А ва х р у к о п и с и антонюк людмила петровна регуляция метаболизма бактерии azospirillum brasilense sp245: особенности азотного обмена и влияние лектина пшеницы (агглютинина зародышей пшеницы)
В с е р о с с и й с к и й и н с т и т у т с е л ь с к о х о з я йс т в е нно й м ик р о б ио л о гии Р А С Х Н ( г. С а н к т - П е т е р б ур г ) З а щ и т а с о с т о и т с я 2 5 а п р е л я 2 0 0 2 г. в 1 0 ч а с на з а с е д а н и и д и с с е р тацио нно го с о в е т а ( Д 0 0 2. 9 6. 2 4 7. 0 1 ) по з а щ и т е д и с с е р т а ц и й на с о и с к а н и е у ч е н о й с т е п е н и д о к т о р а наук в И н с т и т ут е б ио х им ии им. А. Н. Б а х а Р А Н ( 1 1 9 0 7 1 М о с к в а, Л е н и н с к и й пр о с пе к т 3 3, к о р п.
2).
С д и с с е р т а ц и е й м о ж н о о з на к о м ит ь с я в Б и б л и о т е к е б ио л о гич е с к о й л и т е р а т у р ы Р А Н ( 1 1 9 0 7 1 М о с к в а, Л е н и н с к и й пр о с пе к т 3 3, к о р п.
1).
А в т о р е ф е р а т р а з о с л а н “ _ _ _ _ “ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ 2 0 0 2 г.
Ученый секретарь диссертационного совета д о к т о р б ио л о гич е с к их наук Т.А. Валуева ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ Акту альность проблемы Около двух десятилетий тому назад родилось и в настоящее время быстро развивается новое направление современной биологии – иссле дование растительно-бактериальных ассоциативных симбиозов.
Развитие и применение новых методов исследования и, в частности, разработка приборной и методологической базы оценки азотфиксации (по восстановлению ацетилена) достаточно быстро привели к осознанию того, что высшие растения поддерживают на своих корнях су ществование целых бактериальных сообществ, которые, в свою очередь, активно фиксируют молекулярный азот атмосферы, передавая связанные его формы растению-хозяину (Vose and Ruschel, 1981;
Умаров, 1986).
Как изначально, так и в настоящее время интерес к ассоциативным сим биозам остается высоким еще и в силу насущной необходимости замены в землепользовании химического минерального азота на экологически чистый биологический азот. Более внимательное исследование взаимо действия партнеров в ассоциативном симбиозе в последующие годы по казало, что азотфиксация не является единственным фактором позитив ного воздействия бактерий на рост и развитие растения-хозяина.
Оказалось, азоспириллы и другие ассоциативные бактерии способны продуцировать цитокинины, гиббереллины и ауксины (Steenhoudt and Vanderleyden, 2000;
Tien et al., 1979;
1988;
Harari et al., 1988), хорошо известные как вещества, обладающие фитогормональной активностью. К настоящему времени получены строгие доказательства того, что ИУК вносит вклад в ростстимулирующий эффект Azospirillum brasilense, наиболее изученного представителя ассоциативных бактерий (Zimmer et al., 1988;
Barbieri and Galli, 1993). Эксперименты показали, что помимо двух ведущих факторов (синтеза фитогормона ИУК и вклада в азотное питание растений за счет азотфиксации), существует и ряд других аспектов позитивного воздействия микропартнера симбиоза на жизне деятельность макропартнера (Del Gallo and Fendrik, 1994;
Белорукова, 1998;
Белимов и соавт., 1999).
Новый виток развития проблемы связан с осознанием того, что среди ассоциативных бактерий есть штаммы, способные колонизировать преи мущественно внутренние части корня и проводящую систему растения хозяина (Dobereiner et al., 1995). Эти бактерии получили название эндо фитов. Они оказывают значительно более выраженное позитивное влия ние на рост и развитие растения-хозяина по сравнению с бактериями, неспособными проникать внутрь корня (Steenhoudt and Vanderleyden, 2000;
Dobereiner and Pedrosa, 1987). Среди азоспирилл, пожалуй, е д и н с т в е н н ы м штаммом, принадлежность которого к эндофитам строго доказана, является A. brasilense Sp245, природный симбионт пшеницы (Baldani et al., 1983;
Assmus et al, 1995). Как показали исследования, проведенные с использованием олигонуклеотидных зондов и сканирующей конфо кальной лазерной микроскопии, бактерии этого штамма способны к иск лючительно тесному взаимодействию с растением-хозяином: они запол няют корневые волоски (Assmus et al., 1995) и колонизируют проводя щ у ю с и с т е м у корня пш еницы ( S c h l o t e r e t a l., 1 9 9 4 ;
S c h l o t e r a n d H a r t m a n n 1 9 9 8 ). В а ж н о, чт о в с л у ча е A. br as ile ns e Sp245 подобная колонизация х а р а к т е р н а к а к для л а б о р а т о р н ы х у с л ов ий, т а к и для п о л е в ы х. В т о р о й я р к о й особенност ь ю эт ог о ш т а м м а я в л я е т с я э ф ф е к т и в н о с т ь е г о а з о т н о г о обмена в е с т е с т в е н н ы х у с л ов ия х симбиоза. Т а к, иноку ляция пш еницы ш т а м м о м Sp245 в п о л е в ы х у с л ов ия х приводила к б о л е е че м д в у к р а т н о м у ( 2 3 7 % по с р а в н е н и ю с к о н т р о л е м ) в о з р а с т а н и ю с о д е р ж а н и я а з о т а в н а з е м н о й ча с т и р а с т е н и я - хозяина ( D o b e r e i n e r a n d P e d r o s a, 1 9 8 7 ).
Азоспириллы о т н о с я т с я к б а к т е р и я м, и с с л е д о в а н и е к о т о р ы х н а ч а л о с ь о т н о с и т е л ь н о н е д а в н о, и их а з о т н ы й о б м е н м а л о и з у че н. В эт ой с в я з и п р е д с т а в л я л о с ь в а ж н ы м н а ч а т ь изу чение а з о т н о г о м е т а б о л и з м а A.
b ras ile ns e, взяв в к а че с т в е о б ъ е к т а и с с л е д о в а н и я ш т а м м - эндофит эт ог о вида. П р и о р и т е т н о й з а д а ч е й при изу чении эт ог о а с п е к т а биохимии азоспирилл было выбрано исследование свойств и регуляции г л у т а м и н с и н т е т а з ы ( Г С ), к л ю ч е в о г о ф е р м е н т а а з о т н о г о обмена. К н а ч а л у н а ш е г о и с с л е д о в а н и я б ы л а опу бликована л и ш ь одна эк с п е р и м е н т а л ьн а я работа, посвященная ГС A. brasilense (Bozouklian and Elmerich, 1986);
в н е й с о о б щ а л о с ь о клонировании и с е к в е н и р о в а н и и с т р у к т у рн о г о г е н а Г С g l n A т и п о в о г о ш т а м м а A. br as ile ns e. И, к р о м е т о г о, в дву х дру г их р а б о т а х с о о б щ а л о с ь о ж е с т к о й корреляции м е ж д у а к т и в н о с т я м и Г С и н и т р о г е н а з ы у A. br as ile ns e (Okon e t a l., 1 9 7 6 ;
G a u t h i e r a n d E l m e r i c h, 1 9 7 7). Инт е рес к ГС азоспириллы обусловлен еще и тем, чт о бактериальные а д е н и л и р у е м ы е Г С искл юч ит ел ь но с л о ж н ы к а к в ча с т и фу нкций, т а к и в ча с т и с т р у к т у рн о й организации ( L e h n i n g e r, 1 9 9 3 ). Однако с в е д е н и я о б а к т е р и а л ь н ы х Г С, за и с к л ю ч е н и е м ф е р м е н т а из E sc h e ri c h i a c o l i, в е с ьм а ф р а г м е н т а р н ы. К о м п л е к с н о е и с с л е д о в а н и е с в о й с т в Г С A. brasi l ense я в л я е т с я в эт ой с в я з и в а ж н о й и и н т е р е с н о й з а д а ч е й.
Дру г им в а ж н ы м а с п е к т о м биохимии азоспирилл я в л я е т с я р е г у л я ц и я о т д е л ь н ы х с т о р о н их м е т а б о л и з м а п о с р е д с т в о м м о л е к у л я р н ы х с и г н а л о в р а с т е н и я - хозяина. К н а с т о я щ е м у в р е м е н и многие а с п е к т ы фу нкциониро вания а с с о ц и а т и в н ы х и эндофит ных симбиозов о с т а ю т с я н е я с н ы м и и не изу ченными, чт о тормозит не т о л ьк о п р о ц е с с понимания и о с м ы с л е н и я эт ог о и н т е р е с н е й ш е г о явления природы, но и не д а е т в о з м о ж н о с т и в пол ной м е р е и с п о л ь з о в а т ь е г о в п р а к т и к е р а с т е н и е в о д с т в а. К чис л у т а к и х не изу ченных в о п р о с о в о т н о с и т с я и вопрос о м о л е к у л я р н ы х с и г н а л а х, л е ж а щ и х в о с н о в е формирования и у с пе ш ног о фу нкционирования а с с о ц и а т и в н ы х и эндофит ных симбиозов. Н еясно, к а к м а к р о п а р т н е р в л и я е т на м е т а б о л и з м м и к р о п а р т н е р а, и наоборот.
В эт ой с в я з и больш о й и н т е р е с п р е д с т а в л я ю т л е к т и н ы, т. к. и з в е с т н о, чт о они в ы пол ня ют информационные фу нкции в различных биологических системах (Королев, 1984;
Gabius, 1995;
Rudiger, 1998;
Hebert, 2000). В ча с т н о с т и, в симбиозах пш еницы и а з о с п и р и л л ы и н т е р е с е н в эт ом отнош е нии а г г л ю т и н и н з а р о д ы ш е й пш еницы ( л е к т и н пш еницы, АЗП).
К началу данного исследования уже было известно, что АЗП присут ствует не только в зародыше, но и в корнях проростков и взрослых рас тений пшеницы и доступен для контакта с бактериями (Mishkind et al., 1980–1983). Кроме того, несколькими независимыми группами исследо вателей независимыми методами было показано, что лектин пшеницы связывается с клетками A. brasilense (Котусов с соавт., 1984;
Yagoda Shagam et al., 1988;
Del Gallo et al., 1989). В конце 80-х годов уже были опубликованы данные о способности АЗП стимулировать азотфиксацию типового штамма – A. brasilense Sp7 (Никитина и соавт., 1987). Таким образом, имеющиеся к началу данного исследования литературные данные позволяли предположить, что АЗП может наряду с другими функциями (Хайруллин, 2001) играть роль вещества-сигнала для азоспирилл. Ввиду отсутствия каких-либо сведений об обмене молеку лярными сигналами в ассоциативных и эндофитных симбиозах, было заманчиво проверить влияние АЗП на разные аспекты метаболизма азоспириллы, в первую очередь – на азотный обмен.
Размышляя о регуляции метаболизма бактериальной клетки, нельзя не учитывать, что она осуществляется не только посредством присутствующих в клетке металлов, коферментов, макроэргических соединений и других внутриклеточных метаболитов, но и внешними по отношению к клетке факторами. Эту мысль в отношении энергетической стороны метаболизма В.П. Скулачев высказал еще более 30 лет тому назад, когда писал, что в регуляции биоэнергетики "участвует сложная иерархия контрольных систем клетки, а у высших организмов – и управляющие устройства надклеточного уровня" (Скулачев, 1969).
Очевидно, что в изучаемой нами системе в качестве внешних по отношению к клетке факторов могут выступать метаболиты растения хозяина, одним из которых является лектин пшеницы.
