Биологическое разнообразие видов рода trichoderma (fungi, ascomycetes, hypocreales) и их роль в функционировании микробиоты и защите растений в агроценозах различных почвенно - климатических зон на те
На правах рукописи
АЛИМОВА ФАРИДА КАШИФОВНА «Биологическое разнообразие видов рода Trichoderma (Fungi, Ascomycetes, Hypocreales) и их роль в функционировании микробиоты и защите растений в агроценозах различных почвенно - климатических зон на территории Республики Татарстан» 03.00.07 - микробиология 06.01.11 - защита растений
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
КАЗАНЬ 2006 2
Работа выполнена на кафедрах микробиологии и биохимии Казанского государственного университета
Научный консультант: доктор сельскохозяйственных наук, профессор А.Х. Яппаров
Официальные оппоненты: доктор биологических наук Умаров М.М.
доктор биологических наук Госманов Р.Г.
доктор биологических наук Джалилов Ф.С.
Ведущая организация: Институт экологии и генетики микроорганизмов Уро РАН, г.Пермь
Защита состоится 22 июня 2006 г. в 1300 часов на заседании диссертационного Совета Д 212.081.085. в Казанском государственном университете по адресу: 420008, г.Казань, ул. Кремлевская, д.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского государственного университета Автореферат разослан «_22_» _мая_2006 г.
Ученый секретарь Диссертационного Совета доктор биологических наук З.И.Абрамова Актуальность работы. В современных условиях ведения земледелия особую актуальность приобретают две проблемы. Это постоянно растущие затраты на производственную продукцию, вызванные применением традиционных многооперационных технологий возделывания сельскохозяйственных культур, постоянным и значительным повышением цен на энергоносители, сельскохозяйственную технику, минеральные удобрения, средства защиты растений и другие виды промышленной продукции. Вторая проблема связана с потерей плодородных почвенных ресурсов, снижением видового разнообразия микроорганизмов и ухудшением экологической и фитосанитарной обстановки окружающей среды. В настоящее время идет быстрое и повсеместное сокращение площадей с естественной растительностью. В то же время известно, что только природные комплексы с условно коренной растительностью способны поддерживать состояние среды на приемлемом для жизни уровне.
В связи с этим особый интерес при экологических исследованиях представляют ненарушенные леса, расположенные на территории заповедников, которые могут служить эталоном природных ландшафтов со всем видовым разнообразием, населяющих их организмов, а также почвы не затронутые.
Территория Республики Татарстан, в настоящее время имеет около 19% территории, покрытой сильно нарушенными лесными природными системами. Исключение составляют отдельные хорошо сохранившиеся хвойные участки леса Раифского лесничества Волжско-Камского заповедника Национального парка «Нижняя Кама». Лесопитомники, используемые для восстановления лесов, характеризуются резким ухудшением агрохимических характеристик. В результате этого, почти пятая часть всходов и сеянцев ежегодно погибает от болезней, а в отдельные годы отмечалась даже стопроцентная гибель сеянцев.
Современные технологии обеспечивают последовательную замену энергоемких минеральных удобрений и пестицидов биопрепаратами нового поколения, разработанными отечественными микробиологами, и препаратами, производимыми отечественными биологическими фабриками.
В современных процессах используется микробиологический мониторинг почвенных угодий с целью своевременной оценки ухудшения экологической ситуации, безопасных технологий для сельскохозяйственной промышленности.
Одним из наиболее перспективных видов микроорганизмов для внедрения ресурсосберегающих технологий в сельское хозяйство являются грибы рода Trichoderma, которые представляют собой наиболее изучаемые грибы в настоящее время. Представителей рода Trichoderma можно найти практически во всех почвах. Их считают, по крайней мере, частично ответственными за эффект биологического контроля фитопатогенов в супрессивных почвах, на которых зерновые и деревья не подвергаются действию патогенов и микотоксинов, выделяющихся в окружающую среду.
Возможно, что Trichoderma - это единственный род грибов, для которого каждый вид представлен в GeneBank NCBI, по крайней мере, одним геном, и многие виды представлены последовательностью двух или более генов. В целом, в Банке генов хранится информация о 427 видах Hypocrea (телеоморф) и о 110 видах Trichoderma. Согласно последним данным, более 40% видов, представленных в GeneBank NCBI, (44 названия) являются синонимами или идентифицированы неверно.
Причиной возрастающего интереса к Trichoderma является большая практическая и экологическая значимость рода. Виды Trichoderma являются продуцентами ферментов (целлюлаз, хитиназ, пектиназ, ксиланаз, серинзависимых протеиназ и др.), используемых в целлюлозно-бумажной и пищевой промышленностях, в производстве моющих средств, в получении спирта, преобразовании отходов, содержащих целлюлозу и глюкозу, для получения кормовых добавок и в текстильной промышленности. На основе антибиотиков, токсинов и ферментов грибов этого рода получают препараты для биологического контроля болезней и стимуляции роста растений и получения трансгенных растений. Trichoderma также используется для биологической очистки почвы и для получения биокомпостов.
В рамках данного вопроса исследования биоразнообразия определяются как зондирование перспективности использования определенных природных источников с коммерческой целью. Именно такой подход определил разработку международной «Конвенции по биологическому разнообразию» в качестве законодательства по использованию ценных генетических ресурсов.
В настоящее время перед микологами, изучающими Trichoderma, стоит ряд вопросов: по систематическому положению вида, адекватным методам идентификации, по построению естественного филогенетического древа, географической распространенности, разнообразию и выявлению способности к антагонистической активности к фитопатогенам среди всех видов данного рода, по наличию в природе новых видов, в том числе промышленно значимых.
В связи с вышесказанным представляет большой практический интерес анализ распространенности и сохранения видового разнообразия грибов рода Trichoderma на территории Республики Татарстан и их роли в биогеоценозе и антропогенных ландшафтах, а также возможности использования в сельскохозяйственной промышленности.
Целью настоящего исследования явилась оценка биоразнообразия, динамики численности и характеристик структуры популяций Trichoderma в современных почвенных и антропогенных ландшафтах, в эталонных зонах (погребенных и заповедных) на территории РТ, а также выявление основных закономерностей изменения микробиологической активности агроценозов под влиянием антропогенных факторов и роль в этих процессах интродукции штаммов Trichoderma.
Задачи исследования 1. Исследование распространения грибов рода Trichoderma и идентификация аборигенных штаммов Trichoderma, выделенных на территории Республики Татарстан с использованием морфологических, кинетических и молекулярно-генетических методов.
2. Исследование стратегии жизни, внутривидовой и популяционной гетерогенности местных штаммов Trichoderma, выделенных из различных почвенно-климатических зон Республики Татарстан.
3. Исследование биохимических свойств штаммов видов Trichoderma: фитотоксичности культуральных жидкостей и некоторых ферментов гидролазного комплекса.
4. Оценка степени влияния различных экологических параметров на выживаемость штаммов Trichoderma.
5. Изучение взаимоотношения штаммов Trichoderma с растениями, фитопатогенными и сапротрофными почвенными микроорганизмами.
6. Отбор стабильных штаммов – продуцентов биопрепаратов по культурально – морфологическим признакам, антибиотической активности, вегетативной совместимости, устойчивости к фунгицидам, взаимодействию с регуляторами роста и бактериями.
7. Оценка биологической активности различных почвенно климатических зон Республики Татарстан по данным микробиологического мониторинга. Изучение влияния антропогенных факторов и биоудобрений с активными штаммами Trichoderma на микробиологическую активность почв Республики Татарстан.
8. Разработка способов применения местных штаммов Trichoderma в промышленности Республики Татарстан с целью получения кормовых добавок (ксиланазы Trichoderma) для животноводства, переработки растительных, животноводческих, а также городских отходов с целью получения биоудобрений, и для получения биопрепаратов для защиты растений от фитопатогенных микроорганизмов.
Научная новизна. Впервые определен видовой состав и географическое распространение грибов рода Trichoderma на территории РТ.
Выделены типичные и случайные виды Trichoderma в современных, погребенных и затопляемых почвах. По данным молекулярно-генетического анализа выделены новые виды Trichoderma из погребенных почв и могильников на территории РТ. Установлена гетерогенность природных популяций Trichoderma и их структура. В области биотехнологии и защиты растений данное исследование дает исходный материал для инвентаризации ресурсов микромицетного населения по данным одного рода Trichoderma и теоретического обоснования методов направленного поиска и выделения промышленно важных микроорганизмов (например, из погребенных почв выделены виды перспективные для получения биофунгицидов, биогербицидов и продуцентов ксиланаз). Установлены механизмы регуляции численности интродуцированных изолятов Trichoderma в микрокосмах, защищенных грунтах, в полевых условиях и прикорневой зоне растений.
Показана принципиальная возможность управления численностью микробных популяций, моделирования отдельных стадий сукцессии.
Полученные при этом результаты могут способствовать решению вопросов, связанных с организацией контроля применения биофунгицидов и биоудобрений. Впервые изучена эколого-биологическая значимость видов рода Trichoderma в почвенной биоте. Выявлена роль Trichoderma в регуляции супрессивности почв на территории Республики Татарстан. Описана структура популяций Trichoderma при взаимоотношении с растениями.
Установлено, что доля фитотоксических видов зависит от типа стадии сукцессии и типа экологической ниши. Описан комплекс видов фитопатогенных микромицетов, вызывающих поражение сеянцев хвойных, овощных и зерновых культур. Впервые выявлены местные изоляты Trichoderma с высокой антагонистической активностью в отношении почво обитающих патогенных микромицетов и семенных инфекций. Разработаны оптимальные условия культивирования активных штаммов в различных биотехнологических системах и получен биопрепарат новой формы на основе микромицетно – бактериального сообщества с использованием природных регуляторов и промышленных и сельскохозяйственных отходов.
