным способом привели к получению продуцентов с экспрессией целевого гена, детектировать которую было возможно лишь с использованием иммуноблоттинга (Sjstedt et al., 1989).

С целью существенного повышения выхода белка, упрощения схемы его очистки и получения высокоочищенного иммуногенного препарата TUL на основе системы векторов, созданной в данном исследовании, были сконструированы рекомбинантные плазмиды, экспрессирующие гены гибридных белков TUL4–sp–CBD и СBD–sp–TUL4. Данные гибридные белки состоят из последовательности зрелого белка TUL4, (Gly–Ser)5 спейсера и целлюлозосвязывающего домена из Anaerocellum thermophilum в двух возможных ориентациях (Рис. 6).

Рис. 6. Гибридные плазмиды на основе вектора pQE6, контролирующие синтез химерных белков TUL4–sp–CBD и СBD–sp–TUL4.

Уровень экспрессии генов гибридных белков в штамме E. coli DH составляет 30% от тотального белка (Рис. 7).

Использование аффинной очистки рекомбинантных белков TUL4–sp– CBD и СBD–sp–TUL4 на целлюлозе привело к получению препаратов со степенью очистки более 95%. Препарат белка, содержащий комплекс TUL4– sp–CBD и целлюлозы, индуцировал выработку антител к исследуемому белку у лабораторных животных (Рис. 8). Специфичность антител подтверждена с помощью метода иммуноблоттинга.

Рис. 7. Анализ экспрессии генов белков CBD–sp–TUL4 (36,4 кДа) и TUL4–sp–CBD (36 кДа) в клетках E. coli DH5 (электрофорез в 12% ПААГ по Леммли), несущих рекомбинантные плазмиды. 1 – pTUL4–sp–CBD до индукции;

2 – pTUL4–sp–CBD, индукция 2 ч.;

3 – pCBD–sp–TUL4 до индукции;

4 – pCBD–sp–TUL4, индукция 2 ч.;

5 – контроль молекулярной массы 36 кДа;

6 – штамм DH5 до индукции;

7 – штамм DH5, индукция 2 ч.

Рис. 8. Иммуноблоттинг лизатов клеток вакцинного штамма F. tularensis 15/10 и его вариантов 15 pACYCFNLtul4 (вариант с повышенной экспрессией белка TUL4).

А – иммуноблоттинг с конъюгатом козьих антикроличьих IgG с пероксидазой хрена и кроличьей сывороткой к штамму F. tularensis 15/10. Б – иммуноблоттинг с тем же конъюгатом и кроличьей сывороткой к белку TUL4 (разведение 1:50). 1 – лизат клеток F. tularensis 15/10;

лизат клеток F. tularensis 15 рACYCFNLtul4, клон 1;

лизат клеток F. tularensis 15 рACYCFNLtul4, клон 2;

лизат клеток F. tularensis рACYCFNLtul4, клон 3. Молекулярные массы маркерных белков указаны по вертикали.

Таким образом, на основе созданной в данном исследовании системы векторов для получения конструкций с целлюлозосвязывающим доменом, создан эффективный продуцент основного белкового антигена TUL- возбудителя туляремии, наработан высокоочищенный белок, обладающий специфической иммуногенностью. Белок TUL4, полученный с помощью микробиологического синтеза, может быть использован для создания субъединичных вакцин для профилактики туляремии.

5.3. Двудоменные белки антигенов возбудителя туберкулеза и целлюлозосвязывающего домена.

Профилактика туберкулеза – наиболее действенная мера борьбы с этим заболеванием. В настоящее время единственной применяемой вакциной против туберкулеза является BCG (Bacillus Calmette-Guerin), которая представляет собой живой аттенуированный штамм Mycobacterium bovis. Она безопасна, недорога, достаточно эффективно защищает детей от милиарного и диссеминированного туберкулеза, однако не защищает взрослых от легочного туберкулеза, а именно эта форма болезни приводит к распространению инфекции и тяжелой эпидемической ситуации. Поэтому совершенствование существующей и разработка новых вакцин для профилактики туберкулеза является актуальной задачей (Mustafa A.S., 2002).

