Факторы патогенности нехолерогенных штаммов vibrio cholerae
На правах рукописи
МОНАХОВА Елена Владимировна ФАКТОРЫ ПАТОГЕННОСТИ НЕХОЛЕРОГЕННЫХ ШТАММОВ Vibrio cholerae 03.02.03 – микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Ростов-на-Дону 2012
Работа выполнена в ФКУЗ «Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Официальные оппоненты:
Тараненко Татьяна Михайловна – доктор биологических наук, профессор ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора, ведущий научный сотрудник лаборатории биохимии и протеомики Швиденко Инна Григорьевна – доктор медицинских наук, профессор ГБОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского» Минздравсоцразвития Российской Федерации, профессор кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии Кацы Елена Ильинична – доктор биологических наук, профессор ФБУН «Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов» Российской академии наук, заведующая лабораторией генетики микроорганизмов Ведущая организация «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека
Защита состоится «»_2012 г. в _ на заседании диссертаци онного совета Д 208.078.01 по защите докторских и кандидатских диссертаций при ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46).
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФКУЗ «Российский науч но-исследовательский противочумный институт «Микроб».
Автореферат разослан «»_2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета, старший научный сотрудник, доктор биологических наук Слудский А.А.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Несмотря на то, что в патогенезе холеры централь ное место принадлежит холерному токсину (CT), патогенность вида Vibrio cholerae носит выраженный полидетерминантный характер. В настоящее время уже описан целый ряд дополнительных токсинов, однако их роль в развитии заболеваний остает ся недостаточно изученной. Генетические детерминанты большинства токсинов из вестны и представлены в базах GenВank. К ним относятся Zot (zonula occludens toxin) и Асе (accessory cholera enterotoxin), гены которых входят в состав генома умеренных филаментозных фагов CTX [Waldor М.К., Mekalanos J.J., 1996] и pre-СТХ [Boyd E.F., Heilpem A.J., 2000];
MARTX (multifunctional autoprocessing repeats-in-toxin) [Fullner Satchell K.J., 2007];
гемагглютинин/протеаза (НА/Р) [Wu Z. et al., 2000;
Ghosh А. et al., 2006], Cef (СНО сеll elongating factor) [McCardell В.А. et al., 2000, 2002], термостабильный токсин (ST) [Arita М. et al., 1986], гемолизин/цитолизин HlyA [Walia К., Ganguly N.K., 2010], cholix-токсин [Jrgensen R. et al., 2008]. У отдельных штаммов неОl/неОl39 серогрупп были выявлены гены термостабильного прямого ге молизина (TDH) V.parahaeтolyticus [Nishibuchi М. et al., 1990], а в одной публикации [O'Brien A.D. et al., 1984] сообщалось о способности V.cholerae к продукции токсина, иммунологически родственного шигаподобному (Sltl). Кроме того, в литературе опи саны токсины NМDCY (non-membrane-damaging cytotoxin) [Saha Р.К. et al., 1996], NCT (new cholera toxin) [Sanyal S., 1984, 1990] и WO7 (novel cholera toxin) [Walia K. et al., 1999], гены которых до сих пор не идентифицированы. Правомерность их статуса как самостоятельных токсинов требует пересмотра с учетом новых данных.
Помимо собственно токсинов, холерные вибрионы продуцируют множество других факторов, таких как пили ТСР (toxin coregulated pili), кодируемые кластером генов в составе острова патогенности VРI [Karaolis D.K.R. et al., 1998), Сер (core encoded pilin) – продукт одного из генов профага СТХ [Waldor М.К., Mekalanos J.J., 1996], MSНA (mannose sensitive hemagglutinin) [Watnick P.I. et al., 1999], нейра минидаза (NanН), ген которой находится в составе острова VPI-2 [Jermyn W.S., Boyd E.F., 2002]. Недавно у V.cholerae nonO1/non139 были выявлены две контакт зависимые системы секреции – третьего и шестого типов, соответственно T3SS [Dzeijman М. et al., 2005] и T6SS [Pukatzki S. et al., 2006]. Их структура, функции, особенности экспрессии и роль в патогенезе охарактеризованы лишь отчасти.
Наш интерес к дополнительным факторам патогенности V. cholerae обусловлен тем, что на территориях России и бывших республик СССР от больных с признаками диареи различной степени тяжести периодически выделяются штаммы O1 и неO1/ неО139 серогрупп, лишенные генов ctxAB. Они не являются эпидемически опасными, но бывают связаны с локальными вспышками острых кишечных инфекций (ОКИ) и заслуживают особого внимания в связи с наносимым моральным и экономическим ущербом. С этой точки зрения представляет интерес изучение вирулентности нехоле рогенных штаммов с различными генотипами на лабораторных моделях включая электронно-микроскопические исследования, которые ранее не проводились.
Для выявления конкретной роли отдельных факторов в патологии необходимы их препараты. Наиболее перспективным подходом является клонирование генов в штаммах кишечной палочки и создание активных продуцентов рекомбинантных бел ков. В распоряжении отечественных ученых до начала наших исследований отсутст вовали такие продуценты Zot, а зарубежным авторам не удалось получить достаточно эффективной продукции штаммами Е. coli таких факторов, как НА/Р, Cef и Асе.
Цель работы. Изучение структурно-функциональных особенностей и биоло гического действия токсинов холерных вибрионов, распространения и экспрессии ге нов факторов патогенности в пределах вида Vibrio cholerae и оценка их значимости в вирулентности нехолерогенных штаммов.
Основные задачи исследования:
1. Клонирование генов гемагглютинин/протеазы hapA, CHO-удлиняющего фактора cef, дополнительного холерного энтеротоксина асе и zonula occludens-токсна zot V.
cholerae в составе плазмидных векторов, обеспечивающих их контролируемую экспрессию, и создание штаммов E.coli – продуцентов кодируемых ими белков.
2. IIолучение препаратов рекомбинантных белков, изучение их свойств и биологиче ского действия на различных моделях. Выявление ультраструктурных изменений, вызываемых препаратами гемагглютинин/протеазы и CHO-удлиняющего фактора Cef в культурах клеток и в кишечнике мышей-сосунков.
3. Биоинформационный анализ гемагглютинин/протеазы, CHO-удлиняющего факто ра Cef, дополнительного холерного энтеротоксина Асе и zonula occludens-токсина Zot V. cholerae. Секвенирование гена cef V.cholerae O139.
4. Генотипическая и фенотипическая характеристика штаммов холерных вибрионов, несущих профаг pre-CTX. Изучение возможности образования ими репликатив ных форм (РФ) и инфекционных фаговых частиц.
5. Сравнительный анализ свойств цитотоксина, не повреждающего мембрану (NМDCY), новых холерных токсинов NCT и WO7 со свойствами известных фак торов патогенности с использованием литературных и собственных данных.
6. Определение с помощью ПЦP распространения среди холерных вибрионов раз личных серогрупп генов профагов СТХ, pre-CTX и RS1, цитотоксического ком плекса RТХ, островов патогенности VРI и VPI-2;
а также ряда других генов. Мо лекулярное зондирование V.cholerae на присутствие в их геномах генов термоста бильного токсина (stп/sto), шигаподобного токсина (slt), термостабильного прямо го гемолизина (tdh) и родственного ему гeмoлизина (trh) V.parahaemolyticus.
7. ПЦP-детекция генов систем секреции третьего и шестого типов и изучение их экс прессии на модели лабораторного штамма амебы Dictyostelium discoideim.
8. Изучение фенотипического проявления вирулентности нехолерогенными штам мами V.cholerae с различными генотипами in vivo и in vitro. Сравнительное изуче ние ультраструктурных изменений, вызываемых холерогенными и нехолероген ными штаммами в кишечнике кроликов-сосунков.
Научная новизна и теоретическая значимость. Получены приоритетные данные о свойствах ряда дополнительных токсинов холерных вибрионов. Впервые сконструированы рекомбинантные плазмиды, экспрессирующие клонированные гены hapA и асе V.cholerae, и серия рекомбинантных плазмид, экспрессирующих гены сеf V.cholerae O1, O139 и nonOl/nonOl39 в штаммах E.coli. Сконструированы штаммы E.coli – высокоактивный продуцент рекомбинантного белка Zot и продуцент гемоли зина proHlyA. Приоритет подтвержден получением авторского свидетельства № 1649809 от 15.01.91 «Штамм бактерий E.coli – продуцент гемолизина Vibrio cholerae eltor»;
патентов на изобретения: № 2313577 от 27.12.07 «Рекомбинантная плазмида, экспрессирующая клонированный ген cef (СНО cell elongating factor) Vibrio cholerae (варианты) и штамм Escherichia coli – продуцент Cef (СНО cell elongating factor) Vibrio cholerae (варианты)»;
№ 2313576 от 27.12.07 «Рекомбинантная плазмида, экс прессирующая клонированный ген асе Vibrio cholerae, и штамм Escherichia coli – продуцент accessory cholera enterotoxin Vibrio cholerae» и № 2306337 от 20.09.07 «Ре комбинантная плазмида, экспрессирующая клонированный ген гемагглютинин/про теазы Vibrio cholerae, и штамм Escherichia coli – продуцент гемагглютинин/протеазы Vibrio cholerae». Получено свидетельство о регистрации в Реестре баз данных Феде ральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам базы данных «Распространение холерных вибрионов в объектах окружающей среды на территории Российской Федерации в 2005-2008 годах» № 2010620040 от 14.01.10.
Впервые доказана идентичность НА/Р и NМDCY, описанного в литературе как новый самостоятельный токсин. Впервые установлено, что Cef V.cholerae O139, в от личие от Cef V.cholerae O1 и nonОl/nonО139, не способен к гидролизу трибутирина при сохранении твиназной активности. Впервые секвенириован ген cef V.cholerae O139, в нем выявлена точковая мутация, которая привела к несинонимичной замене остатка гидрофобной аминокислоты (валина) остатком гидрофильной (треонина), что явилось причиной сужения спектра субстратной специфичности его продукта. Впер вые показана специфичность гена cef для холерных вибрионов О1, неО1/не О139 се рогрупп и ctxAB+ штаммов О139 серогруппы, а также отсутствие этого гена у ctxAB вибрионов Бенгал, сопровождающееся утратой твиназной активности. Впервые выяв лены ультраструктурные изменения в культурах клеток и в кишечнике мышей сосунков под действием препаратов НA/P и Cef холерных вибрионов, показана спо собность этих белков вызывать серьезные повреждения клеточных органелл.