Поиск ответа на вопрос, является ли лектин пшеницы молекулярным сигналом для азоспириллы, подстегивался также достижениями в изуче нии социального поведения бактерий. Уже накопился большой массив экспериментальных данных, убедительно свидетельствующих о том, что бактерии обмениваются молекулярными сигналами не только друг с другом, но и (в случае симбиоза и паразитизма) с организмом-хозяином (Дебабов, 1999;
Олескин и соавт., 2000;
Завильгельский и Манухов, 2001). В случае бактерий большая часть известных к настоящему време ни молекулярных сигналов – вещества низкомолекулярные. Описаны и изучаются лишь единичные случаи молекулярных сигналов белковой природы (Dworkin, 1996;
Kaprelyants et al., 1999;
Biketov et al., 2000). В этой связи проверка предположения о том, что лектин пшеницы может играть для азоспириллы роль молекулярного сигнала, оказалась доста точно важной.
Все вышесказанное предопределило выбор подходов к изучению регуляции метаболизма эндофитной бактерии A. brasilense Sp245:
попытка приоткрыть тайны внеклеточной регуляции побудила взяться за изучение влияния лектина пшеницы на метаболизм бактерии-эндофита.
В этой части работы прослеживаются три направления:
(а) модуляция внеклеточным сигналом азотного метаболизма A.
brasilense Sp245 (азотфиксации, экскреции продукта азотфиксации, активности и синтеза ГС, биосинтеза нитрогенизы);
(в) изменение под влиянием лектина пшеницы синтеза ИУК азоспи риллой (как одного из основных факторов ростстимулирующего влияния этой бактерии);
(с) изучение влияния АЗП на биосинтетические и ростовые процессы у A. brasilense Sp245.
В с в я з и с информацией о т о м, чт о АЗП, с в я з ы в а я с ь с Т - к л е т к а м и лимфоцитов че лове ка и дру г ими к л е т к а м и - м и ш е н я м и, в ы з ы в а е т гидролиз фосфоинозитидов и у в еличение концентрации ионов кальция в ц ит опл азм е ( C l e v e r s e t a l., 1 9 8 6 ), в данной р а б о т е был предпринят а н а л и з фосфолипидного с о с т а в а A. br as ile ns e Sp245 ( с в е д е н и й о фосфолипидном с о с т а в е м е м б р а н азоспирилл в л и т е р а т у р е не о к а з а л о с ь ). К р о м е т о г о, б ы л и п р о в е д е н ы эк с п е р и м е н т ы с целью в ы я с н е н и я, и з м е н е н я е т с я л и с о д е р ж а н и е ионов кальция при с в я з ы в а н и и АЗП с к л е т к а м и а з о с п и р и л л ы.
С дру г ой с т о р о н ы, а к т у а л ьно с т ь и с с л е д о в а н и я р е г у л я ц и и м е т а б о л и з м а на в ну т рикл ет оч ном у ровне п р е д о п р е д е л и л а изу чение р е г у л я ц и и и с в о й с т в Г С, к о т о р а я, к а к б ы л о о б н а р у ж е н о в ходе выполнения данной ра бот ы, р е г у л и р у е т с я в т о м чис л е и п о с р е д с т в о м АЗП.
Очерченный в ы ш е с п е к т р з а д а ч п р е д с т а в л я е т с я а к т у а л ьны м к а к с т о чк и зрения познания м о л е к у л я р н ы х м е х а н и з м о в в з а и м о д е й с т в и я п а р т н е р о в в симбиозе пш еница - A. br as ile ns e S p 2 4 5, т а к и с позиций и с с л е д о в а н и я биохимии азоспирилл, эт их искл юч ит ел ь но и н т е р е с н ы х к а к с п р а к т и че с к о й, т а к и с т е о р е т и ч е с к о й т о че к зрения б а к т е р и й. У ч и т ы в а я т о т ф а к т, чт о в н а с т о я щ е е в р е м я происходит формирование н а п р а в л е н и я с о в р е м е н н о й биохимии м и к р о о р г а н и з м о в, к о т о р о е м о ж н о обозначить "б е л к и к а к м о л е к у л я р н ы е с и г н а л ы в ж и з н е д е я т е л ьн о с т и б а к т е р и й ", и с с л е д о в а н и е л е к т и н а пш еницы к а к п о т е н ц и а л ь н о г о м о л е к у л я р н о г о с и г н а л а для а з о с п и р и л л ы п р е д с т а в л я е т с я в а ж н о й з а д а ч е й.
Цель и задачи работы Целью р а б о т ы я в и л о с ь изу чение р е г у л я ц и и м е т а б о л и з м а б а к т е р и и A.
b ras ile ns e Sp245 с использованием дву х подходов : ( i ) и с с л е д о в а н и е р е г у ляции и к а т а л и т и че с к и х с в о й с т в Г С – к л ю ч е в о г о ф е р м е н т а а з о т н о г о об мена ;
( i i ) изу чение влияния л е к т и н а пш еницы к а к п р е д п о л а г а е м о г о м о л е к у л я р н о г о с и г н а л а р а с т е н и я - хозяина на а з о т н ы й м е т а б о л и з м б а к т е р и и ( а к т и в а ц и ю и б и о с и н т е з Г С и н и т р о г е н а з ы, экскрецию аммония ) и ряд дру г их а с п е к т о в м е т а б о л и з м а б а к т е р и и.
В ходе д о с т и ж е н и я п о с т а в л е н н о й ц е л и р е ш а л и с ь с л е д у ющ и е задачи :
1. П р о в е с т и к о м п л е к с н о е и с с л е д о в а н и е к а т а л и т и че с к и х с в о й с т в Г С A.
br as ile ns e Sp245: о п р е д е л и т ь рН о п т и м у м ы и т е р м о с т а б и л ь н о с т ь ф е р м е н т а ;
о п и с а т ь с п о с о б н о с т ь различных к а т и о н о в п о д д е р ж и в а т ь а к т и в н о с т ь Г С, изу чить к и н е т и ч е с к о е поведение Mg 2 + - и Mn 2 + активируемой ГС в биосинтетической реакции.
2. П о с т р о и т ь т р е х м е р н ы е к и н е т и ч е с к и е к р и в ы е, о п и с ы в а ю щ ие поведение Mn 2 + - а к т и в и р у е м о й Г С A. br as ile ns e Sp245 в б и о с и н т е т и ч е с к о й р е а к ции. В ы в е с т и у равнение, о п и с ы в а ю щ е е к и н е т и к у ф е р м е н т а.
3. П р о в е р и т ь г и п о т е з у В е с т б и и с о а в т. ( We st b y e t a l., 1 9 8 7 ) о т о м, чт о у A. b r a s i l e n s e а с с и м и л я ц и я аммония о с у щ е с т в л я е т с я че ре з г л у т а м и н с и н т е т а з у - г л у т а м а т с и н т а з у не т о л ьк о при н е д о с т а т к е аммония в с р е де, но и при е г о избы т ке.
4. Изу чит ь влияние л е к т и н а пш еницы к а к эк с т р а к л е т о чн о г о с и г н а л а на а з о т н ы й о б м е н а з о с п и р и л л ы ( а к т и в н о с т ь Г С, а з о т ф и к с а ц и ю, экс к ре цию аммония ).
5. В ы я с н и т ь, приводит л и с в я з ы в а н и е АЗП с п о в е р х н о с т ь ю а з о с п и р и л л ы к изменению у ровня проду к ции б а к т е р и я м и ф и т о г о р м о н а И У К.
6. Исследовать влияние лектина пшеницы на биосинтез белков в клет ках A. brasilense Sp245. Выяснить стимулирует ли связывание АЗП с поверхностью клетки биосинтез ГС и нитрогеназы.
7. Изучить влияние лектина пшеницы на ростовые процессы в культуре A. brasilense Sp245.
8. Выяснить, влияет ли аэрация на способность A. brasilense Sp реагировать на АЗП как на экстраклеточный сигнал. Идентифициро вать и охарактеризовать кристалл, образующийся в среде культиви рования азоспириллы при обильной аэрации.
9. Изучить фосфолипидный состав A. brasilense Sp245;
выяснить, при сутствует ли фосфатидилинозитол в составе мембран азоспириллы.
Проверить, изменяется ли содержание кальция в клетках бактерии при обработке клеток лектином пшеницы.
Нау чная новизна и практическая значимость работы.
Впервые проведено комплексное исследование кинетических свойств ГС A. brasilense, ключевого фермента азотного метаболизма этой бакте рии. Впервые для бактериальных ГС показано, что при смене активи рующего катиона (с магния на марганец, и наоборот) меняется весь спектр каталитических свойств фермента. Впервые в исследовании глу таминсинтетаз построены трехмерные кинетические зависимости, опи сывающие поведение фермента, а также выведено уравнение, описы вающее процесс.
Получены доказательства того, что у A. brasilense существует лишь один путь ассимиляции аммония, через глутаминсинтетазу – глутаматсинтазу, и этот путь функционирует как при избытке, так и при недостатке аммония в среде.
Впервые показано, что в симбиозе пшеницы и A. brasilense Sp один из белков растения-хозяина, лектин пшеницы, способен функцио нировать как экстраклеточный сигнал и оказывать существенное влия ние на азотный метаболизм бактерии: увеличивать активность и био синтез ГС, стимулировать процесс фиксации молекулярного азота, уси ливать экспорт продукта азотфиксации, аммония, за пределы бактери альной клетки.
Установлено, что АЗП является фактором, усиливающим продукцию фитогормона ИУК;
таким образом, впервые показано, что растение спо собно активно влиять на метаболизм микропартнера симбиоза.
Впервые показано, что АЗП может служить фактором роста для A.
brasilense Sp245, микропартнера эндофитных и ассоциативных симбио зов этой культуры. Установлено, что это свойство лектина проявляется в стационарной фазе роста бактерии, в то время как в экспоненциальной фазе оно выражено незначительно.
Получены дозательства того, что у активированных лектином пшени цы клеток A. brasilense Sp245 усиливается синтез уже имеющихся в клетке белков и индуцируется синтез новых. Таким образом, впервые показана способность растительных лектинов стимулировать биосинте тические процессы у бактерий.
Установлено, что кислород является фактором, важным для взаимо действия азоспириллы с лектином пшеницы. Клетки, растущие микро аэробно, д е м о н с т р и р о в а л и ц е л ы й с п е к т р к л е т о ч н ы х о т в е т о в на л е к т и н пш еницы, в т о в р е м я к а к в с л у ча е аэробно в ы р а щ е н н о й к у л ь т у р ы не у да л о с ь з а р е г и с т р и р о в а т ь ни о д н о г о к л е т о ч н о г о о т в е т а на АЗП. Показано т а к ж е, чт о т о л ьк о при обильной аэрации в к у л ь т у р е A. brasi l ense Sp происходит образование к р и с т а л л о в. К р и с т а л л ы идентифицированы к а к одна из модификаций с т р у в и т а с о с т р у к т у р о й MgNH 4 PO 4. 6H 2 O, с о д е р ж а щ а я ря д изоморфных п р и м е с е й. Т а к и м образом, в п е р в ы е для р о с т с т и м у лиру ющих ризобакт ерий описано явление образования к р и с т а л л о в.
В п е р в ы е для A. br as ile ns e и в ц е л о м для г р а м о т р и ц а т е л ь н ы х б а к т е р и й показано п р и с у т с т в и е ф осф ат идил инозит ол а в к о л и че с т в а х, х а р а к т е р н ы х для м е м б р а н м л е к о п и т а ю щ и х. Э т о т ф а к т, в с о в о к у п н о с т и с дру г им п о л у ченным н а м и р е з у л ьт а т о м ( а к т и в а ц и я м е т а б о л и з м а а з о с п и р и л л ы л е к т и н о м я в л я е т с я кальций - з а в и с и м ы м п р о ц е с с о м ), и рядом л и т е р а т у р н ы х данных п о з в о л я е т в п е р в ы е в ы д в и н у т ь предположение о с у щ е с т в о в а н и и у прока риот Ca 2 + - м о б и л и з у ю щ е й фосфоинозитидной сигнал-трансдуцирую-щей системы.
