Новая стратегия использования генов антимикробных пептидов из яда членистоногих в качестве генотерапевтических агентов

На правах рукописи

Лазарев Василий Николаевич «Новая стратегия использования генов антимикробных пептидов из яда членистоногих в качестве генотерапевтических агентов» 03.01.03 – молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

МОСКВА 2010

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Научно исследовательский институт физико-химической медицины» Федерального медико-биологического агентства

Научный консультант:

доктор биологических наук, профессор Говорун Вадим Маркович ФГУ «НИИ ФХМ» ФМБА России

Официальные оппоненты:

академик РАН и РАСХН, доктор биологических наук профессор Скрябин Константин Георгиевич Центр «Биоинженерия» РАН член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор Донцова Ольга Анатольевна МГУ им. М.В.Ломоносова доктор биологических наук, профессор Вейко Владимир Петрович ФГУП «ГосНИИГенетика»

Ведущая организация: Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт биомедицинской химии им. В.Н.Ореховича РАМН

Защита диссертации состоится « » 2010 года в_часов на заседании Диссертационного совета Д 217.013.01 при Федеральном государственном унитарном предприятии ГосНИИгенетики и селекции промышленных микроорганизмов по адресу: 117545 Россия, г. Москва, 1-й Дорожный проезд, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУП «ГосНИИГенетика» Автореферат разослан «_» _2010 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат химических наук, доцент Воюшина Татьяна Львовна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

.

Актуальность проблемы.

На протяжении последних лет во всем мире отмечается значительный рост устойчивости возбудителей инфекционных заболеваний к антибиотикам. Возникновение антимикробной резистентности является естественным биологическим ответом на использование антибиотиков, которые создают селективное давление, способствующее отбору, выживанию и размножению резистентных штаммов микроорганизмов.

Резистентность к антибиотикам имеет большое социально-экономическое значение и в развитых странах мира рассматривается как угроза национальной безопасности.

Инфекции, вызванные резистентными штаммами, отличаются длительным течением, чаще требуют госпитализации и увеличивают продолжительность пребывания в стационаре, ухудшают прогноз для пациентов. При неэффективности препаратов выбора приходится использовать средства второго или третьего ряда, которые, зачастую, более дороги, менее безопасны и не всегда доступны. Все это увеличивает прямые и непрямые экономические затраты, а также повышает риск распространения резистентных штаммов в обществе [MacPherson, 2001].

За последние 5 лет более 30 млрд. долларов было потрачено мировой фармацевтической промышленностью на разработку новых антибиотиков. Если резистентность микроорганизмов к лекарственным средствам будет развиваться столь быстро, большинство этих инвестиций могут быть потеряны (http://www.who.int/topics/drug_resistance/en/ ). В связи с этим, активно обсуждается вопрос о создании альтернативных терапевтических средств, резистентность к которым будет развиваться ограниченно, или полностью отсутствовать. Такими средствами могут явиться антимикробные пептиды (АМП) - уникальная и чрезвычайно разнообразная группа соединений, являющаяся основным компонентом врожденного иммунитета.

Природные антимикробные пептиды являются неотъемлемой частью любого организма и выполняют роль либо «наступательного», либо «оборонительного» оружия [Diamond, 2009]. В настоящее время идентифицировано более 2 000 антимикробных пептидов, выделенных из представителей всех классов растений и животных.

Несомненными преимуществами антимикробных пептидов перед антибиотиками являются: более широкий спектр антибактериального действия, функциональная активность при наномолярных концентрациях, ограниченная возможность формирования резистентности возбудителей к антимикробным пептидам, возможность синтеза аналогов природных пептидов с измененными биологическими свойствами [Palfy, 2009].

Ограниченная возможность формирования устойчивости к АМП объясняется уникальным механизмом их действия, заключающемся в формировании мембранных каналов с последующей фрагментацией мембраны бактериальной клетки [van’t Hof, 2001].

Объектом исследования стали уникальные по своей биологии внутриклеточные паразиты – микоплазмы и хламидии.

В мировой лечебной практике для терапии этих инфекций используются антибиотики широкого спектра действия (тетрациклины, макролиды, фторхинолоны), однако, их действие, вследствие быстрого приобретения резистентности к ним, в редких случаях эффективно. Кроме того, уникальные особенности взаимоотношений этих внутриклеточных паразитов с иммунной системой человека часто способствуют развитию персистенции инфекционного агента в организме.

На сегодняшний день в Российской Федерации высокая заболеваемость внутриклеточными инфекциями остается одной из актуальных проблем в области практического здравоохранения. Во многом этому способствует сложившаяся в России и странах СНГ экономическая и демографическая ситуация (снижение социально экономического уровня населения;

создание рынка интимных услуг, наличие неконтролируемых миграционных потоков населения). Особое значение имеет внутриутробное инфицирование плода этими патогенами, приводящее к различным негативным последствиям, часто несовместимым с жизнью. Неконтролируемое применение антибактериальных препаратов, фальсификация лекарственных средств, и, как следствие, эскалация антибиотикорезистентности, отсутствие отечественных разработок в области создания новых антимикробных средств наносят колоссальный экономический ущерб и создают угрозу национальной безопасности страны.

Таким образом, разработка современных высокоэффективных антихламидийных и антимикоплазменных препаратов, развитие резистентности к которым будет ограничено, является чрезвычайно актуальной задачей.

Цель работы: разработать основу для реализации генотерапевтических подходов к лечению микоплазмозов и хламидиозов с использованием генов антимикробных пептидов.

Задачи исследования:

1) Сконструировать рекомбинантные плазмидные векторы, экспрессирующие гены антимикробных пептидов – мелиттина из яда пчелы и пептидов (латарцинов и оксиопининов) из яда двух видов пауков.

2) Адаптировать систему тетрациклин-зависимой регуляции экспрессии генов к полученным рекомбинантным плазмидным векторам.

3) Создать инфекционные модели микоплазмозов и хламидиозов у лабораторных животных.

4) Протестировать полученные рекомбинантные плазмидные векторы в культуре клеток и на моделях микоплазмозов и хламидиоза у лабораторных животных.

5) Установить основные механизмы действия АМП на развитие микоплазменной и хламидийной инфекций.

Научная новизна.

Впервые в качестве потенциальных генотерапевтических агентов для подавления инфекций, вызываемых внутриклеточными паразитами – микоплазмами и хламидиями, использованы антимикробные пептиды из яда членистоногих. Создана серия рекомбинантных плазмидных векторов, экспрессирующих гены мелиттина из яда пчелы и гены латарцинов и оксиопининов из яда паука.

Впервые для снижения цитотоксического эффекта антимикробных пептидов использована система тетрациклин-зависимой регуляции экспрессии генов АМП.

Впервые показана возможность элиминации M.hominis и C.trachomatis из линий клеток, трансфицированных полученными рекомбинантными плазмидными векторами.

Впервые, на созданных инфекционных моделях микоплазмоза и хламидиоза человека у лабораторных мышей, а также у цыплят-бройлеров, инфицированных возбудителем микоплазмоза птиц - M.gallisepticum показано ингибирование микоплазменной и хламидийной инфекций после введения полученных рекомбинантных плазмидных векторов.

Впервые, выявлены механизмы действия АМП на внутриклеточных паразитов.

Помимо прямого бактерицидного эффекта продемонстрировано снижение трансмембранного потенциала клеток, экспрессирующих ген мелиттина, изменение редокс-состояния клетки и нарушение внутриклеточного трафика, приводящих к нарушению цикла развития хламидий.

Практическая значимость.

Для практического использования разработана система точного регулирования экспрессии генов АМП, которая позволяет решать следующие задачи: 1) определять антимикробную активность кандидатных АМП без их химического синтеза - при клонировании кодирующих их генов в созданный универсальный плазмидный вектор и последующей трансфекции культуры эукариотических клеток;

2) определять степень цитотоксичности кандидатных пептидов при различном уровне экспрессии кодирущих их генов.

Созданные инфекционные модели, а именно урогенитальные микоплазмоз и хламидиоз человека у лабораторных мышей, респираторный микоплазмоз у цыплят бройлеров, могут быть использованы для тестирования новых антимикоплазменных и антихламидийных препаратов.

Результаты исследований использовались при выполнении работ в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» по соглашению с Федеральным агентством по науке и инновациям №01.168.24.016 от июня 2007 г. «Разработка методов высокопроизводительного скрининга активности антимикробных пептидов как препаратов для терапии внутриклеточных инфекций», по Государственному контракту с Федеральным агентством по науке и инновациям №02.512.11.2202 от 12 мая 2008 г. «Новые генно-инженерные лекарственные препараты на основе антимикробных пептидов для терапии внутриклеточных инфекций».

Теоретические положения и результаты диссертационной работы используются в курсах лекций по молекулярной медицине в Московском Физико-Техническом институте (Государственном университете) и Российском государственном медицинском университете им. Н.И.Пирогова. По результатам работ поданы заявки на патенты на изобретения: «Способ раздельного выделения одно- и двунитевых нуклеиновых кислот на силикатных матрицах» (№2008137197), «Способ терапии внутриклеточных инфекций с использованием прототипов генно-инженерных лекарственных препаратов на основе генов антимикробных пептидов паука Lachesana tarabaevi» (№2009136937), «Способ конденсации плазмидной ДНК для трансфекции эукариотических клеток» (№2009136936).

Апробация работы Основные результаты работы были доложены на научной конференции в рамках межлабораторного семинара отдела молекулярной биологии и генетики ФГУ «НИИ ФХМ» ФМБА России и на секции “Молекулярная биология” Ученого Совета ФГУП “ГосНИИ генетика”.

Результаты работы были представлены на: Международной конференции «Антибиотики и антибиотикорезистентность на пороге ХХI века» (Москва, 2000), 10-ом и 11-ом Международных биотехнологических симпозиумах (Берлин, 2000;

Мадрид, 2001), 11-ом Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (Стамбул, 2001), 8-ом Всероссийском съезде дерматовенерологов (Москва, 2001), 4-ой и 5-ой Международных конференциях МАКМАХ «Антимикробная терапия» (Москва, 2001;

Москва, 2002), Международной конференции «Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины» (Москва, 2002), 14-ом Международном конгрессе общества микоплазмологов (Вена, 2002), 11-ом Европейском конгрессе по биотехнологии (Базель, 2003), Международном симпозиуме «Геномика для изучения взаимоотношений паразит-хозяин» (Хинкстон, 2006), Научно-практической конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии» (Казань, 2008), 4-ом Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009), 45-й Международной конференции по медицинской химии (Орлеан, 2009).