Изучена структура и изменчивость профагов pre-СТХ в составе геномов более 20 штаммов холерных вибрионов, выделенных в СНГ, показана возможность их гори зонтальной передачи за счет образования инфекционных вирионов.
Проведен комплексный анализ генотипических и фенотипических свойств большого числа нехолерогенных штаммов V.cholerae, выделенных на территориях бывшего СССР. В геноме ряда штаммов О1 серогруппы впервые выявлены последо вательности, гомологичные гену tdh V. parahaeтolyticus.
Получены экспериментальные данные, свидетельствующие в пользу того, что NCT, описанный в литературе как новый холерный токсин, представляет собой варь ирующую по составу смесь секретируемых факторов патогенности.
Впервые установлено распространение генов T3SS среди ctxAB- штаммов V.cholerae O1 серогруппы. На модели D.discoideim впервые показана экспрессия T6SS нехолерогенными штаммами O1 серогруппы и определено, что устойчивостью к по еданию амебой обладают только штаммы с генотипом acd-vgrG1+рbd-vgrGЗ+VРI+.
Впервые исследованы ультраструктурные изменения в тонком кишечнике кро ликов-сосунков при заражении холерогенными штаммами O139 и неОl/неО139 серог рупп, нехолерогенными штаммами O1 и неОl/неОl39 серогрупп.
Практическая значимость работы. Штаммы Е.соli, содержащие рекомби нантные плазмиды pНP61, pAce90, pZot69, pCef 69B, pCef61B, pCef 49B, pCef31, де понированы в Государственной коллекции патогенных бактерий (ГКПБ) «Микроб» под номерами КМ 192, КМ 194, КМ 193, КМ 191, КМ 190, КМ 189, КМ 188 соответ ственно. Штамм Е.соli – продуцент гемолизина V.cholerae eltor депонирован в музее живых культур ГИСК им. Л.А.Тарасевича под номером 182. Депонированы в ГКПБ «Микроб» штаммы V.cholerae О1 КМ 253 – продуцент репликативных форм и вирио нов СТХ и RS1 и V.cholerae nonO1/nonO139 КМ 209, одновременно содержащий профаг СТХ и кластер генов T3SS. Нуклеотидная последовательность гена cef V.
cholerae O139 и аминокислотная последовательность его продукта депонированы в базах GenBank под номерами JF499787 и AEC04822.1 соответственно.
Отработаны методы выделения рекомбинантных белков. Подобраны адекват ные биологические модели (культуры клеток) для тестирования токсинов in vitro.
Штамм E.coli, экспрессирующий клонированный ген hapA V.cholerae, и полученный из него препарат HA/P использован сотрудниками лаборатории биохимии микробов РостНИПЧИ в исследованиях системы активатор плазминоген/плазмин у холерных вибрионов (акт внедрения от 4.07.11). Осветленные ультразвуковые дезинтеграты этого же штамма и штамма E.coli – продуцента гемолизина вибриона эльтор исполь зуются сотрудниками группы гибридом в качестве контрольных препаратов при изу чении соответственно цитотоксической и цитодеструктивной активности холерных вибрионов на модели культур клеток (акт внедрения от 9.11.11). Сконструирован но вый набор праймеров для детекции генов V.cholerae. Методы ПЦР используются в лаборатории микробиологии холеры РостНИПЧИ для проведения скрининга музей ных и свежевыделенных культур на присутствие генов факторов патогенности с г. по настоящее время (акт внедрения от 12.09.11), а результаты ПЦР генотипирования – для паспортизации штаммов холерных вибрионов, хранящихся в Музее живых культур Ростовского ПЧИ (акт внедрения от 16.07.11).
Методические подходы к детекции генов факторов патогенности у штаммов V.cholerae вошли в состав «Методических рекомендаций по мониторингу наличия холерных вибрионов в поверхностных водоемах и сточных водах на территории ад министративного района или населенного пункта», одобренных Ученым советом Ро стНИПЧИ и утвержденных директором института (протокол №7 от 22.10.07), МУК 4.2.2218-07 «Лабораторная диагностика холеры», утвержденных Главным государст венным санитарным врачом РФ Г.Г.Онищенко 31.05.07, и практического руководства «Лабораторная диагностика опасных инфекционных заболеваний» (под редакцией акад. РАМН Г.Г.Онищенко и чл.-корр. РАМН В.В.Кутырева, М.: Медицина, 2009).
Основные положения, выносимые на защиту 1. Клонирование гена hapA V.cholerae в Е. coli позволило впервые установить, что рекомбинантная гемагглютинин/протеаза осуществляет не только самопроцессинг, но и деградацию белков чужеродного хозяина. Гемагглютинин/протеаза обладает гемагглютинирующей и протеолитической активностями, осуществляет процес синг холерного токсина, термолабильного токсина кишечной палочки и гемолизи на вибрионов эльтор, а также вызывает морфологические и ультраструктурные повреждения клеток и тканей. Впервые доказана идентичность гемагглюти нин/протеазы и цитотоксина, не повреждающего мембрану (NMDCY).
2. Рекомбинантные белки CHO-удлиняющего фактора Cef, выделенные из штаммов E.coli, экспрессирующих клонированные гены сеf V.cholerae O1, O139 и nonO1/ nonО139, обладают твиназной активностью, вызывают удлинение культивируе мых клеток и накопление жидкости в кишечнике мышей-сосунков, а также значи тельные повреждения ультраструктуры клеток и тканей. Впервые установлено, что ген cef холерных вибрионов Бенгал, в отличие от cef V.cholerae O1 и nonO1/ nonO139, содержит точковую мутацию, приводящую к несинонимичной замене остатка гидрофобной аминокислоты на остаток гидрофильной, следствием чего является утрата его продуктом способности к гидролизу трибутирина.
3. Активные домены (АТ1002) zonula occludens-токсинов Zot, кодируемые генами профагов СТХ и pre-CTX, идентичны, что указывает на наличие у них одинаковой биологической активности. Белки Асе и Zot, выделенные из сконструированных нами рекомбинантных штаммов E.coli, биологически активны на моделях in vitro и in vivo. Холерные вибрионы, содержащие pre-CTX, образуют инфекционные ви рионы, способные к горизонтальному переносу генов факторов патогенности.
4. Новый холерный токсин (NCT), описанный в литературе как отдельный самостоя тельный токсин, представляет собой варьирующую по составу смесь нескольких секретируемых биологически активных факторов, в состав которой могут входить гемагглютинин/протеаза и CHO-удлиняющий фактор Cef.
5. Кластер генов системы секреции третьего типа распространен почти исключи тельно среди нехолерогенных штаммов. Впервые показано присутствие этого кла стера в геномах штаммов O1 серогруппы. Все штаммы холерных вибрионов со держат кластер генов другой системы секреции – шестого типа, но у многих она находится в неактивном состоянии из-за отсутствия актин-связывающего домена ключевого эффектора VgrG1 и/или острова патогенности VРI.
6. Нехолерогенные штаммы V.cholerae могут обусловливать на модели кроликов сосунков энтеропатогенный и сходный с холерогенным эффекты, однако интен сивность эффектов не коррелирует с генотипами. Морфологические и ультра структурные изменения в кишечнике свидетельствуют о том, что факторы пато генности V.cholerae «взаимозаменяемы», то есть отсутствие одних компенсируется повышенной продукцией других, результатом чего является развитие заболевания.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на заседаниях про блемной комиссии «Холера и патогенные для человека вибрионы» межведомственно го научного совета по санитарно-эпидемической охране территории РФ (1993- гг.), Российских научно-практических конференциях по проблеме «Холера» (Ростов н/Д, 1992, 1995, 2003), международных симпозиумах «VIBRIO-2007» (Париж, Фран ция, 2007) и «Fifty years of discovery of cholera toxin: а tribute to S.N.De» (Колката, Ин дия, 2009);
представлены на научной конференции «Генетика и биохимия вирулент ности возбудителей ООИ» (Волгоград, 1992), на юбилейной научной конференции «Диагностика, лечение и профилактика инфекционных заболеваний» (Екатеринбург, 1999), международном конгрессе «Ninth International Congress for Culture Collections» (Brisbane, Австралия, 2000), VI Российском съезде врачей-инфекционистов (Санкт Петербург, 2003);
III, XIII, ХV, ХVII Российских Гастроэнтерологических неделях (Москва, 1997, 2007, 2009, 2011), Всероссийской конференции «Диагностика, лечение и профилактика опасных и особо опасных инфекционных заболеваний» к 80-летию ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России» (Киров, 2008);
международной научно практической конференции «Перспективы сотрудничества государств-членов ШОС в противодействии угрозе инфекционных болезней» (Новосибирск, 2009).
Публикация результатов исследований. Материалы исследований отражены в 63 опубликованных работах, из них 28 – в периодических изданиях из перечня ве дущих рецензируемых научных журналов, утвержденных ВАК Министерства образо вания и науки России и рекомендованных для публикации основных научных резуль татов диссертации на соискание ученой степени, и 1 – в зарубежном издании.
Структура диссертации. Диссертация написана в стиле монографии, изложена на 282 страницах, состоит из введения, шести глав, заключения и выводов, иллюстри рована 20 таблицами и 54 рисунками. Библиография содержит ссылки на 369 публи каций (в том числе 49 работ отечественных и 320 – зарубежных авторов).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Гемагглютинин/протеаза (HA/P) и цитотоксин, не повреждающий мем брану (NMDCY). Поскольку холерные вибрионы продуцируют несколько протеаз, изучение свойств HA/P с использованием штаммов V. cholerae крайне затруднено. До начала наших исследований в литературе имелось всего одно сообщение [Hse C.C., Finkelstein R.A., 1991] о клонировании гена hapA с собственным промотором, но он совершенно не экспрессировался в E.coli. Поэтому мы клонировали этот ген в соста ве вектора pQE30, промотор которого обеспечивает экспрессию чужеродных генов при индукции ИПТГ. ПЦР-амплификат гена hapA длиной 1847 п.н., полученный на матрице ДНК штамма V.cholerae Р-9961 с помощью сконструированных нами прай меров, был встроен в полилинкер pQE30 по сайтам BamHI и HindIII. В результате трансформации E.coli Jm103 были получены клоны, несущие рекомбинантную плаз миду pHP61. Для определения способности рекомбинантов к продукции HA/P их вы ращивали в среде LB с индуцией 1 мМ ИПТГ. Контролем служил штамм, содержа щий векторную плазмиду без вставки. Клетки разрушали ультразвуком, и прозрач ные осветленные дезинтеграты (ОД) использовали для тестирования.