Впервые показана целесообразность использования биопестицида на основе Trichoderma в ограничении численности возбудителей инфекционных заболеваний яровых и озимых зерновых культур, а также и сеянцев сосны на территории Республики Татарстан. Впервые с позиций системного подхода исследован широкий спектр разнонаправленных микробиологических и биохимических параметров различных природных - климатических зон на территории Республики Татарстан. Показано, что введение в агроэкосистему определенных видов и различных сочетаний удобрений, известкования и сочетания удобрений с известкованием, а также биоудобрений оказывает положительное фитотерапевтическое действие на растения и влияет на уровень супрессивности и плодородие почв. Установлены закономерности биосинтеза ксиланаз у представителей родов Trichodermа. Впервые проведено исследование влияния рН и температуры, соответствующих параметрам желудка моногастричных сельскохозяйственных животных, а также воздействия гидротермической обработки на активность ксиланаз, синтезированных представителями рода Trichoderma.
Основные защищаемые положения:
1. Запасы жизнеспособных пропагул Trichoderma изменяются в зависимости от расположения в почвенном профиле, от затопляемости почв, антропогенной нагрузки.
2. Распространение, морфологические, молекулярно-генетические, кинетические характеристики и экологические стратегии штаммов рода Trichoderma зависят от типа экологических ниш и почв.
3. Смена популяций штаммов Trichoderma с различной стратегией жизни зависит от стадий сукцессии экологической ниши.
4. Микробиологическая активность, биотический потенциал фитопатогенных грибов в агроценозах изменяются в широком диапазоне в зависимости от типа почвы, биологической активности, окультуренности, внесения удобрений, мелиорантов и фитосанитарного состояния культур в севообороте.
5. Минеральные, органические удобрения и известкование почвы оказывают разнонаправленное действие на биологическую активность и супрессивность агроценозов.
6. Отдельные изоляты рода Trichoderma могут использоваться для восстановления плодородия почв в виде биокомпостов на основе осадков сточных вод крупного промышленного города, отходов пищевых предприятий и сельскохозяйственных производств, а также для получения биопестицидов, биогербицидов для защиты растений от заболеваний, с целью восстановления супрессивности и регуляции биологической активности почв.
7. Стабильность культурально – морфологических признаков Trichoderma является критерием отбора антагонистов.
Практическая значимость работы. В области биотехнологии и защиты растений данное исследование дает исходный материал для инвентаризации ресурсов микромицетного населения по данным одного рода Trichoderma, теоретического обоснования методов направленного поиска и выделения промышленно важных микроорганизмов. Например, из погребенных почв выделены виды, перспективные для получения биофунгицидов, биогербицидов и продуцентов ксиланаз. Установлены механизмы регуляции численности интродуцированных изолятов Trichoderma в микрокосмах, защищенных грунтах, в полевых условиях и прикорневой зоне растений. Показана принципиальная возможность управления численностью микробных популяций, моделирования отдельных стадий сукцессии. Полученные при этом результаты могут способствовать решению вопросов, связанных с организацией контроля и применения биофунгицидов и биоудобрений. Предложен комплекс методов для проведения микробиологического мониторинга, адекватно отражающего состояние биоты и позволяющего прогнозировать возможные эпифитотии.
Предложены способы получения биокомпостов на основе осадков сточных вод, отходов пищевых и сельскохозяйственных производств с использованием штаммов Trichoderma с высокой гидролазной, фунгицидной и гербицидной активностями с целью внедрения препаратов в практику лесного и сельского хозяйств Республики Татарстан для восстановления плодородия и супрессивности почв. Разработана технология получения биопестицида на основе отходов пищевых предприятий, которая была внедрена в практику производства биопрепаратов на базе биозавода на территории совхоза «Казанский тепличный». Показана возможность использования гидролазного комплекса Trichoderma для переработки отходов спиртовой промышленности в РТ. Разработаны методики снижения антипитательного действия пентозанов при помощи ксиланаз Trichoderma, что позволило правильно подбирать дозировки препаратов ксиланаз в зерновые рационы, содержащие пентозаны. Результаты исследований используются для подготовки лекций на биолого - почвенном факультете КГУ по курсам «Биология почв», «Сельскохозяйственная микробиология», «Экология микроорганизмов», «Микология», «Почвенная микробиология».
Монография «Микробная биотехнология» Изд-во Казань УНИПРЕСС 2006г.
рекомендована для обучения студентов и аспирантов биолого – почвенного факультета КГУ.
Апробация работы. Материалы работы докладывались и обсуждались на Всесоюзн. Конф. «Микроорганизмы стимуляторы и ингибиторы роста растений и животных». - Ташкент. – 1989, Всесоюзн. Совещ.: Нуклеазы микроорганизмов и их практическое применение // Рига. – 1989, Всесоюзн.
Конф.: Методы получения, анализа и применения ферментов. - Рига. - 1990. -, 5 Междунар. Симп. Молодых Ученых. - Болгария, Варна. - 1990., Научн.
Конфер. // Днепропетровск. - 1991., Всесоюз. Симпозиуме: Микробиология охраны биосферы в регионах Урала и Сев. Прикаспия. - Оренбург. – 1991, Всесоюзной Конфер. «Экологические проблемы фармакологии и токсикологии». - Москва. – 1991, Раб. Совещ.: Регуляторы роста и развития растений. - Москва. – 1991,.5-ой Всероссийск. Конфер.: Новые направления в биотехнологии. - Пущино. – 1990, Всесоюз. Конфер.: Ферменты микроорганизмов. - Казань. – 1991, Всесоюзн. Конфер.: Микроорганизмы в сельском хозяйстве. - Пущино. - 1992., Научн. Конфер.: Эволюция почв и почвенного покрова в связи с изменением природной среды // Пущино. – 1992, 6-ой Всероссийской Конфер.: Новые направления биотехнологии. Пущино. – 1994, Конф.: Физиология и биохимия мицелиальных грибов в связи с проблемами биотехнологии. - М. - 1994., Конфер.: Генетика народному хозяйству. - Москва. – 1994, Всесоюзная конфер.: Интродукция микроорганизмов в окружающую среду. - М. – 1994, Forum for applied biotechnology. - Brugge. – 1995, Advanced Biotechnologies and Agriculture. Ferrary-Itali. – 1995, 7th international symposium. - Santos-Brazil. – 1995, III Международн. Конфер.: Регуляторы роста и развития растений. - М. – 1995, Intern. Co-Conf. On ICEP95-ICONE95. - St.Peterburg, Russia. - 1995, Материалы 3-й международной коференции по химии нефти. - Томск. – 1997, 3-й Республ. Научн. Конфер.: Актуальные экологические проблемы районов Татарстана. - Казань. – 1997, 3-й Научно-практич. Конфер.: Достижения и перспективы развития селекции семеноводства сельскохозяйственных культур. - Пенза. – 1999, Всероссийской Научной Конфер.: Экологические проблемы и пути их решения в зоне Среднего Поволжья. - Саранск. – 1999, 9 th International Congress of Mycology. - Sydney. – 1999, YI-th International Simposium: In suti and onside biorenudiation. - San-Diego, California. – 1999, Междунар. Научн. Конфер. Изучение и охрана биологического разнообразия ландшафтов русской равнины:
- Пенза. – 1999, X-th International Soil Conservation Organisation Conferens. – 1999, Научной конфер.:
Новочеркасск. – 2000, Всероссийской научно-практич. Конфер.: Актуальные вопросы мониторинга экосистем антропогенно-нарушенных территорий. Ульяновск. – 2000, Всероссийской конференции «сельскохозяйственная микробиология в 19-21 веках» 14-19 июня 2001г, 1-ом Съезде микологов России «Современная микология в России» М., 2002, Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана. 7-ая международная конференция Санкт- Петербург 15-18 сент 2003, «8-ой, 9-ой Пущинской школах-конференциях молодых ученых. Биология - наука XXI века. 17- мая 2004, 2005,2006». Пущино, 7-ой международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана»,Санкт Петербург – Репино, 15-18 сентября 2003г.,Научно- практическая конференции «Биотехнологии - на поля Татарстана». ОАО "Казанская ярмарка", Казань-2004, Международной научной конференции авг. 25 – сент.
5, 2003, 13-ая международная конференция «Ферменты микроорганизмов:
структура, функция, применение». Казань: КГУ, 2005, Международной научно- практической конференции «Перспективы и проблемы развития битехнологии в рамках единого экологического пространства стран содружества» 25-28мая, 2005, Минск-Нарочь, Республика Белорусь, Научной конференции «Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии», Казань, 17-18 июня 2004, Втором съезде Общества биотехнологов: Москва, 13-15 октября 2004, Межд. научно-практ. конф. по развитию сотрудничества между Республикой Татарстан и Германией в рамках Президентской программы "Дни Германии в Татарстане и перспективы развития экологического сельского хозяйства и природопользования в Республике Татарстан". 5-6 ноября 2004, Международном симпозиуме «Научные основы обеспечения защиты животных от экотоксикантов, радионуклеидов и возбудителей опасных инфекционных заболеваний» 28 - 29 ноября, 2005, XX Congreso Nacional Microbiologa Cceres, Espaa. 19 – 22 septiembre Ponencias y Comunicaciones “Universidad de Extremadura” Sociedad Espaola de Microbiologa, Symposium of Biology Students in Europe" Finland University of Helsinki Department of Biology July 29th to August 7th 2005, Межд. Конф «Грибы и водоросли в биогеоценозах- Москва МГУ., 31янв. - февраля 2006, 9th International Workshop on Trichoderma and Gliocladium.