Публикации. Материалы диссертационной работы отражены в 34 публикациях: статьях и11 материалах российских и международных научных конференций.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 254 страницах машинописного текста;

состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, выводы. Работа иллюстрирована 26 таблицами и 56 рисунками, библиографический указатель включает 611 публикаций.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Штаммы E.coli:

В работе использовали следующие штаммы E.coli:

DH5a (Invitrogen, США), генотип F- 80lacZM15 (lacZYA-argF) U169 recA1 endA hsdR17 (rk-, mk+) phoA supE44 - thi-1 gyrA96 relA1, TOP10 (Invitrogen, США), генотип F- mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80lacZM15 lacX nupG recA1 araD139 (ara-leu)7697 galE15 galK16 rpsL(StrR) endA1 JM110 (Stratagene, США), генотип rpsL (Strr) thr leu thi-1 lacY galK galT ara tonA tsx dam dcm supE44 (lac-proAB) [F traD36 proAB lacIqZM15] BL21(DE3) (Novagen, США), генотип F– ompT gal dcm lon hsdSB(rB- mB-) (DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1 sam7 nin5]).

Плазмидные векторы:

В работе использовали следующие плазмидные векторы pGEM-Teasy (Promega, США), pRc/CMV (Invitrogen, США), pUC19 (Сибэнзим, Россия), pTet-On (Clontech, США), pTet-Off (Clontech, США), pBI-EGFP (Clontech, США), pTRE (Clontech, США), pCR2. (Invitrogen, США), pEGFP-N1 (Clontech, США), pEGFP-C1 (Clontech, США), pET-15b (Novagen, США), pET-32a (Novagen, США), pQE-32 (Qiagen, Германия), pRep4 (Qiagen, Германия), pCR4Blunt-TOPO (Invitrogen, США), pCMVb (Clontech, США).

Объекты исследования:

Штаммы M.hominis, выделенные от больных с неспецифическими воспалительными заболеваниями урогенитального тракта (штамм 1862.3, содержащий детерминанту резистентности tetM, обеспечивающую устойчивость микоплазм к антибиотикам тетрациклинового ряда (МИК доксициклина 1 мг/л) и штамм 574, не содержащий tetM детерминанту), были любезно предоставлены А.Е. Тараскиной (НИИ акушерства и гинекологии им. Д.О. Отта РАМН, Санкт-Петербург, Россия).

Лабораторный штамм M.hominis Н-34 был любезно предоставлен И.В. Раковской (НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи, Москва).

Штамм C.trachomatis (штамм D/UW-3/Cx, ATCC VR-885, МИК доксициклина 0. мг/л) был любезно предоставлен доктором Eva Hjelm (Университет Uppsala, Швеция).

Штамм Mycoplasma gallisepticum 1226 (МИК доксициклина 2 мкг/мл) был любезно предоставлен доктором Laszlo Stipkovits (Институт ветеринарной медицины, Венгрия).

Реакция прямой иммунофлуоресценции.

Реакцию прямой иммунофлуоресценции для детекции ингибирования инфекции C.trachomatis проводили c использованием моноклональных антител, конъюгированных с флуоресцеином (”Orion Diagnostica”, Финляндия), согласно инструкции фирмы производителя. Подсчет количества включений (не менее 50 полей зрения) проводили с использованием микроскопа Eclipse E800 (Nikon, Япония) при увеличении х400.

Для исследования влияния экспрессии мелитина в линиях клеток HeLa/tTA и HeLa/rtTA на инфекцию M.hominis использовали также реакцию прямой иммунофлуоресценции. Учитывали результаты с помощью люминесцентной микроскопии, а также с использованием планшетного флуориметра “Multiscan Ascent” (LabSystems, Финляндия).

Учет результатов с помощью люминесцентной микроскопии.

Клетки линий HeLa/tTA и HeLa/rtTA выращивали на покровных стеклах. Через 48 ч после трансфекции и заражения ростовую среду удаляли и клетки промывали 2 раза фосфатно-солевым буфером (PBS, 1.47mM KH2PO4, 4.29mM Na2HPO4x7H2O, 137mM NaCl, 2.68mM KCl, pH 7,4) и фиксировали метанолом. После фиксации клетки промывали 1 раз PBS, добавляли 30 мкл сыворотки, конъюгированной с FITC (разведение сыворотки 1:16). Стекла с клетками инкубировали во влажной камере 15 мин при 37 0C при покачивании. Затем стекла с клетками промывали 1 раз PBS, подсушивали и проводили микроскопию.

Учет результатов с использованием планшетного флуориметра.

Через 48 ч после трансфекции и заражения ростовую среду удаляли и клетки промывали 2 раза PBS. В каждую лунку добавляли 170 мкл PBS и 30 мкл сыворотки, конъюгированной с FITC (разведение сыворотки 1:16). Клетки инкубировали во влажной камере 15 мин при 37 0C при покачивании. Клетки осторожно переносили в 1,5 мл пробирку. К клеткам добавляли 600мкл PBS. Суспензию клеток центрифугировали при 3000 об/мин 5 мин при комнатной температуре. Надосадочную жидкость сливали, к клеткам добавляли 600 мкл PBS, клетки ресуспендировали и центрифугировали при том же режиме. Клетки ресуспендировали в 200 мкл PBS и переносили в плашку для измерения. Измерение проводилось при длине волны возбуждающего света 485нм и эмиссии 538 нм.

Оценка жизнеспособности клеток.

Цитотоксический эффект оценивали с использованием набора LIVE/DEAD (Invitrogen, США) согласно инструкции фирмы-производителя с небольшими модификациями. Подсчет живых и мертвых клеток проводили методом конфокальной сканирующей микроскопии с использованием аргонового лазера (488 нм) и проточной цитофлуориметрии. Клетки промывали ростовой средой, не содержащей сыворотку и инкубировали с кальцеином FM (2 мкМ) и гомодимером-1 этидиума бромида (4 мкМ) в течение 20 мин. Жизнеспособность клеток оценивалась как отношение клеток, окрашенных кальцеином FM (зеленая флуоресценция), ко всем окрашенным клеткам (зеленая и красная флуоресценция).

Флуоресцентное окрашивание плазматической мембраны, ЭПР и аппарата Гольджи эукариотических клеток.

Для окрашивания аппарата Гольджи клетки фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 5 минут при комнатной температуре и инкубировали в 0.5% Triton X-100 в течение 10 минут при комнатной температуре. Образцы блокировали с использованием 2% козьей сыворотки либо 2% бычьего сывороточного альбумина в TNT-буфере (0.1 M Tris-HCl [pH 7.5], 0.15 M NaCl, 0.05% Tween 20) от 30 до 40 минут. Затем образцы инкубировали с антителами к анти-Гольджин-97 в течение ночи при 4°C, отмывали и инкубировали с Alexa 594-конъюгированными антителами в течение ночи при 4°C, затем препараты отмывали и просушивали перед монтированием.

Окрашивание эндоплазматического ретикулума осуществляли с использованием мкM ER-Tracker в растворе Хэнкса (Биолот, Россия) в течение 15 минут и отмывали препарат перед монтированием.

Создание экспериментальной инфекции M.hominis у лабораторных мышей.

В работе использовались самки мышей линии BALB/c 6-8 недельного возраста, вес 18-22 г. Для синхронизации эстрального цикла животным вводили гексэстрол («Фармадон», РФ) в дозе 0.5 мг на мышь подкожно в объеме 0.05 мл четырехкратно с недельным интервалом. Заражение производили сразу после второй инъекции гормона путем интравагинального введения суспензии микоплазм в объеме 50 мкл с использованием автоматической пипетки. Используемые для заражения микоплазмы выращивали в жидкой питательной среде, концентрировали центрифугированием, трижды отмывали забуференным физиологическим раствором (pH 7,4). Титрование взвеси микоплазм производили как описано [Семененко, 1981]. Контролем служили животные, которым вместо суспензии микоплазм вводили стерильный физиологический раствор.

Вирулентность микоплазм сравнивали, определяя ID50 для каждого исследуемого штамма по формуле Кебера (Ашмарин И.П. и Воробьев А.А., 1962). Диапазон инфицирующих доз составил от 0,5х106 до 0,5х1011 КОЕ/мл на мышь. Количество животных в каждой группе - 6.

Еженедельно, начиная с 1-й недели после заражения, определяли наличие микоплазм в нижних (соскоб эпителиальных клеток со слизистой влагалища) и верхних (гомогенаты асептически выделенных яичников, фаллопиевых труб и верхней трети рога матки) отделах генитального тракта. Соскобы эпителиальных клеток со слизистой влагалища собирали у всех животных в группе (n=20) с помощью одноразовых стерильных зондов (DNC Med, Россия) и вносили в 1 мл жидкой питательной среды. Для получения гомогенатов органов, еженедельно забивали по 2 мыши. Гомогенаты органов готовили как описано (Прозоровский С.В. и др., 1995). Для определения титра M. hominis готовили серийные растворы десятикратных разведений первичного материала до конечного разведения 1: 1010 в 0,5 мл жидкой питательной среды, содержащей аргинин и индикатор феноловый красный, инкубировали при 37 0С не менее 10 суток. Наибольшее разведение инокулята, при котором наблюдался рост микоплазм и изменялся цвет индикатора, принимали за титр культуры M. hominis и выражали в CCU/мл (color-changing unit, цветоизменяющие единицы на единицу объема среды).

Создание экспериментальной инфекции C.trachomatis у лабораторных мышей.

В работе использовались самки мышей линии BALB/c 6-8 недельного возраста, вес 18-22 г. Прогестерон (Depo-Provera, Великобритания) в дозе 2.5 мг на мышь вводили подкожно в объеме 0.1 мл за четыре дня до инфицирования C. trachomatis. Фракцию элементарных телец C. trachomatis (титр 106 ifu/мл) введили мышам интравагинально в объеме 50 мкл после инъекции прогестерона. Титр C. trachomatis выражали в IFU (inclusion forming unit;

единица, формирующая хламидийное включение).