Известно, что первичный продукт гена hapA имеет молекулярную массу (ММ) 69,3 кДа, а зрелая форма HA/P с ММ 32 кДа образуется в результате многоступенча того процессинга [Hse C.C., Finkelstein R.A., 1991]. Поскольку в штаммах E.coli про цессинг рекомбинантных белков обычно не осуществляется, мы ожидали обнаружить в полиакриламидном геле (ПААГ) после SDS-электрофореза лизатов и ОД клеток штамма Jm103pHP61 мажорную полосу с ММ около 70 кДа. Однако в геле присутст вовало всего 3 белка, ММ одного из которых соответствовала таковой зрелой формы HA/P (рис.1А), что указывало на способность HA/P к самопроцессингу и протеолизу большинства внутриклеточных белков E.coli. Это позволило разработать ускоренный метод выделения из рекомбинантных штаммов зрелой формы HA/P с помощью гель фильтрации на колонке с Toyopearl HW55F. В полученном препарате была выявлена мажорная полоса с ММ 32 кДа, примеси других белков практически не поддавались визуализации (рис. 1Б). Выход продукта составлял до 5 мг на 1 г сырой биомассы.
Рисунок 1. SDS-электрофорез:
А – лизатов клеток E.coli Jm103, со держащих рекомбинантную плазмиду pHP61 (дорожки 1,2) и векторную плазми ду pQE30 (3,4), выращенных без индукции (1,3) и с индукцией ИПТГ (2,4);
Б – препарата HA/P (дорожка 3), по лученного с помощью гель-фильтрации содержимого клеток E.coli Jm103pHP (дорожка 2). Дорожка 1 – ОД E.coli Jm103pHP61.
Рекомбинантный белок сохранил все свойства, известные для нативной HA/Р, продуцируемой V.cholerae: вызывал агглютинацию предварительно отобранных «агг лютинабельных» куриных эритроцитов, причем реакция не ингибировалась сахарами [Hse C.C., Finkelstein R.A., 1991];
обладал еще более широким спектром субстратной специфичности по сравнению с описанным ранее [Silva A.J. et al., 2003;
Halpern M. et al., 2003;
Pal A. et al., 2007];
осуществлял процессинг СТ, термолабильного токсина E.coli (LT) [Booth B.A. et al., 1984;
Naka A. et al., 1998] и гемолизина pro-HlyA [Nagamune K. et al., 1996].
Биоинформационный анализ с помощью программ Blast Search и AlignX пока зал, что наиболее высоким уровнем гомологии с HA/P V. cholerae обладали протеазы представителей родов Vibrio, Aeromonas, Pseudomonas, Chromobacterium и Helicobac ter. С помощью программы AlignX Blocks и у этих, и у намного менее гомологичных протеаз (Bacillus, Legionella, Shewanella, Myxococcus) был выявлен каталитический участок, близкий таковому HA/P. Многие из сходных с HA/P цинк-зависимых метал лопротеаз ряда бактерий известны как факторы их патогенности [Hse C.C., Finkel stein R.A., 1990;
Smith A.W. et al., 1996;
Denkin S.M., Nelson D.V., 1999;
Cascon A. et al., 2000]. Поэтому данные биоинформационного анализа свидетельствовали в пользу причастности HA/P к патогенезу, но это предположение нуждалось в эксперимен тальной проверке. С этой целью мы провели исследования биологической активности полученных нами препаратов на моделях in vitro и in vivo.
Рисунок 2. Ультраструктурные изменения в культурах клеток (а,б) и в тонкой кишке мышей-сосунков (в-г) под действием препатата HA/P а – округление клетки HeLa, образование на поверхности пузырей и их отделение без повреждения цитоплазматической мембраны, набухание митохондрий, в цитоплазме видны липидные гранулы, х4200;
б – ретракция клеток CaCo2 и увеличение межкле точных пространств в монослое при сохранении интактных tj, х4200;
в – многочис ленные полости между эпителиальными клетками крипт сообщаются друг с другом с помощью расширенных межэпителиальных пространств, х 5000;
г – образование крупных полостей между эпителиоцитами ворсин, х 8000;
д – усиление трансэндоте лиального микропиноцитоза и появление микродефектов в эндотелиальной выстилке, х 3000.
HA/P вызывала округление клеток CHO, L-929, HeLa, HEp2 и McCoy и разру шение плотного монослоя MDCK и CaCо2, а на модели мышей-сосунков – статисти чески достоверное увеличение веса их кишечника (Р 0,003). Это сопровождалось серьезными ультраструктурными нарушениями, показанными на рис.2. Как и в куль турах тканей, в тонкой кишке в первую очередь обращало на себя внимание не затра гивающее плотных контактов (tj) появление крупных лакун между смежными эпите лиоцитами. В макроорганизме это происходило на фоне изменений в эндотелии ка пилляров и развития интерстициального отека вследствие дегрануляции тучных и Ес клеток, которая способствует выделению факторов сосудистой проницаемости.
В 1996 г. Saha P.K. et al. был описан новый цитотоксин V.cholerae, обозначен ный авторами NMDCY (non-membrane-damaging cytotoxin). Анализ литературных и собственных данных позволил нам предположить, что он идентичен HA/P, поскольку оба белка имеют одинаковые ММ (32-35 кДа) [Saha P.K. et al., 1996;
Finkelstein R.A. et al., 1983;
Finkelstein R.A., Hanne L.F., 1982;
Naka A. et al., 1992;
Ghosh A. et al., 2006;
настоящее исследование] и полностью гомологичные 15N-концевые последователь ности [Saha P.K. et al., 1996];
обладают протеолитической активностью, которая ин гибируется ЭДТА и ЭГТА [Mitra R. et al., 1998], что характерно для металлопротеаз;
в условиях in vitro являются исключительно внеклеточными белками и синтезируются в стационарной фазе роста культуры [Saha P.K. et al., 1996;
Benitez J.A. et al., 2001;
Silva A.J. et al., 2003;
Silva A.J., Benitez J.A., 2004], причем в большем количестве СТХ- штаммами, чем СТХ+ [Saha P.K., Nair G.B., 1997;
Kimsey H.H., Waldor M.K.,1998];
при исследовании в камерах Юссинга NMDCY увеличивают ток коротко го замыкания (Isc) [Mitra R. et al., 1998;
Ghosh et al., 2006;
Mel S.F. et al., 2000] и не ин гибируются моносахарами [Finkelstein R.A., Hanne L.F., 1982 Saha;
P.K. et al., 1996], то есть не требуют наличия углеводсодержащих рецепторов. В дополнение к этому мы установили, что способность HA/P вызывать округление клеток и разрушение плотного монослоя в культурах тканей подчиняется закономерностям, выявленным Saha P.K. et al., (1996) для NMDCY, а ультраструктурные изменения в них под дейст вием HA/P полностью совпадают с результатами электронно-микроскопических ис следований клеток Int407 и HeLa, обработанных NMDCY [Basu I. et al.,1999], что по зволило сделать окончательное заключение об идентичности этих двух факторов.
2. Цитотонический фактор Cef (CHO-удлиняющий фактор). Cef, термола бильный белок с ММ ~85 кДа, обладающий эстеразной активностью, способностью вызывать удлинение клеток CHO и накопление жидкости в кишечнике мышей сосунков – один из самых малоизученных предполагаемых факторов патогенности V.cholerae. До начала наших исследований все сведения о нем ограничивались тремя публикациями [McCardell B.A. et al., 2000, 2002;
Satyamorrthy et al., 2000]. Ранее ген cef холерных вибрионов обоих биоваров О1 серогруппы был клонирован McCardell B.A. et al. (2002) с использованием модели Pichia pastoris, поскольку авторам не уда лось клонировать его в векторе pBAD. Однако в дрожжевом хозяине образовался гликозилированный продукт, утративший биологическую активность in vivo и поэто му непригодный для изучения характера его воздействия на макроорганизм. Нам удалось преодолеть эту проблему путем успешного клонирования генов cef штаммов V.cholerae О1 (эльтор и классического биовара), О139 и неО1/неО139 в составе ре комбинантных плазмид (соответственно pCef61В, pCef69В, pCef31В и pCef49В) и их эффективной экспрессии в E.coli под контролем PBAD-промотора. ПЦР-амплификаты генов cef длиной 2473 п.н., полученные с помощью сконструированных нами прай меров, были встроены в полилинкер pBAD18 по сайтам EcoRI-XbaI. Для выявления способности рекомбинантов к синтезу Cef использовали ОД их клеток (полученные как описано выше для HA/P), выращенных с индукцией арабинозой.
В исследованиях McCardell B.A. et al. (2000, 2002) Cef проявлял эстеразную ак тивность по отношению к р-нитрофениловым эфирам жирных кислот с длиной цепи С2-С14. Нами была выявлена эстеразная активность ОД рекомбинантных клонов по отношению к твинам 20, 40, 60, 80 и 85. Липазная активность по отношению к олив ковому, подсолнечному и льняному маслам не выявлялась. ОД всех рекомбинантных штаммов, кроме продуцента Cef V.cholerae О139 (E.coli Jm103pCef31B) разлагали трибутирин. Чтобы проверить, не является ли неспособность Cef вибриона Бенгал к гидролизу трибутирина штаммовой особенностью, мы дополнительно клонировали ген cef из другого штамма О139 серогруппы – Р-16065, который имел существенные отличия от Р-16131 на уровне генома. ОД штамма E.coli Jm103, содержащего соответ ствующую плазмиду pCef65B, также не расщеплял трибутирин, сохраняя способность к гидролизу твинов, то есть это характерно для Cef вибрионов О139 серогруппы.
ОД всех рекомбинантных клонов вызывали удлинение клеток СНО и L-929.
В отличие от полученных McCardell B.A. et al. (2002) рекомбинантных глико зилированных белков Cef, утративших биологическую активность на модели мышей сосунков, ОД сконструированных нами штаммов E.coli вызывали в их кишечнике статистически достоверное накопление жидкости (Р 0,007). Таким образом, реком бинантные белки сохранили все известные свойства. В дальнейшем было показано, что теми же видами активности обладают и препараты Cef.
Метод выделения Cef и подходы к определению свойств полученных препара тов были подобраны на основе биоинформационного анализа. Прогностические дан ные о том, что Cef представляет собой термотолерантную сериновую липазу с доме ном Куница и лейциновой «молнией» (рис.3), подтверждены экспериментально.