В п е р в ы е для а с с о ц и а т и в н ы х и эндофит ных симбиозов п р е д л о ж е н а г и п о т е з а об обмене м о л е к у л я р н ы м и с и г н а л а м и м е ж д у п а р т н е р а м и с и м биоза. Г и п о т е з а о с н о в ы в а е т с я на больш о м м а с с и в е с о б с т в е н н ы х и л и т е р а т у р н ы х данных. П р е д л о ж е н о новое понимание одной из фу нкций АЗП, с в я з а н н о й с т е м, чт о в р е а л ьны х у с л ов иях р а с т е н и е пш еницы р а с т е т в о к р у ж е н и и больш о г о чис л а разнообразны х м и к р о о р г а н и з м о в.
Полу ченные в р а м к а х р а б о т ы данные с у щ е с т в е н н о р а с ш и р я ю т п р е д с т а в л е н и я о биохимии азоспирилл, в ча с т н о с т и, о р е г у л я ц и и их а з о т н о г о обмена, а т а к ж е о р е г у л я ц и и м е т а б о л и з м а б а к т е р и и под влиянием м о л е к у л я р н ы х с и г н а л о в р а с т е н и я - хозяина.
П р а к т и че с к а я з н а ч и м о с т ь полу ченных р е з у л ьт а т о в с в я з а н а в п е р в у ю о че р е д ь с т е м, чт о п р о г р е с с в и с с л е д о в а н и и а с с о ц и а т и в н ы х и эндофит ных симбиозов крайне в а ж е н для з а м е н ы в п р а к т и к е с е л ьс к о г о х о з я й с т в а х и м и ч е с к о г о м и н е р а л ь н о г о а з о т а на э к о л о г и ч е с к и чис т ый биологический а з о т. И з в е с т н о, чт о с озданы и п р и м е н я ю т с я биоу добрения на о с н о в е азоспирилл и дру г их а с с о ц и а т и в н ы х б а к т е р и й ( O k o n a n d L a b a n d e r a G o n z a l e s, 1 9 9 4 ). В с в о ю о че р е д ь, н е д о с т а т о чн о в ы с о к а я э ф ф е к т и в н о с т ь и н е д о с т а т о чн о ш и р о к о е их использование с в я з а н ы с н е д о с т а т о чн о с т ью знаний об а с с о ц и а т и в н ы х и эндофит ных симбиозах.
Работа выполнена в л а б о р а т о р и и биохимии Инст ит у т а биохимии и физиологии р а с т е н и й и м и к р о о р г а н и з м о в РАН в р а м к а х т е м ы “Изу чение м о л е к у л я р н о - г е н е т и ч е с к и х м е х а н и з м о в у знавания, к о н т а к т а и обмена м е т а бол и т а м и азоспирилл и к у л ь т у р н ы х з л а к о в ” ( н а у чн ы й р у к о в о д и т е л ь д. б. н. п р о ф е с с о р з а с л. д е я т е л ь н а у к и РФ Иг нат о в В. В., № г о с. р е г и с т р а ции 01860024516) и т е м ы ” О с о б е н н о с т и биохимии эндофит ных и а с с о ц и а т и в н ы х симбионтов рода A z o s p i r i l l u m” ( н а у чн ы й р у к о в о д и т е л ь к. б. н.
Ант о нюк Л. П., № г о с. р е г и с т р а ц и и 0 1 2 0 0 0 1 2 8 5 5 ).
Работа поддержана г р а н т а м и Р о с с и й с к о г о фонда ф у н д а м е н т а л ьн ы х исследований (проекты № 93-04-20680, № 95-04-11473, № 95-03-08295 и № 0 1 - 0 4 - 4 8 7 5 5 ), ИНТАС ( п р о е к т № 9 6 - 1 0 1 5 ), К о м и с с и и РАН по д е л а м м о л о д е ж и ( 6 - й конку рс - эк с п е р т и з а п р о е к т о в, п р о е к т № 2 0 5 ) и НАТО ( г р а н т L ST. CL G. 9 7 7 6 6 4 ).
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены:
– на международных научных симпозиумах и конференциях: 4th INTAS Interdisciplinary Sy mposium on Phy sical and Chemical Methods in Biology, Medicine, and Environment (Moscow, Russia, May 30 – June 3, 2001);
2nd International Conference on Trace Element Speciation in Biomedical, Nutriational and Environmental Sciences (Munich, Germany, May 07 – 10, 2001);
School for Molecular Biology, Microbiology and Science for Piece (Keszthely, Hungary, August 23 – 27, 2000);
XXV European Congress on Molecular Spectroscopy (Coimbra, Portugal, August 27 – September 1, 2000);
Между народной конференции "Физиология растений - наука III тысячелетия" (Москва, 4 – 9 октября 1999);
Intrnational conference "Nuclear Acids and their Interactions with Metal Ions” (Alghero, Italy, September 5 – 7, 1998);
V Intrernational Sy mposium on Metal Ions in Biology and Medicine (Munich, Germany, May 8 – 10, 1998);
17-th International Lectin Meeting “Interlec 17“ (Wrsburg, Germany, September 24 – 27, 1997);
The International Sy mposium on Subsurface Microbiology (Davos, Switzerland, September 15 – 21, 1996);
7th International Sy mposium on Nitrogen Fixation with Non-Legumes (Faisalabad, Pakistan, October 16 – 21, 1996);
XXIII European Congress on Molecular Spectroscopy (Balatonfured, Hungary, August 25-30, 1996);
8th International Congress of Bacteriology and Applied Microbiology Division (Jerusalem, Israel, August 18-23, 1996);
26th International Sy mposium on Environmental Analitical Chemistry (Vienna, Austria, April 9-12, 1996);
3rd International Sy mposium on Bioorganic Chemistry (Dagomy s, Russia, September 17-23, 1995);
XXIX Colloquium Spectroscopicum Internationale (Leipzig, Germany, August 27 – September 1, 1995);
International Workshop on Associative Interactions of Nitrogen-fixing Bacteria with Plants (Saratov, Russia, June 5 – 8, 1995);
3rd IUBMB Conference "Molecular Recognition" (Singapore, April 23 – 27, 1995);
10th International Congress on Nitrogen Fixation (St. Petersburg, Russia, May 28 – June 3 1995);
NATO Advanced Research Workshop on Azospirillum and Related Microorganisms (Sarvar, Hungary, September 4 – 7, 1994);
1st European Nitrogen Fixation Conference (Szeged, Hungary, August 28 – September 2, 1994);
16th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology (New Delhi, India, September 19 – 22, 1994);
VIII Eastern European Sy mposium on Biological Nitrogen Fixation "Nitrogenfix-92" (Saratov, Russia, September 22 – 26, 1992).
– на всероссийских конференциях и совещаниях: XII юбилейной конференции “Ферменты микроорганизмов” (Казань, 1 – 5 февраля 2001 г.) ;
XVI Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Санкт Петербург, 31 мая – 3 июня 1998 г.);
9-м Баховском коллоквиуме по азотфиксации (Москва, 24 – 26 января 1995 г.);
VI Симпозиуме по биохимии липидов (Санкт-Петербург, 3 – 6 октября 1994 г.);
конференции “Клинические и экспериментальные аспекты клеточной сигнализации” (Москва, 27 – 29 сентября 1993 г.);
IV Всероссийской конференции “Микроорганизмы в сельском хозяйстве” (Пущино, 20 – 24 января 1992 г.).
Публикации. По теме диссертации опу бликовано 85 печатных работ в отечественных и зару бежных изданиях.
Структура и объем диссертации. Д и с с е р т а ц и я с о с т о и т из в в е дения, а н а л и т и че с к о г о обзора л и т е р а т у р ы, описания о б ъ е к т о в и м е т о д о в и с с л е д о в а н и я, изложения полу ченных р е з у л ьт а т о в и их о б с у ж д е н и я, за ключения, о с н о в н ы х в ы в о д о в, с п и с к а использованных л и т е р а т у р н ы х ис точников и р а з д е л а «Б л а г о д а р н о с т и ». Ра бот а изложена на 374 с т р а н и ц а х м а ш и н о п и с н о г о т е к с т а, в к л ю ча е т 10 т а бл и ц и 42 р и с у н к а. Список л и т е р а т у р н ы х источников с о д е р ж и т 684 наименований, в т о м чис л е 523 з а р у бежных.
СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Обзор литературы В обзоре л и т е р а т у р ы, п р е д с т а в л е н н о м 4- м я р а з д е л а м и и 10- ю п о д р а з д е л а м и, и з л а г а ю т с я с о в р е м е н н ы е п р е д с т а в л е н и я по а з о т н о м у обмену азоспирилл, р е г у л я ц и и м е т а б о л и з м а прокариот в о т в е т на эк с т р а к л е т о ч ные с и г н а л ы. От дельный р а з д е л обзора п о с в я щ е н п о в е р х н о с т н ы м с т р у к т у р а м а з о с п и р и л л ы и с в я з ы в а н и ю л е к т и н а пш еницы. Подробно а н а л и з и р у ю т с я л и т е р а т у р н ы е данные по с т р о е н и ю АЗП, п р е д п о л а г а е м ы м фу нкци я м и б и о л о г и ч е с к о й а к т и в н о с т и эт ог о б е л к а. Приведены с о в р е м е н н ы е п р е д с т а в л е н и я о л окал изации азоспирилл в у с л ов иях а с с о ц и а т и в н ы х и эн дофит ных симбиозов и о в з а и м о д е й с т и я х п а р т н е р о в симбиоза.
Материалы и методы исследований Объ е кт ы и с с л е д о в а н и я. Объ е кт ом и с с л е д о в а н и я б ы л а эндофит на я ( колонизиру ющ а я к л е т к и и т к а н и корня ) б а к т е р и я A. brasi l ense S p 2 4 5, эволюционно п р и с п о с о б л е н н а я к в з а и м о д е й с т в и ю с м а к р о п а р т н е р о м симбиоза – пш еницей. Шт амм A. br as ile ns e Sp245 был любезно предо с т а в л е н Ж. Д о б е р е й н е р (EMBRAPA, Рио - де - Жанейро, Бразилия ) и п о д д е р ж и в а л с я в к о л л е к ц и и к у л ь т у р Инст ит у т а биохимии и физиологии р а с т е н и й и м и к р о о р г а н и з м о в РАН В данной р а б о т е и с с л е д о в а л а с ь Г С A.
b ras ile ns e Sp245 – в с и л у ц е н т р а л ь н о й р о л и эт ог о ф е р м е н т а в р е г у л я ц и и а з о т н о г о м е т а б о л и з м а. Дру г ой б е л о к, л е к т и н пш еницы, и з у ча л с я к а к п о т енциал ь ны й эк с т р а к л е т о чн ы й с и г н а л для A. br as ile ns e S p 2 4 5.