Перспективным и технологически более совершенным направлением в разработке вакцин следует признать создание субъединичных вакцин на основе одного или нескольких белков Mycobacterium tuberculosis. К потенциально важным вакцинным антигенам относят, в частности, иммунодоминантные секретируемые антигены ESAT6, CFP10, белки комплекса 85 (Ag85A, Ag85B, Ag85C) и другие.

Белки ESAT6 и CFP10 присутствуют в разных штаммах вирулентных микобактерий, но утрачены вакцинным штаммом BCG. In vivo эти белки индуцируют синтез интерферона-гамма (ИФН-) Т-лимфоцитами инфицированных M. tuberculosis лиц, поэтому ESAT6 и CFP10 используются для разработки различных серологических методов диагностики.

Близкородственные белки Ag85 A, B и C кодируются тремя отдельными генами микобактерий многих штаммов, в том числе BCG. Эти антигены также участвуют в формировании Т-клеточного ответа (Arend S.M., 2000;

Berthet F.-X., 1998;

Shen H, 2010).

При разработке вакцинных препаратов на основе отдельных белковых компонентов необходимо обеспечить эффективную систему очистки, чистоту препарата от контаминации липополисахаридом и ДНК штамма продуцента, стабильность синтезируемых белков, простоту тестирования иммуногенности. Особенно важен выбор адъюванта, без которого белковые антигены практически неиммуногенны (Deng Y.H., 2010;

Zhang H, 2010).

Используя созданную в данном исследовании систему векторов для получения конструкций с целлюлозосвязывающим доменом, были сконструированы двухкомпонентные гибридные белки CFP10-CBD, ESAT6 CBD и Ag85A-CBD (Рис. 9).

При выделении все белки были стабильны, при +4°С в PBS буфере с азидом натрия белки хранились в течение 2-6 мес.

На основе этих антигенов по разработанной технологии иммобилизации получили комплексные препараты – суспензии целлюлозы с иммобилизованными белками.

CFP10 CBD T5 pro ter Gly-Ser ESAT6 CBD T5 pro Gly-Ser ter Ag85A CBD T5 pro Gly-Ser ter Рис. 9. Схема генно-инженерных конструкций pCFP10-CBD, pESAT6-CBD и pAg85A-CBD: T5 pro – промотор бактериофага Т5;

ter – терминатор транскрипции;

CFP10, ESAT6, Ag85A – гены соответствующих белков M. tuberculosis;

Gly-Ser – спейсерная последовательность GSPGSGSGSGSGSRS;

CBD – ген целлюлозо связывающего домена A. thermophilum.

Характеристика полученных плазмидных конструкций представлена в таблице 6.

Таблица 6.

Характеристика полученных плазмидных конструкций и уровня экспрессии и растворимости гибридных белков.

Уровень Мr экспрессии Название Описание конструкции белка, белка в E. coli, кДа;

растворимость CFP10 – sp (Gly, Ser) – CBD pCFP10-CBD 32,8 10-15%;

40% ESAT6 – sp (Gly, Ser) – CBD pESAT6-CBD 32,0 10-15%;

50% Ag85A – sp (Gly, Ser) – CBD pAg85A-CBD 54,1 7-10%;

50% Иммуногенность комплексных препаратов на целлюлозе в сравнении с контролями исследовали на инбредных мышах линии C57BL/6. При подкожном введении препаратов через 5 недель выявляли 2-3-кратный прирост ИФН--положительных Т-клеток (выраженный специфический иммунный ответ) на все три антигена и 4-6-кратное усиление пролиферации Т клеток в присутствии соответствующих антигенов в культуре по сравнению с контролем (Рис. 10).

Рис. 10. Пролиферативный ответ Т-клеток паховых лимфатических узлов на антигены Ag85A, ESAT6, CFP10 после двукратной подкожной иммунизации препаратами мышей линии C57BI/6. Группы: 1, 2 – Ag85A-CBD + cell + НАФ (неполный адъювант Фрейнда) с и без Ag85A;

3, 4 – Ag85A-CBD + cell с и без Ag85A;

5, 6 – ESAT6-CBD + cell с и без ESAT6;

7, 8 – CFP10-CBD + cell с и без CFP10;

9, 10 – CBD + cell с и без ESAT6;

11, 12 – cell с и без ESAT6;

13, 14 – контроль с и без ESAT6.