Vienna, Aistria, 5-8 Аpril 2006.
Публикации. По теме диссертации в отечественной и зарубежной печати опубликовано 90 научных работ, в том числе 1 коллективная и авторские монографии, 68 научных статей, 15 учебных пособий и методических руководств. Получено 4 патента.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на стр.
компьютерного текста, состоит из введения, 4 глав, включающих разделов, обсуждения, выводов, списка цитируемой литературы, включающей 235 наименований (из них 159 на иностранных языках) и приложения. Работа содержит 20 таблиц, иллюстрирована 28 рисунками и фотографиями.
Личный вклад автора. Основная работа по получению экспериментального материала, обобщению результатов и формулированию выводов выполнена лично автором. В выделении отдельных изолятов из тепличного грунта совхоза «Майский», фитоэкспертизе семян зерновых, испытаниях в тепличных грунтах принимали участие доцент кафедры микробиологии Захарова Н.Г. и старший инженер кафедры микробиологии Мочалова Н.К. В организации полевых исследований на базе ТатНИИСХ и ГУ «Татарский НИИ агрохимии и почвоведения РАСХН», принимали участие д.с.х. наук Шакиров Р.С., д.с.х.н. Яппаров А.Х., зав. лаб. к.с.х.н.
Ломако Е.И. Молекулярно-генетические исследования проводились при активной помощи доц. кафедры биохимии Аскаровой А.Н. и сотрудника Института химической инженерии в Вене д.б.н. Дружининой И.А., хроматографические исследования по азотфиксации и респираторной активности почв проводилось с помощью вед.н.с Гарусова А.В., консультации по методам анализа видов Trichoderma и гетерогенности популяций получены на кафедре микологии и альгологии МГУ у зав.каф.
д.б.н. Дьякова Ю.Т., д.б.н. Лихачева А.В., к.б.н. Александровой А.В., микрофотосъемки конидий были сделаны с помощью д.б.н. Камзолкиной О.В., консультации по методам микологического анализа антропогенных ландшафтов были получены у д.б.н. поф. Марфениной О.Е., участие микроорганизмов в силосовании кормов исследовалось при участии к.б.н.
Вершининой В.И., полевые испытания биоудобрений на основе компостов на основе отходов очистных сооружений г. Казани и Trichoderma для применения под сеянцы сосны проводили на базе лесопитомника Матюшинский при участии д.с.х..н. проф.Ведерникова Н.М., д.б.н., проф.
Селивановской С.Ю., пробы из зон контакта площадей питания Pinus sylvectris L. Раифского заповедника получены от нач. отдела Росприроднадзора России к.б.н. Морозкина А.И., к.б.н.Каримуллиной С.Н., почвенные образцы из древних поселений получены с помощью доц. каф.
почвоведения и агрохимии КГУ Мельникова Л.В., образцы черепов из древних захоронений и описания к ним получены с помощью сотрудников ин-та истории им. Марджани АНРТ Газимзянова И.Р.,Чижевского А.А., к.б.н., конструирование праймеров и программные модели для морфологической и молекулярно – генетической идентификации Trichoderma сделаны при участии преп. каф. биохимии к.б.н. Акберовой Н.И. и аспиранта каф. генетики Тарасова Д.С.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Глава 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Идентификация и филогения грибов – второй по численности видов группы организмов после насекомых – представляет неразрешенную проблему. Причиной такого положения является относительная бедность таксономических (морфофизиологических) признаков и их значительная внутривидовая изменчивость. Грибы, благодаря особенностям их жизненных циклов, и чередованию полового и бесполого способов размножения с частым превалированием последнего, представляют собой быстро эволюционирующую группу организмов. Поэтому большая их часть, по видимому, представляет не обособленные «значимые» виды, а дивергентные видовые комплексы, идентификация которых в принципе затруднена из-за сложности вычленения таксономически достоверных признаков. Кроме того, как показали молекулярно-генетические исследования последних лет, видовое разнообразие грибов и других микроорганизмов гораздо богаче, чем было принято считать.
Доминирование грибов Trichoderma в микробоценозах связано с реализацией в экосистемах различных типов гетеротрофного и биотрофного взаимодействий с микробиотой и макробиотой (путем паразитизма и даже оппортунистического эндофитизма, и способностью разрушать органический материал и сохранение супрессивности почв). Использование видов Trichoderma в сельском хозяйстве для защиты растений от болезней и вредителей - началось в 1980 – х годах. Однако в результате неточной идентификации отдельных видов исследователи на практике столкнулись с некоторыми проблемами. Так, в 1980 – х годах была впервые отмечена эпидемия шампиньонов («зеленая плесень»), вызванная видом Trichoderma, идентичным по морфологическим признакам Trichoderma harzianum, который широко использовался в защите растений. Наблюдаемое явление могло вызвать дискредитацию вида Trichoderma, как перспективного антагониста фитопатогенов для сельского хозяйства. В результате микологи вынуждены были вновь пересмотреть систему описаний рода Trichoderma.
Благодаря использованию молекулярно-генетических методов был обнаружен новый вид, морфологически сходный с Trichoderma harzianum, идентифицированный как возбудитель «зеленой плесени» шампиньонов T.aggressivum. Известно, что Банк NCBI Taxonomy содержит названия всех организмов, для которых установлен и помещен в генетические базы данных хотя бы сиквенс гена одного белка.
С момента первого описания этого рода в 1794 г по 1969 г было дано морфологическое описание 8 агрегатов рода Trichoderma, за последующие лет (к 1991 г) число описанных видов возросло до 27. В эру молекулярно генетического анализа наблюдается критический пересмотр старой систематики Trichoderma, основанной на морфологических критериях. С помощью различных молекулярно-генетических методов, таких как неспецифичный ПЦР анализ с использованием праймеров к рибосомным ITS 1 и 2 сиквенсам, были идентифицированы ранее не определенные виды и были построены новые филогенетические древа. В результате количество видов Trichoderma к 2002 г возросло до 46. Мультигенный филогенетический анализ позволили выявить 88 видов Trichoderma к 2005 г. С помощью компьютерной программы Barcode к началу 2006 г. определено 110 видов.
Предполагается, что в ближайшие годы количество видов Trichoderma может достигнуть 130 и более. В настоящее время исследования рода Trichoderma идут параллельно по 3 направлениям: (а) биоразнообразие и распространение в различных регионах биосферы, (б) скрининг видов, перспективных для биотехнологии из новых выделенных и описанных изолятов Trichoderma, и (в) разработка методологии быстрой и правильной идентификации и построения филогенетического древа рода Trichodema /Hypocrea.
Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Образцы почвы (табл. 1) отобраны в соответствии с правилами отбора проб для микробиологического анализа (Методы …, 1991).
Выделение Trichoderma из образцов почвы проводили методом серийных разведений с последующим высевом на среду с пароморфогенным веществом (Бенкен, Хацкевич, 1972). Данный метод позволяет провести количественный учет выросших колоний грибов, так как пароморфогенное вещество не дает им разрастись по всей чашке.
Моноспоровые культуры грибов получали методом разведения конидиальной суспензии в различных модификациях (Васин, 1966;
Кузнецов и др., 1968), а также использовали предложенный Лихачевым метод выделения моноспоровых культур на жидких питательных средах с добавлением глицерина до получения ими определенной вязкости (Лихачев, 1994).
Таблица Объекты исследования объект район тип почвы зоны анализа глубина, см 1 Раифский Зеленодольский серая лесная Коп заповедник К 0- К К 2 Больше- Камско- чернозем А1 10- Кляринское Устьинский выщелоченн [ЕА1] 122- городище ый [А1] 134- А1 0- А11 52- А12 77- 3 Мурзихинский II Алексеевский чернозем раскоп 196, могильник выщелоченн череп № ый раскоп 162, череп № 4 лесопосадки/агр Высокогорский серая лесная оценозы серая лесная подстилка/ Лаишевский [А1] 0- Сабинский серая лесная Агрызский дерново подзолистая Тюлячинский чернозем Буинский чернозем 5 теплицы Казань, тепличные - Зеленодольск грунты 6 нефтезагрязненн Альметьевский чернозем [А1] 0- ые почвы, нефтешлам Обозначения: Коп – территория, свободная от площадей питания;
К1, К2, К3 - зоны перекрытия площади питания растений, могли быть однократного, двукратного и т.д. контакта.
Морфолого-культуральные свойства изучали на минеральной среде (Samuel, 1989), картофельно-глюкозном агаре (PDA), среде Чапека-Докса с низким содержанием сахарозы, специальном питательном агаре (SNA) (по Samuels et al., 1998). Для выращивания использовали как твёрдые (агаризованные), так и жидкие среды.
Идентификация по морфологическим признакам проводилась по ключу Александровой (Александрова с соавт., 2001), Samuels (2003) и Chaverri (Chaverri et al., 2003).
Идентификация по кинетическим признакам проводилась по ключу Chaverri (2004).
Размеры объектов замеряли с помощью окуляр–микрометра, так же с помощью программы Paint.
Определение цвета колонии, что необходимо для описания изолятов проводили двумя способами. С помощью шкалы Бондарцева (1959) и с помощью модели RGB. Модель RGB описывает излучаемые цвета и основана на трех базовых цветах - Red (Красный), Green (Зеленый), Blue (Синий). Остальные цвета образуются при смешивании этих трех основных.
Вегетативную совместимость моноспоровых клонов изучали сращиванием от двух до восьми колоний на чашках Петри на среде картофельно-глюкозный агар, с последующим визуальным наблюдением за поведением колонии и микроскопированием пограничной зоны между колониями, что позволило наблюдать за анастомозами и оценить относительную частоту их образования. Характер проявления реакций при визуальной оценке и микроскопировании сравнивали с описаниями, приведенными у Дьякова и Долговой (1995).