Соскобы эпителиальных клеток со слизистой влагалища собирали у всех животных в группе (n=20) с помощью одноразовых стерильных зондов (DNC Med, Россия) и вносили в 1 мл жидкой среды MEM. Для определения титра C. trachomatis с использованием реакции прямой флуоресценции влагалищные смывы из - инфицированных мышей (разведения до 10 ) вносили в линию клеток McCoy и центрифугировали при 3000хg 1 час при комнатной температуре и затем инкубировали 37 0С 48-72 часа. Реакцию прямой иммунофлуоресценции проводили как описано при выше. Подсчет количества хламидийных включений (не менее 50 полей зрения) проводили при увеличении х900.

Создание экспериментальной инфекции M.gallisepticum у цыплят-бройлеров.

В работе использовались однодневные цыплята (n=70) бройлеров породы Ross (Babolna Agricultural Company, Венгрия). Цыпляты были сертифицированы по отсутствию M.gallisepticum и M.sinoviae с использованием реакции микроагглютинации (Antigen Nobilis, Intervet International, Голландия) и иммуноферментного анализа (MYGA test, Diagnosztikum, Венгрия). 10 однодневных цыплят из группы были забиты и исследованы с целью обнаружения патологических изменений внутренних органов и присутствия микоплазм. 60 цыпят в возрасте 21 дня были маркировали, взвешивали и разделяли на четыре группы по 15 птиц так, чтобы средняя масса тела цыплят в каждой группе достоверно не отличалась по критерию Стьюдента.

Инфицирование цыплят проводилось как описано [Whithear, 1996] с некоторыми модификациями. Цыплята были последовательно помещены в аэрозольную камеру объемом 0.224 м3 и инфицированы 10 мл культуры M.gallisepticum в титре 3х108 КОЕ/мл.

Каждый инокулят был превращен в аэрозольные частицы 7-10 мкм диаметром и распылен в течение 2 мин в камере. Цыплята выдерживались в камере в течение 20 мин после распыления M.gallisepticum.

Через 10 дней все цыплята были взвешены, забиты и вскрыты для выявления патоморфологических изменений. Фиксировалось наличие катаррального экссудата в носовых и околоносовых пазухах, трахее, бронхах, повреждения воздушного мешка, конъюнктивиты, синуситы, пневмония, перигепатит и перикардит. Степень выраженности оценивали в баллах: от 0 (нет патоморфологических изменений) до (сильные двусторонние изменения).

Для гистологических исследований отобирали образцы ткани трахеи, легкого, селезенки и печени. Срезы окрашивали гематоксилин-эозином и исследовали с целью обнаружения утолщения и инфильтрации лимфоцитами слизистой оболочки трахеи и наличия интерстициальной пневмонии, перибронхитов, периваскулитов и катарральной пневмонии. Гистологические изменения оценивали в баллах: 0 - нет интерстициальной пневмонии и инфильтрации, 1 – очаговая инфильтрация, 2 - диффузная инфильтрация, 3 – сильная инфильтрация.

Измерение концентрации восстановленного глутатиона в линии клеток HeLa..

Клетки были обработаны 0,01% трипсином с последующим центрифугированием 1500g в течение 5 мин. Осадок трижды промывали фосфатным буфером (ФСБ). Лизис клеток проводили путем трехкратного замораживания (при –135 0С)/оттаивания.

Содержание GSH в лизате определяли с использованием малеимидного реагента ThioGlo (Invitrogen, США) [Langmuir, 1996]. Калибровочную кривую получали путем разведения препарата GSH (Invitrogen, США) (0,5-8,0 мкМ) в 100 мМ фосфатном буфере, рН 7.4, содержащим ThioGlo1 (10 мкМ). Содержание GSH определяли путем измерения флуоресценции сразу после добавления реагента [Kagan, 1999] с использованием планшетного флуориметра “Multiscan Ascent” (LabSystems, Финляндия) (lex – 390 нм, lem – 500 нм). Концентрация GSH была нормализована на количество общего белка в образце. Концентрацию белка определяли с использованием Protein Assay Kit (BioRad, США).

Восстановленные тиолы в живых клетках визуализировали посредством флуоресцентной микроскопии. Клетки HeLa, выращенные на покровных стеклах (5х5 мм), промывали PBS и обрабатывали реагентом BODYPY-maleimide (2 мкМ) в течение 10 мин.

Флуоресценцию измеряли непосредственно после окраски с использованием конфокальной микроскопии.

Конфокальная микроскопия.

Конфокальную лазерную сканирующую микроскопию и иммунофлоресцентный анализ осуществляли с использованием конфокального флуоресцентного микроскопа Eclipse E800 (Nikon, Япония) с VEM Epi-Fluorescence насадкой, укомплектованного аргоновым (используемая длина волны 488 нм) и гелий-неоновым (используемая длина волны 594 нм) лазерами (Nicon Corporation, Япония), под объективом 60x, ЧА 1,4 с масляной иммерсией. Конфокальные изображения с шагом по Z -оси получали с интервалом в 0.25 мкм и записывали с помощью программы EZ-C1 2.00 Software (Nikon, Япония). Изображения обрабатывали с помощью программы Image Pro-plus 5.1 (Media Cybernetics, США).

Транскрипционное профилирование.

Клетки линий HeLa или 293 промывали трехкратно раствором Хенкса (Биолот, Россия) и снимали с подложки с использованием RLT буфера (Qiagen, Германия).

Тотальную РНК выделяли из клеток с использованием реагента Trizol (Invitrogen, США), согласно инструкции фирмы-производителя. Концентрацию РНК определяли с использованием спектрофотометра Nanodrop (Thermo Scientific, США). 200 нг тотальной РНК амплифицировали с использованием набора Illumina® TotalPrep™ RNA Amplification Kit (Ambion, США). Амплифицированная РНК была гибридизована на чипе WG- (Illumina, США) согласно инструкции фирмы-производителя. Анализ результатов проводился с использованием программного обеспечения GenomeStudio (Illumina, США).

Дифференциальный двухмерный гель-электрофорез.

Трансфицированные клетки HeLa или 293 обрабатывали трипсином, промывали ФБС. Клеточный осадок (10 мкл) растворяли в буфере: 7M мочевина, 2M тиомочевина, 4% CHAPS, 30 mM Tris-HCl, pH 8.5. Концентрацию белков определяли с помощью Quick start Bradford реагентов (Bio-Rad, USA) и выравнивали образцы по концентрации белка ( мг/мл). 50 мкг образцов метили 400 пМ Cy3 или Cy5 CyDye DIGE Fluor флуоресцентными красителями (Amersham Biosciences, Австрия) согласно протоколу производителя. Далее полученные образцы смешивали в равных объемах со 100 мM DTT (Bio-Rad, USA) и 2% (о/о) Ampholine 3-10 (Bio-Rad).

В первом направлении (изоэлектрофокусирование) использовали 4% ПААГ, 9М мочевину и 4% Амфолины (Pharmacia) рН 3–10, либо ИПГ стрипы 3–10 (Bio-Rad).

Изоэлектрофокусирование проводили 14 000 Вч по заданной пограмме (2 ч – 250 В, 2 ч – 450 В, 14 ч – 900 В). После проведения изоэлектрофокусирования ИПГ-стрипы или гели вымачивали в растворе, содержащем 125 mM TrisHCl, 40% (w/v) глицерин, 3% (w/v) ДДС, 65 mM ДДТ, pH 6.8 в течение 15 мин. После этого гель с фокусированными белками переносили во второй полиакриламидный гель с градиентом пористости ПААГ 9–16% и разделяли белки во втором направлении в присутствии 0,1% ДСН. Далее гели сканировали с помощью Typhoon Trio Imager (Amersham Biosciences, Austria) с разрешением 200 мкм и анализировали с помощью программы PDQest (Bio-Rad, USA).

Дифференциально экспрессированные белковые пятна вырезали из геля, подвергали трипсинолизу и наносили на твердую подложку чипа фирмы Bruker Daltonics, смешая их с раствором коричной кислоты в этаноле, содержащем 0.1% ТФУ.

Идентификацию белков производили методом пептидного фингерпринта на основе программного пакета Mascout [Zgoda, 2006]. Масс-спектры пептидов снимали на приборе MALDI-TOF AUTOFLEX Bruker Daltonics.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 2.1. Получение и тестирование in vitro рекомбинантных конструкций, экспрессирующих ген антимикробного пептида мелиттина.

Идея использования бактерицидного эффекта не химически синтезированных АМП, а продуктов экспрессии кодирующих их генов в инфицированной клетке, реализованная в данной работе, является оригинальной. В литературе описаны единичные случаи транзиентной трансфекции клеток эукариот векторами, экспрессирующими гены АМП. Ярким примером является использование плазмидных конструкций, экспрессирующих гены цекропина и мелиттина под контролем промотора вируса лейкемии мышей для демонстрации противоопухолевого эффекта этих пептидов в клетках человека [Winde, 1998]. Однако, ни в одном из этих случаев речь не идет о бактериальных инфекциях.

На первом этапе работы был получен плазмидный вектор, в составе которого ген мелиттина находился под контролем сильного конститутивного раннего промотора цитомегаловируса человека (HCMV). Однако, после трансфекции полученным вектором клеток линии HeLa через 24 часа наблюдалась практически 100%-ная гибель клеток.

Как известно, мелиттин неселективно индуцирует пермеабилизацию мембран как про-, так и эукариот [Papo, 2003]. Механизм его цитотоксического действия описывается моделью формирования тороидальных пор, когда мелиттин, встраиваясь в липидный бислой, соединяет внешний и внутренний липидные слои в поре [Yang, 2001]. Очевидно, что время существования пор зависит от концентрации пептида. Можно предположить, что неконтролируемая экспрессия гена мелиттина под контролем одного из самых сильных из известных на сегодняшний день промоторов - раннего промотора цитомегаловируса человека приводит к формированию перманентных пор и лизису клетки.

В связи с этим, на следующем этапе работы необходимо было решить задачу точного регулирования уровня экспрессии гена мелиттина.

Одной из наиболее прецизионных систем регуляции экспрессии генов является тетрациклиновая система регуляции (Tet-On и Tet-Off ) [Gossen, 1992]. Следует отметить, что до настоящего времени данная система не применялась для регулирования экспрессии генов АМП.