Защитные свойства препаратов на целлюлозе по сравнению с контролем – CBD на целлюлозе – проверяли на генетически чувствительных к туберкулезу инбредных мышах линии I/St, которых после вакцинации заражали аэрозольно вирулентным штаммом M. tuberculosis H37Rv. Через дней в высевах гомогенатов легких и селезенки наблюдалось 5-7-кратное уменьшение бактериальной нагрузки по сравнению с контрольными животными. Кроме того, вакцинация достоверно продлевала срок жизни зараженных животных (Рис. 11).

Таким образом, отработана технология выделения, очистки и доклинической проверки новых вакцинных противотуберкулезных препаратов, представляющих собой гибридные белки антигенов CFP10, ESAT6 и Ag85A M. tuberculosis с целлюлозосвязывающим доменом, иммобилизованные на целлюлозе. Дальнейшие направления исследований в области разработки субъединичных вакцин для профилактики туберкулеза связаны с комбинированием антигенов и расширением круга адъювантных полисахаридных матриц.

Рис. 11. Защитные свойства новых вакцинных препаратов: А) Оценка бактериальной нагрузки в легких при вакцинации мышей комплексными препаратами;

Б) Оценка выживаемости животных, иммунизированных комплексными препаратами.

5.3. Двудоменные белки антигенов возбудителя лептоспироза и целлюлозо- и глюкан-связывающего доменов.

Лептоспирозы относятся к числу повсеместно распространенных природно-очаговых инфекций человека и животных. Действующие природные и антропургические очаги этого заболевания расположены во многих странах мира, включая Россию.

В настоящее время в России наиболее эффективным способом борьбы с лептоспирозом является специфическая профилактика с использованием инактивированной вакцины, содержащей культуры лептоспир основных серологических групп. Применяемая инактивированная вакцина обеспечивает развитие серовароспецифического иммунного ответа длительностью не более 1 года. В странах Западной Европы и США инактивированные вакцины используют только в ветеринарии, вакцина для профилактики лептоспирозов человека отсутствует. Поэтому получение рекомбинантных вакцинно-ценных антигенов лептоспир и изучение их свойств представляет несомненный интерес для разработки подходов к созданию кандидатных субъединичных противолептоспирозных вакцин нового поколения.

Субъединичные вакцины имеют ряд преимуществ, важнейшими из которых являются исключение возможности возникновения манифестной инфекции, низкая реактогенность и возможность создания препарата, обеспечивающего перекрестный (сероваронезависимый) иммунитет (Arnon E. et al. 2003). Вместе с тем, основные сложности при разработке субъединичных вакцин связаны с недостаточными сведениями о протективных антигенах лептоспир и механизмах развития иммунного ответа макроорганизма (Haake D.A. 2000, Palaniappan R.U.M. et al. 2007).

Основная роль в формировании невосприимчивости к лептоспирозу отводится гуморальному иммунному ответу. Стратегии идентификации консервативных антигенов разных сероваров лептоспир сводятся, в основном, к изучению белков наружной мембраны (OMP) (Haake D.A. et al.

2002, Cullen P.A. et al. 2005). Важнейшим открытием среди OMP стало обнаружение иммуноглобулиноподобных белков Lig (Leptospiral immunoglobulin-like), представляющих собой семейство нефимбрильных адгезинов лептоспир, что придало огромный импульс исследованиям, направленным на создание кандидатных субъединичных препаратов (Palaniappan R.U.M. et al. 2002, Matsunaga J. et al. 2003). В настоящее время спектр основных иммуногенных белков патогенных лептоспир окончательно не определен, однако исследователи сходятся во мнении, что из всех известных на сегодняшний день антигенов лептоспир наибольшим вакцинным потенциалом обладает белок LigA (Palaniappan R.U.M. et al.2006, Faisal S.M. et al. 2008).

Проанализировав структуру выбранного антигена LigA и гомологию аминокислотных последовательностей его отдельных модулей – иммуноглобулиноподобных доменов среди разных сероваров лептоспир, были выбраны три домена из консервативной области LigA в качестве потенциальных антигенов - домены 1, 4 и 5 (Рис. 12).