Антагонистическую активность и конкурентоспособность изолятов Trichoderma определяли методом встречных культур на среде Чапека, КГА (Семонян и Мамиконян, 1982).
Гетерогенность популяций выделенных изолятов оценивали по их разделению на культурально-морфологические типы (КМТ) и появлению секторов при росте на чашках Петри (Дьяков, 1998).
Определение ксиланазной, протеазной и целлюлазной активностей изолятов Trichoderma проводили по Konig (2002).
Активность азотфиксация в почве измеряли «ацетиленовым» методом (Методы…, 1991;
Гарусов А. В., 1998).
Определение активности почвенного дыхания осуществляли на газовом хроматографе (Ананьева Н. Д. и др., 1997;
Гарусов А. В., 1998).
Дегидрогеназную активность почвы определяли методом Ленарда в модификации Колешко (Колешко, 1981).
Для определения уреазной активности почвы использовали метод Галстяна (Галстян, 1974).
Определение интенсивности разложения целлюлозы в почве определяли методом Звягинцева (Методы …, 1991).
Протеолитическую активность почвы определяли методом Галстяна и Арутюняна (Колешко, 1981).
Определение каталазной активности почвы определяли методом Звягинцева (Методы …, 1991).
Измерение углерода микробной биомассы проводили экстракционно фумигационным методом (ISO 14240-2, 1997).
Определение численности микроорганизмов в почве проводили методом прямого счета в люминесцентном микроскопе по Звягинцеву и Кожевину (Головченко и др., 1995;
Кожевин, 1989;
Методы …, 1991).
Количественный учет грибов проводился методом Хансена в модификации Мирчинк (1988).
Определение фитотоксичности почвы и КЖ проводили на семенах растений (Методы …, 1991).
Выделение ДНК, ПЦР-анализ. ДНК было выделено из свежего мицелия фенол/хлороформным методом, включающим лизис клеток, с высвобождением ядерной ДНК и очистку ДНК от белков, нуклеаз с использованием органических растворителей (Druzhinina et al, 2005). Участок ядерной рДНК, содержащий ITS1 и 2 и ген 5,8S рРНК, был амплифицирован в реакции ПЦР с использованием комбинации праймеров Ф4 (5’-TCT GAG CCT TCT CGG CGC CT-3’) и A5 (5’-GCG CAG GAA AGG CTG CGG CG-3’), а участок, содержащий ген эндоглюконазы, - с праймерами Ф2 (5’-GGC AAG ACA TGA CAA GT-3’) и A3 (5’-ACA TTG GAG AGT GCG AAG C-3’).
Также для проведения ПЦР были использованы следующие праймеры:
ПР1 – 5’-GAG GTG GNG GNT CT-3’ – неспецифический праймер, консенсусная последовательность белка III фага М13;
ПР2 – 5’-GTT TTC CCA GTC ACG AC-3’ – стандартный прямой праймер фага М13;
ПР3-5’ – GGC AAG ACA TGA CAA GT-3’ – неспецифическая последовательность.
Для проведения ПЦР и секвенирования по последовательностям ITS и 2 были использованы праймеры forward SR6R 5’-AAG TAG AAG TCG TAA CAA GG-3’ и reverse LR1 5’-GGT TGG TTT CTT TTC CT-3’.
Режимы ПЦР - амплификации: а) денатурация ДНК - 950С;
1 мин, б) отжиг праймеров - 540С;
1,5 мин, в) элонгация - 720С;
1 мин.
Результаты ПЦР оценивались в агарозном и полиакриламидном (ПААГ) гелях различной концентрации.
Глава 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Распространение Trichoderma на территории Республики Татарстан При исследовании распространения Trichoderma нами использовались зональный, морфологический, таксономический и экологический подходы.
Изучение взаимоотношений Trichoderma с растениями рассматривалось с позиций ярусного и консортивного подходов.
Незатронутые деятельностью человека и являющиеся резервуарами сохранения видового разнообразия почвы рассматривались как эталонные по отношению к антропогенным ландшафтам. В качестве эталонов были отобраны почвы из древнего захоронения (Мурзихинский II могильник), зоны археологических раскопок на территории древних поселений (Больше Кляринское городище), из Раифского заповедника Волжско-Камского биосферного резервата (статус, присвоенный президиумом Международного координационного совета МАБ ЮНЕСКО 29 июня 2005 г), который из-за особенностей рельефа представляет собой модель, имитирующую широтную зональность всей лесной полосы Европейской части России. В качестве альтернативного объекта былы отобраны образцы под Матюшинским лесопитомником с обедненной серой лесной почвой, почвы агроценозов под зерновыми культурами, защищенные грунты, нефтезагрязненные почвы, а также почвы вдоль автотрасс (табл. 2).
Нами было выделено свыше 700 изолятов Trichoderma из образцов почв и подстилок археологических раскопок, государственного Раифского заповедника, почв и агроценозов, антропогенных ландшафтов.
Применение консортивного подхода к изучению влияния растений и животных на распространение позволило выявить виды, ассоциированные с ризосферой, филлосферой и спермисферой, а также виды, ассоциированные с почвенными животными, и обитающие в экскрементах, а также транзитные формы из кишечника дождевых червей сем. Lumbricidae.
В результате исследований была отмечена высокая частота встречаемости (КОЕ/г почвы) изолятов Trichoderma в эталонных почвах и защищенных грунтах. Антропогенные ландшафты – агроценозы и почвы вдоль автотрасс, нефтезагрязненные почвы и нефтешламы характеризовались снижением популяционного уровня более, чем в 100 раз, снижением частоты встречаемости и видового разнообразия. Из комплекса исследованных антропогенных ландшафтов исключение составляли защищенные грунты в теплицах, что связано с ежегодной интродукцией популяций Trichoderma в составе с биофунгицидов, изготавливаемых на основе штаммов - антагонистов фитопатогенов.
Видовое разнообразие Trichoderma на территории Республики Татарстан При исследовании структуры микромицетного сообщества почв выявлено в разных климатических зонах на территории Республики Татарстан более 11 видов Trichoderma, идентифицированных морфологическими и молекулярно-генетическими методами. Для отдельных изолятов не обнаружено гомологичных сиквенсов, которые бы позволили их отнести хотя бы к одному из известных видов.
Идентификация по морфологическим признакам выделенных изолятов показала, что наиболее распространенным и часто встречающимся оказался вид T. koningii (161 изолят). На втором месте по распространенности стоит T.hamatum (100 изолятов), а на третьем –T.longibrachiatum (92 изолята).
Далее следуют T. harzianum (87 изолятов), T. asperellum (80 изолятов) и T.
citrinoviride (69 изолятов), T. atroviride (22 изолята), T.viride (12 изолятов) и T. oblongisporum (10 изолятов). Последний вид встречается немного реже, но все-таки его также можно считать обычным видом. Редко встречались виды T. saturnisporum (8 изолятов) и T. spirale (2 изолята (табл.3). Можно проследить некоторые закономерности распределения видов рода Trichoderma в зонах лесопосадок разных климатических областей на территории РТ (рис.1, табл. 3). Из таблицы 4 видно, что виды группы T.
koningii чаще встречаются в прохладной климатической зоне, а в более южных областях количество пропагул (КОЕ/1г почвы) этого вида сокращаются.
Таблица Места выделения и частота встречаемости (%) изолятов Trichoderma объект Район тип почвы зоны глуб ччастота анализа ина, встреча см емости изолятов, % 1 Раифский Зеленодольский серая лесная Коп заповедник К 0-20 40- К К 2 Больше- Камско- чернозем А1 10- Кляринское Устьинский выщелоченн [ЕА1] 122 городище ый 60- [А1] 134 А1 0- А11 52- А12 77- 3 Мурзихинский II Алексеевский чернозем раскоп 196, могильник выщелоченн череп № 1 60- ый раскоп 162, череп № 4 лесопосадки/агр Высокогорский серая лесная 20-25/0- оценозы серая лесная подстилка/ Лаишевский 22-29/4- [А1] 0-20 25-26/4- Сабинский серая лесная Агрызский дерново- 23-28/0- подзолистая Тюлячинский чернозем 22-27/5- Буинский чернозем 26-30/4- 5 Защищенные Казань, тепличные - - 40 - 50 грунты теплиц Зеленодольск грунты 25/4- 6 Лесопитомник Столбищенский Серая - [А1] 0-20 лесная Рис.1. Карта Республики Татарстан *- районы, в которых выделены изоляты Trichoderma Таблица Список видов и количество изолятов грибов рода Trichoderma, обнаруженных на территории Республики Татарстан Вид Количество изолятов, % от общего числа Trichoderma sect. Trichoderma 100/13, T.hamatum (Bon)Boner T. asperellum Samuels, Lieckfelt et Nirenberg 80/10, * T. atroviride Karsten * 22/3, группа T. koningii Oudemans et Koning 161/22, группа T. viride Pers.: Fr. 12/1, Trichoderma sect. Pachybasium T. harzianum Rifai 87/11, T. oblongisporum Bissett * 10/1, T. spirale Bissett * 2/0, Trichoderma sect. Longibrachiatum T. citrinoviride Bissett * 69/9, T. longibrachiatum Rifai 92/12, T. saturnisporum Hammill * 8/1, неидентифицируемые изоляты 90/12, Сумма Виды T.hamatum, T. asperellum, T. harzianum и T. citrinoviride имеют широкий диапазон распространения. T. longibrachiatum и T. atroviride чаще выделялись в умеренно-теплой и теплой зонах. Находок видов T. spirale и T.
saturnisporum слишком мало для того, чтобы можно было сделать какие-либо выводы об их распространении (рис.1, таб.4).