Ключевым компонентом системы является ген, кодирующий трансактиваторный белок tTA или rtTA. Он представляет собой составной белок из тетрациклинового протеина-репрессора (TetR - последовательность из тетрациклин-устойчивого оперона транспозона Tn10 E.coli) и активаторного домена (AD) белка VP16 вируса простого герпеса. tTA связывается с последовательностью TRE-элемента (tetracycline responsive element, тетрациклин-зависимый элемент) и активирует процесс транскрипции при отсутствии тетрациклина. TRE-элемент состоит из семи копий (по 42 п.о. каждая) последовательности тетрациклинового оператора (tetO). В качестве промотора выступает так называемый минимальный промотор цитомегаловируса человека, который неактивен в отсутствие трансактиватора.

Нами была создана серия рекомбинантных плазмид, обеспечивающих точную регуляцию экспрессии гена мелиттина в культуре клеток (рисунок 1). Поскольку для функционирования системы необходим трансактиватор, для проверки созданных плазмидных конструкций были получены линии клеток HeLa, стабильно экспрессирующие трансактиваторные белки. Линии клеток, получившие названия HeLa/Tet-On и HeLa/Tet-Off, стабильно экспрессируют гены трансактиваторных белков rtTA и tTA.

a-спиральным Мелиттин является катионным, амфипатическим пептидом, обладающим гемолитическими свойствами. В силу мембранотропности и цитотоксичности экспрессия гена мелиттина в клетках эукариот является нетривиальной задачей. Представляется необходимым контролировать наличие продукта экспрессии гена мелиттина на двух уровнях реализации генетической информации - РНК и белка.

MCS poly(A) pBI-EGFP GFP PminCMV2 TRE PminCMV1 poly(A) pBI/mel GFP PminCMV2 TRE PminCMV1 melittin poly(A) poly(A) pBI/mel2 GFP PminCMV2 TRE PminCMV1 melittin poly(A) poly(A) pTet-On(Off) P (r)tetR VP16AD poly(A) neo CM V Рисунок 1. Схема плазмидных конструкций системы точной регуляции экспрессии генов Tet-On и Tet-Off, использованных в работе.

PCMV – ранний промотор цитомегаловируса человека P min CMV – минимальный ранний промотор цитомегаловируса человека GFP – green fluorescent protein (ген «зеленого белка») TRE – тетрациклин-зависимый элемент SV40ori – точка начала репликации вируса SV Melittin – ген мелиттина Poly(A) – сигнал полиаденилирования (r)TetR – последовательность из тетрациклинового оперона транспозона Tn10 E.coli VP16AD – активаторный домен белка VP16 вируса простого герпеса.

На первом этапе, с использованием обратной транскрипции – полимеразной цепной реакции, продемонстрирована экспрессия гена мелиттина в линии клеток HeLa/Tet-On после трансфекции ее плазмидным вектором pBI/mel2GFP (рисунок 2А).

Таким образом, была показана экспрессия гена мелиттина в полученных клетках HeLa/Tet-On. Однако, наличие мРНК гена, в ряде случаев, автоматически не означает наличие соответствующего белкового продукта, в частности, из-за быстрой деградации молекул мРНК, особенностей ее структуры и т.д. Поэтому следующей нашей задачей стала детекция молекул пептида в трансфицированных линиях.

Для реализации этой задачи необходимо было получить поливалентную сыворотку против пептида мелиттина. Мелиттин является 100% гемолитическим агентом, поэтому получение антител к пептиду довольно затруднено. Мы решили эту проблему путем сшивки молекул мелиттина глутаровым альдегидом и оптимизации схемы введения антигена. Эмульсию пептида в полном адъюванте Фрейнда в соотношении 1:1 троекратно вводили мышам линии BALB/с подкожно с интервалом 12-14 дней. После получения, сыворотку тестировали в реакции дот-гибридизации. На рисунке 2Б видно, что полученная нами поливалентная сыворотка мышей против мелиттина, во-первых, специфически взаимодействует с очищенным препаратом мелиттина, и, во-вторых, в линии клеток HeLa/Tet-On, трансфицированной плазмидным вектором pBI/mel2GFP, мы детектируем целевой пептид.

М1 2 3 1 100 нг 50 нг 83 п.о.

10 нг 1 нг A. Б. В.

Рисунок 2. А. ОТ-ПЦР анализ экспрессии гена мелиттина в линии клеток HeLa/Tet-On.

Линия клеток была трансфицирована плазмидным вектором pBI/mel2GFP, выделена тотальная РНК, проведена реакция обратной транскрипции и полимеразная цепная реакция с использованием специфических олигонуклеотидов.

М – маркер молекулярной массы (Gene Ruler DNA Ladder Mix, Fermentas, Литва) 1 – отрицательный контроль (в реакционную смесь не добавлялась обратная транскриптаза) 2 – ОТ-ПЦР анализ трансфицированной линии HeLa/Tet-On.

3 – положительный контроль (в качестве матрицы для ПЦР использовали плазмидный вектор pBI/mel2GFP).

Б. Детекция мелиттина с использованием дот-блот гибридизации. Лизат (1% Тритон Х 100) клеток линии HeLa/Tet-On, трансфицированной плазмидным вектором pBI/mel2GFP, нанесен на нитроцеллюлозный фильтр (дорожка 2). Препарат мелиттина в количестве от 1 до 100 нг также нанесен на фильтр (дорожка 1).

В. Иммуноцитохимический анализ экспрессии мелиттина. Трансфицированная линия клеток была обработана полученной поливалентной сывороткой к мелиттину.

Наконец, мы детектировали мелиттин с помощью иммуноцитохимического метода.

Клетки были трансфицированы тем же вектором, через 24 часа зафиксированы, обработаны полученной поливалентной сывороткой к мелиттину и конъюгатом анти мышиные IgG-FITC. На рисунке 2В видно, что с использованием данного метода мы подтвердили наличие пептида в трансфицированных клетках.

Таким образом, показав наличие продукта экспрессии гена мелиттина в клетках, трансфицированных полученными рекомбинантными векторами, на уровне мРНК и белка, мы перешли к тестированию биологической активности мелиттина, а именно, к изучению влияния экспрессии гена этого АМП на развитие микоплазменной и хламидийной инфекций в клетках эукариот.

Линию клеток HeLa/Tet-Off трансфицировали плазмидным вектором pBI/mel2GFP. Через 24 часа после трансфекции линия была инфицирована C.trachomatis. Учет результатов с помощью люминесцентной микроскопии проводили через 24 и 48 часов после заражения. По данным люминесцентной микроскопии, (таблица 1) ингибирование инфекции C.trachomatis в линии клеток HeLa/Tet-Off через 24 часа составило 60%, а через 48 часов – 75%. В качестве контроля использовали линию HeLa/Tet-Off, трансфицированную плазмидным вектором pBI/GFP. Данный плазмидный вектор отличается от целевого отсутствием гена мелиттина.

Таблица 1. Ингибирование инфекции C.trachomatis в линии клеток HeLa/Tet-Off после трансфекции плазмидным вектором pBI/mel2GFP.

Время после инфекции 24 часа 48 часов Среднее количество включений в поле зрения Линия инфицирована, трансфицирована 13,0+/-1,6 12,8+/-2, плазмидным вектором pBI/GFP Линия инфицирована, трансфицирована 5,2+/-1,1 3,2+/-1, плазмидным вектором pBI/mel2GFP Помимо уменьшения количества хламидийных включений, мы наблюдали замедление их созревания.

Подобный экспреримент был проведен и на инфекционной модели M.hominis, однако, в данном случае мы использовали линию HeLa/Tet-On. Эта линия клеток была трансфицирована плазмидным вектором pBI/mel2GFP. Через 24 часа после трансфекции линию инфицировали M.hominis. Для индукции экспрессии гена мелитина в ростовую среду добавляли доксициклин в концентрации 0,04 мкг/мл. Минимальная ингибирующая концентрация доксициклина для M.hominis (штамм Н34) составляет 0,1 мкг/мл. Учет результатов с помощью люминесцентной микроскопии и измерения интенсивности флуоресценции проводили через 48 часов после заражения. Результаты эксперимента приведены на рисунке 3.

По результатам измерения интенсивности флуоресценции видно, что ингибирование инфекции M.hominis составило 65%, что соответствует и данным, полученным с помощью люминесцентной микроскопии.

Необходимо отметить, что в нетрансфицированных линиях клеток, инфицированных M.hominis или C.trachomatis при наличии в ростовой среде доксициклина, интенсивность флуоресценции сходна с таковой в трансфицированной линии клеток, но без добавления доксициклина. Это означает, во-первых, отсутствие неконтролируемой экспрессии мелитина, и, во-вторых, что выбранная нами концентрация индуктора (доксициклина) не влияет на развитие инфекционного процесса.

2.2. Получение и тестирование in vivo рекомбинанных конструкций, экспрессирующих ген антимикробного пептида мелиттина.

2.2.1. Создание инфекционной модели M.hominis.

Для создания инфекционной модели M. hominis необходимо было решить ряд задач: i) выбор лабораторного животного;

ii) сравнительное изучение способности клинических штаммов M. hominis колонизировать генитальный тракт лабораторного животного;

iii) описание экспериментальной инфекции и отбор штамма, с наиболее выраженными вирулентными свойствами для дальнейших исследований.

Относительные единицы флуоресценции А Б В Рисунок 3. Ингибирование инфекции M.hominis в линии клеток HeLa/Tet-On после трансфекции плазмидным вектором pBI/mel2DGFP.

A – линия клеток HeLa/Tet-On, инфицированная M.hominis, трансфицированная плазмидным вектором pBI/DGFP (концентрация доксициклина в ростовой среде 0. мкг/мл) Б - линия клеток HeLa/Tet-On, инфицированная M.hominis и трансфицированная плазмидным вектором pBI/mel2DGFP (доксициклин в ростовой среде отсутствует).

В - линия клеток HeLa/Tet-On, инфицированная M.hominis и трансфицированная плазмидным вектором pBI/mel2DGFP (концентрация доксициклина в ростовой среде 0. мкг/мл).

Мы выбрали 3 штамма M. hominis: лабораторный штамм H-34 и два клинических – 574 и 1862.3, последний содержал детерминанту устойчивости к тетрациклину. Перед инфицированием мы провели предварительную обработку мышей эстрадиолом. Для синхронизации эстрального цикла животным вводили гексэстрол четырехкратно с недельным интервалом.

Заражение животных на фоне гормональной обработки приводило к колонизации слизистой влагалища M.hominis. Однако, длительность выделения возбудителя и выраженность воспалительной реакции существенно отличались между испытуемыми штаммами.