Рис. 12. Схема строения иммуноглобулиноподобного белка LigA.

Были сконструированы рекомбинантные плазмиды, кодирующие гибридные белки D1-CBD, D4-CBD, D5-CBD, а также D1-GBD, D4-GBD и D5-GBD, которые содержат консервативный иммуноглобулиноподобный домен LigA (домен 1, 4 или 5) и целлюлозосвязывающий (CBD), либо 1,3- глюкан-связывающий (GBD) домен из Thermatoga neapolitana (Рис. 13).

На основе полученных плазмид впервые удалось получить эффективные штаммы-продуценты отдельных структурных модулей белка LigA в составе соответствующих химерных белков, обеспечивающие высокий уровень синтеза в клетках E. coli (около 10-15% от тотального белка клетки) (Рис. 14).

Рис. 13. Схемы полученных химерных белков, содержащих рекомбинантный домен LigA (D1, D4, D5) с аффинным доменом (CBD или GBD).

D1-CBD, 31,6 кДа D4-CBD, 32,3 кДа D5-CBD, 32 кДа контроль мол.

массы, 35,8 кДа Рис. 14. Анализ экспрессии рекомбинантных белков в клетках E. coli штамма М15.

Электрофорез в 12%-ном ПААГ-ДСН, окраска Кумасси R-250.

Поскольку домены 1, 4 и 5 LigA являются высококонсервативными и имеют похожую структурную организацию, в дальнейших экспериментах использовали два гибридных белка – D5-CBD и D5-GBD для проведения сравнительных исследований in vivo как самих антигенов, так и сорбентов (целлюлозы и глюкана).

Выделение и очистку белка D5-СBD проводили с использованием в качестве сорбента препарата аморфной (волокнистой) целлюлозы, приготовленной медно-аммиачным способом по методу А.Е. Гурвича (Гурвич А.Е. и др., 1961, 1981) с нашими модификациями. В результате был получен препарат D5-CBD, иммобилизованного на целлюлозе с концентрацией 3 мг белка на 1 мл сорбента, а также раствор антигена D5 CBD с концентрацией белка 4 мг/мл (Рис. 15).

Выделение и очистку белка D5-GBD проводили аналогичным способом с использованием в качестве сорбента препарата глюкана. В результате был получен препарат D5-GBD, иммобилизованный на глюкане, с концентрацией 4 мг белка на 1 мл сорбента, а также раствор антигена D5-GBD с концентрацией белка 3,5 мг/мл (Рис. 16).

Рис 15. Анализ физико-химических свойств белка D5-CBD и препаратов выделенного белка D5-CBD. Электрофорез в 10%-ном ПААГ-ДСН, окраска Кумасси R-250.

Рис. 16. Анализ физико-химических свойств белка D5-GBD и препаратов выделенного белка D5-GBD. Электрофорез в 12%-ном ПААГ-ДСН, окраска Кумасси R-250.

Рекомбинантный антиген D5-CBD использовали для постановки непрямого иммуноферментного анализа с пулами сывороток больных лептоспирозом, вызванного разными серогруппами лептоспир:

Icterohaemorrhagiae, Grippotyphosa, Canicola, Sejroe, а также четырьмя пулами сывороток, полученных от клинически здоровых доноров (коллекция лаборатории лептоспирозов ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи» Минздравсоцразвития России). Результаты исследования антигенных свойств D5-CBD с сыворотками больных методом непрямого ИФА представлены на рис. 17.

Как видно из рис. 17, с рекомбинантным антигеном D5-CBD взаимодействовали антитела сывороток больных лептоспирозом серогрупп Icterohaemorrhagiae (пулы 1, 2, 3) и Canicola (пул 7) (ОП450 0,250).

Сыворотки здоровых доноров (Д, 21, 30 и 50), а также пулы больных, инфицированных серогруппами Grippotyphosa и Sejroe, с антигеном D5-CBD не взаимодействовали (значения ОП450 0,250). Полученные результаты свидетельствуют о сохранении антигенных свойств рекомбинантных доменов LigA в составе полученных химерных белков. Кроме того, обнаруженная групповая специфичность D5-CBD к антителам серогрупп Icterohaemorrhagiae и Canicola отражает близкое антигенное родство этих групп лептоспир, что согласуется с литературными данными.