Таблица Распространение Trichoderma в почвах лесопосадок на территории Республики Татарстан по климатическим зонам Зона Прохладная* Умеренно Теплая** Умеренн - * о прохладн теплая** ая** ** Вид число число число число изолятов изолятов изолятов изолятов 100 20 23 T. koningii Oudemans et Koning 20 24 14 T. asperellum Samuels, Lieckfelt et Nirenberg 4 4 10 T. atroviride Karsten 8 0 4 T. viride Pers.: Fr.
23 17 27 T. harzianum Rifai 15 22 25 T. longibrachiatum Rifai 20 13 17 T. citrinoviride Bissett 2 0 0 T. spirale Bissett 8 0 0 T. saturnisporum Hammill 0 0 10 T. oblongisporum Bissett T.hamatum (Bon)Boner *Прохладная зона – Высокогорский, Лаишевский, Сабинский, Зеленодольский, Агрызский районы;
**Умеренно-прохладная зона – Альметьевский, Тюлячинский районы;
***Теплая зона – Буинский район, тепличные субстраты;
****Умеренно-теплая зона – Алексеевский район Анализ исследуемых почв показал, что наибольшее разнообразие видов обнаружено в эталонных почвах и наименьшее – в антропогенных ландшафтах. Уменьшение видового разнообразия в антропогенных и современных ландшафтах отмечалось ранее и для других микроскопических грибов. Так, в эталонных почвах нами было выделено 11 видов и группа новых, неидентифицируемых по морфологическим признакам изолятов.
В антропогенных ландшафтах обнаружено среди типичных только видов. Практически не обнаружились в агроценозах ни одной климатической зоны виды T. atroviride, T. spirale, T. citrinoviride, T.
saturnisporum, а также не представлена группа новых видов (табл. 5).
Распространение Trichoderma на территории Раифского заповедника и лесопитомника «Матюшинского» Исследование распространения Trichoderma в зоне подстилки на современной территории Раифского заповедника позволило выделить свыше 150 изолятов. Пробы отбирались в местах отсутствия деревьев (К0), в непосредственной близости от одного дерева (К1), зонах контакта двух деревьев (К2) и под валежником К0п.
Нами обнаружено морфологическими методами 9 видов T. harzianum, T. koningii, T. saturnisporum, T. viride, T. longibrachiatum, T. hamatum, T.
atroviride, T. asperellum, T. spirale и группа неидентифицируемых (табл. 6).
Наибольшее разнообразие видов обнаружено в почве под валежником и на поверхности гниющего дерева, что, вероятно, связано с тем, что типичной зоной распространения видов Trichoderma являются места произрастания древесных культур.
Таблица Места выделения видов Trichoderma на территории РТ Вид Место выделения тепличное хозяйство «Майский», грунт T. koningii Раифский заповедник, почва Раифский заповедник (подстилка, почва) T. viride Больше-Кляринское городище (почва), тепличное хозяйство «Казанский тепличный», грунт Больше-Кляринское городище, почва T. atroviride Раифский заповедник (подстилка, почва) Раифский заповедник, почва T. hamatum тепличное хозяйство «Майский», грунт Раифский заповедник, почва T. spirale Раифский заповедник, почва T. longibrachiatum с поверхности семян огурца сорта «Эстафета» Мурзихинский II могильник, почва (8-6 вв. до н.э.) Больше-Кляринское городище, почва (8-10 вв.) T. citrinoviride Мурзихинский II могильник, почва (8-6 вв. до н.э.) тепличное хозяйство «Тепличный», грунт T. oblongisporum Раифский заповедник, почва T. saturnisporum тепличное хозяйство «Майский», «Казанский T.asperellum тепличный» грунт серая лесная почва лесопосадок с различными нормами тяжелых металлов, агроценозы Раифский заповедник, подстилка, почва, Мурзихинский II могильник, почва Неидентифицируемые Мурзихинский II могильник, почва (8-6 вв. до виды н.э.), Раифский заповедник Анализ распространения Trichoderma в зонах произрастания растений, характеризуемых как зоны возможного аллелопатического взаимодействия растений, показало, что наибольшее количество изолятов обнаружено в зоне питания одного растения.
Отмечена отрицательная коррелятивная зависимость числа клонов от числа растений в зоне питания. Наименьшее количество изолятов обнаружено в зоне питания трех растений.
Таблица Распространение видов Trichoderma и изолятов, охарактеризованных по комплексу признаков на территории Раифского заповедника Зона КОп К1 К2 К Изоляты, Изоляты, Изоляты, Изоляты, 60** 22** 18** 10** Вид\изоляты*, количество 183 150 65, T. koningii 8(з), 63 60 V(з) T. asperellum 5(з) T. atroviride 6(з) 23(з) T. viride 18(з) 3(з) T. harzianum 10(з) 16(з) T.
longibrachiatum 0(з) T. spirale 11(з) T.
saturnisporum 14(з) 32р/ф T. hamatum *Изоляты, охарактеризованные по комплексу морфологических, молекулярно – генетических и физиологических признаков;
**Общее число клонов идентифицировано только по морфологическим признакам Морфологические и молекулярно-генетические исследования изолятов, выделенных на территории РТ Для анализа видовой принадлежности и внутривидовой изменчивости организмов (выявления клональной изменчивости в гетерогенных популяциях), как необходимое условие, требуется подбор соответственных универсальных праймеров как необходимого условия. Исходя из двух важных свойств UP PCR (неспецифический ПЦР или НП ПЦР) паттернов, видо- и праймероспецифичности на уровне ДНК, можно заключить, что НП ПЦР технология представляет собой удобный инструмент, позволяющий проводить строгую экспресс-идентификацию видов любых организмов. Для этого можно использовать универсальные праймеры. Вместе с тем, на основе широкого набора универсальных олигонуклеотидов, строго специфически праймирующих соответствующие локусы в геноме, появилась возможность детального изучения структуры генома отдельных организмов и генетической структуры популяций и видов любых организмов по локусам, ранее не подлежащих анализу. Выявляемые по ряду праймеров полиморфизмы (измененные по отдельным фрагментам ПЦР паттерны) могут быть использованы в качестве генетических маркеров клонов.
Использование НП ПЦР (ПЦР с универсальными праймерами) стала возможной благодаря использованию произвольных или универсальных олигонуклеотидов, праймирующих ДНК любых геномов. Основным свойством амплифицированной с этим праймером ДНК оказалась видоспецифичность, т.е. сходство ПЦР паттернов организмов в пределах биологического вида. Вместе с тем, выяснилось, что некоторые виды организмов характеризуются весьма гетерогенными ПЦР паттернами независимо от используемых универсальных праймеров. Кроме того, обнаружилась разница в действии самих праймеров, часть которых на особях данного вида может давать сходные или идентичные ПЦР паттерны (вариабельные «праймеры). Первые известные попытки идентифицировать грибы методом ПЦР были предприняты с использованием праймеров, сконструированных на основе клонированных видоспецифичных ДНК последовательностей.
Для получения фингерпринтов изолятов Trichoderma, максимально отражающих видовые и внутривидовые различия. нами были взяты неспецифические, случайные, универсальные и специфические праймеры к гену, кодирующему эндоглюканазу, а также к ITS последовательностям участка гена рибосомальной ДНК. Исследование ДНК с помощью ПЦР анализа изолятов Trichoderma из древних захоронений выявило более видов. На рис 2 представлены данные по идентификации отдельной группы видов, выделенных из могильников с использованием ITS праймеров (SR6R и LR1). Наибольшей частотой встречаемости характеризовались 3 вида: – H.
schweinitzii, T. longibrachiatum и T. asperellum.
Для исследования внутривидовой изменчивости нами был изучен феномен «консервативных» и «вариабельных» праймеров. ПЦР идентификация видов с использованием универсальных праймеров (НП ПЦР) позволяет путем сравнения ПЦР паттернов разных изолятов делать заключение об их родстве в рамках биологического вида. Однако, в связи с тем, что не все универсальные праймеры дают сходные или идентичные ПЦР паттерны в пределах биологического вида организма, возникают затруднения в таком сравнении.
Особенно это касается грибов, у которых НП ПЦР паттерны могут коррелировать с паттернами внутрипопуляционных клонов. Нами получены типичные спектры продуктов амплификации ДНК разных видов Trichoderma с использованием неспецифических праймеров. Основная зона распределения фрагментов располагается в диапазоне от 2 до 8000 п.н. и от 370 до 470 п.н.
Рис.2 Кластерная дендрограмма штаммов Trichoderma, построенная на основании сиквенсов ITS – областей с праймерами SR6R и LR1: 1700 – H. schweinitzii, 1701 – T.
longibrachiatum, 1701 – T. longibrachiatum, 1702 – H. schweinitzii, 1703 – H. schweinitzii, 1704 - unclear species identification, 1705 – H. schweinitzii, 1706 – H. schweinitzii, 1707 – T.
longibrachiatum, 1708 – H. schweinitzii, 1710 – T. asperellum, 1711 – T. asperellum, 1712 – T.
asperellum, 1713 – T. asperellum, 1714 – T. asperellum, 2127 – T. asperellum, 2128 – T.
asperellum.