Для повышения адгезивных свойств клинические штаммы были трехкратно пассированы через слизистую влагалища мышей линии Balb/c, что привело к повышению колонизационной способности испытуемых штаммов. Таким образом, длительность выделения микоплазм увеличилась для штамма 1862.3 в 7 раз (7 недель против 1), для штамма 574 – в 2 раза (6 недель против 3), 100% выявление микоплазм у инфицированных мышей наблюдалось в течение первых двух недель после заражения. Суммарные титры микоплазм для 3-го пассажа представлены в таблице 2.

2.2.2. Создание инфекционной модели C.trachomatis.

Известно, что у микоплазм, как и у хламидий, существуют штаммы, патогенные только для мышей. Однако, как и в случае с M.hominis, мы намеренно выбрали серовар хламидий, вызывающий урогенитальный хламидиоз у человека, а именно серовар D (D/UW-3/Cx, ATCC VR-885, MIC доксициклина 0.08 мкг/мл). Выбор именно лабораторного штамма, а не клинического изолята C.trachomatis, объясняется сложностью культивирования последнего даже в линии клеток McCoy. Попытки инфицировать мышей полученными нами клиническими изолятами хламидий, в том числе и устойчивыми к различным антибиотикам, не увенчались успехом.

Таблица 2. Динамика выделения штаммов M. hominis 574 и 1862.3 из влагалища мышей линии BALB/c (третий пассаж штаммов).

Титр M.hominis во влагалищных смывах инфицированных мышей (lg CCU/мл) по срокам наблюдения, M + m 1 2 3 4 5 6 7 неделя неделя неделя неделя неделя неделя неделя неделя Штамм M.hominis 7,9±1,1 5,9±1,3 3,5±0,9 2,4±1,1 1,2±1,1 0 0 574 ( пассаж) Штамм M.hominis 8,3±0,8 6,4±1,2 4,9±1,1 4,7±1,3 7,2±1,8 3,0±1,9 1,8±1,8 1862.3 ( пассаж) Как и в предыдущем случае, интравагинальное заражение мышей испытуемым штаммом в различных инфицирующих дозах не приводило к колонизации генитального тракта животных хламидиями.

Для индуцирования пролонгированного диэструса (и, таким образом, увеличения скорости начальной фазы хламидийной инфекции) самкам мышей линии BALB/c 6- недельного возраста вводили прогестерон за четыре дня до инфицирования. Фракция элементарных телец C. trachomatis вводилась мышам интравагинально после инъекции прогестерона. Через определенные интервалы времени у мышей брались соскобы со слизистой оболочки влагалища, которыми заражались клетки линии McCoy. После гормональной обработки длительность выделения возбудителя из организма достигала 35 ти дней (таблица 3).

Таблица 3. Динамика выделения C.trachomatis из влагалища мышей линии Balb/c.

Количество включений в поле зрения (х 400), по срокам наблюдения (дни) 2-й 6-й 9-й 13-й 16-й 20-й 27-й 34-й 3,1+0,6 2,03±0,81 1,16±0,27 1,25±0,64 0,60±0,12 0,28±0,08 0.75±0,31 0,13±0, Как и в случае с микоплазмами, интравагинальное введение хламидий приводило к инфицированию только нижних отделов генитального тракта. Заражение гомогенатами органов верхних отделов генитального тракта (яичники, фаллопиевы трубы и верхняя треть рога матки) линии клеток McCoy не дало положительных результатов.

К сожалению, оказалось безуспешным и пассирование данного штамма хламидий через слизистую оболочку мышей для повышения его способности к более длительной колонизации. Это вполне можно объяснить биологическими особенностями хламидий – облигатных внутриклеточных паразитов. После первого пассажа для достижения титра хламидий, необходимого для вторичного пассирования, требуется провести более пассажей в культуре клеток McCoy. За это время вирулентные свойства материнских хламидий, видимо, нивелируются.

Таким образом, мы разработали стабильно воспроизводящиеся модели урогенитального микоплазмоза и хламидиоза, подходящие для тестирования созданных нами рекомбинантных конструкций, экспрессирующих гены АМП.

2.2.3. Получение плазмидных конструкций, экспрессирующих ген мелитина для экспериментов in vivo.

Тестирование созданных плазмидных конструкций in vivo в нашем случае осложнялось тем, что в разработанной системе точного регулирования экспрессии генов, целевой ген под контролем минимального промотора цитомегаловируса человека и трансактиваторные белки (rtTA или tTA) находятся в разных плазмидных векторах.

Известно, что эффективность котрансфекции двумя и более плазмидными векторами несравнимо ниже, нежели эффективность трансфекции одним вектором. Поэтому на следующем этапе работы мы создали однокассетный вектор, который содержал все необходимые элементы системы точной регуляции экспрессии генов.

Ген, кодирующий трансактиваторный белок rtTA, был получен путем ПЦР амплификации соответствующего участка с использованием в качестве матрицы плазмиды pTet-On с введением в олигонуклеотидные праймеры сайтов узнавания эндонуклеаз рестрикции. Затем, полученный ген был клонирован в полученный ранее плазмидный вектор pBI/mel2. В результате вектор, получивший название pBI/mel2/rtTA/GFP, содержал ген мелиттина под контролем тетрациклин-зависимого промотора CMV и ген трансактиваторного белка rtTA под контролем конститутивного раннего промотора СMV, а также маркерный ген gfp и все необходимые регуляторные элементы.

Таким образом, нами впервые был сконструирован плазмидный вектор, объединяющий в себе все элементы двуплазмидной системы тетрациклин-зависимой регуляции экспрессии генов. Успешное тестирование функциональной активности полученного вектора в культуре клеток позволило перейти к его применению на лабораторных животных.

2.2.4. Тестирование рекомбинантных плазмид, экспрессирующих ген мелиттина у мышей, инфицированных M.hominis, С.trachomatis и M.gallisepticum.

Мыши были разделены на несколько групп (по 6 животных в каждой группе, независимых эксперимента):

Контрольная группа – мыши не инфицированы, плазмидный вектор и доксициклин не вводился.

Группа №1 - мыши инфицированы M. hominis или C. trachomatis без введения плазмидного вектора pBI/mel2/rtTA и доксициклина.

Группа №2 – мыши инфицированы M. hominis или C. trachomatis, введен доксициклин (2 мкг/мышь для M. hominis и 1 мкг/мышь для C. trachomatis).

Группа №3 - мыши инфицированы M. hominis или C. trachomatis, введен доксициклин и плазмидный вектор pBI/mel2/rtTA Суспензии микоплазм и хламидий, а также плазмидный вектор вводились интравагинально, доксициклин – внутримышечно. Рекомбинантный вектор вводился двукратно: за 24 часа до заражения M. hominis или C. trachomatis и через 14 дней после заражения в количестве 2 мкг ДНК/мышь. Через определенные интервалы времени делались урогенитальные мазки и определялся титр патогена. Экспрессия гена мелиттина была подтверждена с использованием реакции обратной транскрипции, сопряженной с полимеразной цепной реакцией.

После введения рекомбинантного вектора pBI/mel2/rtTA и последующего инфицирования мышей мы наблюдали ингибирование инфекции M.hominis. Результаты приведены в таблице 4. Титр M.hominis во влагалищных смывах мышей в контрольной группе №1 варьировал, снижаясь от 5.9 до 2.4 log10 CCU/ml в течение четырех недель. В то же время, в третьей группе мышей, которым до инфицирования вводился рекомбинантный вектор pBI/mel2/rtTA совместно с доксициклином, титр M.hominis находился в пределах от 4.1 до 1.8 log10 CCU/ml.

В случае введения плазмидного вектора pBI/mel2/rtTA и последующего инфицирования мышей С. trachomatis уровень ингибирования инфекции составлял от 45% до 80% (таблица 5).

Несмотря на то, что мы не обнаружили полного освобождения мышей от микоплазм и хламидий в пределах сроков наблюдения, скорость элиминации возбудителя в группе №3 была выше, чем в контрольных группах. Однако, более интересно оказалось проследить развитие инфекционного процесса у индивидуального животного, поскольку техническая погрешность при трансфекции может изменить картину. Так, 6 мышей из 12ти в группе 3 была свободна от возбудителя уже к 21 дню после инфицирования, в то время как в группе 1 и 2 все мыши были оставались инфицироваными. Среди мышей группы 3, инфицированных хламидиями, у 4х из 6ти мышей к 27му дню хламидии не детектировались.

Необходимо отметить, что мы не получили статистически достоверных отличий в титрах между группами мышей №1 и №2, инфицированных M.hominis или С. trachomatis, что говорит, во-первых, об отсутствии неконтролируемой экспрессии гена мелитина, во вторых, выбранная нами концентрация индуктора (доксициклина) не влияет на развитие инфекционного процесса.

Кроме того, дополнительное введение вектора pBI/mel2/rtTA через 14 дней и через 28 дней после инфицирования мышей не приводило к существенному ингибированию инфекции M.hominis и С. trachomatis. Вероятно, это связано со снижением эффективности доставки вектора в инфицированную клетку.

Нами был обнаружен интересный факт, что у мышей в группе 3 воспалительная реакция на слизистой оболочке влагалища была гораздо менее выражена, нежели у мышей группы 1 и 2, что показало исследование влагалищных мазков.

Таким образом, мы впервые продемонстрировали ингибирование урогенитального микоплазмоза и хламидиоза человека in vivo после введения мышам плазмидного вектора, экспрессирующего ген мелитина под контролем тетрациклин-зависимого промотора цитомегалавируса.

На следующем этапе нам удалось показать, что созданные прототипы генно инженерных препаратов способны подавлять рост природных патогенов животных. Для этого мы использовали инфекционную модель Mycoplasma gallisepticum – респираторного патогена птиц, применив аэрозольное введение рекомбинантных плазмид.

Mycoplasma gallisepticum вызывает тяжелые хронические респираторные заболевания у кур и синуситы у индеек [Davidson, 1982]. Экономические потери при инфицировании M.gallisepticum обуславливаются снижением яйценоскости и массы тела на 10-20%, увеличением смертности цыплят на 5-10% [Mohammed, 1987].