У с л о в и я ку льтивирования A. br as ile ns e Sp245. Во в с е х эк с п е р и м е н т а х б а к т е р и и в ы р а щ и в а л и при 32 o C в периодической к у л ь т у р е на м а л а т н о й с и н т е т и че с к о й с р е д е ( МС ) с л е д у ющ е г о с о с т а в а ( г / л ) : K 2 HPO 4 – 3, 0 ;
KH 2 PO 4 – 2, 0 ;
N a C l – 0, 1 ;
M g S O 4. 7H 2 O – 0, 2 ;
C a C l 2 – 0,02;
FeSO 4. 7H 2 O – 0,02;
MnSO 4. 7H 2 O – 0,1;
Na 2 MoO 4. 2H 2 O – 0, 0 0 2 ;
я б лочная к и с л о т а – 5, 0 ;
д р о ж ж е в о й э кс т ра кт – 0, 1 ;
p H 6, 8 6. В эк с п е р и м е н т а х по о ц е н к е с о д е р ж а н и я ИУК в к у л ь т у р а л ь н о й ж и д к о с т и а з о с п и р и л л ы с р е д а б ы л а дополнена L - т р и п т о ф а н о м ( 0, 2 г / л ). Во в с е х с л у ча я х, к о г д а A. brasi l ense Sp245 в ы р а щ и в а л и аэробно ( с использованием к а ч а л к и, в к о л б а х Э р л е н м е й е р а, под в а т н о - м а р л е в ы м и п р о б к а м и ) с р е д а с о д е р ж а л а NH 4 C l, 0, 5 или 3 г / л в з а в и с и м о с т и от ц е л е й эк с п е р и м е н т а. При р о с т е к у л ь т у р в у с л ов ия х а з о т ф и к с а ц и и б а к т е р и и в ы р а щ и в а л и на с р е д е МС либо ( i ) в г е р м е т и ч н о у к у поре нны х ф л а к о н а х, к о т о р ы е проду в ал и г а з о в о й с м е с ью, с о д е р ж а щ е й 9 9 % N 2 и 1 % О 2, и з а т е м инку биров ал и с использованием к а ч а л к и, либо ( i i ) в к о л б а х Э р л е н м е й е р а б е з дополнительной аэрации.
В ы дел ение и о ч и с т к а АЗП. Л е к т и н в ы д е л я л и из к о м м е р ч е с к о г о пре п а р а т а з а р о д ы ш е й пш еницы по м е т о д у С е м е н о в а и К а р а г о д о в о й ( 1 9 8 9 ).
П р е п а р а т АЗП был э л е к т р о ф о р е т и ч е с к и г о м о г е н н ы м. В ряде эк с п е р и м е н т о в и с п о л ь з о в а л и к о м м е р ч е с к и е п р е п а р а т ы АЗП фирм Л е к т и н о т е с т ( Украина ) и Sigma ( США), к о т о р ы е д а л и т а к и е ж е р е з у л ьт а т ы, к а к и АЗП, полу ченный н а м и из к о м м е р ч е с к и х з а р о д ы ш е й пш еницы.
Вы дел ение и о ч и с т к а Г С A. br as ile ns e. З а м о р о ж е н н у ю б и о м а с с у про д а в л и в а л и че ре з фильеры Ф р е нч- п р е с с а, полу ченный г о м о г е н а т с у с п е н д и р о в а л и в Т р иc - H C l бу фере. С у п е р н а т а н т п о с л е центрифу гирования п о д в е р г а л и о б р а б о т к е ДНКазой I ( 0, 2 5 м г / м л, 3 0 мин) и с т р е п т о м и ц и н с у л ьф а т о м ( 2 м г / м л, 3 0 мин). О с а д о к о т д е л я л и ц е н т р и ф у г и р о в а н и е м, а с у п е р н а т а н т ( с о д е р ж а щ и й Г С э кс т ра кт ) и с п о л ь з о в а л и в эк с п е р и м е н т а х по о предел ению т е р м о с т а б и л ь н о с т и Г С или п о д в е р г а л и д а л ь н е й ш е й о ч и с т к е.
Очист к а в к л ю ч а л а с л е д у ющ и е с т а д и и : о б р а б о т к у с у л ьф а т о м аммония до 5 0 % насы щ е ния, т е р м о о б р а б о т к у ( 5 0 o С, 3 0 мин), о б р а б о т к у с у л ьф а т о м аммония до 8 0 % насы щ е ния, о б е с с о л и в а н и е п р е п а р а т а Г С с использова нием к о л о н к и РД- 1 0, анионообменну ю х р о м а т о г р а ф и ю на к о л о н к е ДЭАЭ T o y o p e a r l 6 5 0 M (к о л о н к у у ра в н о в е ш и в а л и T рис -H C l бу фером, рН 7, 0 ;
б а л л а с т н ы е б е л к и э л ю и р о в а л и исходным бу фером, с о д е р ж а щ и м 0, 2 М N a C l, Г С – бу фером, с о д е р ж а щ и м 0, 3 5 М N a C l ). З а к л ю ч и т е л ь н ы м эт а пом о ч и с т к и б ы л а FPL C х р о м а т о г р а ф и я ( и с п о л ь з о в а л и анионообменну ю к о л о н к у Mono Q, у ра в н о в е ш е н н у ю T рис -H C l бу фером ;
б е л к и э л ю и р о в а л и в г р а д и е н т е N a C l от 0 до 1 М). Ра з р а б о т а н н ы й н а м и м е т о д о ч и с т к и позволял п о л у ч и т ь э л е к т р о ф о р е т и ч е с к и г о м о г е н н ы й п р е п а р а т Г С.
Ф е р м е нт и м е л с р е д н ю ю с т е п е н ь аденилирования ( n = 6, 4 ).
Определение а к т и в н о с т и Г С A. br as ile ns e. И с п о л ь з о в а л и гидрок с а м а т н ы й и т р а н с ф е р а з н ы й м е т о д ы для к о н т р о л я за а к т и в н о с т ью Г С A.
b r a s i l e n s e в ходе о ч и с т к и ф е р м е н т а ;
т р а н с ф е р а з н ы й м е т о д для о ц е н к и т е р м о с т а б и л ь н о с т и Г С и б и о с и н т е т и ч е с к и й м е т о д при изу чении к и н е т и ч е с к о г о поведения э л е к т р о ф о р е т и ч е с к и г о м о г е н н о й Г С. Во в с е х эк с п е р и м е н т а х по влиянию л е к т и н а пш еницы на а к т и в н о с т ь Г С азоспириллы использоавали трансферазный метод. В биосинтетическом м е т о д е а к т и в н о с т ь Г С о ц е н и в а л и по к о л и че с т в у н е о р г а н и ч е с к о г о ф о с ф а т а, о б р а з у ю щ е г о с я при гидролизе А Т Ф в р е а к ц и и с и н т е з а г л у т а м и н а. И с п о л ь з о в а л и модификацию м е т о д а, предложенну ю А. В.
Пу ш к иным и с о а в т. ( 1 9 7 2 ). В с л у ча е т р а н с ф е р а з н о г о м е т о д а и с п о л ь з о в а л и м е т о д и к у Шапиро и Стэдмана ( S h a p i r o & S t a d t m a n, 1 9 7 0 ) с небольш ими модификациями. Реакционная смесь для транферазной реакции с о д е р ж а л а : А Т Ф, н а т р и е в у ю с о л ь – 0, 2 м М;
а р с е н а т н а т р и я – 20 м М;
L г л у т а м и н – 70 м М;
M n C l 2 – 0, 4 м М;
N H 2 OH – 5 м М;
T рис - HCl бу фер – м М. Ак т и в н о с т ь Г С в ы р а ж а л и в м и к р о м о л я х - г л ю т а м и л г и д р о к с а м о в о й к и с л о т ы ( - Г Г К ), о б р а з о в а в ш е й с я за 15 мин инку бации. В с л у ча е г и д р о к с а м а т н о г о м е т о д а а к т и в н о с т ь Г С т а к ж е о ц е н и в а л и по к о л и че с т в у Г Г К, о б р а з о в а в ш е й с я в б и о с и н т е т и ч е с к о й р е а к ц и и Г С при з а м е н е в реакционной с м е с и аммония на г и д р о к с и л а м и н.
В эк с п е р и м е н т а х по влиянию л е к т и н а пш еницы на а к т и в н о с т ь Г С A.
b r as ile ns e б ы л и использованы не э кс т ра кт ы, а п е р м е а б и л и з о в а н н ы е клетки азоспириллы. Клетки осаждали центрифугированием и ресус п ендиров ал и в 0, 9 % N a C l т а к и м образом, чт обы п л о т н о с т ь с у с п е н з и и бы л а р а в н а 4. 10 9 к л / м л. З а т е м к с у с п е н з и и д о б а в л я л и АЗП из р а с с че т а 0, м к г л е к т и н а на к а ж д ы е 8 м л н б а к т е р и а л ь н ы х к л е т о к. Контрольные б е л к и, бычий сывороточный альбумин (БСА) и конканавалин А (Кон А), добав ляли в тех же концентрациях, что и АЗП. Через 10 минут к 0,25 мл термостатируемой при 370 С суспензии добавляли 0,025 мл смеси толуол + этанол (1:4) для того, чтобы сделать клетки проницаемыми для компонентов реакционной смеси. Все дальнейшие этапы измерения активности ГС трансферазным методом были такими же, как и в случае использования экстрактов.
Степень аденилиривания ГС оценивали по методу, описанному Шапиро и Стэдманом (Shapiro and Stadtman, 1970). Трансферазную активность фермента измеряли в присутствии и отсутствии 75 мМ MgCl2 как описано выше;
степень аденилирования рассчитывали по предложенной авторами формуле.
Для измерения активности нитрогеназы A. brasilense использовали метод ацетиленредукции. Анализ содержания этилена в газовой фазе проводили на газовом хроматографе (Chrom 5, Чехословакия).
Измерение концентрации аммония осуществляли непосредственно в культуральной жидкости A. brasilense Sp245, используя для этой цели ион-селективный электрод OP-NH3-7113 в комплекте с цифровым pH метром ОР-21 (Radelkis, Венгрия).
Концентрацию белка определяли по Брэдфорд (Bradford, 1976).
Получение грубых экстрактов АЗП-активированных и контрольных клеток. Культуру A. brasilense наращивали на среде МС в герметично закрытых флаконах, делили на 2 равные по объему и количеству клеток части, в одну из которых добавляли раствор АЗП (до конечной концен трации 0,5 мкг/мл). После часовой инкубации обе культуры тщательно отмывали, клетки ресуспендировали в 10 мМ Трис-HCl буфере и под вергали обработке ультразвуком на дезинтеграторе UD-20 (Польша).
Полученные экстракты осветляли центрифугированием и анализировали в иммуноэлектрофорезе и в электрофорезе в полиакриламидном геле (ПААГ) в присутствии додецилсульфата натрия (SDS).
SDS-ПААГ электрофорез. Разделение белков проводили с использо ванием стандартного прибора с пластинами 17 х 14 см по методу Лэмм ли (Laemmli, 1970) в градиенте акриламида от 6 до 25%. Все растворы (электродный буфер и буфер для образцов, а также растворы, исполь зуемые для полимеризации гелей) содержали SDS. Препараты перед на несением на гель тщательно диализовали, смешивали с буфером для об разцов и кипятили 5 мин.
Денситометрия белковых профилей осуществляли с использованием спектрофотометра Specord M 40 (Германия), оборудованного специаль ной приставкой для сканирования гелей.
Двойную радиальную иммунодиффузию проводили по методу Ухтер лони и Нильсона (Ouchterlony and Nilson, 1978).
Ракетный иммуноэлектрофорез проводили по методике, изложенной в Руководстве по количественному иммуноэлектрофорезу (Вееке, 1977).
Для оценки параметров роста культуры A. brasilense Sp245 находя щейся в экспоненциальной фазе, использовали спектротурбидиметри ческий метод (Щеголев и Хлебцов, 1984). Для оценки ростовых процес сов использовали также взвешивание биомассы бактерий, высушенной по постоянного веса при 1050С, и подсчет числа жизнеспособных клеток (колониеобразующих единиц, КОЕ), который проводили по общеприня той методике.
При световой микроскопии просмотр препаратов проводили на фазо воконтрастном микроскопе Jenaval (Германия) при увеличении изобра жения в 400 раз.