Нами обнаружена невысокая изменчивость между основными исследуемыми ДНК различных изолятов, относящихся к одному виду. Число фрагментов, полученных при амплификации ДНК девяти изучаемых популяций, колеблется от 6 до 14. Каждая популяция имеет специфический спектр ПЦР продуктов – фенотип, характеризующийся: 1) определенным количеством фрагментов;
2) их размерами и 3) степенью выраженности (мажорностью). Некоторые фрагменты являются общими для фенотипов всех или большинства исследуемых популяций, и выявляют, по-видимому, консервативные участки генома, характеризующие принадлежность этих популяций Trichoderma к одному виду T. harzianum. Число таких фрагментов составило от 3 до 4 в области 370, 470 и 1650 и 2500 п.н. Неспецифические праймеры, используемые нами, не дали маркерных специфических фрагментов, которые были бы характерны только для одной популяции. В большинстве случаев одни и те же полиморфные фрагменты присутствовали в спектрах продуктов ПЦР ДНК 2 или 3 популяций. Использование праймеров позволило выявить большую гетерогенность среди исследуемых популяций особенно в области от 200 до 400 п.н. Сравнительное исследование клонов изолятов с различным типом взаимоотношения с фитопатогенными почвенными микроорганизмами и растениями не позволило выявить принципиальных различий за исключением фрагментов ДНК в области 470 п.н. Изолят с наибольшей конкурентоспособностью, антагонистической и фитотоксической активностями дальше всех стоит от других изученных изолятов.
Исследование праймеров по отношению их к консервативному или вариабельному типам на примере Trichoderma asperellum показало, что праймер 2 может быть охарактеризован, как «консервативный», так как он не различает взятые в анализ популяции гриба, а праймеры 1 и 3, как «вариабельные». Отмеченная вариабельность фрагментов ПЦР паттернов при использовании «вариабельных» праймеров, вероятно, связана с разницей между клонами гетерогенной популяции. Дальнейшие исследования изолятов подтвердили наблюдаемую нами разницу фингерпринтов с различной стратегией жизни. Исследуемые клоны отличались по скорости роста и конкурентоспособности. Таким образом, нами были подобраны «консервативный» праймер 2 для строго НП ПЦР видоидентификации и «вариабельные» праймеры 1, 2 - для клонов выделенных из гетерогенной популяции. Нами использовался также «консервативный» праймер, который был сконструирован Тарасовым и Акберовой на основании ДНК последовательностей гена эндоглюканазы Trichoderma harzianum, как наиболее широко распространенного и используемого вида в практике сельского хозяйства в качестве агента биозащиты. Сравнительный анализ фингерпринтов показал, что наибольшая гетерогенность ПЦР продуктов наблюдается при использовании праймеров к ITS («вариабельный») последовательности по сравнению с праймером к гену эндглюканазы. Праймер к гену эндоклюганазы можно отнести к «консервативному» типу, так как он не позволяет выявить клональную изменчивость. Специфичный праймер к гену эндоклюганазы был сконструирован на основании известных последовательностей, характерных для T.harzianum, так как, по мнению исследователей, это наиболее распространенный вид в почве и наиболее перспективный, как антагонист.
Молекулярно-генетические исследования опровергли это мнение. Изоляты, которые мы относили на основании морфологических анализов к T.harzianum, после ПЦР анализов с использованием специфичных ITS фрагментов ядерной рибосомной ДНК (внутренних транскрибируемых спейсеров) были отнесены к T. asperellum. Использование сконструированных праймеров к ITS последовательности позволили нам выявить новые виды внутри T.koningii-подобной группы, члены которой имеют сходные морфологические признаки, но различаются по данным ПЦР диагностики рис.3.
На микологическом сайте Самюэлем и Кубичеком с соавторами в середине 2006 года было опубликовано сообщение о том, что на основании молекулярно-генетического анализа с использованием праймеров к ITS локусам было доказано, что вид T.koningii является комплексом видов, сходных только по морфологическим признакам.
На рис. 3 видны полиморфизмы ПЦР продуктов изолятов, выделенных из защищенных грунтов и подстилки Раифского заповедника. Наблюдаемые различия по ITS локусу подтверждают различия на видовом уровне.
Рис. 3. ПЦР паттерны изолятов Trichoderma koningii с праймерами ITS 1 и 2. Дорожки 1 маркер, 2-.+Т+А, 3-Т.150, 4 –Т.7, 5 – Т.1, 6 – Т.183, 7 – Т.65, 8 –Т.22, 9 –Т.4, 10 – Т.Gk р/ф, 11- Т.+Tr, «-» – контроль) Последующий ПЦР анализ с более чем 20 изолятами других экологических ниш из группы T.koningii подтвердил их генетическую гетерогенность. Таким образом, морфологическое сходство этой группы не было подтверждено ПЦР анализом. Дальнейшие исследования, проведенные нами с использованием праймеров к ITS последовательности, позволили переидентифицировать такие виды, как T.viride и отнести его из группы доминирующей в редкую, T. asperellum – в часто встречающуюся. Наши исследования подтверждаются последними исследованиями в систематике Trichoderma. Так, T. asperellum отнесен к группе наиболее распространенных в мире, тогда как «типичный» вид T. viride - относят к редким видам. В отдельных случаях мы получили подтверждение морфологической идентификации генетическими методами. Так, результаты сиквенирования ITS последовательности группы изолятов подтвердило принадлежность к виду T. longibrachiatum и T. citrinoviride. Также нами показано достоверное различие ПЦР паттернов изолятов T. spirale и T. longibrachiatum, подтверждающие принадлежность их к различным видам.
Построены дендрограммы, демонстрирующие сходства и различия ДНК паттернов изолятов, выделенных из заповедника, с использованием праймеров к ITS. Сходные фингерпринты T.koningii-подобных видов попали в первую группу (изоляты T.koningii Т.22, Т. 65, Т.183), а отличающиеся во вторую группу (Т.4 и Т.1). Изолят T. viride 6(з) повторно идентифицирован как T. аsperellum 6 (з). По данным электрофореза были построены древа родства (рис. 4). На бинарном древе изоляты разделяются на две группы. В первую группу входит два изолята (Т. 67 и Т. 60). Вторая группа разделяется на две основные ветви: в первой - штаммы заповедника (Т.11(з) и Т.65) и выделенные из ризосферы культур (К3риз. и Т.32 р/ф), во второй - штаммы заповедника (Т.35, Т.61, Т.62) и изоляты из тепличного хозяйства. Среди представленных штаммов К3риз. и Т.32 р/ф входят в одну группу, что свидетельствует о том, что изоляты, выделенные из ризосфер, имеют общее или близкое происхождение. По бинарному построению мы видим, что в одну группу по степени сходства ПЦР паттернов входят штаммы T.oblongisporum 11(з), T.koningii 65 и изоляты, выделенные из ризосферы растений K3риз и T.32р/ф). По-видимому, данные изоляты имеют общее или близкое происхождение. Нами обнаружена невысокая изменчивость между основными исследуемыми ДНК различных изолятов при использовании праймеров к гену эндоглюканазы. Число фрагментов, полученных при амплификации ДНК 9 изучаемых популяций, колеблется от 10 до 14.
Некоторые фрагменты являлись общими для фенотипов всех или большинства исследуемых популяций, и выявляли, по-видимому, консервативные участки генома, характеризующие принадлежность этих популяций Trichoderma к одному виду T. harzianum.
Таким образом, нами выделены и повторно идентифицированы изоляты из эталонных и антропогенных ландшафтов. Были сконструированы «консервативные» и «вариабельные» праймеры, регистрирующие межвидовые и внутрипопуляционные изменения. Использование специальной программы Тарасова позволило определить вид Trichoderma asperellum, как наиболее распространенный и занимающий центральное положение среди изученных нами видов. С помощью молекулярно генетического подхода повторно идентифицирован ряд изолятов и уточнена их видовая принадлежность. Сиквенирование ITS последовательностей рибосомной ДНК изолятов, выделенных из эталонных почв, позволило выявить не только известные виды, но и новые, имеющие необычные сиквенсы.
По данным морфологического анализа изоляты Trichoderma из тепличного грунта в зависимости от сроков эксплуатации грунта и времени после высокотемпературной обработки попадают по частоте встречаемости в доминирующую или часто встречающуюся группу.
Рис. 4. Бинарное древо родства изолятов рода Trichoderma по ITS - последовательности: 1 T.spp.62;
2- T.spp.61;
3-T.asperellum35;
4- T.spp.Tr 32 Riz;
5-T.oblongisporum 11 з;
6 T.koningii65;
7-T.asperellum60;
8- T.spp.Tr 5(2);
9- T.spp.K 3 Riz;
10- T.spp.67.
Построено по фингенпринтам ПЦР анализа в 8% ПААГ изолятов, выделенные из Раифского заповедника РТ ПЦР анализ изолятов из тепличного грунта подтвердил низкое видовое и высокое внутривидовое разнообразие. Вероятно, это связано с тем, что после ежегодной интродукции одного гетерогенного вида на высоком популяционном уровне происходит расщепление на клоны. Исследование изолятов из грунтов показало, что из гетерогенной популяции максимальное преимущество в экологической нише получают наиболее конкурентоспособные клоны с высокой антагонистической активностью к фитопатогенным микромицетам и высоким уровнем фитотоксичности.
Расщепление гетерогенной популяции на клоны было подтверждено ПЦР анализом с использованием праймеров к ITS последовательностям.
Природные популяции грибов, как правило, являются гетерогенными.
Процесс выщепления клонов в популяции с последующим их обособлением, перегруппировкой и доминированием определенных форм способствует раскрытию адаптивных свойств вида (Чикин, Лихачев, 1997).
Популяционная гетерогенность изолятов Trichoderma, выделенных на территории РТ Существование генетически гомогенных популяций в природных условиях проблематично. Известно, что в геноме одной клетки может быть уже заложена способность расщепления на варианты. Известно, что на основании физиолого–биохимических критериев гетерогенность природных популяций может быть определена как возрастная, половая, морфологическая, генетическая и пространственная. Нами проводилось сравнение морфометрических параметров, кинетических и других параметров, определяющих стратегию жизни гетерогенных популяций Trichoderma.