Рисунок 3. Схема локализации доменов в белке Cef V.cholerae Домен Куница (АК 179-196) – домен ингибитора протеаз. Лейциновая «молния» – домен, характерный для некоторых ДНК-связывающих белков;
обеспечивает форми рование димерной структуры. GHSLG (549-553) – домен сериновых триацилглице роллипаз (GXSXG), ответственный за связывание с субстратом и липаз ную/эстеразную активность. а/bH (424-563) – домен белков суперсемейства альфа бета-гидролаз. LIP (444-723) – домен, характерный для большинства триацилглице роллипаз, перекрывающийся с доменом а/bH.
В частности, при гель-фильтрации Сef выходил с колонки (HW-55F) двумя фракциями: тяжелой и легкой, что указывает на его способность формировать диме ры, вероятнее всего, за счет лейциновой «молнии». После прогревания в течение мин при 40-50оС Cef сохранял 100% эстеразной активности, при 60оС – 50%, при 70 90оС – инактивировался. Таким образом была подтверждена предсказанная относи тельная термостабильность Cef. Это позволило ввести дополнительный этап его очи стки – прогревание при 56оС в течение 60 мин для денатурации большинства приме сей термолабильных белков. После SDS-электрофореза прогретых препаратов в гелях выявлялась мажорная полоса с ММ ~85 кДа, что соответствовало ММ Cef. Для под тверждения принадлежности Cef к сериновым липазам и выяснения причастности домена GHSLG к цитотонической активности мы провели эксперимент по его инак тивации ингибитором сериновых ферментов PMSF. Инактивированный препарат полностью утратил эстеразную активность, но сохранил способность вызывать удли нение клеток L-929. Следовательно, цитотоническая активность Cef не определяется его субстрат-связывающим доменом (GHSLG).
Поскольку в литературе отсутствовали какие-либо данные о Сef V.cholerae O139, мы секвенировали его ген и сравнили полученные данные с представленными в GenBank. Как видно из таблицы 1, нуклеотидная замена в позиции 2015 привела к по явлению в Cef-О139 остатка гидрофильной аминокислоты треонина в позиции 672, вместо гидрофобных – изолейцина в Cef классического типа и валина в Cef вибрио нов эльтор и неО1/неО139 серогруппы. Чтобы убедиться в том, что треонин в этой позиции является маркером Cef-О139, мы дополнительно секвенировали соответст вующий участок гена cef штамма Р-16065 и получили такой же результат. Эта неси нонимичная замена слегка повлияла на вторичную (согласно данным программы PSIPRED, http://bioinf3.cs.ucl. ac.uk) и, возможно, третичную структуру белка Cef O139 и позволила объяснить изменение спектра его субстратной специфичности.
Таблица 1. Нуклеотидные и аминокислотные замены в генах cef и их продуктах Позиция АК в белке 671 672 673 -Ser Val Ser Cef-eltor Val (AAV40602) -TCT GTA GTG AGC -Ser Val Ser Cef-classicae Ile (AAV40603) -TCT ATA GTG AGC - Ser Val Ser Cef-O139 Thr (AEC04822.1) -TCT ACA GTG AGC Cef-nonO1 -Ser Val Ser Val (AAV40604.1) -TCT GTG GTG AGC Позиции триплетов в гене 2011-2012 2014-2016 2017-2019 2020- Мы впервые изучили ультраструктурные изменения в культуре клеток L-929 и в тонкой кишке мышей-сосунков при действии препарата Cef. На обеих моделях Cef вызывал выраженную вакуолизацию цитоплазмы, свидетельствующую о нарушениях водно-электролитного баланса и обезвоживании клеток (рис.4). Вероятно, это явилось причиной нарушений структуры внутриклеточных органелл, продукты распада кото рых переваривались активизированным лизосомальным аппаратом. На уровне макро организма обезвоживание усугублялось вовлечением в процесс тучных клеток (про дуцентов факторов сосудистой проницаемости – гистамина, гепарина, серотонина) и, как следствие, дополнительной потерей жидкости через стенки капилляров Эти дан ные определенно указывают на причастность Cef к проявлению холерными вибрио нами патогенных свойств.
Рисунок 4. Ультраструктурные изменения в клетках L-929 (а-г) и в тонкой кишке мышей-сосунков (д-з) под действием препатата Cef а – контрольная клетка L-929, х8200;
б – вакуолизация цитоплазмы, увеличение числа лизосом и смещение ядра на периферию клетки, обработанной Cef, х6000;
в – образо вание вакуолей и освобождение их содержимого через разрывы клеточной стенки, х4200;
г – деформация ядра, вакуолизация цитоплазмы и увеличение числа лизосом, х11500;
д – набухание митохондрий, разрушение их крист, образование в цитоплазме эпителиоцитов множественных вакуолей, х20500;
е – вакуоли в цитоплазме, внутри набухших митохондрий и ядер, х 6000;
ж – частичная дегрануляция тучной клетки, х11500;
з – пиноцитозные везикулы в стенке капилляра стромы, х8200.
Ранее ничего не было известно о степени специфичности гена cef для V.
cholerae. Мы провели ПЦР-детекцию этого гена в геномах нескольких сотен штаммов и выявили, что он всегда присутствовал у холерных вибрионов О1, неО1/неО139 се рогрупп и CTX+ V.cholerae О139, но отсутствовал у всех изученных CTX- водных штаммов Бенгал, которые были лишены и твиназной активности, хотя были способны к гидролизу трибутирина, по-видимому, за счет действия других липаз/эстераз. Эти данные, полученные с использованием природной «модели» – cef-негативных виб рионов О139 серогруппы, подтвердили, что твиназная активность связана с продук том гена cef. Однако, учитывая принципиальные отличия в структуре геномов водных штаммов Бенгал от всех прочих представителей вида V.cholerae [Ерошенко Г.А., 2004], вопрос о том, является ли он единственной твиназой холерных вибрионов, тре бует дальнейшего исследования. Вместе с тем, широкое распространение гена cef среди клинических и водных штаммов различных серогрупп и достаточно высокий уровень его экспрессии позволяют полагать, что данный фактор может вносить су щественный вклад в их выживаемость в водоемах и сточных водах, которые в на стоящее время значительно загрязнены поверхностно-активными веществами. Таким образом, Cef, как и HA/P, является фактором патогенности/персистенции.
3. Токсины, кодируемые генами профага СТХ, и неполный СТХ-элемент.
В состав генома CTX [Waldor М.К., Mekalanos J.J., 1996] и его предшест венника –ctxAB фага pre-СТХ [Boyd E.F., Heilpern A.J., 2000] входят гены zot (zonula occludens toxin) и асе (accessory cholera enterotoxin). Их продукты обладают двойной функцией, являясь составляющими фагового морфогенеза и обладая биоло гической активностью. Zot разрушает tj в тканях макроорганизма, обеспечивая более свободный доступ токсинов и других белков к мембране [Fasano A., 2000], а Ace мо жет участвовать в развитии диареи благодаря свойствам ион-проницаемой поры [Trucksis M. et al., 2000].
Из первичного продукта гена zot с ММ 45 кДа в результате процессинга под действием протеаз V.cholerae образуются 2 формы: N-концевая (33 кДа), ответствен ная за вирогению, и С-концевая (12 кДа) – собственно токсин, обозначаемый как G [Menon D. et al., 2005;
Song K.H. et al., 2008]. Последний является аналогом эндоген ного модулятора tj зонулина и использует его рецептор [Fasano A., 2001]. Ранее Писа новым Р.В. (2004) было показано, что если 33 кДа форма обладает сходством с бел ками целого ряда филаментозных фагов, то собственно токсиновая оказалась уни кальной, свойственной только Zot. В соответствии с задачами настоящего исследова ния наибольший интерес для нас представляла именно эта форма, и в первую очередь вопрос о том, обладает ли G продукта гена zot pre-CTX (Gpre-СТX) свойствами ток сина или же они были приобретены только после образования полного CTX с новым 3'-концом zot [Boyd E.F. et al., 2000]. Для ответа на этот вопрос мы провели сравни тельный биоинформационный анализ первичной и вторичной структуры GСТX и Gpre-СТX и установили полную консервативность мотива, ответственного за связыва ние с рецептором Zot/зонулина [Di Pierro M.D. et al., 2001], активного домена AT1002, которому принадлежит ключевая роль в разрушении tj [Motlekar A. et al., 2006;
Goldblum S.E. et al., 2011], и потенциального трансмембранного домена. Что же каса ется существенно различающихся С-концов, то они, тем не менее, обладали очень близкими вторичными структурами. Это свидетельствовало о наличии у Zotpre-СТX та кой же биологической активности, как у ZotCTX.
Сравнительный анализ первичных структур AceСТX и Асеpre-СТX показал их пол ную гомологию, то есть Асеpre-СТX достоверно несет ту же функциональную нагрузку.
Моделирование вторичной структуры Асе позволило установить, что большая часть его молекулы представлена двумя -спиралями – потенциальными трансмембранны ми доменами. Вероятно, способность Асе интегрировать в мембрану объясняет его токсичность для клеток кишечника за счет нарушения их ионного баланса.
С целью получения препаратов Zot и Асе мы клонировали их гены в составе рекомбинантных плазмид pZot69 и pAce90. Для этого ПЦР-амплификаты генов zot (1,2 т.п.н.) и ace (311 п.н.) V.cholerae, полученные с помощью сконструированных нами праймеров, были встроены в вектор pQE30 по сайтам BamHI-HindIII. Ожидае мые продукты должны были содержать на N-конце гексагистидиновый блок (6His).
Для определения способности штаммов E.coli, содержащих рекомбинантные плазми ды, к продукции Zot и Ace и локализации белков их, а также контрольный штамм, со держащий векторную плазмиду без вставки, выращивали и индуцировали ИПТГ так же, как описано выше для продуцента HA/P. Затем разделяли растворимую и нерас творимую (НР) фракции клеток и исследовали их в электрофорезе (рис.5).
Как видно из рисунка 5А, 6His-Zot (белок с ММ ~46 кДа) находился в НР фракции (тельцах включения), где его содержание составляло, по данным программы Quantity One, ~18-21% суммарных белков (рис.5А). Белок с ММ ~13 кДа (что соот ветствует ММ 6His-Ace), был выявлен в основном в НР фракции и только после до крашивания ПААГ нитратом серебра (рис. 5Б). Следовательно, он действительно представляет собой Ace, который, как известно, не окрашивается Coomassi Blue [Trucksis M. et al., 1993]. Его выход составлял 7-10% суммарных белков.