Получение фосфолипидных экстрактов. На первом этапе работы ис пользовали 4 различных методики экстракции фосфолипидов: Блайя и Дайера (Bligh and Dyer, 1959), Филлипса и Прайвитта (Phillips and Pri vett, 1979), Артура и Шелтави (Arthur and Sheltawy, 1980) и Фолча с со авт. (Folch et al., 1957). В дальнейшем использовали только метод, предложенный Филлипсом и Прайвиттом, так как он давал наилучший выход фосфолипидов A. brasilense Sp245 по их сумме и набору индиви дуальных компонентов. Экстракты выпаривали, перерастворяли в хло роформе и хранили в плотно закрытых флаконах при –200С.
Одномерная тонкослойная хроматография (ТСХ) фосфолипидных экс трактов. Для ТСХ использовали пластины силикагеля Silufol UV- (Merсk, ФРГ). Хроматографию проводили в стеклянных прямоугольных камерах в системе растворителей: хлороформ - метанол - 7N аммиак вода в соотношении 60:37,5:0,62:3,38, v/v.
Двумерную ТСХ фосфолипидных экстрактов использовали для выяв ления минорных фосфолипидов. Разделение в 1-м направлении проводи ли в системе растворителей: хлороформ – метанол – 7N аммиак в соот ношении 130:60:8. Для 2-го направления использовали хлороформ, ме танол, уксусную кислоту и воду, в объемных пропорциях – 170:25:25:6.
Качественное и количественное определение фосфолипидов. Для ви зуализации пятен, соответствующих фосфолипидам, была использована комбинация двух методик: окрашивание парами йода (выявление липи дов) и окрашивание реактивом Васьковского-Костецкого (выявление фосфосодержащих липидов). Принадлежность к тому или иному классу фосфолипидов определяли, сравнивая длину пробега (Rf) фосфолипидов исследуемых экстрактов с Rf фосфолипидов-стандартов. Для количест венной оценки содержания отдельных фосфолипидов использовали ме тод Ван-Вельдховена и Маннартса (Van Veldhoven and Mannaerts, 1987).
Определение содержания ИУК в культуральной жидкости азоспирил лы. ИУК экстрагировали этилацетатом из подкисленной (до рН 3) куль туральной жидкости A. brasilense Sp245, экстракты упаривали досуха на роторном испарителе (Unipon, Польша), растворяли в этаноле и под вергали ТСХ на пластинах с силикагелем Silufol UV-254 в системе растворителей хлороформ – этанол (16:1, v/v). В качестве маркера ис пользовали синтетическую ИУК (Fluca). Пятна, соответствующие по подвижности ИУК, элюировали и анализировали на содержание ИУК с использованием реактива Сальковского.
Инструментальные методы. Для изучения кристаллов, обнаруженных в среде культивирования азоспириллы, использовали рентгенофазовый, термогравиметрический и дифференциальный термический анализы, ионную хроматографию, ИК-спектроскопию, атомно-эмиссионную и атомно-абсорбционную спектрометрию (АЭС, ААС). Содержание металлов в клетках А. brasilense Sp245 определяли с помощью АЭС и ААС. Для оценки содержания кальция в клетках А. brasilense Sp использовали ААС. Рентгенофазовый анализ проводили с использованием дифрактометра ДРОН-3.0 (Россия);
для термогравиметрического и дифференциального термического анализов использовали дериватограф OD-103 фирмы МОМ (Венгрия). ИК-спектры кристаллов снимали на ИК спектрофотометре Specord IR 75 (Германия). Ионная хроматография проводилась для определения содержания в кристаллах фосфора (в форме PO 4 3 - ), хлора (в форме Cl - ) и серы (в форме SO 4 2 - );
содержание азота в кристаллах определяли по Кьельдалю. Для ААС и АЭС был использован спектрометр Perkin-Elmer 3110 с автосэмплером Perkin-Elmer АS-60 (США).
Результаты и обсуждение 1. Регуляция активности и cвойства ГС А. brasilense Термостабильность ГС и рН-оптимумы. Для оценки термо устойчивости ГС А. brasilense препарат фермента подвергали действию высоких температур при 4-х режимах (50 o C и 60 o C, 30 мин и 60 мин), после чего оценивали активность фермента. Эксперименты показали, что ГС А.
brasilense достаточно термостабильна: при 30-минутной инкубации при 50 o C сохранялось 76% исходной активности фермента. Инкубация при 60 o C в течение часа также не приводила к полной элиминации активности ГС.
Полу ченные результаты позволили ввести термообработку ГС-содержащего экстракта (50 о С, 30 мин) в схему очистки фермента. ГС А. brasilense, очищенная по разработанной нами схеме (изложено в разделе “Материалы и методы исследований“) имела среднюю степень аденилирования (n=6,4).
Известно, что pH-оптиму м у аденилиру емых бактериальных ГС зависит от катиона, активиру ющего фермент. Мы предприняли исследование зависимости активности ГС A. brasilense от pH в прису тствии Mn 2 + и Mg 2 +.
Обе зависимости имели характерну ю колоколообразную форму с оптиму мом 6,25 при активации ГС Mn 2 + и 8,0 при активации Mg 2 +.
Кинетическое поведение ГС при активации магнием. Было предпринято изучение кинетического поведения ГС А. brasilense в биосинтетической реакции в прису тствии Mg 2 +, взятого в качестве активиру ющего катиона. Анализ зависимости активности ГС от концен трации аммония (рис. 1а) показывает, что фермент не подчиняется кинетике Михаэлиса-Ментен. Использование концентраций аммония выше 10 мМ приводило к ингибированию активности ГС. Представление полученной зависимости в координатах Лайну ивера-Берка давало кривую вогнутой формы, и не позволяло определить К m ( к а ж. ). Графическое представление той части экспериментальной кривой, где не наблюдается су бстратного ингибирования, по методу Корниш-Боу дена (Корниш-Боуден, 1983) показало, что К m ( к а ж. ) для аммония равна 0,2 мМ (рис. 1в). Это, в свою очередь, свидетельствует о достаточно высоком сродстве среднеаденилированной ГС к аммонию. Кинетика насыщения ГС A.
brasilense другим субстратом, L-глутаматом, оказалась сходной (рис. 1б). В случае глутамата наблюдалось более глу бокое субстратное ингибирование (34,6% по сравнению с 23,6% для аммония). Графическое определение К m ( к а ж. ) для глутамата методом Корниш-Боу дена дало значение 2,3 мМ (рис.
1г), т.е. сродство фермента к этому субстрату было ниже, чем к аммонию.
а б в г Рис. 1. Зависимость активности ГС A. brasilense от концентрации аммония (а) и L-глутамата (б) при активации фермента Mg2+ и соот ветствующие графики в координатах Корниш-Боудена (в,г). Реакцион ная смесь содержала 6 мМ MgCl2;
3 мМ ATФ;
20 мМ L-глутамат Na или 20 мМ NH4Cl при рН 8,0.
И з в е с т н о, чт о а к т и в н о с т ь г л у т а м и н с и н т е т а з з а в и с и т к а к от а б с о л ю т ных значений концентраций к а т и о н о в и AT Ф, т а к и от их соотнош е ния ( Е в с т и г н е е в а и с о а в т., 1 9 8 8 ). В эт ой с в я з и м ы и с с л е д о в а л и з а в и с и м о с т ь а к т и в н о с т и Г С A. b r a s i l e n s e от концентрации Mg 2 + при различных у ровнях AT Ф. Б ы л о у с т а нов л е но, чт о для проявления м а к с и м а л ь н о й а к т и в н о с т и ф е р м е н т а т р е бу е т с я с у щ е с т в е н н о е п р е в ы ш е н и е концентрации Mg 2 + н а д к о н ц е н т р а ц и е й AT Ф ( в п л о т ь до 8- к р а т н о г о п р е в ы ш е н и я н а б л ю д а л и н а р а с т а н и е а к т и в н о с т и Г С ). Б о л ь ш е е п р е в ы ш е н и е, в п л о т ь до 36 р а з, не в л и я л о на а к т и в н о с т ь ф е р м е н т а. З а в и с и м о с т ь а к т и в н о с т и Г С а з о с п и р и л л ы о т к о м п л е к с а Mg 2 + -AT Ф, с н я т а я при Mg 2 + :A T Ф = 1 6 : 1, о т л и ч а л а с ь от а н а л о г и ч н ы х з а в и с и м о с т е й для аммония и г л у т а м а т а. График двойных об р а т н ы х величин и м е л в ог ну т у ю форму, а и н т е р п р е т а ц и я данных в к о о р д и н а т а х Корниш - Боу дена д а в а л а ря д н е п е р е с е к а ю щ и х с я п р я м ы х ;
т. е. д а н ный м е т о д не позволял о п р е д е л и т ь К m ( к а ж. ).
Кинетическое поведение ГС при активации марганцем. Прове денные н а м и эк с п е р и м е н т ы п о к а з а л и, чт о к и н е т и к а Г С A. b r a s i l e n s e при а к т и в а ц и и е г о м а р г а н ц е м ( рис. 2 ) разит ел ь но о т л и ча е т с я от к и н е т и к и Мg 2 + - а к т и в и р у е м о й Г С ( рис. 1 ). В с л у ча е а к т и в а ц и и Г С Mn 2 + не на блю д а л и с у б с т р а т н о г о ингибирования ;
б о л е е т о г о – не у да в а л о с ь дост ичь н асы щ е ния ф е р м е н т а а м м о н и е м д а ж е при в ы с о к и х ( нефизиологических ) концент рациях эт ог о с у б с т р а т а ( рис. 2а ). Г р а ф и че с к о е п р е д с т а в л е н и е эк с п е р и м е н т а л ьн о й крив ой по м е т о д у Корниш - Боу дена ( рис. 2в ) п о к а з а л о, чт о К m ( к а ж. ) для аммония р а в н а 1, 5 м М. Э т о, в с в о ю о че р е д ь, свиде т е л ьс т в у е т о б о л е е низком с р о д с т в е Mn 2 + - а к т и в и р у е м о й Г С A. b r a s i l e n s e к аммонию по сравнению с ГС, активиру емой Mg 2 +. Кинетика насыщения ГС A. brasilense другим субстратом, L-глутаматом, оказалась сходной (рис.
2б). Попытка графического определения К m ( к а ж. ) для глу тамата методом Корниш-Боу дена дала ряд пересечений в области от 3 до 5 мМ (рис. 2г).
Хотя точной цифры К m ( к а ж. ) определить не удалось, можно отметить, что диапазон 3 - 5 мМ характеризу ет сродство Mn 2 + -активируемой ГС A.
brasilense к глутамату как несколько более низкое в сравнении с Mg 2 + активиру емой ГС (К m ( к а ж. ) = 2,3 мМ).
Было проведено исследование зависимости активности ГС A. brasilense от концентрации Mn 2 + при двух у ровнях ATФ: 4 мМ и 8 мМ. В обоих слу ча ях максимальная активность фермента наблюдалась при Mn 2 + :АТФ = 2:1, и при отклонении от этого соотношения активность ГС снижалась. Интересно отметить, что при содержании АТФ, равном 4 мМ, абсолютные значения активности фермента были выше примерно на 19% по сравнению с концен трацией 8 мМ. Зависимость активности ГС азоспириллы от комплекса Mn 2 + ATФ, снятая при Mn 2 + :ATФ = 2:1, отличалась а б в г Рис. 2. Зависимость активности ГС A. brasilense от концен трации аммония (а) и L-глутамата (б) при активации фермента Mn2+. Ниже приведены оответствующие графики в координатах Корниш-Боудена (в,г). Реакционная смесь содержала 6 мМ MnCl2;
3 мМ ATФ;
7,5 мМ NH4Cl или 10 мМ L-глутамат Na при рН 6, от аналогичных зависимостей для аммония и глутамата. Интерпретация данных в координатах Корниш-Боу дена дала значение К m ( к а ж. ) для АТФ, равное 0,5 мМ.