Известно, что повышение гетерогенности является адаптивным фактором, способствующим распространению изолятов Trichoderma. Для оценки популяционных различий в пределах одного вида мы сравнивали размеры конидий изолятов из разных климатических зон и экологических ниш с помощью компьютерной программы Paint. Следует отметить, что был возможен анализ зонального распространения достаточно изученных областей и доминирующих видов: T. viride, T. koningii, T. harzianum, T.
asperellum, T. atroviride, T. citrinoviride, T. saturnisporum, T. spirale, T.
oblongisporum, T. longibrachiatum.
При сравнении выборок выяснили, что внутри популяций из разных климатических зон нет достоверных различий в размере конидий Минимальная вариабельность размеров конидий отмечена для видов T.citrinoviride и T. oblongiosporum (рис. 5). Мы провели сравнительный анализ размеров конидий видов, выделенных на территории РТ, видов, распространенных на территории России (описанных Александровой в г), и видов, распространенных на различных территориях, описанных Самюельсом (2002). Нами отмечена достоверная разница между конидиями только по ширине. Так, конидии изолятов группы T. koningii из РТ более крупные и более округлые, чем конидии, описанные Александровой (2000) и Самюэльсом (Samuels, 2002). Аналогичную картину наблюдали при анализе конидий изолятов других видов (рис. 6). Известно, что в условиях почвы наибольшей выживаемостью обладают более мелкие формы, которые А 4, T. a T. T. c T. h T. l sp e sat u T. obl T. k on g i trin длина конидий, мкм arz T. T. v ong T on i 3,5 ov ir i an atr re llu rni s ibra i ri d ngi is. sp um ovi p or ide c hia e m um porum i rale i ri de tum 2, 1, 0, представители видов Рис.5 Морфологическая характеристика конидий видов Trichoderma, распространенных на территории РТ обладают повышенной адаптационной способностью и летучестью, что способствует расширению ареала распространения. Вероятно, отмеченное нами снижение численности видового разнообразия видов Trichoderma на территории РТ обусловлено селекцией изолятов с более крупными размерами конидий.
ширина, Хсред длина, Хсред 4, 3, мкм 2, 1, 0, А Б В Рис. 6. Сравнительный анализ размеров конидий T. koningii (А – местные изоляты;
Б – по Александровой, 2003;
В – по Samuels, 2004) Сравнительный анализ размеров конидий изолятов, выделенных из эталонных почв, антропогенных ландшафтов и современных горизонтов почв показал, что размеры конидий изолятов, полученных из современных почвенных горизонтов, уменьшаются. Таким образом, нами выявлена общая тенденция уменьшения размеров конидий изолятов, выделенных из современных горизонтов по сравнению с конидиями изолятов из погребенных почв. Установлено, что размеры конидий сапротрофных изолятов также меньше по сравнению с размерами конидий ризосферокомпетентных изолятов. По-видимому, снижение размеров конидий является адаптационным механизмом. Вероятно, повышение интенсивности прямого и косвенного антропогенного воздействия в современных горизонтах почв привело к селекции и выживаемости популяций Trichoderma с более мелкими конидиями. Аналогичная тенденция отмечена при исследовании степени удаления от зоны ризосферы. Удаление микромицета от растения-эдификатора (из зоны ризосферы) сопровождалось селекцией и преобладанием в микробиоценозе популяций с более мелкими и шиповатыми конидиями. Исследование морфометрических показателей видов с шиповатыми конидиями показало, что по мере созревания конидии проходят стадии от форм с гладкой поверхностью к формам с шиповатой поверхностью. Вероятно, повышение доли видов Trichoderma с гладкими конидиями в микромицетном сообществе связано с ранней стадией сукцессии экологической ниши, и может являться диагностическим признаком возраста почвенных горизонтов или использоваться для оценки интенсивности антропогенного воздействия на популяции в природных условиях.
Вегетативная совместимость клонов в популяциях Trichoderma и культурально-морфологические типы Важным биотехнологическим свойством при промышленном использовании Trichoderma является стабильность признаков, характерная только для моноспоровых изолятов. Известно, что популяции грибов представляют собой мозаику клонов, одним из изолирующих механизмов которых являются различные культурально-морфологические типы колоний, реакции вегетативной совместимости и гетерокариоз. Мицелиальные грибы формируют анастомозы, что играет важную роль в адаптации грибов.
Установлено, что парасексуальная рекомбинация между тесно связанными видами и предположительно несовместимыми штаммами некоторых видов более выражена под влиянием стрессов среды. На самом деле, несовместимость штаммов между собой и даже между видами может быть преодолена мутацией единственного гена. Возможность горизонтального переноса генов (обмен неполовым путем между различными видами или несовместимыми родами) стала причиной появления новых генов в различных грибах. Мутации и стресс могли изменить половой процесс и межвидовую совместимость. Гетерокариоз играет большую роль в жизни грибов. Анастомозы между гифами с последующей миграцией ядер приводят к исчезновению внутрипопуляционных единиц – индивидуумов, клонов и интеграции их в единую сеть мицелия, что также резко усиливает адаптационные возможности. Нами были исследованы природные гетерогенные популяции Trichoderma и их расщепление на клоны (табл. 7).
Сравнительный анализ колоний гетероспоровых популяций местных изолятов позволил выделить 2 стабильных культурально–морфологических типа из раннее описанных четырех. Гетероспоровые популяции в большей степени (54%) были представлены вторым культурально–морфологическим типом, из них 20% приходилось на изоляты T. koningii, на изоляты T.
atroviride, по 6,6% пришлось на изоляты T. longibrahiatum, T. viride, T.asperellum, по 3,3% у изолятов T. harzianum и T. saturnisporum, и 43,3% у неидентифицированных изолятов.
К четвертому типу принадлежат 46% из исследованных изолятов:
19,2% изолятов T.koningii, 3,8% пришлось на изоляты T.atroviride, T.oblongisporum, по 11,5% приходиться на изоляты T.harzianum, T.viride, 7% принадлежит изолятам T.asperellum, оставшиеся 38,5% пришлось на неидентифицированные штаммы. Наблюдаемая нами модель природных расщеплений гетерогенных популяций в лабораторных условиях на агаризованных средах была подтверждена регистрацией клонального расщепления в тепличных грунтах. Это природная модель ускоренного эволюционного развития аллохтонных гетерогенных популяций в оптимальных условиях молодой экологической ниши.
Таблица Расщепление гетероспоровых популяций Trichoderma на моноспоровые клоны Изоляты Изоляты клонов 1-го Изоляты клонов 2-го порядка порядка T.asperellum (18) T.asperellum (18м), T.asperellum (181н), T.asperellum (1810н) T.asperellum (1850) нет дальнейшего T.asperellum (18200) расщепления T.viride (23з) T.viride 23з(1), T.viride 23з(2), T.viride (23з(4)) T.viride 23з(3)1, T.viride 23з(3)2, T.viride 23з(3) T.viride 23з(3)3, T.viride 23з(3) T.koningii (183) нет дальнейшего расщепления T.koningii 183(1), T.koningii 183(4), T.koningii 183(6) T.koningii 183(2)1 T.koningii T.koningii 183(2) 183(2)2, T.koningii 183(2) T.koningii 183(3)1, T.koningii T.koningii 183(3) 183(3) T.koningii 183(5)1, T.koningii T.koningii 183(5) 183(5)2, T.koningii 183(5) Т.spp 192 Т.spp 192(1)1, Т.spp 192(1)2, Т.spp 192(1) Т.spp 192(1) Т.spp 192(2)1, Т.spp 192(2)2, Т.spp 192(2) Т.spp 192(2) T.atroviride (204) нет дальнейшего расщепления T.atroviride 204(1), T.atroviride 204(2) T.atroviride 204(0) T.atroviride 204(0) Т.spp 301 Т.spp 301(2) Т.spp 306 Т.spp 306(1) нет дальнейшего Т.spp.310 Т.spp 310(2) расщепления Т.spp 312 Т.spp 312(1),Т.spp 312(2) Т.spp 316 Т.spp 316(1) Т.spp 317 Т.spp 317(2), Т.spp.317(3) Вегетативная совместимость автохтонных изолятов Trichoderma При исследовании взаимодействия между гетероспоровыми популяциями и моноспоровыми клонами нами были обнаружены различные реакции вегетативной совместимости: образование мицелиального валика из гиф воздушного мицелия, взаимное проникновение мицелия (нейтральная или индифферентная реакция), а также реакции несовместимости барраж, бордюр и ограничение роста. Вегетативная совместимость типа валик выявлена у 14,3% исследованных изолятов: 3,6% у T.koningii, по 1,8% у изолятов T.atroviride, T.harzianum, T. saturnisporum, T.asperellum,. У 9% отмечена индифферентная реакция: 3,6% у изолятов T.koningii, по 1,8% у T.atroviride. Вегетативная совместимость типа мелдинг выявлена у 3,6% исследованных изолятов: по 1,8 % у неидентифицированных изолятов.
Вегетативная несовместимость типа бордюр выявлена у 8,9% изолятов: по 1,8% у T.longibrahiatum, 3,6% у изолятов T.viride;
барраж – у 7,1% исследуемых изолятов: 5,3% у T.koningii, 9% у неидентифицированных изолятов. У оставшихся 50% исследованных изолятов выявлен смешанный тип реакций. При расщеплении гетероспоровых популяций на моноспоровые клоны преобладает тип вегетативной несовместимости бордюр – 48% барраж у 4% клонов. Среди типов вегетативной совместимости преобладает валик 24%, мелдинг-реакция обнаружена у 16% клонов, индифферентная реакция выявлена у 8% исследуемых клонов. Сравнительный анализ общих частот проявления типов реакций совместимости выявил тенденцию к увеличению у гетероспоровых популяций реакций смешанного типа (50%), на втором месте - реакции совместимости (26,9%) и реже всего отмечены реакции несовместимости.