Если в предыдущих случаях мы создавали инфекционную модель урогенитального микоплазмоза и хламидиоза у мышей путем гормональной обработки лабораторных животных, пассированием патогена через слизистую оболочку влагалища для достижения более длительной колонизации тканей, то, в данном случае, M.gallisepticum является естественным патогеном кур. Более того, чрезвычайно интересным кажется оценка эффективности действия плазмидных конструкций, экспрессирующих ген мелиттина, вводимых аэрозольным путем, поскольку, если говорить о практическом применении этих прототипов генно-инженерных препаратов, то такой путь кажется экономически оправданным.

Для тестирования рекомбинантных плазмид животные были разделены на несколько групп (в каждой группе по 15 птиц). Деление птиц на группы описано в таблице 6.

Первая группа цыплят не была инфицирована M.gallisepticum и рекомбинантный плазмидный вектор pBI/mel2/rtTA не вводился. Цыплята второй группы были инфицированы M.gallisepticum, рекомбинантный плазмидный вектор pBI/mel2/rtTA также не вводился. Цыплятам третьей группы был введен плазмидный вектор за 5 часов до инфицирования M.gallisepticum, а также за 24 и 5 часов до инфицирования внутримышечно вводился индуктор транскрипции гена мелитина – доксициклин.

Цыплятам четвертой группы вводился доксициклин (в такой же дозе и с такими же интервалами), с последующим инфицированием M.gallisepticum. Цыплятам этой группы рекомбинантный плазмидный вектор pBI/mel2/rtTA не вводился.

Для мониторинга течения инфекции производился ежедневный осмотр, фиксировались респираторные шумы, измерялась масса тела. Перед забоем была взята кровь для проведения серологических исследований. После вскрытия были исследованы патологоанатомические изменения, характерные для этой микоплазменной инфекции, гистологические исследования внутренних органов, произведен микробиологический посев мазков из внутренних органов.

У цыплят всех групп была измерена масса тела за 24 часа до заражения и через дней после заражения M.gallisepticum и введения рекомбинантного плазмидного вектора pBI/mel2/rtTA. Масса тела цыплят в группе 1 к моменту забоя составила 817,5 ± 229,0 г. В группе 2 мы наблюдали статистически достоверное снижение средней массы тела цыплят – 638 ± 124 г. Что же касается группы 3, то средняя масса тела цыплят в этой группе статистически не отличалась от таковой в группе 1, и составила 794 ± 194 г.

Таблица 4. Влияние экспрессии гена мелиттина на динамику изоляции Mycoplasma hominis из урогенитального тракта инфицированных мышей.

Титр log10 CCU/ml Дни после 7 14 21 инфекции Группа/животное 1 группа 2 группа 3 группа 1 группа 2 группа 3 1 группа 2 группа 3 группа 1 группа 2 группа 3 группа группа a1 5 6 6 5 5 6 6 5 6 5 3 a2 4 8 4 2 4 3 1 5 3 0 4 a3 6 6 0 4 4 0 5 4 0 6 2 a4 7 7 8 6 5 6 5 5 6 4 4 a5 7 8 5 4 4 2 6 4 0 4 5 a6 5 5 4 2 4 0 2 3 0 0 3 a7 6 7 6 3 5 5 6 6 6 4 4 a8 6 8 3 3 5 2 5 5 3 0 3 a9 8 8 0 5 5 0 6 4 0 3 0 a10 8 6 6 6 4 5 5 5 6 2 4 a11 5 7 5 2 4 1 2 4 0 1 4 a12 4 6 3 4 3 0 1 2 0 0 1 M± m 5,92±0,47 6,83±0,34 4,17±0,69 3,83±0,42 4,33±0,19 2,5±0,7 4,17±0,59 4,33±0,31 2,50±0,81 2,42±0,63 3,08±0,42 1,83±0, P* 0,051 0,128 0,37 0, P** 0,028 0,029 0,029 0, P*** 0,0029 0,0068 0,0055 0, * P (t test) среднего log10 CCU U/мл для сравнения 1 группы и ** P (t test) среднего log10 CCU/мл для сравнения 1 группы и *** P (t test) среднего log10 CCU/мл для сравнения 2 группы и Таблица 5. Влияние экспрессии гена мелиттина на динамику изоляции Chlamydia trachomatis из урогенитального тракта инфицированных мышей.

Животные Посев ( IFU/ml) на указанный день после инфеции 2 6 9 13 16 20 группа a1 11275 7934 5846 3758 2297 1462 a2 17539 14150 6264 3758 2506 1879 a3 19627 14616 7934 18374 4385 2088 a4 12946 8490 2506 2088 2297 626 a5 9187 2923 1670 2088 1879 369 a6 7099 2830 1253 1253 1670 0 M± m 12950±1974 8490±2105 4250±1138 5220±2662 2506±396 1071±350 1567± группа a1 7934 7098 1670 5011 2088 1044 a2 16704 12804 6680 10750 3260 1840 a3 8352 7517 2300 5011 1670 918 a4 17539 12108 5429 4176 1670 626 a5 12528 10021 5011 2500 2500 835 a6 12528 8977 2500 1670 1670 626 M± m 12597±1644 9754±959 3930±832 4853±1303 2143±261 981±184 1468± группа a1 7099 3758 2506 2506 2088 0 a2 5846 2088 2506 1670 835 626 a3 5220 2088 835 835 418 209 a4 6682 1253 1253 3341 626 209 a5 9605 5429 2506 2088 1253 835 a6 6682 1670 1920 2088 1253 369 M± m 6850±616 2710±645 1921±297 2088±341 1079±244 375±125 348± P* 0,258 0,338 0,193 0,128 0,207 0,43 0, P** 0,018 0,029 0,045 0,156 0,009 0,063 0. 0, P*** 0,01 0,03 0,044 0,000251 0,00064 0, После забивки цыплят никаких признаков инфицирования M.gallisepticum в воздушных мешках и брюшной полости у животных в группе 1 обнаружено не было (Таблица 7). В то же время, у всех цыплят второй группы обнаруживался аэросаккулит и перитонит со средним баллом 110. В группе 3, у четырех птиц отсутствовали патологические изменения, а у десяти диагностировался аэросаккулит и перитонит с общим баллом 42. В то же время, все птицы в группе 4 демонстрировали сходные патологические изменения (общий балл 100) с группой 2.

Таблица 6. Разделение цыплят бройлеров на группы.

Группа M.gallisepticum Плазмидный Доксициклин вектор pBI/mel2/rtTA Группа 1 - - Группа 2 + - Группа 3 + + + Группа 4 + - + Таблица 7. Патологические изменения, наблюдаемые у забитых цыплят различных групп, через 9 дней после инфицирования (общий балл).

Левый грудной Правый грудной Брюшина Общий балл воздушный воздушный мешок мешок Группа 1 0 0 0 Группа 2 32 45 33 Группа 3 а 12 10 20 Группа 4 б 29 39 32 a Различия статистически достоверны между группой 3 и группами 1,2,4;

P 0.001.

б Различия статистически недостоверны между группой 4 и группой 2.

Еще один важный диагностический признак инфекции M.gallisepticum – утолщение слизистой оболочки трахеи. При гистологическом исследовании у цыплят в контрольной группе 1 толщина слизистого слоя трахеи составляла в среднем 80 мкм. У цыплят в группе 2 толщина слизистого слоя трахеи, благодаря лимфогистиоцитической инфильтрации, была статистически достоверно больше и составляла в среднем 177,1 мкм.

В то же время среднее значение толщины слизистого слоя трахеи у цыплят в группе статистически не отличалось от таковой в группе 1, а в группе 4 этот показатель был значительно выше (таблица 8).

У цыплят в группе 1 никаких патологических изменений при гистологическом исследовании не обнаруживалось. Выраженные клинические симптомы интерстициальной пневмонии, бронхита и перибронхита обнаруживались у птиц в группе 2 с общим баллом 29 и 25, соответственно. У 7 из 14 цыплят также наблюдалась катаральная пневмония с общим баллом 14. Значительно менее выраженные клинические симптомы бронхита, перибронхита и интерстициальной пневмонии наблюдались в группе 3 (общий балл 14 и 7, соответственно). Лишь у одного цыпленка из этой группы наблюдалась катаральная пневмония. В то же время у цыплят в группе 4 бронхит, перибронхит и интерстициальная пневмония развивались также, как и у цыплят в группе (таблица 8).

Таблица 8. Гистологичеcкое исследование тканей респираторного тракта цыплят в различных группах.

Легкиеa Трахея Бронхит Интерстициальная Катаральная Утолщение, Инфильтрация Перибронхит пневмония пневмония мкм Группа 1 0 0 0 80 Группа 2 29 25 14 177,1 б Группа 3 14 7 1 97,1 в Группа 4 25 23 12 133,6 a Общий балл б Различия статистически достоверны между группой 3 и группами 1,2,4;

P 0.01.

в Различия статистически недостоверны между группой 4 и группой 2.

Что касается реизоляции возбудителя, то, как видно из таблицы 9, M. gallisepticum была успешно выделена из органов респираторного тракта (трахея, легкие и воздушные мешки) цыплят группы 2 в 36-ти образцах из 42, а также в 18ти из 56 образцов внутренних органов (печень, селезенка, почки и сердце). В то же время, из органов респираторного тракта цыплят группы 3 M. gallisepticum выделялась в 30 случаях из 42, и только в 6 (!) из 56 образцов внутренних органов. Удивителен факт, что из печени, селезенки и сердца цыплят этой группы ни в одном случае M. gallisepticum не была выделена. Частота выделения M. gallisepticum из органов респираторного тракта и внутренних органов цыплят группы 4 была сходна с таковой у цыплят группы 2.

Что касается серологических исследований, то до экспериментального инфицирования у цыплят всех групп антитела к M.gallisepticum не обнаруживались в реакции микроагглютинации (SPA- тест) и ИФА. Через 9 дней после инфицирования антитела к M.gallisepticum обнаруживались у цыплят в группах 2, 3 и 4 с помощью SPA теста (таблица 10).

Заметим, что клинические, патоморфологические, гистологические и серологические показатели цыплят группы 4, которые были инфицированы M.gallisepticum и которым вводился только доксициклин, оказались сходны с таковыми у цыплят группы 2. Это означает, что выбранная нами концентрация индуктора – доксициклина (разовая доза доксициклина была в 7 раз меньше МИК для выбранного штамма M.gallisepticum) не влияет на развитие инфекционного процесса.