2, 2, Д(-) 21(-) 30(-) 1, ОП, 450 нм 50(-) 1(Ictero) 2(Ictero) 1, 3(Ictero) 7(Canicola) 10(Grippotyphosa) 0, 12(Sejro) 0, 1:100 1:200 1:400 10 1:1600 1:3200 1: Разведения сывороток Рис. 17. Определение титров специфических антител к антигену D5-CBD в сыворотках больных методом непрямого ИФА.

Для прореагировавших в нИФА сывороток определяли титр специфических анти-D5 антител. Титром считали величину, обратную последнему разведению, в котором ОП в 2 и более раз превышает ОП в отрицательном контроле. Результаты определения титров специфических антител в сыворотках больных представлены в таблице 7. Как видно из таблицы 7, титры специфических антител, определенные методом нИФА с использованием рекомбинантного антигена D5-CBD, во всех случаях, кроме пула №1, коррелируют с титрами антител, определенными в РМА, являющейся «золотым стандартом» диагностики лептоспироза.

Таблица 7.

Титры специфических анти-D5 антител в сыворотках больных лептоспирозом.

Номер пула Серогруппа Титр РМА Титр нИФА 1 Icterohaemorrhagiae 800 2 Icterohaemorrhagiae 800 3 Icterohaemorrhagiae 400 7 Canicola 400 Полученные результаты подтверждают перспективность использования рекомбинантного антигена D5-CBD в качестве маркера для разработки диагностических тест-систем на основе нИФА (Guerreiro H. et al. 2001, Koizumi N, Watanabe H. 2004, Croda J, Ramos J.G.R., Matsunaga J. 2007).

При изучении цитокиновых профилей, появляющихся после введения животным разработанных препаратов, было показано, что препарат рекомбинантного антигена D5-GBD, иммобилизованного на глюкане, способствовал повышенному синтезу интерлейкинов 4 и 10 – ключевых цитокинов гуморального иммунного ответа, который играет основную роль в формировании невосприимчивости к лептоспирозу (Рис. 18).

При введении инактивированной вакцины против лептоспироза в организме развивается иммунный ответ гуморального типа (Th-2), о чем свидетельствует индукция экспрессии IL-1 альфа и бета (активация АПК – макрофагов, моноцитов и В-клеток), а также высокий уровень синтеза IL-4 и IL-10 – цитокинов, поддерживающих дифференцировку Th-2. Наиболее близок к профилю вакцины цитокиновый профиль иммунного ответа на введение препарата GBD-глюкан.

Обнаруженное повышение синтеза провоспалительных цитокинов (интерлейкины 1 и, ФНО) в сыворотках этой же группы животных в первые дни после иммунизации свидетельствует о ранней активации иммунокомпетентных клеток (лимфоцитов, моноцитов, макрофагов), что, по видимому, также является следствием применения глюканового сорбента, и, в целом, способствует повышению иммунного ответа. Таким образом, разработанный препарат D5-GBD, иммобилизованный на глюкане, стимулирует синтез цитокинов гуморального иммунного ответа. Кроме того, благодаря неспецифическим иммуностимулирующим свойствам глюкана в первые-вторые сутки синтезируется большое количество провоспалительных цитокинов, способствующих активации макрофагов и фагоцитов, а также пролиферации и дифференцировке лимфоцитов.

А Группа №11. Инактивированная вакцина Концентрация цитокинов, пг/мл IL-1a IL-1b 800 IL- IL- TNFa 1 2 15 27 29 - Дни эксперимента Б Группа №12. Живая культура Концентрация цитокинов, пг/мл 1000 IL-1a IL-1b IL- 600 IL- TNFa 1 2 15 27 29 - Дни эксперимента В Рис. 18. Цитокиновые профили иммунного ответа животных, иммунизированных инактивированной вакциной (А), живой культурой лептоспир (Б), препаратом рекомбинантного антигена D5-GBD+глюкан (В).

Таблица 8.

Титры специфических антител после иммунизации лабораторных животных.