Рисунок 5. SDS-электрофорез:
А – нерастворимой (1,3) и рас творимой (2,4) фракций клеток E.coli M15[pREP4], содержа щих pQE30 (1,2) и pZot69 (3,4) в 10% ПААГ. Окраска Coomassi Blue;
Б – нерастворимой (1,3) и рас творимой (2,4) фракций клеток E.coli M15[pREP4], содержа щих pQE30 (1,2) и pAce90 (3,4) в 16,5% ПААГ. Окраска Coomassi Blue и нитратом се ребра.
Положение рекомбинантных белков 6His-Zot и 6His-Ace от мечено стрелками.
Для тестирования на моделях in vitro и in vivo мы использовали как ОД клеток рекомбинантных клонов, так и их НР фракции после их растворения в 8 М мочевине и многоступенчатого диализа с постепенным снижением концентрации мочевины.
Несмотря на присутствие в рекомбинантных молекулах N-концевого гексагистидино вого блока (и отсутствия процессинга Zot), оба белка обладали характерной для них биологической активностью. Zot вызывал заметное разрежение плотного монослоя в культурах клеток CaCo2, McCoy и L-929, а также проявление на модели мышей сосунков энтеротоксичности содержащимися в ОД балластными белками E.coli, ко торые в отсутствие Zot абсолютно безвредны даже для такой чувствительной модели.
Напротив, Zot из телец включения не вызывал накопления жидкости. Асе не оказы вал существенного влияния на культуры клеток, но вызывал статистически достовер ное накопление жидкости в кишечнике мышей-сосунков (Р0,003).
Поскольку эти данные еще раз подтвердили «токсический статус» Zot и Ace, мы обратили особое внимание на 26 выделенных в СНГ клинических и водных штаммов, содержащих их гены в составе pre-CTX, с точки зрения возможности обра зования ими инфекционных вирионов – факторов горизонтальной передачи. Присут ствие в геномах этих штаммов pre-CTX было подтверждено данными зондирования и ПЦР. У двух штаммов был также выявлен профаг RS1. Изменчивость профагов каса лась в основном RS-элементов, особенно гена rstR. У некоторых штаммов удалось определить принадлежность этого гена к эльтор либо к классическому типу, а у одно го – присутствие обоих типов. Остальные, возможно, содержали rstR другого типа [Davis B.M. et al., 1999;
Mukhopadhyay A. K. et al., 2001]. Результаты ПЦР и блот гибридизации HindIII- и BglII-рестриктов ДНК с мечеными Р зондами US (содер жащим гены orfU, zot и асе) и RS позволили предположить наличие у многих штам мов тандемной дупликации pre-CTX, которая является необходимым условием обра зования репликативных форм (РФ) и фаговых частиц [Davis B.M., Waldor M.K., 2000].
Эта способность была подтверждена экспериментально следующим образом.
Известно, что размножение фага СТХ происходит без лизиса клетки-хозяина, при этом образуется небольшое число фаговых частиц, которое заметно увеличивает ся в культурах, содержащих в клетках РФ (рСТХ). Поэтому для повышения выхода вирионов и визуализации РФ и мы использовали соответственно индукцию митоми цином С как описано Faruque S.M. et al. (1998) и амплификацию хлорамфениколом (как при выделении низкокопийных плазмид). Электрофорез тотальной ДНК иссле дуемых штаммов позволил выявить у 16 из 18 штаммов О1 и 2 из 8 штаммов неО1/неО139 серогрупп поддающиеся визуализации плазмиды. Для доказательства того, что эти плазмиды являются РФ pre-CTX, мы провели блот-гибридизацию с зондом Us, меченым дигоксигенином. Плазмиды гибридизовались с этим зондом, то есть действительно представляли собой РФ pre-CTX (рис.6).
Рисунок 6. Пример результатов блот гибридизации тотальной ДНК штаммов холерных вибрионов, содержащих профаг pre-CTX, с зондом Us.
На дорожках 1 и 4- видны по 1-2 формы РФ pre-CTX.
Препараты предполагаемой фаговой ДНК выделяли из супернатантов культур [Faruque S.M. et al., 1998] до индукции хлорамфениколом (так как последний ингиби рует синтез белка и мог препятствовать фагосборке). В препаратах из супернатантов штаммов, содержащих РФ, с помощью ПЦР были выявлены гены pre-CTX cep, orfU, ace, zot, rstA и не были выявлены гены бактериального генома toxR, hapA, cef и rtxA.
Следовательно, в них присутствовала ДНК pre-CTX. Напротив, штаммы, не обра зующие РФ, оказались неспособными и к вирогении. Один из штаммов О1 серогруп пы (Р-9961) одновременно продуцировал РФ и вирионы двух фагов – pre-CTX и RS1 даже в отсутствие какой-либо индукции.
Таким образом, большинство выделенных в СНГ штаммов V.cholerae, содер жащих pre-СТХ, могут служить источником фаговых частиц, осуществляющих спе цифическую трансдукцию – «традиционный» путь горизонтальной передачи. Однако и все остальные штаммы данной группы следует считать источником генов факторов патогенности Cep, Ace и Zot, которые могут быть переданы «нетрадиционными» спо собами, такими как неспецифическая ТСР-независимая трансдукция фагами СР-Т [Boyd E.F., Waldor M.K., 2000] либо VGJ [Campos J. et al., 2003].
4. Другие токсины и вспомогательные факторы патогенности. Кроме опи санных выше, холерные вибрионы обладают еще целым рядом факторов, роль кото рых в патогенезе доказана либо только предполагается. К числу таких факторов отно сится высокомолекулярный цитотоксин MARTXVc, продукт гена rtxA в составе RТХ кластера [Boardman K.B., Fullner Satchell K.J., 2004, 2007]. Его биологическая актив ность выражается в деполимеризации и ковалентном связывании актина, что приво дит к повреждению цитоскелета эукариотической клетки [Lin W. et al., 1999;
Fullner K.J., Mekalanos J.J., 2000]. За эти процессы отвечает актин-связывающий домен ACD, сходный с ACD другого белка – VgrG1 (ключевого эффектора системы секреции шес того типа), который обладает такой же активностью и, возможно, является предшест венником ACD-RtxA [Sheanan K.L. et al., 2004]. Мы провели ПЦР-детекцию последо вательностей, кодирующих 5-конец rtxA, его ACD, и гена rtxC (предполагаемого ак тиватора MARTX). Подавляющее большинство штаммов содержало все 3 искомые последовательности, у некоторых были выявлены делеции acd-rtxA либо rtxC. Одно временное присутствие детерминант доменов-«двойников» acd-rtxA и acd-vgrG1 было выявлено у меньшинства штаммов, поэтому не исключено, что их сосуществование невыгодно для бактериальных клеток. По-видимому, ген rtxA может экспрессировать ся многими нехолерогенными штаммами V.cholerae и вносить свой вклад в патогенез вызываемых ими заболеваний.
К факторам патогенности V.cholerae некоторые авторы относят нейраминидазу (НАНазу) [Мишанькин Б.Н. с соавт.,1989;
Galen J.E. et al., 1992;
Миронова Л.В. с со авт., 2004], ген которой (nanH) входит в состав острова патогенности VPI-2 [Jermin W.S., Boyd E.F., 2002]. Мы изучали целостность VPI-2 по наличию трех последова тельностей – int («левый» краевой ген VC1758), nanH и vce («правый» краевой ген VC1806). Холерогенные штаммы О1 серогруппы за редким исключением содержали полный VPI-2, как и многие нехолерогенные, однако для последних более характер ным было отсутствие vce. Меньшая часть штаммов имела делеции различных частей либо всего острова. У некоторых штаммов О1 и неО1/неО139 серогрупп отсутствова ла его центральная часть с геном nanH, как у ctxAB+ штаммов Бенгал. Аналогичные результаты были получены Топорковым А.В. с соавт. (2004) при исследовании гено ма штаммов V.cholerae классического биовара. Эти данные свидетельствуют о том, что делеция части VPI-2, характерная для штаммов Бенгал, может иметь место и у вибрионов О1 серогруппы. Все изученные водные ctxAB- штаммы О139 серогруппы, по видимому, содержали интактный VPI-2.
Мы также обратили внимание на токсины, гены которых встречаются у холер ных вибрионов довольно редко. С помощью дот-гибридизации (но не ПЦР) у целого ряда ctxAB- штаммов О1 и неО1/неО139 серогрупп удалось выявить последовательно сти, гомологичные гену термостабильного токсина (ST). Однако вопрос о том, спо собны ли они к продукции полноценного, биологически активного ST, требует до полнительного изучения. Это же относится и к группе штаммов О1 серогруппы – воз будителей вспышки и последующих случаев заболеваний в Донецке и Мариуполе 1970х годов, у которых также с помощью дот-гибридизации были выявлены последо вательности, гомологичные гену термостабильного прямого гемолизина (tdh) – клю чевого фактора патогенности V.parahaemolyticus. Эти результаты оказались неожи данными, поскольку в литературе имеются сведения о редком обнаружении tdh толь ко у представителей неО1/неО139 серогрупп [Yoh M. et al., 1986;
Terai A. et.al., 1991].
Однако изученные нами штаммы V.cholerae nonO1/nonO139 (около 150) не гибриди зовались с зондом tdh. Что касается Донецких штаммов, то в пользу возможной экс прессии ими TDH свидетельствует лишь тот факт, что вспышка протекала по типу пищевой токсикоинфекции, что характерно для V.parahatmolyticus. Ни у одного из штаммов не было выявлено генов TDH-родственного гемолизина (trh) и шигаподоб ного токсина (slt1). По-видимому, они вообще не встречаются у V.cholerae, поскольку ген trh не был обнаружен у них и другими авторами и не связан с типичными мо бильными элементами [Kishishita M. et al., 1992;
Yamamoto K. et al., 1992], а слабая продукция холерными вибрионами токсина, близкого Slt1, была выявлена исключи тельно серологическими методами [O’Brien A.D. et al., 1984].