Таким образом, на первом этапе работы мы показали, что полученные рекомбинантные плазмидные конструкции, экспрессирующие ген мелиттина, эффективно подавляют развитие инфекции M.hominis и C.trachomatis в культуре клеток. Мы также успешно протестировали полученные конструкции на созданных нами моделях урогенитального микоплазмоза и хламидиоза у лабораторных мышей. Кроме того, мы продемонстрировали эффективную элиминацию естественного патогена птиц M.gallisepticum из инфицированных цыплят-бройлеров после аэрозольного введения данных плазмид.

Таблица 9. Реизоляция M.gallisepticum из органов респираторного тракта и внутренних органов.

Орган Группа 1 Группа 2 Группа 3 Группа 0/14 a Респираторный Трахея 14/14 14/14 14/ тракт Воздушные 0/14 12/14 10/14 14/ мешки Легкие 0/14 10/14 6/14 11/ б Общее 0 36 30 количество ре изоляций Внутренние Печень 0/14 4/14 0/14 3/ органы Селезенка 0/14 3/14 0/14 4/ Почки 0/14 8/14 6/14 7/ Сердце 0/14 3/14 0/14 3/ 6в Общее 0 18 количество ре изоляций a Количество цыплят, из которых была выделена M.gallisepticum относительно общего числа птиц.

б Различия статистически недостоверны между группой 2 и группами 3, 4.

в Различия статистически достоверны между группой 3 и группами 2 и 4, P 0.01.

Таблица 10. Серологическое исследование сыворотки крови цыплят, инфицированных M.gallisepticum, с использованием реакции микроагглютинации.

Группа 1 Группа 2 Группа 3 Группа а 24 часа до 0 0 0 инфицирования 33б 50в 9 дней после 0 инфицирования a Общий балл б Различия статистически достоверны между группой 3 и группами 1,2,4;

P 0.001.

в Различия статистически недостоверны между группой 4 и группой 2.

Основываясь на полученных результатах, можно сделать первое предположение, что одним из механизмов ингибирования микоплазменной и хламидийной инфекции при внутриклеточной экспрессии гена мелитина in vitro и in vivo является прямое бактерицидное действие. Однако, исходя из уникальных биологических свойств АМП, трудно представить, что механизм их действия ограничивается простым бактерицидным эффектом.

2.3. Исследование механизмов антибактериального действия АМП при экспрессии их генов в инфицированной клетке.

2.3.1. Изменение трансмембранного потенциала при экспрессии гена мелиттина.

Известно, что в мембранах мелиттин принимает a-спиральную конформацию, что подтверждается многочисленными исследованиями, выполненными на мембраномиметиках, таких как мицеллы, обратные мицеллы, липосомы. Молекулярные механизмы взаимодействия пептида с мембраной клетки достаточно хорошо изучены, однако, все исследования проводили с использованием химически синтезированных пептидов [Mahalka, 2009]. До настоящего исследования полностью отсутствовала информация о влиянии мелиттина на мембрану клетки при его эндогенной экспрессии.

В первую очередь мы изучили изменение трансмембранного потенциала клетки при экспрессии гена мелиттина. Для измерения трансмембранного потенциала клеток HeLa/Tet-Off после трансфекции плазмидным вектором pBI/mel2GFP, экспрессирующим ген мелитина, использовали потенциал-зависимый флуоресцентный зонд ДСМ [Kosnikov, 1991].

Измерение флуоресценции зонда проводили через 48 часов после трансфекции.

Как видно на рисунке 4, экспрессия гена мелитина в трансфицированной клетке приводит к уменьшению ее трансмембранного потенциала более чем в 2 раза. При деполяризации клеток (эквимолярная замена в инкубационном буфере ионов Na+ на ионы K+) также наблюдается разница между трансмебранными потенциалами трансфицированной и нетрансфицированной линиями клеток.

Относительные единицы флуоресценции Na+ - буфер K+ - буфер A B A B Рисунок 4. Изменение трансмембранного потенциала клеток HeLa/Tet-Off после трансфекции плазмидным вектором pBI/mel2GFP с использованием потенциал чувствительного зонда ДСМ:

A – нетрансфицированная линия клеток;

B – линия клеток, трансфицированная плазмидным вектором pBI/mel2GFP Na+ - буфер – раствор Хенкса K+ - буфер – раствор Хенкса, ионы Na+, замещены на ионы K+.

Несомненно, как было сказано выше, одним их механизмов действия мелиттина, приводящим к ингибированию инфекции M.hominis и C.trachomatis в культуре клеток, является его прямое цитотоксическое действие на эти бактерии. Вместе с тем, показано [Beven, 1997], что обработка микоплазм амфипатическими пептидами, такими как цекропин А, мелиттин, маганин 2 приводит к деполяризации их плазматических мембран, изменению морфологии и уменьшению подвижности. Основываясь на этих результатах, мы можем сделать второе предположение о возможном механизме действия мелиттина.

Экспрессия гена мелитина приводит к снижению трансмембранного потенциала трансфицированной клетки, что, в свою очередь, нарушает процесс адгезии микоплазм и хламидий к клетке и, таким образом, изменяет нормальный цикл их внутриклеточного развития [Razin, 1992].

2.3.2. Роль внутриклеточного восстановленого глутатиона в развитии инфекции Chlamydia trachomatis.

Несмотря на значительные успехи в изучении молекулярных основ внутриклеточного паразитизма хламидий, до сих пор остается до конца не выясненной начальная стадия инфекционного процесса, а именно, прикрепление и интернализация элементарного тельца в клетку.

Структурная жесткость ЭТ хламидий определяется чрезвычайно сшитой природой комплекса белков наружной мембраны. Меж- и внутримолекулярные цистеиновые мостики обнаруживаются в цистеин-богатых белках наружной оболочки ЭТ, таких как OmpA, OmcB, OmcA [Hatch, 1999]. Однако, восстановитель дисульфидных связей в наружной оболочке ЭТ в процессе его интернализации до сих пор остается неизвестным.

Мы предположили, что таким агентом в клетке может являться восстановленный глутатион (GSH). В эукариотических клетках концентрация глутатиона варьирует в пределах 0.1 – 10 мМ [Meister, 1983].

На первом этапе мы определили изменение уровня восстановленного глутатиона в клетке при экспрессии гена мелиттина.

Клетки линии HeLa трансфицировали плазмидным вектором pBI/mel2/rtTA, в ростовую среду был добавлен доксициклин (0,02 мкг/мл) и через 24 часа был измерен уровень глутатиона. В качестве контроля использовалась также трансфицированная линия клеток без добавления индуктора.

Как видно на рисунке 5, через 24 часа после трансфекции мы наблюдается достоверное (P0,05) снижение концентрации восстановленного глутатиона.

Поскольку мы наблюдаем снижение концентрации GSH в клетках, трансфицированных плазмидным вектором, экспрессирующим ген мелиттина, далее логично выяснить, как влияет изменение уровня GSH на развитие хламидийной инфекции.

Для модуляции уровня GSH в клетке мы использовали три различных подхода:

обработка клеток бутионин сульфоксимином (BSO), который является необратимым ингибитором -глутамилцистеин синтетазы, ключевого фермента в биосинтезе GSH, прямое окисление GSH перекисью водорода, а также культивирование клеток в присутствии N- ацетил-L-цистеина (NAC), который является предшественником GSH.

После обработки клеток BSO через 48 часов мы измеряли концентрацию GSH с помощью малеимидного реагента ThioGlo1. Концентрация BSO варьировала в пределах от 1 до 500 мкМ. На рисунке 6 представлена зависимость изменения уровня GSH от концентрации BSO.

GSH пмоль/мкг белка контроль Dox 0,02 мкг/мл Рисунок 5. Изменение концентрации внутриклеточного восстановленного глутатиона через 24 часа после трансфекции клеток линии HeLa плазмидным вектором pBI/mel2/rtTA.

GSH, пмоль/мкг белка Жизнеспособность (%) BSO (мкМ) 0 100 200 BSO (мкM) А. Б.

Рисунок 6. Изменение уровня GSH в линии клеток HeLa при различных концентрациях BSO и определение влияния BSO на жизнеспособность клеток HeLa.

A. Клетки были обработаны BSO в концентрации от 1 до 500 мкМ и инкубировались в течение 48 часов. Измерение GSH проводилось с помощью малеимидного реагента ThiоGlo 1.

Б. Определение цитотоксического эффекта различных концентраций BSO на клетки линии HeLa.

Поскольку BSO является необратимым ингибитором -глутамилцистеин синтетазы, мы оценивали жизнеспособность клеток после модуляции в них концентрации глутатиона. При концентрации BSO 250 мкМ количество живых клеток снижается на 4% по сравнению с контролем, а при концентрации BSO 500 мкМ – на 6%, причем статистически достоверных отличий в цитотоксическом эффекте BSO на клетки HeLa при его различных концентрациях не было выявлено (рисунок 6 Б).

Другой GSH – модулирующий агент, NAC (N-ацетил-L-цистеин) является тиолом, предшественником L-цистеина и восстановленного глутатиона, источником сульфгидрильных групп в клетке и «поглотителем» свободных радикалов. Мы оценивали изменение GSH в клетках линии HeLa при их инкубации в течение 48 часов с NAC (концентрация NAC составила 1 и 2 мМ). Интересно, что концентрация глутатиона, рассчитанная относительно количества внутриклеточного белка, при добавлении NAC в концентрации 1 мМ снижается по сравнению с контрольными клетками на 40%, а при концентрации 2 мМ – на 50%, причем статистически достоверных отличий в изменении уровня GSH при концентрации NAC 1 и 2 мМ не обнаружено. С другой стороны, при обработке клеток HeLa NAC мы наблюдаем почти двукратное увеличение концентрации суммарного клеточного белка. Таким образом, можно предположить, что длительное культивирование клеток в присутствии NAC приводит не столько к снижению уровня восстановленного глутатиона, сколько к активации белкового синтеза.

Исходя из предположения, что восстановленный глутатион играет важную роль в начальной стадии развития инфекционного процесса C.trachomatis, мы исследовали влияние уровня восстановленного GSH в клетке на развитие инфекции. Клетки линии HeLa были обработаны BSO (250 и 500 мкМ) или NAC ( 0.05 мМ - 10 мМ), инкубацию проводили в течение 48 часов. Перед инфицированием C.trachomatis, BSO или NAC были удалены путем трехкратной промывки монослоя клеток средой для культивирования.