Для более полной характеристики среднеаденилированной Мn 2 + -акти виру емой ГС мы проведели многофакторный эксперимент. Были сняты кривые насыщения фермента субстратами. В четырех сериях эксперимента использовали 4 различных концентрации АТФ – 1, 2, 4 и 8 м М ( п р и Mn2+:ATФ = 2:1);
концентрации аммония и глутамата варьировали.
Математическую обработку данных многофакторного эксперимента проводили с использованием пакета прикладных программ SSP (Максимов, 1980). В итоге было выведено уравнение, характеризующее кинетическое поведение Mn2+-активируемой ГС A. brasilense, и построены трехмерные кинетические зависимости для каждой из 4-х концентраций АТФ (рис. 3). Зависимости имели сходный характер;
их анализ показывает, что с увеличением концентрации каждого из субстратов плавно нарастает скорость реакции. Не является исключением и AТФ: с переходом к более высоким значениям этого субстрата "купол" трехмерной пространственной модели становился выше при сохранении общего ее характера. Полученные графические изображения описываются следующим уравнением:
[Pi] = 4,47 х [ATP]0,147 х [NH4+]0,24 х [Glu]0, где [Pi] – концентрация неорганического фосфата;
[ATP], [NH4+], [Glu] – концентрации соответствующих субстратов.
Приведенное уравнение дает возможность рассчитать количество неорганического фосфата, продуцируемое Мn2+- активируемой ГС A.
i мкг P brasilense, при любых задан ных значениях концентраций каждого из субстратов.
Взаимодействие ГС азоспириллы с другими L-глутамат, к а т и о н а ми. П о м и м о M g 2 + и NH4Cl, мМ мМ 2+ Мn, 17 других катионов были проверены на Рис. 3. Пространственная модель кине способность поддерживать тического поведения глутаминсинтетазы биосинтетическую в присутствии Mn2+ как активирующего активность ГС A. brasilense.
катиона. Уровень АТФ – 1 мМ.
Большинство катионов поддерживали по сравнению с Mg2+ значительно более низкий (от 5 до 38%) уровень активности фермента (рис. 4). Два катиона, Cu2+ и Sn2+, не активировали ГС. Интересно в этой связи отметить, что предпринятое нами изучение накопления катионов клетками A.
brasilense Sp245 показало, что азоспирилла аккумулирует ионы меди (в концентрации 2,0 мг на грамм сухой биомассы при добавлении 0,2 мМ CuSO4 в среду культивирования). Было также показано, что присутствие солей меди в среде культивирования A. brasilense Sp245 приводит к увеличению накопления ряда эссенциальных металлов, в том числе Mg и Мn (в 5,2 и 2,7 раза соответственно). Как биологический смысл, так и молекулярные основы этих интересных фактов остаются пока неясными.
Обращает на себя внимание Со2+: он давал самый высокий среди аль тернативных катионов уровень активности ГС, но был менее Рис 4. Активность глутаминсинтетазы Azospirillum brasilense S p 2 4 5 в пр и сутствии р азличных катионов. Реакцио нная смесь содержала 4 мМ АТФ, 1 мМ Mg Cl 2 или д р уг о й соли, 1 0 мМ NH 4 C l, 2 0 мМ L-глутамат;
р Н 8,0.
эффективен, чем Mg 2 + (рис. 4). При добавлении же Со 2 + к ферменту, активиру емому Mg 2 +, активность ГС A. brasilense у величивалась более, чем в 3 раза. Этот факт хорошо согласуется с литерату рными данными для других ГС (Ip et al., 1983;
Данг Хоанг Фыок Хьен, 1988, Нatanaka et al., 1987). Знание особенностей строения и функционирования активного центра ГС S. typhimuruim (Eisenberg et al., 2000), позволяет сформу лировать некоторые предположения относительно механизма стиму ляции активности Mg 2 + -активиру емой ГС ионами Со 2 +. Известно, что ГС сальмонеллы имеет два сайта связывания катионов в активном центре, n1 и n2. Наличие двух сайтов связывания катионов в активном центре показано недавно нами и для ГС A. brasilense (методом Мёссбауэровской спектроскопии, Kamnev et al., 2002). В случае, когда в реакционной среде прису тству ют два различных вида катионов (Ме и Ме'), теоретически возможно образование четырех типов функционально активных комплексов катион-фермент;
это: Ме' 2 ГС, Ме 2 ГС, Ме'МеГС и МеМе'ГС. Первые два типа комплексов, в соответствии с принятой в настоящеее время терминологией, можно назвать гомобиядерными;
вторые два – гетеробиядерными. В рассматриваемом нами случае (стимуляция активности Mg 2 + -активиру емой ГС ионами кобальта), по-видимому, имеет место (Mg 2 + ) 2 ГС (Со 2 + ) 2 ГС образование следу ющих комплексов: и (гомобиядерные), а также Mg 2 + Со 2 + ГС и Со 2 + Mg 2 + ГС (гетеробиядерные). Из данных, приведенных на рис. 4, видно, что в рассматриваемом слу чае гомобиядерный комплекс (Mg 2 + ) 2 ГС более каталитически активен, чем (Со 2 + ) 2 ГС. Это позволяет предположить, что по крайней мере один сайт связывания катионов в активном центре ГС A. brasilense имеет большее сродство к Mg 2 +, чем к Со 2 +. Очевидно также, что в этих условиях гетеробиядерный комплекс Mg 2 + Со 2 + ГС или Со 2 + Mg 2 + ГС (возможно и оба) более эффективны для проявления каталитической активности ГС A.
brasilense по сравнению с гомобиядерными.
Изложенные выше данные свидетельствуют о том, ГС A. brasilense, наряду с чертами, общими для других бактериальных аденилируемых ГС, имеет ряд особенностей. К числу наиболее ярких из них следует отнести, по-видимому, изменение каталитического поведения ГС при изменении активиру ющего катиона. Так, при смене активиру ющего катиона (с магния на марганец, и наоборот) менялись все тестированные в данной работе каталитические свойства – рН-оптиму м, максимальный уровень ак т и в н о с т и, с р о д с т в о к с у б с т р а т а м, х а р а к т е р к р и в ы х насыщ е ния, а т а к ж е соотнош е ние к а т и о н - А Т Ф, оптимальное для проявления к а т а л и т и че с к о й а к т и в н о с т и. Особое внимание о б р а щ а е т на с е б я т о т ф а к т, чт о при с м е н е а к т и в и р у ю щ е г о к а т и о н а и з м е н я е т с я с р о д с т в о Г С по к р а й н е й м е р е к дву м с у б с т р а т а м, аммонию и г л у т а м а т у. Б о л е е в ы с о к о е с р о д с т в о б ы л о у Г С A.
b ras ile ns e, а к т и в и р у е м о й м а г н и е м ( К m ( к а ж. ) для аммония и г л у т а м а т а р а в н ы с о о т в е т с т в е н н о 0, 2 и 2, 3 м М). При а к т и в а ц и и ф е р м е н т а м а р г а н ц е м с р о д с т в о к аммонию п а д а л о в 7, 5 р а з, а с р о д с т в о к г л у т а м а т у – примерно д в у к р а т но ( К m ( к а ж. ) в о з р а с т а л и до 1, 5 и 3 - 5 м М с о о т в е т с т в е н н о ). В а ж н о о т м е т и т ь, чт о в с л у ча е п о л н о с т ь ю неаденил иров анной Г С A. b r a s i l e n s e Sp245 при с м е н е а к т и в и р у ю щ е г о к а т и о н а т а к ж е м е н я л с я х а р а к т е р к р и в ы х н асы щ е ния ф е р м е н т а с у б с т р а т а м и ( A n t o n y u k e t a l., 2 0 0 1 ).
Полу ченные н а м и данные по Г С A. b r a s i l e n s e, в з я т ы е в с о в о к у п н о с т и, с в и д е т е л ьс т в у ют о в а ж н о й р о л и к а т и о н о в в фу нкционировании эт ог о ф е р м е н т а а з о т н о г о обмена. И н т е р е с н о, чт о по ряду с в о и х с в о й с т в ( т е р м о с т а б и л ьно с т и, о п т и м у м а м рН с Mg 2 + и Mn 2 + ) с р е д н е а д е н и л и р о в а н н а я Г С A. br as ile ns e близка к а д е н и л и р у е м ы м б а к т е р и а л ь н ы м Г С ( Me i st e r e t a l., 1 9 8 0 ;
E i s e n b e r g e t a l., 2 0 0 0 ) ;
в т о в р е м я к а к по ряду дру г их с в о й с т в ( р е з к о е изменение к и н е т и ч е с к о г о поведения при с м е н е а к т и в и р у ю щ е г о к а т и о н а, с п о с о б н о с т ь п р о я в л я т ь а к т и в н о с т ь c разнообразными к а т и о н а м и ) ф е р м е н т близок к н е а д е н и л и р у е м ы м Г С ц и а н о б а к т е р и й ( Данг Хоанг Ф ы о к Х ь е н, 1 9 8 8 ) и г р а м п о л о ж и т е л ь н ы х б а к т е р и й ( D e u e l a n d S t a d t m a n, 1 9 7 0 ;
Hatanaka et al., 1987).
2. Пу ти ассимиляции аммония у А. brasilense Б о л ь ш о й и н т е р е с п р е д с т а в л я е т вопрос о пу тях а с с и м и л я ц и и аммония у А. br as ile ns e. В н а с т о я щ е е в р е м я доминиру е т т о чк а зрения, чт о в л и м и т и ру ющих у с л ов ия х по а з о т у аммоний у б а к т е р и й а с с и м и л и р у е т с я че ре з г л у т а м и н с и н т е т а з у – г л у т а м а т с и н т а з у ( G l t S ), а при избытке аммония в с р е д е – че ре з ГДГ. Две р а н е е опу бл иков анны е р а б о т ы (Westby e t a l., 1 9 8 7 ;
Z a n e t t i e t a l., 1 9 8 8 ) позв ол я л и п р е д п о л о ж и т ь, чт о A. b r a s i l e n s e, возможно, я в л я е т с я и с к л ю ч е н и е м из эт ог о п р а в и л а. Полу ченные н а м и р е з у л ьт а т ы в с о в о к у п н о с т и с л и т е р а т у р н ы м и данными по ф е р м е н т а м а з о т н о г о обмена у A. b r a s i l e n s e ( Z a n e t t i e t a l., 1 9 8 8 ;
R a t t i e t a l., 1985;
Pu rushothaman et al., 1981;
Pirola et al., 1992;
Maulik and Ghosh, 1986), а т а к ж е ингибиторному а н а л и з у (Westby e t a l., 1 9 8 7 ) даю т у бе д и т е л ьны е д о к а з а т е л ь с т в а т о г о, чт о у данной б а к т е р и и Г С -GltS п у т ь а с с и м и л я ц и и аммония фу нкциониру е т не т о л ьк о при н е д о с т а т к е аммония в с р е д е, но и при е г о избы т ке.
И з в е с т н о, чт о р е ш а ю щ и м а р г у м е н т о м в пользу т о й или иной т о чк и зрения о биохимических пу тях с л у ж и т а н а л и з с р о д с т в а ф е р м е н т о в к их с у б с т р а т а м. К н а с т о я щ е м у в р е м е н и и з в е с т н ы к о н с т а н т ы Мих а е л и с а Ме нт е н для в с е х ф е р м е н т о в а с с и м и л я ц и и аммония, чт о д а е т в о з м о ж н о с т ь с р а в н и т ь их с р о д с т в о. В а ж н о о т м е т и т ь, чт о в с л у ча е A. b r a s i l e n s e для у с л ов ий избы т ка аммония в с р е д е ( 4 0 м М NH 4 + и в ы ш е ) необходимо р а с с м а т р и в а т ь с р о д с т в о к с у б с т р а т а м аденил иров анной Г С. Д е л о в т о м, чт о у а д е н и л и р у е м ы х б а к т е р и а л ь н ы х Г С, в у с л ов ия х изб ытка аммония Г С а д е н и л и р у е т с я, и е е с в о й с т в а и з м е н я ю т с я. В эт ой с в я з и, р а с с м а т р и в а я п у т и а с с и м и л я ц и и аммония у а з о с п и р и л л ы в у с л ов иях из бытка а з о т а в среде, целесообразно сравнивать сродство к субстратам ГДГ, GltS и аденилированной ГС.