В начале наших исследований, когда геном холерных вибрионов еще не был расшифрован полностью, наше внимание привлек ряд работ под руководством Sanyal S.C. (1983-1996), в которых был описан диареегенный фактор, названный авторами NCT (new cholera toxin). Мы полагали, что некоторые ctxAB- штаммы, выделенные в бывших республиках СССР от больных с признаками типичной холеры, могли быть способны к продукции такого токсина, и попытались определить свойства некоторых секретируемых ими биологически активных субстанций. Действительно, препараты сырцы, полученные осаждением сульфатом аммония как описано Saha S., Sanyal S.C.
(1990), вызывали повышение кожной проницаемости в пробе Крейга, отек лапок бе лых мышей, энтеропатогенный эффект у кроликов-сосунков и два типа реакции кле ток СНО – округление в присутствии низких разведений препарата и удлинение под действием более высоких. С помощью гель-фильтрации на Toyopearl HW55F удалось разделить «округляющую» и «удлиняющую» фракции. При этом первая расщепляла белки молока, а вторая – трибутирин, то есть цитотоксический компонент, по видимому, представлен в основном HA/P (возможно, с примесью других протеаз), а цитотонический – Cef. Анализ литературных и полученных нами данных позволил заключить, что NCT представляет собой не отдельный самостоятельный токсин, а варьирующую по составу смесь нескольких факторов. У исследованных нами штам мов она включала Cef, HA/P, а также, возможно, другие протеазы и/или MARTXVc.
Следует подчеркнуть, что авторы, описавшие NCT, не идентифицировали его генети ческих детерминант и работали фактически с тотальной смесью белков, осажденных из культуральных жидкостей сульфатом аммония. Этот же препарат был использован ими и для получения сывороток к NCT, которые, естественно, реагировали со всеми штаммами V.cholerae (как и полученные нами сыворотки к препарату-сырцу).
Важнейшая роль в патогенности и персистенции холерных вибрионов принад лежит факторам адгезии. К ним относятся, наряду с другими, TCP и маннозочувстви тельные пили (MSHA) [Kaper J.B. et al., 1995]. Их специальное изучение не входило в цели настоящей работы, но для более полной характеристики исследуемых штаммов мы определяли наличие генов tcpA и mshA, кодирующих структурные единицы этих пилей. TCP считаются главным фактором колонизации, а MSHA связывают в основ ном с персистенцией в водоемах за счет формирования биопленок [Watnick P.I. et al., 1999;
Chiavelli D.A. et al., 2001]. Результаты определения гена tcpA с помощью зонди рования и ПЦР показали, что лишь небольшая часть ctxAB- штаммов V. cholerae О1 и nonO1/nonO139 содержала этот ген. У tcpA+ штаммов почти всегда выявлялся и дру гой ген VPI, toxT, что свидетельствовало в пользу присутствия у них данного острова.
Сам ген tcpA у большинства штаммов находился в виде аллеля tcpAelt. Аллель tcpAclass был выявлен всего у 7 штаммов. У отдельных pre-CTX+ штаммов ген tcpA не ампли фицировался в ПЦР несмотря на положительные результаты гибридизации, что ука зывает на принадлежность его к другому(им) типу. Ген mshA содержали все исследо ванные CTX+VPI+ штаммы О1 и О139, большинство ctxAB-VPI+ и ctxAB-VPI- штаммов О1, но меньшинство представителей неО1/неО139 серогрупп и ни один из 22 водных штаммов Бенгал. Отсутствие гена mshA у многих штаммов, циркулирующих в откры тых водоемах, указывает на то, что MSHA, хотя и считаются существенными факто рами персистенции, могут быть заменены другими адгезинами. Следует отметить, что у всех изученных штаммов были выявлены гены хромосомного локуса vps (vpsA, vpsL), также играющего важную роль в образовании биопленок [Yildiz F.H., Schoolnik G.K., 1999]. Еще одной заслуживающей внимания функцией пилей MSHA является их способность служить рецептором для адсорбции фага VGJ, переносящего СТХ с более высокой частотой, чем при их собственной ТСР-зависимой трансдукции [Cam pos J. et al., 2003]. Поэтому VPI–mshA+ штаммы V.cholerae могут рассматриваться на ряду с VPI+ штаммами как потенциальные реципиенты генов факторов патогенности.
В настоящее время способность TCP служить рецептором CTX общеизвестна [Faruque, S.M., Mekalanos J.J., 2003]. Однако их наличие является необходимым, но не достаточным условием эффективного проникновения фага в бактериальную клетку, для этого нужны также продукты генов tol-кластера (TolQRA) [Heilpern A.J., Waldor M.K., 2000]. Они способны обеспечивать горизонтальную передачу CTX даже в от сутствие TCP, хотя вероятность такого события довольно низка. Среди изсследован ных нами нескольких сотен штаммов V.cholerae различных серогрупп не было обна ружено ни одного лишенного генов tolQRA. Это вполне объяснимо с точки зрения по казанного Heilpern A.J., Waldor M.K. (2000) участия их продуктов в поддержании це лостности клеточной стенки. Повреждение любого из этих генов приводит к резкому снижению жизнеспособности, и такие мутации, по-видимому, летальны.
Таким образом, СТХ-ТСР- штаммы могут использовать по меньшей мере два «запасных» пути приобретения профага СТХ – за счет продуктов генов tol-кластера [Heilpern A.J., Waldor M.K., 2000] и MSHA [Campos J. et al., 2003], а представители О серогруппы располагают еще и третьим путем – за счет трансдукции СТХ фагом СР Т1, рецептором которому служит О1-антиген [Boyd E.F., Waldor M.K., 1999].
5. Контакт-зависимые системы секреции. Особое значение во взаимоотно шениях бактерий с организмом хозяина имеют специализированные способы секре ции токсических субстанций (эффекторов). Недавно у отдельных штаммов неO1/не О139 серогрупп было установлено наличие двух систем секреции (SS), действие ко торых основано на непосредственном контакте бактериальных клеток с эукариотиче скими – третьего (T3SS) [Dziejman M. et al., 2005;
Chen Y. et al., 2007] и шестого (T6SS) [Pukatzki S. et al., 2006] типов. Обе состоят из комплекса белков-транслоконов, напоминающего иглу, через которую эффекторы проникают из клетки возбудителя в клетку хозяина минуя внеклеточное пространство, что ограничивает подверженность антигенов действию защитных сил макроорганизма. Вместе с тем, T3SS и T6SS коди руются разными кластерами генов и имеют разные транслоконы и эффекторы. По скольку данные о распространении кластеров этих двух SS среди штаммов V. cholerae были весьма немногочисленны [Ерошенко Г.А., с соавт., 2008, 2009], мы провели ПЦР-детекцию отдельных генов, выбранных в качестве маркерных, у 320 штаммов различных серогрупп.
Маркерами vsc-кластера (T3SS) служили гены vcsN2, vcsV2, vscC2 и vspD. Они были выявлены примерно у половины штаммов не только неО1/неО139, но и O1 се рогруппы (последнее установлено нами впервые). Практически все CTX+ вибрионы были лишены генов T3SS. В группе pre-CTX+ штаммов были как T3SS+, так и T3SS-, а среди клинических CTX-/pre-CTX- штаммов преобладали T3SS+. К их числу относи лись все CTX–VPI+ штаммы клона О1 серогруппы, вызвавшего эпидосложнения в Каменском районе Ростовской области в 2005 г., и вышеупомянутые CTX–VPI– штаммы клона О1 серогруппы – возбудители заболеваний в Донецке и Мариуполе (1971-1973). Гены vcs были обнаружены менее, чем у половины штаммов О1 и неО1/неО139 серогрупп, выделенных из внешней среды в отсутствие эпидосложне ний, и ни у одного из CTX– штаммов Бенгал.
Для детекции vas-кластера (T6SS) мы использовали в качестве маркерных 4 ге на – vasA, vasF, vasK и vgrG3 (его 3-концевую последовательность, кодирующую пептидогликан-связывающий домен, PBD-VgrG3). Также выявляли локализованные за пределами этого кластера гены транслокона hcp и последовательность, кодирую щую ACD ключевого эффектора T6SS VgrG1. У 100% штаммов присутствовали гены vas и hcp, тогда как acd-vgrG1и pbd-vgrG3 у многих не были обнаружены.
Для определения экспрессии этих SS мы использовали штамм амебы Dictyostelium discoideum – своеобразную модель макрофагов, предложенную Pukatski S. et al. (2006) для изучения T6SS у V.cholerae. При совместном культивировании эта амеба, передвигаясь по поверхности агара и питаясь бактериями, образует зоны про светления (бляшки) в газоне штаммов, не экспрессирующих T6SS, а экспрессирую щие T6SS убивают амебу, и бляшки не образуются. Эта же модель оказалась адекват ной для изучения экспрессии T3SS P.aeruginosa [Pukatzki S. et al., 2002], а все опуб ликованные экспериментальные данные о механизмах устойчивости V.cholerae к D.discoideum были получены с использованием всего одного штамма, лишенного T3SS (Pukatzki S. et al., 2006;
Miyata S.T. et al., 2011). Поэтому вопрос о том, может ли устойчивость V.cholerae к поеданию амебой проявляться за счет T3SS, остался откры тым. Мы определили Dictyo-фенотипы 152 штаммов с различными генотипами (CTX, VPI, T3SS, acd-vgrG1). Анализ полученных результатов (табл.2) позволил установить следующие корреляции:
1). Устойчивость ctxAB- штаммов никак не зависела от присутствия генов T3SS, то есть она либо не экспрессируется в данных условиях эксперимента, либо у V.cholerae, в отличие от Pseudomonas, не является фактором антагонистической ак тивности по отношению к простейшим, как предполагали Dziejman M. et al. (2005).
Очевидно, эта система служит для колонизации кишечника, особенно у штаммов, не образующих TCP [Tam V.C. et al., 2007, 2010;
Alam A. et al., 2011]. Следовательно, модель D.discoideum позволяет достоверно оценить функционирование именно T6SS.
Таблица 2. Генотипическая характеристика 152 штаммов холерных вибрионов и их Dictyo-фенотипы ctxAB– ctxAB+ T3SS– T3SS– T3SS+ Серо- acd- Dic acd- Dic acd- Dic N* VPI N* VPI N* VPI группа vgrG1 tyo vgrG1 tyo vgrG1 tyo 20 - - S 7 - - S 1 - + S 1 - + S O1 20 + + S 1 + - S 3 + - S 6 + + R 21 + + R О139 10 + + S 0 20 - - S nonO1/ 5 - + S 14 - - S 2 - - S non 1** - + S 7 - + S 1 - + S O139 4 + + S 2 + - S 6 + - S + *N – число штаммов, **T3SS -штамм 2). Устойчивостью (DictyoR-фенотипом) обладали всего 27 штаммов О1 серо группы, и все они содержали не только acd-vgrG1, но и остров патогенности VPI, а acd-vgrG1+VPI- штаммы были чувствительны (DictyoS). Нам не удалось оценить зна чимости PBD, поскольку все без исключения DictyoR штаммы содержали pbd-vgrG3.