По сравнению с контролем, после инкубации линии клеток HeLa с BSO в концентрации 250 мкM наблюдается шестикратное уменьшение инфекционности C.trachomatis, а при концентрации 500 мкM – тридцатикратное, причем, как видно из рисунка 7, общее количество клеток после инкубации c BSO достоверно не изменяется.

При инкубации клеток HeLa с NAC мы наблюдали увеличение инфекционности C.trachomatis в диапазоне концентраций NAC 1-5 mM. Необходимо заметить, что предварительная инкубация в течение 24-48 часов клеток HeLa с восстановленным глутатионом, который, в отличие от NAC, не может проникать через клеточную мембрану, не приводила к повышению инфекционности C.trachomatis.

На следующем этапе для модуляции уровня GSH мы использовали перекись водорода. Клетки HeLa инкубировались с перекисью водорода в концентрации 100, 200, 500 мкМ в интервале 0 - 4 часа.

На рисунке 8 представлена зависимость изменения уровня GSH от концентрации H2O2 и времени инкубации.

При концентрации H2O2 100 мкМ уровень GSH достоверно снижался через 2 часа после добавления перекиси водорода. При концентрации H2O2 200 и 500 мкМ достоверное снижение уровня GSH детектировалось уже через 1 час после обработки. Максимальное снижение уровня GSH наблюдалось при инкубации клеток с H2O2 в концентрации мкМ в течение 2 часов.

количество включений в поле зрения 0 250 500 0,1 1 BSO NAC (mM) Рисунок 7. Определение инфекционности C.trachomatis при заражении линии клеток HeLa, инкубированных с BSO и NAC.

100 мкM H2O 100 200 мкM H2O 500 мкM H2O жизнеспособность (%) GSH пмоль / мкг белка 0 100 200 0ч 1ч 2ч H2O2 (мкM) А. Б.

Рисунок 8. Изменение уровня GSH в линии клеток HeLa при различных концентрациях H2O2 и времени инкубации (А), определение влияния H2O2 на жизнеспособность клеток HeLa (Б).

После оценки влияния H2O2 на жизнеспособность клеток оказалось, что количество живых клеток составляло 94% при концентрации H2O2 500 мкМ и 99% в необработанных клетках.

Несмотря на то, что уровень GSH при обработке клеток H2O2 максимально снижался на 30% (при концентрации H2O2 500 мкМ и времени инкубации 2 ч) мы наблюдали значительное снижение инфекционности C.trachomatis. Как видно из таблицы 11, происходит двукратное снижение титра C.trachomatis при инкубации клеток с H2O2 в концентрации 100 мкМ в течение часа. При концентрации H2O2 200 мкМ и времени инкубации 30 мин наблюдается снижение инфекционности C.trachomatis на 60%, причем различия в титре хламидий при инкубации клеток с перекисью в концентрации 200 мкм час, 500 мкМ 30 мин и 500 мкМ 1 час были не достоверны.

Таблица 11. Определение инфекционности C.trachomatis при заражении линии клеток HeLa, обработанных H2O Концентрация H2O2 (мкМ), время инкубации 0, 0 100, 1 час 200, 30мин 200, 1 час 500, 30мин 500, 1 час Количество включений в поле 41.4 ± 4.0 23.0 ± 2.8 16.3 ± 2.1 12.1 ± 2.0 10.1 ± 1.4 10.4 ± 4. зрения, х Таким образом, исходя из предположения, что внутриклеточный глутатион является восстанавливающим агентом дисульфидных связей в белках наружной оболочки элементарного тельца хламидии на начальной фазе инфекции, мы использовали три различных подхода для изменения концентрации GSH в клетке: 1) обработку клеток BSO – ингибитором -глутамилцистеин синтетазы, основного фермента в биосинтезе глутатиона, 2) инкубацию клеток с перекисью водорода и 3) инкубацию клеток с N ацетил-L-цистеином, предшественником глутатиона. В первых двух случаях мы наблюдали достоверное ингибирование развития хламидийной инфекции.

Далее, предположив, что обработка клеток GSH-модулирующими агентами ведет к изменению белкового профиля, что, в свою очередь, влияет на течение инфекции C.trachomatis, мы провели дифференциальный двумерный электорофорез экстрагированных белков с последующей их масс-спектрометрической детекцией.

В клетках линии HeLa, инкубированных 48 часов с BSO, обнаружено дифференциально экспрессирующихся белков. При этом уровень экспрессии был увеличен у семи из них (таблица 12).

На наш взгляд, только один дифференциально экспрессирующийся белок в клетках, инкубированных с BSO, может влиять на развитие инфекции C.trachomatis. Это мембрано-связанный эффектор цитоскелета Cdc42, обладающий GTFазной активностью.

Таким образом, на основании протеомного анализа можно предположить, что снижение инфекционности C.trachomatis в клетках, инкубированных с BSO и H2O2, не связано с изменением белкового профиля, что подтверждает гипотезу о том, что внутриклеточный глутатион является основным восстановителем дисульфидных связей в наружной оболочке элементарного тельца хламидий и играет решающую роль в начальной стадии развития инфекции C.trachomatis.

Таблица 12. Дифференциально экспрессирующиеся белки в клетках линии HeLa после обработки BSO, NAC and H2O2, идентифицированные MALDI-TOF MS. Цветом выделены белки, уровень экспрессии которых в клетках, обработанных GSH- модулирующими агентами, снижается.

Инкубация с 200 мкМ BSO, 48 часов normalized spot volume Mascot GI Наименование белка Символ M.w.(Da)/pI Отношение score + BSO контроль 1633054 Chain A, Cyclophilin A 2, Complexed With PPIA 17870 / 7,82 145 655 Dipeptide Gly-Pro 5542168 Chain A, Cdc42ACK GTPASE-Binding CDC42 20403 / 5,48 121 644,3 272,8 2, Domain Complex 4503513 Eukaryotic translation 36479 / 5, initiation factor 3, subunit EIF3B 169 240,8 100 2, 2 beta 55663125 SET translocation (myeloid leukemia- SET 31114 / 4,09 79 1519,1 583,1 2, associated) oncogene 4503729 FK506-binding protein 4 FKBP4 51772 / 5,35 164 385,3 125,5 2, 6841456 HSPC117 C22orf28 55175 / 6,61 125 143,1 447,8 0, 4501867 aconitase 2 precursor acnB 85372 / 7,36 138 182 377,1 0, 5032087 splicing factor 3a, subunit SF3A1 88831 / 5,15 161 2536,8 1133,2 2, 184433 histone-binding protein RBBP4 85139 / 4,27 131 1067,9 473,7 2, Инкубация с 1мМ NAC, 48 часов Hist1h2b 81866317 Histone H2B type 1-P 13984 / 10,31 144 3428.0 1463.6 2, p 5031851 stathmin 1 STMN1 17292 / 5,76 148 1537.7 734.9 2, 4506671 ribosomal protein P2 RPLP2 11658 / 4,42 79 1309.6 646.2 2, chloride intracellular 14251209 CLIC1 26906 / 5,09 110 376.5 151.8 2, channel 825671 B23 nucleophosmin NPM1 30919 / 4,71 101 645.4 1730.0 0, 189306 nucleolin NCL 76298 / 4,59 145 874.2 1885.0 0, 21626466 matrin 3 MATR3 94565 / 5,87 247 1491.4 534.4 2, nuclear autoantigenic 27262628 NASP 85186 / 4,26 102 769.3 351.9 2, sperm protein isoform Инкубация с 200 мкМ H2O2, 2 часа nuclear autoantigenic 27262630 NASP 48775 / 4,35 72 230,1 52,8 4, sperm protein isoform 4758638 peroxiredoxin 6 PRDX6 25019 / 6,0 163 188,4 480,7 0, 5-aminoimidazole-4 carboxamide 20127454 ribonucleotide ATIC 64575 / 6,27 112 185,1 617,7 0, formyltransferase/IMP cyclohydrolase heat shock 70kDa protein 38327039 HSPA4 94271 / 5,11 215 108,7 233,7 0, 40788339 matrin-3 MATR3 94565 / 5,87 175 270,3 643,4 0, eukaryotic translation 4503483 EEF2 95277 / 6,41 119 129,2 377,1 0, elongation factor 2.3.3. Транскриптомный и протеомный анализ клеток, экспрессирующих ген мелиттина.

Исходя из того факта, что экспрессия антимикробного пептида мелиттина ингибирует микоплазменную и хламидийную инфекции как в культуре клеток, так и на моделях лабораторных животных, для выяснения механизмов ингибирования мы провели дифференциальный двумерный электорофорез экстрагированных белков из клеток линии HEK 293 с последующей их идентификацией времяпролетной масс-спектрометрией.

Клетки линии HEK 293 трансфицировали плазмидным вектором pBI/mel2/rtTA, в ростовую среду был добавлен доксициклин (0,02 мкг/мл). Время после трансфекции составило 24 часа. В качестве контроля использовалась также трансфицированная линия клеток без добавления индуктора.

В клетках линии HEK 293, трансфицированных плазмидным вектором pBI/mel2/rtTA, обнаружено 17 дифференциально экспрессирующихся белков (рисунок 9).

При этом уровень экспрессии увеличен у восьми белков (таблица 13).

Рисунок 9. Дифференциальный протеомный анализ клеток линии HEK 293, трансфицированных плазмидным вектором pBI/mel2/rtTA.

Экстрагированные белки из контрольных клеток (трансфекция в отсутствие доксициклина) были окрашены флуоресцентным красителем Cy (зеленая флуоресценция). Время после трансфекции составило часа. Белки, выделенные из трансфицированной линии клеток в присутствии доксициклина (0,02 мкг/мл), окрашены флуоресцентным красителем Cy5 (красная флуоресценция).

Во-первых, обращает на себя внимание повышение количества белка, играющего одну из ключевых ролей в организации цитоскелета клетки – статмина. Этот белок вовлечен в регуляцию организации микротрубочек – предотвращает сборку и потенцирует дестабилизацию микротрубочек [Rubin, 2004]. Нарушение нормального процесса динамической реорганизации сети микротрубочек приводит к значительным изменениям процессов мембранного трафика в клетке [Hamm-Alvarez, 1994].

Таблица 13. Дифференциально экспрессирующиеся белки в клетках линии HEK 293, трансфицированных плазмидным вектором pBI/mel2/rtTA, идентифицированные MALDI TOF MS. Цветом выделены белки, уровень экспрессии которых в трансфицированных клетках снижается.