Таблица 1. Константы Михаэлиса-Ментен для ферментов ассимиляции аммония Azospirillum brasilense Субстраты Km или Km(каж.) NH4+ 2-оксо- L-глутамат НАДФН, Ссылка глутарат НАДН или НАДФ Ферменты ГС – 0,2 мМ 2,3 мМ – данная работа GltS 0,029 мМ – – 6,25 мкМ Ratti et.al., Maulik & ГДГ* 0,25 мМ 0,38 мМ 10 мМ 13 мМ Ghosh, 5 мМ 100 мМ 500 мкМ 66 мМ 40 мкМ *Приведены значения для прямой и обратной реакции с разными кофакторами Сравнение К m ( к а ж. ) для 2- о к с о г л у т а р а т а ( 2 - ОГ ) п о к а з ы в а е т, чт о у GltS с р о д с т в о к данному с у б с т р а т у з н а чи т е л ьно в ы ш е, че м у ГДГ ( т а бл. 1 ).
Т а к, К m ( к а ж. ) для GltS р а в н а 0, 0 2 9 м М, в т о в р е м я к а к в с л у ча е ГДГ она в ы ш е почти на порядок ( 0, 2 5 м М, в НАДФ Н- з а в и с и м о й р е а к ц и и ). Е щ е б о л е е низкое с р о д с т в о к 2- ОГ у ГДГ в НАДН- з а в и с и м о й р е а к ц и и : К m ( к а ж. ) - 5 м М, т о е с т ь примерно в 172 раза в ы ш е, че м у G l t S. Сравнение а н а л о г и чн ы х п о к а з а т е л е й для дру г ог о с у б с т р а т а, NH 4 + ( т а бл. 1 ), показы в а е т, чт о в с л у ча е ГДГ в с е т р и приведенные в л и т е р а т у р е К m ( к а ж. ) в ы ш е ( 0, 3 8 ;
6 6 и 100 м М), че м у аденил иров анной Г С ( 0, 2 м М). Э т о о з н а ча е т, чт о Г С A. b r a s i l e n s e в у с л ов иях избы т ка а з о т а в с р е д е и м е е т больш е е с р о д с т в о к аммонию, че м ГДГ. П ров еденны е н а м и эк с п е р и м е н т ы показа л и, чт о Mg 2 + - а к т и в и р у е м а я с р е д н е а д е н и л и р о в а н н а я Г С а з о с п и р и л л ы и м е е т больш е е, че м ГДГ, с р о д с т в о не т о л ьк о к аммонию, но и к г л у т а м а т у ( значения к о н с т а н т – 2, 3 и 10 м М с о о т в е т с т в е н н о, ( т а бл. 1 ). И н а к о н е ц, м ы с р а в н и л и с р о д с т в о GltS и ГДГ к к о ф а к т о р у и в ы я с н и л и, чт о GltS и м е е т больш е е с р о д с т в о к НАДФ Н ( К m ( к а ж. ) р а в н а 6, 2 5 м к М), че м ГДГ к НАДФ Н и НАДН в р е а к ц и и аминирования ( к о н с т а т н ы р а в н ы 13 и 500 м к М соответственно).
Т а к и м образом, ф е р м е н т ы Г С -GltS п у т и у A. b r a s i l e n s e и м е ю т больш е е, че м ГДГ с р о д с т в о к о в с е м с у б с т р а т а м и к о ф а к т о р у ( 2 - ОГ, аммоний, г л у т а м а т и НАДФ Н), в о в л е ч е н н ы м в а с с и м и л я ц и ю аммония. Е щ е один а р г у м е н т в пользу е д и н с т в е н н о с т и п у т и а с с и м и л я ц и и аммония у A.
b r as ile ns e в ы т е к а е т из а н а л и з а рН- з а в и с и м о с т е й ф е р м е н т о в а с с и м и л я ц и и аммония. И з в е с т н о, чт о A. b r a s i l e n s e и м е е т в н у т р и к л е т о ч н ы й рН 7, 1 ( Z h u lin et al., 1996). Среднеаденилированная ГС, присутствующая в клетке при избы т ке аммония в с р е д е, а к т и в н а при рН 7, 1 с о в с е м и эс с е н ц и а л ьны м и к а т и о н а м и (Mg 2 +, Mn 2 + и Со 2 + ). Т а к, п о д д е р ж и в а е м а я м а г н и е м а к т и в н о с т ь Г С с о с т а в л я е т при данном значении рН примерно 7 5 % от м а к с и м а л ь н о й. GltS, т а к ж е к а к и Г С, при н е й т р а л ь н ы х з н а че н и я х рН в ы с о к о а к т и в н а ( R a t t i e t a l., 1 9 8 5 ). С о в с е м иное д е л о – ГДГ. У A. b r a s i l e n s e эт от ф е р м е н т а к т и в е н т о л ьк о в щ е л о чны х у с л ов иях ( M a u l i k a n d G h o s h, 1 9 8 6 ). Т а к и м образом, с р а в н и т е л ьны й а н а л и з к а т а л и т и че с к и х с в о й с т в с р е д н е а д е н и л и р о в а н н о й Г С, ГДГ и G l t S, у бе д и т е л ьно с в и д е т е л ьс т в у е т о с у щ е с т в о в а н и и у A. b r a s i l e n s e л и ш ь о д н о г о п у т и а с с и м и л я ц и и аммония, че ре з Г С - G l t S, и фу нкционировании эт ог о п у т и к а к при из бытке, т а к и при н е д о с т а т к е аммония в с р е д е.
Арг у мент ы, п о д д е р ж и в а ю щ ие п р е д с т а в л е н и е о с у щ е с т в о в а н и и л и ш ь о д н о г о п у т и а с с и м и л я ц и и аммония с в о д я т с я к с л е д у ющ е м у :
– ф е р м е н т ы Г С -GltS п у т и у A. b r a s i l e n s e и м е ю т больш е е, че м ГДГ, с р о д с т в о к о в с е м с у б с т р а т а м ( 2 - ОГ, аммоний и г л у т а м а т ) и к о ф а к т о р у ( НАДФ Н), в о в л е ч е н н ы м в а с с и м и л я ц и ю аммония.
– и а д е н и л и р о в а н н а я Г С, и GltS прояв л яют в ы с о к у ю а к т и в н о с т ь при значении рН, р а в н о м в н у т р и к л е т о ч н о м у ( рН 7, 1 ), в т о в р е м я к а к ГДГ при р Н 7, 1 либо н е а к т и в н а, либо п р о я в л я е т с л е д о в у ю а к т и в н о с т ь.
– ингибиторный а н а л и з с использованием ингибиторов Г С и GltS по к а з а л, чт о к а к при н е д о с т а т к е, т а к и при избы т ке аммония в с р е д е инги бирование включения м е ч е н о г о а з о т а в а м и н о к и с л о т ы о с т а е т с я одина ково в ы с о к и м ( 8 4 – 9 0 % при использовании метионинсу л ьфоксимина, ингибитора Г С ( W e s t b y e t al., 1 9 8 7 ) ).
– для б а к т е р и й, и м е ю щ их два п у т и а с с и м и л я ц и и аммония ( K l e b si e l a p n e u m o n i a e, E n t e r o b a c t e r a e r o g e n e s, P s e u d o m o n a s f l u o r e s c e n s), п р е в ы ш е ние у де л ьной а к т и в н о с т и ГДГ н а д а к т и в н о с т ью GltS при из бытке аммония в с р е д е р о с т а – б о л е е че м 25- к р а т н о е по с р а в н е н и ю с эт им ж е пока з а т е л е м для у с л ов ий ограничения по а з о т у ( Me e r s e t al., 1 9 7 0 ;
N a g a t a n i e t a l., 1 9 7 1 ;
W e s t b y e t a l, 1 9 8 7 ). У A. b r a s i l e n s e а н а л о г и чн о е п р е в ы ш е н и е я в л я е т с я л и ш ь 4 -к р а т н ы м ( Z a n e t t i e t a l., 1 9 8 8 ;
W e s t b y e t a l., 1 9 8 7 ).
Чт о к а с а е т с я ГДГ а з о с п и р и л л ы, т о в л и т е р а т у р е с л о ж и л о с ь п р е д с т а в ление о т о м, чт о ф и з и о л о г и че с к а я р о л ь эт ог о ф е р м е н т а у A. brasi l ense – к а т а б о л и че с к а я (Westby e t a l., 1 9 8 7 ;
P u r u s h o t h a m a n e t a l., 1 9 8 1 ). В а ж н о о т м е т и т ь, чт о д о к а з а т е л ь с т в а фу нкционирования л и ш ь о д н о г о, Г С - G l t S, п у т и а с с и м и л я ц и и аммония полу чены и для дру г их б а к т е р и й ( O s b u r n e a n d S i g n e r, 1980;
A li e t a l., 1981;
D o n a l d & L u d w i g, 1 9 8 4 ;
B r a v o & M o r a, 1 9 8 8 ).
3. Регу ляция азотного метаболизма А. brasilense лектином пше ницы Л и т е р а т у р н ы е данные позволили н а м п р е д п о л о ж и т ь, чт о л е к т и н пш еницы м о ж е т с л у ж и т ь эк с т р а к л е т о чн ы м с и г н а л о м для эндофит а А.
b r as ile ns e Sp245 и в ы з ы в а т ь изменения е г о а з о т н о г о м е т а б о л и з м а, прежде в с е г о – а к т и в н о с т и н и т р о г е н а з ы и Г С. И з в е с т н о, чт о А. b r a s i l e n s e Sp245 в е с т е с т в е н н ы х у с л ов иях о б р а з у е т д о с т а т о чн о м о щ н у ю в н у т р и к о р н е в у ю попу ляцию (~5. 10 5 к л. / г р. корня, S c h l o t e r a n d H a r t m a n n, 1 9 9 8 ) и значи т е л ьн о о б о г а щ а е т колонизиру е мые р а с т е н и я пш еницы с в я з а н н ы м а з о т о м ( D o b e r e i n e r a n d P e d r o s a, 1 9 8 7 ). В эт ой с в я з и возникло предположение, чт о эндофит А. br as ile ns e Sp245 а н а л о г и чн о ризобиям способен э к с п о р т и р о в а т ь проду к т а з о т ф и к с а ц и и аммоний за п р е д е л ы б а к т е р и а л ь ной клетки, и этот процесс может стимулироваться АЗП. Задачей изло женных ниже экспериментов была проверка возникших предположений.
Увеличение активностей нитрогеназы и ГС под влиянием АЗП. Добавление АЗП к к у л ь т у р е А. br as ile ns e Sp245 приводило к у в е л и чению а к т и в н о с т и н и т р о г е н а з ы ( рис. 5, к р и в а я 2 ). Х а р а к т е р з а в и с и м о с т и а к т и в н о с т и ф е р м е н т а от концентрации л е к т и н а был т а к и м ж е, к а к и в с л у ча е т и п о в о г о ш т а м м а ( Никитина с с о а в т., 1 9 8 7 ). И с к л ю ч е н и е м б ы л и л и ш ь больш ие м а к с и м а л ь н ы е значения а к т и в а ц и и в с л у ча е Активность ГС (1, ), нитрогена зы (2, ), и концентрации аммо Sp245 по с р а в н е н и ю с S p 7.