Причины этой корреляции нам неизвестны. Учитывая, что активность ACD-VgrG T6SS-зависима и проявляется только при эндоцитозе вибрионов клетками-мишенями [Ma A.T. et al., 2009], можно допустить, что определенную роль во взаимодействии с клетками амебы могут играть TCP. Однако у вибрионов эльтор они практически не образуются вне кишечника теплокровного хозяина [Waldor M.K., Mekalanos J.J., 1996]. Предстоит еще выяснить, может ли их синтез индуцироваться в присутствии амебы. С другой стороны, VPI содержит ряд генов, функции которых до сих пор не установлены.
3). Большинство T3SS+ штаммов не содержало acd-vgrG1, а большинство T3SS– – содержало. Это наводит на мысль о том, что для реализации стратегии контакт зависимой вирулентности in vivo холерным вибрионам достаточно одной из этих SS, а поддержание активности обеих одновременно, возможно, для них невыгодно.
4). CTX+ штаммы не обладали устойчивостью несмотря на наличие всех генов T6SS. Не исключено, что данная стратегия вообще не используется штаммами, про дуцирующими высокоактивный CT, и присутствие у них генов vas, hcp, pbd-vgrG3 и acd-vgrG1 является своего рода «рудиментом». Последний, кстати, был уже утрачен большинством представителей неО1/неО139 серогрупп.
6. Фенотипическая и генотипическая характеристика вирулентности не холерогенных штаммов холерных вибрионов. В предшествующих разделах была показана причастность к патогенезу отдельных факторов, но наибольший интерес представлял вопрос о том, каким(ими) из них обусловлена реальная опасность сtхAB штаммов V.cholerae. Поэтому мы провели изучение фенотипических свойств, связан ных с проявлением вирулентности, рядом штаммов c различными генотипами in vitro и in vivo. Все включенные в это исследование штаммы содержали гены toxR, attRS, tolQRA, rtxA, rtxC, hapA, hapR, cef, hlyA, T6SS (vasA, vasK, vasF, hcp), vpsA, vpsL и не содержали slt1и trh. По присутствию/отсутствию генов pre-CTX, VPI и VPI-2, T3SS, а также acd-vgrG1, pbd-vgrG3, mshA, stn/sto и tdh имелись межштаммовые различия.
Для определения активности секретируемых факторов использовали суперна танты бульонных культур, выращенных с шуттелированием (то есть в условиях, ис ключающих синтез HlyA). Большинство их вызывало округление клеток CHO и L 929, возможно, за счет действия HA/P, других протеаз и/или MARTX. Некоторые ока зывали цитодеструктивное действие либо вызвали заметное, хотя и более слабое по сравнению с индуцируемым СТ удлинение, что было связано, по-видимому, с актив ностью Cef. Все супернатанты вызывали повышение кожной проницаемости в пробе Крейга, один (pre-CTX+) инициировал некроз, и он же обусловливал гибель и дест рукцию клеток СHO и L-929. Ранее точно такие же эффекты были отмечены Помухи ной О.И. (1990) при изучении на модели СНО препаратов так называемого дермонек ротического фактора (ДНФ).
Полученные данные свидетельствуют о том, что сtхAB- штаммы V.cholerae даже при одинаковых или близких генотипах варьируют по уровням продукции различных биологически активных факторов. Поскольку эти уровни могут существенно разли чаться в условиях in vitro и in vivo, следующим этапом работы явилось изучение эф фектов, вызываемых живыми культурами в организме чувствительных животных.
Для изучения вирулентности на модели кроликов-сосунков было отобрано сtхAB- штаммов V.cholerae О1 и nonO1/nonO139, для сравнения использовали CTX+ штаммов различных серогрупп. Все CTX+ штаммы О1/О139, содержащие также VPI, вызывали гибель почти всех зараженных крольчат с развитием выраженного хо лерогенного (ХГ) эффекта, тогда как представители неО1/неО139 серогрупп вызыва ли ХГ эффект только у части зараженных животных, а у другой части наблюдался эн теропатогенный (ЭП) эффект. CTX+ штаммы О139 и неО1/неО139, в отличие от О1, оказались способными к диссеминации в другие органы и ткани. Большинство сtхAB штаммов вызывало гибель части зараженных животных при развитии у них выражен ного ЭП эффекта с интенсивным размножением вибрионов в кишечнике, а более по ловины их были способны к диссеминации. Другие занимали промежуточное поло жение между ХГ и ЭП штаммами: у части животных они вызывали эффект, сходный с ХГ (СХГ) – накопление больших количеств полупрозрачной опалесцирующей жид кости, у другой части – выраженный ЭП эффект. Супернатанты содержимого кишеч ника кроликов, зараженных некоторыми штаммами, лизировали эритроциты барана, что указывало на продукцию HlyA. Однако ни один из перечисленных эффектов строго не коррелировал с генотипами использованных для заражения штаммов. На пример, авирулентный для сосунков штамм Р-9337 имел такой же генотип, как высо ковирулентный 14863 (CTX/pre-CTX– VPI– acd-rtxA+ int+ nanH+ vce– mshA+ T3SS + acd vgrG1– pbd-vgrG3– mshA+ stn/sto+). Напротив, штаммы с разными генотипами могли обладать практически одинаковой вирулентностью. Очевидно, факторы патогенности «взаимозаменяемы», то есть отсутствие одних компенсируется повышенной продук цией других, результатом чего является развитие заболевания. Для проверки этого предположения мы провели электронно-микроскопическое изучение тонкого кишеч ника кроликов-сосунков, зараженных несколькими штаммами V.cholerae.
При заражении кроликов-сосунков CTX+-штаммами ультраструктурные изме нения не отличались от описанных в литературе [Авакян А.А. с соавт., 1972;
Бардах чьян Э.А. с соавт., 2001;
Mathan M.M., 1995, 2009;
Quadri F. et al., 2004]. Клетки ки шечника погибали в основном в результате гидропической и баллонной дистрофии.
У сосунков, зараженных нехолерогенным штаммом О1 серогруппы, вибрионы выявлялись не только в просвете кишки, но и в строме ворсин, и даже проникали в подслизистый слой (рис. 7а, б). В результате в эпителии возникали необратимые по вреждения и некроз. Происходила деструкция микроворсинок, клазматоз и слущива ние отдельных клеток, разрушение их мембран, набухание митохондрий, расширение эндоплазматического ретикулума, активация лизосомального аппарата (рис. 7б, в). В ЕС-клетках была заметна дегрануляция. Интересным свойством изучаемого штамма явилась способность вызывать апоптоз лимфоцитов собственной пластинки слизи стой оболочки и межэпителиальных лимфоцитов (рис. 7д), следствием которого мо гут быть серьезные нарушения иммунного статуса и последующее развитие иммуно дефицита. На этом фоне происходили изменения микроциркуляции: образование тромбов в просвете капилляров, усиление микропиноцитоза, вакуолизация цитоплаз мы и локальные повреждения мембраны эндотелиоцитов. Экстравазальные наруше ния характеризовались выходом жидкой части крови, фибрина и форменных элемен тов в интерстициальное пространство (рис. 7е, ж).
Рисунок 7. Ультраструктурные изменения в тонкой кишке, вызванные нехолерогенным штаммом V.cholerae 14863:
а – вибрионы в строме ворсин, х630 и б – в подслизистом слое, х3000;
в – набухание митохондрий и деструкция их мембран, х6000;
в – расширение гранулярного эндо плазматического ретикулума, х6000;
г – увеличение числа лизосом и их активация, х6000;
д – апоптоз внутриэпителиального лимфоцита, х6000;
е – расхождение эндоте лиоцитов и выход крови в интерстициальное пространство, х10000;
ж – адгезия тром боцита в участке деструкции капилляра, х8000.
При заражении штаммом О13 серогруппы в первую очередь обращало на себя внимание образование лакун между смежными эпителиоцитами (рис. 8а,б), аналогич ное наблюдаемому под действием препарата HA/P, а также два типа реакций мито хондрий – набухание и конденсация (рис. 8в). Вакуолизация цитоплазмы (рис. 8г) бы ла выражена значительно слабее, чем при заражении CTX+ штаммом неО1/неО серогруппы (рис.8д). Однако в 2011 г. Shin et al. показали способность другого ctxAB tcpA- штамма (O39 серогруппы) обусловливать за счет экспрессии T3SS точно такую же гидропическую дистрофию, как изученный нами ctxAB+tcpA+T3SS- штамм. Это указывает на способность некоторых нехолерогенных штаммов к активной продук ции дополнительных токсинов и/или других факторов, которые и в отсутствие СТ мо гут вызывать тяжелые диарейные заболевания.
Рисунок 8. Ультраструктурные изменения в тонкой кишке, вызванные V.cholerae nonO1/nonO139 17449 (pre-CTX+, а-г) и 16150 (CTX+, д):
а – образование лакун по ходу границы между смежными эпителиоцитами щеточной каймы (х9900) и б – крипт (х4200);
в – изменения митохондрий двух типов – набуха ние с разрушением крист и конденсация, х16500;
г – вакуолизация цитоплазмы и по вреждение органелл, х16500;
д – гидропическая дистрофия эпителиоцитов под дейст вием CTX+ штамма, х10000.
Результаты изучения ультраструктурных изменений подтвердили наше пред положение о «взаимозаменяемости» факторов патогенности ctxAB- вибрионов.