AЗП о к а з ы в а л влияние и на ния (3, •) % от контроля а к т и в н о с т ь Г С A. brasi l ense Sp245 ( рис. 5, к р и в а я 1 ), при че м а к т и в а ц и я Г С б ы л а м е н е е в ы р а ж е н а по с р а в н е н и ю с а к тивацией нитрогеназы. Так ж е, к а к и в с л у ча е н и т р о г е н а зы м а к с и м а л ь н у ю а к т и в а ц и ю Г С н а б л ю д а л и, к о г д а на к а ж дые 8. 10 6 к л е т о к приходилось 0, 5 м к г ( 1, 3 9. 10 - 8 М) АЗП.
Для обоих ферментов з а в и с и м о с т ь "доза - о т в е т " бы л а я р к о в ы р а ж е н а : при п р е в ы ш е нии м а к с и м а л ь н о й а к т и в и р у ю щ е й концентрации АЗП А З П, м к г /м л * в с е г о в 4 раза в с л у ча е Г С и в 7 р а з в с л у ча е н и т р о г е н а з ы, Рис. 5. Зависимость активности глутамин синтетазы (1, ), нитрогеназы (2, ) активация ферментов сменя Azospirillum brasilense Sp245 и концентра- л а с ь их ингибированием ( рис.
ции аммония (3, •) от концентрации лекти- 5).
на пшеницы. *В случае кривой Обнаруженные эффекты. размерность – мкг/8 10 кл/мл.
были специфичны и связаны со способностью лектина пшеницы обратимо и специфично связываться с N-ацетил-D глюкозамин-содержащими полимерами поверхности азоспириллы. Так, эффекты исчезали, когда АЗП перед добавлением лектина к суспензии бактерий инкубировали с N-ацетил-D-глюкозамином. Кроме того, в случае замены АЗП на белок-нелектин (БСА) или лектин с иной углеводсвязывающей специфичностью (Кон А) нам не удалось зарегистрировать ни активации, ни ингибирования ГС и нитрогеназы. И наоборот, при использовании UEA II, лектина с такой же углеводсвязывающей специфичностью, наблюдали увеличение активности обеих ферментов, которое было менее выражено, чем в случае АЗП. Было обнаружено, что индуцируемое лектином пшеницы усиление активности нитрогеназы и ГС зависит от фазы роста культуры и максимально выражено в середине логарифмической фазы.
Индукция экскреции аммония под влиянием лектина пшени цы. Известно, что A. brasilense, растущая в условиях азотфиксации, экскретирует в среду обитания часть продукта азотфиксации, аммония (Elmerich et al., 1978). Определение содержание аммония в среде культивирования A. brasilense Sp245, растущей в присутствии и отсут ствии АЗП, показало, что лектин вызывает существенное усиление экс креции продукта азотфиксации (рис.5, кривая 3). Зависимость стимуля ции экскреции аммония от концентрации лектина пшеницы имела такой же характер, как аналогичные зависимости для ГС и нитрогеназы, но была более выражена количественно (максимальная стимуляция – 12, раза). Эффект усиления экскреции аммония хорошо коррелировал с дву мя вышеописанными: коэффициент корреляции был равен +0,83 для кривых 1 и 3 на рис. 5 и +0,92 для кривых 2 и 3, представленных на рисунке. В случае аммония, так же, как и в случае нитрогеназы и ГС, эффект был специфичен и максимально выраженен в середине логариф мической фазы роста культуры.
4. Влияние лектина пшеницы на биосинтетические и ростовые процессы у A. brasilense Для о ц е н к и в о з м о ж н о г о влияния л е к т и н а пш еницы на б и о с и н т е т и ч е с к и е п р о ц е с с ы в к л е т к а х A. br as ile ns e Sp245 б ы л и полу чены г р у бы е экс т ра кт ы а к т и в и р о в а н н ы х л е к т и н о м и н е а к т и в и р о в а н н ы х к л е т о к и п р о в е д е н о их с р а в н и т е л ьно е и с с л е д о в а н и е с использованием э л е к т р о ф о р е т и ч е с к и х и и мм у нол огич еских подходов. Чт обы с д е л а т ь с р а в н е н и е к о р р е к т н ы м, м ы выращивали клетки в у с л ов иях азотфиксации до середины л о г а р и ф м и ч е с к о й фазы р о с т а, з а т е м д е л и л и к у л ь т у р у на две р а в н ы е по о б ъ е м у и к о л и че с т в у к л е т о к ча с т и. Обе с у с п е н з и и, к о н т р о л ь н а я и о п ы т н а я, п о д в е р г а л и с ь о д и н а к о в ы м манипу ляциям, за т е м л и ш ь и с к л ю чением, чт о в опытну ю был д о б а в л е н АЗП ( до конечной концентрации 0, м к г / м л ). П о с л е разру ш ения к л е т о к и полу чения г р у бы х э к с т р а к т о в м ы в з я л и для а н а л и з а р а в н ы е а л и к в о т ы э к с т р а к т о в для т о г о, чт обы р е з у л ь таты электрофореза и иммуноэлектрофореза можно было отнести к р а в н о м у к о л и че с т в у а к т и в и р о в а н н ы х и н е а к т и в и р о в а н н ы х к л е т о к.
Сравнение полипептидных профилей лектин-активированных и неактивированных клеток. Э л е к т р о ф о р е т и ч е с к и й а н а л и з полу чен ных э к с т р а к т о в ( рис. 6 ) у бе д и т е л ьно с в и д е т е л ьс т в о в а л в пользу с т и м у л я ции биосинтеза б е л к о в у A. b r a s i l e n s e Sp245 под влиянием АЗП. На п е р в ы х дву х д о р о ж к а х ( рис. 6, а и б), п р е д с т а в л я ю щ и х с о о т в е т с т в е н н о д в у к р а т но р а з в е д е н н ы й и исходный э кс т ра кт ы к л е т о к п о с л е их инку бации с л е к т и н о м пш еницы, визу ально р е г и с т р и р о в а л о с ь 64 п о л о с ы, в т о в р е м я к а к полипептидный профиль к о н т р о л ь н о г о э кс т ра кт а о б н а р у ж и в а л л и ш ь 2 6 полос ( рис. 6, в ). Попарное с р а в н е н и е полос, с о в п а д а ю щ и х по эле к т р о ф о р е т и ч е с к о й п о д в и ж н о с т и в контрольном и о п ы т н о м в а р и а н т а х, позволило в ы я в и т ь 2 в а ж н ы х м о м е н т а. Во - п е р в ы х, в с е п о л о с ы, обна р у ж и в а е м ы е в контрольном полипептидном профиле, б ы л и видимы и в о п ы т н о м ( т о е с т ь о т с у т с т в о в а л о ингибирование с и н т е з а о т д е л ь н ы х б е л к о в в о т в е т на добавление к к у л ь т у р е а з о с п и р и л л ы АЗП). Во - в т о р ы х, и н т е н с и в н о с т ь п р а к т и че с к и в с е х с о в п а д а ю щ и х по п о д в и ж н о с т и полос в о п ы т н о м э кс т ра кт е б ы л а в ы ш е, че м в контрольном. Э т о, в с в о ю о че р е д ь, г о в о р и т об у с илении с и н т е з а т е х б е л к о в, к о т о р ы е п р и с у т с т в у ю т в к л е т к а х А. b r a s i l e n s e, не п о д в е р г а в ш и х с я в о з д е й с т в и ю л е к т и н а пш еницы. Т а к и м образом, полипептидный профиль к л е т к и, а к т и в и р о в а н н о й л е к т и н о м, состоит из 26 полипептидов, идентичных по электрофоретической подвижности полипептидам контрольного профиля, и 38 новых. Данные электрофоретического анализа хорошо согласовывались с результатами оценки содержания белка в грубых экстрактах (380 мкг/мл – в экстракте активированных клеток и 120 мкг/мл – в контрольном экстракте, средние арифметические экспериментов).
Эффект стимуляции биосинтеза белков у A. brasilense Sp245, так же, как и опи санные выше эффекты, был специфичным.
Так, замена АЗП на Кон А или БСА не приводила к увеличению концентрации белка в грубых экстрактах по сравнению с контрольными экстрактами. Кроме того, полипептидные профили клеток, инкуби ровавшихся с Кон А или БСА, были иден тичны контрольным. Попытка осмыслить полученные экспериментальные данные приводит к представлению о том, что лектин пшеницы, специфически связыва ясь с N-ацетил-D-глюкозамин-содержащим полимером (полимерами) клеточной поверхности бактерии, приводит в конеч а б в ном итоге как к интенсификации тех Рис. 6. Электрофореграммы синтезов, которые уже протекают в клет экстрактов клеток ке, так и к индукции новых. Последнее, Azospirillum brasilense безусловно, связано с активацией генов, Sp245, подвергавшихся и не репрессированных в неактивированных подвергавшихся воздействию лектином клетках A. brasilense Sp245.
АЗП. а, б – клетки после ин кубации с АЗП;
в – клетки Индукция биосинтеза ГС. Ре без инкубации с АЗП. а – з у л ьт а т ы эк с п е р и м е н т о в, п р е д с т а в л е н н ы х экстракт был разбавлен на рис. 5 и описанны х в ы ш е, не д а в а л и вдвое для лучшего разреше о т в е т а на вопрос, с в я з а н о л и у в еличение ния мажорных белков.
а к т и в н о с т и Г С под влиянием л е к т и н а пш еницы с а к т и в а ц и е й п р е с и н т е з и р о в а н н о г о ф е р м е н т а, или АЗП инду циру е т с и н т е з эт ог о б е л к а. Для в ы я с н е н и я в о п р о с а о в о з м о ж н о й инду к ции биосинтеза Г С у A. b r a s i l e n s e Sp245 под влиянием АЗП м ы использовали ракетный иммуноэлектрофорез с антителами к гомогенному п р е п а р а т у A. br as ile ns e S p 2 4 5 *.
С р а в н и в а л и в ы с о т у р а к е т, полу ченных при и м м у н о э л е к т р о ф о р е т и ч е с к о м а н а л и з е г р у бы х э к с т р а к т о в АЗП- а к т и в и р о в а н н ы х и н е а к т и в и р о в а н н ы х к л е т о к а з о с п и р и л л ы. Для полу чения б о л е е полной к а р т и н ы а н а л и з и р о в а л и т а к ж е э кс т ра кт ы, р а з б а в л е н н ы е в 2 и 4 раза. В с е а н а л и з и р у е м ы е э к с т ра кт ы АЗП- а к т и в и р о в а н н ы х к л е т о к ( н е р а з б а в л е н н ы й и р а з б а в *Благодарим к.б.н. Л.Ю. Матору за предоставление антител к ГС A.
brasilense Sp245 и д.б.н. Л.А. Сырцову за предоставление препарата Mo-Fe-белка A. vinelandii.
ленные) давали большую высоту ракет по сравнению с соответст вующими экстрактами неактивированных клеток. Это, в свою очередь, означает, что клетки азоспириллы, активированные лектином, содержали большее число молекул антигена, то есть ГС. На полученной в наших экспериментах иммуноэлектрофореграмме две ракеты имели одинаковую высоту (27,5 мм – неразбавленный контрольный и двукратно разбавленный опытный экстракты). Из этого следует, что часовая инкубация клеток A. brasilense Sp245 c лектином пшеницы приводила к примерно двукратному увеличению в них числа молекул ГС. Другими словами, связывание АЗП c клетками азоспириллы приводило в конечном итоге к интенсификации биосинтеза ГС.
Индукция биосинтеза нитрогеназы. Е щ е одной з а д а ч е й р а б о т ы б ы л о – в ы я с н и т ь, инду циру е т л и л е к т и н пш еницы б и о с и н т е з н и т р о г е н а з ы.