Штамм V.cholerae O1 лишен генов pre-CTX, VPI, детерминант активных доменов T6SS (acd-vgrG1 и pbd-vgrG3), но содержит гены T3SS. Несмотря на отсутствие TCP, он обладает высокой колонизирующей способностью и даже инвазивностью. Воз можно, она обусловлена экспрессией T3SS in vivo, на что могут указывать незавер шенный фагоцитоз вибрионов макрофагами и гибель лимфоцитов и эпителиоцитов [Tam V.C. et al., 2007], хотя мы не исключаем участия других факторов, таких как MARTX и HlyA [Olivier V. et al., 2007, 2009], тем более что гемолизин присутствовал в содержимом кишечника зараженных животных. Штамм неО1/неО139 серогруппы отличается от него присутствием pre-CTX и VPI. Если он образует TCP и/или Cep, то экспрессия T3SS, генами которой он также обладает, может не происходить или быть пониженной. T6SS лишена ACD-VgrG1, но имеет PBD-VgrG3, поэтому остается ве роятность транслокации других, еще неизвестных эффекторов. В развитии диареи мо гут участвовать порообразователь Ace и модулятор актина Zot, отсутствующие у штамма О1 серогруппы. Уровни эспрессии генов, общих для обоих штаммов (rtxA, cef, hapA, hlyA и, возможно, stn/sto) также могут быть разными. Например, образова ние лакун между смежными эпителиоцитами в кишечнике животных, зараженных штаммом 17449, наводит на мысль о преобладании HA/P (ср. рис. 8а,б и 2в, г), а при знаки быстрого обезвоживания под действием штамма 14863 – о повышенной про дукции Cef (ср. рис.7в,г и 4д,е). Сходные повреждения клеточных органелл и капил ляров, вызванные обоими штаммами, могут быть следствием активности общих либо различных токсических субстанций, количественное соотношение которых скорее всего неодинаково. Наконец, некоторые из эффектов имеют сходство с вызываемыми CTX+ штаммами (вакуолизация цитоплазмы, разрушение органелл, реакции тучных и ЕС клеток, повышение сосудистой проницаемости). Это обстоятельство указывает на то, что в отдельных случаях даже основной фактор патогенности СТ вполне заменим теми или иными дополнительными факторами. Очевидно, эти случаи относятся большей частью к ослабленным людям с пониженной сопротивляемостью инфекциям в силу неблагоприятных экологических условий, возрастных особенностей либо на личия хронических соматических заболеваний.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ Нехолерогенные штаммы V.cholerae, способные вызывать спорадические слу чаи и вспышки ОКИ, привлекают к себе особое внимание. Молекулярно-генетические характеристики некоторых из них уникальны, что свидетельствует о формировании новых клонов с достаточно высоким патогенетическим потенциалом, таких как клон из Саудовской Аравии [Bubshait S.A. et al., 2000], «Tukumn» из Аргентины [Pichel M.
et al., 2003], «Mexican» из Мексики [Lizrraga-Partida M.L., Quilici M.-L., 2009] и «Amazon» из Бразилии [Figueiredo S.C. et al., 2005], представители которого были об наружены и в Гане [Thompson C.C. et al., 2011]. Результаты наших исследований ука зывают на клональный характер вспышек ОКИ в Ростовской области РФ 2005 г., Ук раине 1971 г. и Узбекистане 1990 г. Риск распространения этих и, возможно, еще не выявленных подобных клонов продолжает существовать. Многие штаммы, лишенные генов ключевого фактора патогенности холерного токсина, компенсируют их отсут ствие приобретением и экспрессией целого ряда других генов, восстанавливая таким образом реализуемую V.cholerae общую стратегию вирулентности.
Своеобразным путем приспособления холерных вибрионов к существованию в организме человека представляется «эксплуатация» в качестве факторов патогенно сти продуктов генов, входящих в состав геномов умеренных фагов CTX и pre-CTX и необходимых для вирогении. Продукт гена сер является белком капсида СТХ, од нако холерные вибрионы используют его в качестве дополнительного фактора коло низации кишечника. Асе, также белок капсида, обладает свойствами ион проницаемой поры. Zot способствует сборке вирионов и их выходу из бактериальной клетки, но его C-терминальная часть (G) представляет интереснейший пример свое образной «мимикрии», являясь аналогом эндогенного модулятора tj зонулина и ис пользуя его рецептор. Другими примерами такой «мимикрии» могут служить термо стабильный токсин (ST) – «суперагонист» эукариотического гормона гуанилина, ак тиватора гуанилатциклазы [Fasano A., 2002], и эффектор T3SS VopF с тремя домена ми, сходными с эукариотическими нуклеаторами актина [Tam V.C. et al., 2007].
Интенсивное развитие исследований геномов V.cholerae позволило наблюдать и такое интересное явление, как дублирование генов, доменов, структуры и функции их продуктов. Две копии в составе большой и малой хромосом имеет ген транслокона T6SS hcp. Актин-связывающий домен ее эффектора, ACD-VgrG1, является гомологом и вероятным предшественником уникального домена ACD-RtxA. Вообще же функции модуляторов актина разными путями реализует целый ряд факторов: Zot – за счет ак тивации протеинкиназы С [Fasano A., 2002], HA/P – посредством расщепления окк людина [Wu Z. et al., 2000], эффекторы T3SS VopF/VopN – благодаря нуклеации ак тина [Tam V.C. et al., 2010], MARTXVc – вызывая его деполимеризацию и ковалентное связывание [Fullner Satchell K.J., 2007]. У отдельных штаммов даже отсутствие акти ватора аденилатциклазы СT отчасти компенсируется активатором гуанилатциклазы ST, ген которого был приобретен сравнительно недавно. Создается впечатление, буд то холерные вибрионы накапливали и продолжают накапливать «про запас» гены, продукты которых неидентичны структурно, но сходны функционально. Тогда в слу чае повреждения либо утраты одних генов всегда можно активизировать другие. Оче видно, этим объясняются неудачи при попытке создания совершенно нереактогенных живых противохолерных вакцин. С другой стороны, иногда прослеживается и прямо противоположный процесс – утрата либо повреждение некоторых «дублирующих» генов или их доменов, поддержание экспрессии которых может быть энергетически невыгодно. Результаты наших исследований показали, что одновременное присутст вие детерминант ACD-VgrG1 и ACD-RtxA, ACD-VgrG1 и кластера генов T3SS, про фага CTX и T3SS характерно лишь для меньшинства штаммов.
По образному выражению Fasano A. (2002), «то, как бактерии приспособились приобретать новые гены, сохранять их в своем весьма небольшом геноме, да еще и делиться этой информацией с другими себе подобными, наводит на мысль о том, что они знали физиологию макроорганизма уже за тысячи, если не за миллионы лет до нас». Этому обмену генетической информацией способствует наличие в геноме V.cholerae большого числа мобильных элементов [Faruque S.M., Mekalanos J.J., 2003] и суперинтегрона [Clark C. A. et al., 2000;
Heidelberg J.F. et al., 2000]. Постоянно про должающееся формирование новых форм возбудителя требует дальнейшего изучения свойств известных дополнительных токсинов и идентификации неизвестных, по скольку нельзя исключить, что в скором времени может произойти отбор клонов с та ким их сочетанием, которое обеспечит способность вызывать более тяжелые заболе вания людей и распространяться на обширные пространства, как это уже происходит с токсигенными вибрионами, образующими «гибридные» варианты [Nair G.B. et al., 2007;
Смирнова Н.И. с соавт., 2011 и др.].
ВЫВОДЫ 1. Рекомбинантные белки – продукты клонированных генов гемагглюти нин/протеазы hapA, CHO-удлиняющего фактора cef, дополнительного холерного энтеротоксина асе и zonula occludens-токсина zot V. cholerae, экспрессируемых сконструированными штаммами E.coli, сохраняют все виды ферментативной и/или биологической активности.
2. Гемагглютинин/протеаза (HA/P) V.cholerae осуществляет самопроцессинг и де градацию белков чужеродного хозяина, что позволяет выделять ее из рекомби нантных штаммов E.coli в зрелой форме. HA/P обладает широким спектром про теолитической активности и способностью вызывать существенные морфологи ческие и ультраструктурные нарушения в культивируемых клетках и в кишечнике чувствительных животных, то есть является фактором патогенно сти/персистенции.
3. Результаты сравнительного анализа собственных и литературных данных свиде тельствуют об идентичности гемагглютинин/протеазы и цитотоксина, не повреж дающего мембрану (NМDCY), описанного в зарубежных публикациях как само стоятельный токсин V.cholerae.
4. CHO-удлиняющий фактор Cef V. cholerae обладает эстеразной активностью и вы зывает морфологические и ультраструктурные изменения в культурах клеток и в кишечнике чувствительных животных, то есть может играть существенную роль как патогенности, так и в персистенции. Его молекула содержит лейциновую «молнию», домен Куница и активный центр сериновых липаз, который обуслов ливает эстеразную, но не цитотоническую активность.
5. CHO-удлиняющий фактор Сef холерогенных вибрионов Бенгал отличается от Сef V.cholerae О1 и nonО1/nonО139 неспособностью к гидролизу трибутирина при сохранении твиназной активности. Это изменение спектра субстратной специ фичности обусловлено точковой мутацией в кодирующем его гене, следствием которой явилась несинонимичная замена остатка гидрофобной аминокислоты на остаток гидрофильной. Ген cef присутствует в геномах всех холерных вибрионов, кроме нехолерогенных штаммов О139 серогруппы, которые лишены и твиназной активности.
Активные домены zonula occludens-токсинов Zot, кодируемых генами профагов 6.
СТХ и pre-CTX, идентичны, что указывает на наличие у них одинаковой биологи ческой активности. Zot вызывает разрежение плотного монослоя культивируемых клеток in vitro и приобретение чувствительности к белкам E.coli клетками кишеч ника in vivo. Дополнительный холерный энтеротоксин Асе является консерватив ным белком;
он вызывает накопление жидкости в кишечнике мышей-сосунков. В клетках холерных вибрионов, геномы которых содержат тандем из двух профагов pre-CTX, могут образовываться инфекционные вирионы, способные к горизон тальному переносу генов токсинов (асе, zot) и пилина (сер).
7. Нехолерогенные штаммы V.cholerae содержат как консервативные (общие с холе рогенными) гены факторов патогенности/персистенции, так и целый ряд генети ческих детерминант, которые могут присутствовать/отсутствовать в их геномах, образуя различные сочетания. С помощью молекулярного зондирования у многих штаммов V.cholerae O1 и nonO1/nonO139 выявлены последовательности, гомоло гичные гену термостабильного токсина, а у штаммов одного клона О1 серогруппы – возбудителей локальной вспышки – термостабильного прямого гемолизина V.
parahaemolyticus.
8. Новый холерный токсин NCT, описанный в литературе как отдельный самостоя тельный токсин, представляет собой варьирующую по качественному и количест венному составу смесь нескольких секретируемых биологически активных фак торов, которая может включать гемагглютинин/протеазу и CHO-удлиняющий фактор Cef.