Гетерокариоз изолятов Trichoderma, выделенных из почв РТ В связи с многоядерностью клеток и отсутствием препятствий на пути миграции ядер у грибов широкое развитие получило явление гетерокариоза.
Нами отмечалась генетическая неоднородность ядер, внешним проявлением которого являлось скачкообразное возникновение сальтантов (неустойчивых или лабильных штаммов и гетеротипов). На поверхности колоний нами отмечалось образование секторов, отличающихся характером роста или окраской, внезапно проявляющихся в моноспоровых культурах на некотором расстоянии от центра колонии. Так, отмечалось образование светло окрашенных секторов, которые называют аберрантными пятнами мицелия.
Интенсивность спороношения Исследования интенсивности спороношения выявили как видовую дифференциацию, так и клональную изменчивость (рис. 7). Наибольшая интенсивность спороношения характерна для T. harzianum и T. spirale (110 140*105 конидий/мл), во вторую группу были отнесены T.asperellum и T.atroviride (90-110*105 и 80-90*105 конидий/мл, соответственно), а в третью T.viride и T.koningii – 60-80 конидий/мл.
Взаимоотношения с фитопатогенными микроорганизмами Известно более 100 разнообразных антибиотических веществ, активно продуцируемых грибами Trichoderma. Показана способность Trichoderma к регуляции жизнедеятельности почвенных микроорганизмов и эффективному ингибированию развития многих почвенных фитопатогенов даже при отсутствии непосредственного прямого контакта мицелиев. Эти свойства широко используются для отбора наиболее перспективных штаммов биологического контроля in vitro при разработке биологических методов борьбы с различными возбудителями сельскохозяйственных культур, как в полевых, так и в условиях теплицы.
T. spirale конидии*105/мл T. harzianum T. asperellum T. atroviride T. viride T. koningii T. longibrachiatum T. citrinoviride T. oblongisporum T. saturnisporum виды Trichoderma Рис. 7 Интенсивность спороношения видов Trichoderma на КГА при 28°С.
Нами рассматривалась внутривидовая и видовая дифференциация по признаку взаимоотношения с отдельными группами почвенных микроорганизмов в опытах in vitro и in vivo. Показана способность к регуляции жизнедеятельности более 40 видов микромицетов-фитопатогенов и сапротрофов. Отмечен видовой и внутривидовой полиморфизм по признаку фунгистатичности. Для 34,1% исследуемых изолятов характерен В тип антагонистической активности (обоюдное подавлении при контакте): по 9 % для изолятов T.koningii, T.asperellum;
по 2,3% для T.viride, T.harzianum, 4,5% - для T.atroviride;
С-тип антагонистической активности (обоюдное подавление на расстоянии) характерен для 11,4% исследованных штаммов:
по 4,6% для изолятов T.koningii и T.harzianum. В1-тип реакции (обоюдное подавление при контакте и дальнейшим переходом к паразитизму) выявлен у 9% изолятов: T.viride – 2,3%, T.harzianum – 4,6% и у T.atroviride – 2,3%.
Наиболее интенсивное проявление фунгистатичности в опытах in vivo отмечено в тепличных грунтах, где отмечено наиболее оптимальное сочетание комплекса эдафических факторов для большинства изолятов Trichoderma. По мере увеличения сроков эксплуатации грунтов увеличивается гетерогенность автохтонной популяции, и, как следствие усиления конкурентных взаимоотношений, возрастает доля изолятов с высокой фунгистатической активностью.
Стратегии жизни изолятов Trichoderma в экосистемах Стратегия жизни определяется как способ выживания и поддержания стабильности популяции в сообществах и экосистемах. Всего выделено типа стратегий, которые эволюционно закрепились в результате действия, соответственно, отбора эксплуатации (в условиях ненасыщенности среды микроорганизмами), насыщения (в климаксном сообществе при максимальной конкуренции) и в неблагоприятных условиях. Нами исследовались все типы сред.
Для решения вопроса о стратегиях, все члены изученной нами коллекции были расположены в пространстве KrL- континуума, где каждый изолят занял свое место. Изоляты в тепличных грунтах после термической обработке и в ризосфере растений чаще реализуют r-отбор. В группе r стратегов отмечена тенденция к специализации в условиях окружающей среды. Грибы используют в качестве основного механизма тропизм– векторизированный пронизывающий рост гиф. В твердофазных гетерогенных средах, подобных почве, тропизм имеет преимущество перед таксисом. Высокая колонизирующая способность грибов обусловлена гигантскими размерами периферической зоны и возможностью транслокации субстратов вдоль гиф. Количественной мерой успеха при первом приближении служит линейная скорость роста гиф. В ходе сукцессии по вегетации растений отмечен переход в популяционной структуре к преобладанию К-стратегов. Для Trichoderma характерно расположение на rK оси экологических стратегий KrL- континуума, благодаря высокой скорости роста. Все выделенные нами изоляты по скорости роста в условиях KrL делятся на 3 группы: с низкой и высокой удельной скоростью и промежуточная группа. Для Trichoderma чаще отмечались высокие значения максимальной скорости роста, поиск субстрата с низкой эффективностью, но на больших расстояниях. Активная миграционная способность оправдана только при r–типе стратегии, когда энергоемкий процесс механического движения повышает вероятность попадания в благоприятную микрозону и приводит к взрывному росту популяции. В прикорневой зоне растений прижизненные выделения подчинены суточным ритмам, а положение локусов экссудации меняется из-за роста корня. Ризосфера, в связи с этим, служит характерным примером оазиса жизни для микробов с r-стратегией жизни, где условия нелимитированного роста и пионерские стадии микросукцессии создаются ежедневно, но не в одной точке пространства, а в разных микрозонах. Среди выделенных нами изолятов современных и антропогенных ландшафтов преобладали виды с r-типом стратегии, а в погребенных почвах и могильниках с rK – типом стратегии. В зоогенных местообитаниях миграции способствуют насекомые и нами отмечены транзитные изоляты Trichoderma. В других местообитаниях рост r–стратегов возобновляется со значительно меньшей частотой, чем в ризофере. На свежем опаде отмечена вспышка роста изолятов с r–стратегией. Способность к использованию микроорганизмами труднодоступных и полимерных соединений рассматривается как проявление L–отбора. Выработка способности усваивать труднодоступные соединения есть один из способов избежать прямой конкурентной борьбы за предпочтительные субстраты, но дефицитные, следовательно это не К–стратегия. Приобретение данной способности энергетически затратно, поскольку утяжеляет метаболическую машину новыми блоками (также как в случае приспособления к неблагоприятным условиям – влажности, солености температуры и др.) и замедляет рост популяции. Следовательно, это не r–стратегия. Признаки использования полимеров и синтеза гидролаз (высокая активность у бацилл и грибов-гидролитиков) можно рассматривать как проявление биоценотической патиентности - переход на «менее ценный корм» из–за конкурентного давления. Отсюда становится понятным экологический смысл тесной корреляции признаков спорообразования, деполимеразной активности и антибитикообразования у обширной группы микроорганизмов, в том числе медленнорастущих грибов. Все они слабые конкуренты в прямой борьбе за дефицитные доступные субстраты, поэтому они приспособились сохранять свою жизнеспособность путем перехода в споры, атаки полимеров растительного опада и «отпугивания» конкурентов токсическими метаболитами. Перечисленные микроорганизмы тяготеют к L–полюсу LK– и Lr–континуумов, на противоположном К-полюсе находятся простекобактрии, а на r–полюсе – грибы–сахаролитики, ризобии, псевдомонады и энтеробактерии. Нами было показано наличие изолятов, занимающих промежуточное положение, т.е. LKr-континиум.
Концепция стратегий жизни привлечена для объяснения происхождения различий в индивидуальных кинетических характеристиках изученных нами изолятов Trichoderma.
Нами обнаружены ризосферкомпетентные виды Trichoderma, жизнедеятельность которых приурочена к ризосфере. Они по комплексу характерных признаков отнесены в группу r-стратегов, для которых отмечена тенденция к специализации в условиях окружающей среды.
Аналогичная группа выявлена нами в тепличных грунтах после пропаривания, где создаются максимально благоприятные условия для реализации r- стратегии жизни. Наблюдаемая нами в ризосфере и грунтах после пропарки активная миграционная способность грибов оправдана только при r–типе стратегии.
Анализ соотношения Trichoderma по стратегии жизни показал, что 1,4% изолятов занимает среднее положение между r-, L- и K-стратегами. К этой группе стратегов были отнесены изоляты T. citrinoviride, 51,39% тяготеет к r–стратегам (все виды встречаются), 8,33% - переходные формы между r- и K- (T.citrinoviride,T.asperellum, T.longibrachiatum, T.harzianum), 20,83% - тяготеет к K-стратегам (T.citrinoviride, T.asperellum, T.
longibrachiatum, T. koningii), 11,11% - тяготеет к L-стратегам (Т.asperellum и группа Т.koningii), 6,94% - переходные формы между r- и L- (Т.asperellum, Т.koningii, Т.harzianum) (рис. 8).
Обобщение доступных сведений о кинетике роста на средах с различным содержанием доступных субстратов, антагонистической активности, интенсивности спороношения, гидролазной активности и других изученных свойств позволило расположить их в поле треугольника rKL по координационному принципу. Выполненная координация носит чисто иллюстративный не количественный характер и может быть использована в целях прогноза эволюции популяций Trichoderma (рис. 8).
Представляет интерес конструирование подобных схем для конкретных экосистем и проверка их адекватности по критерию согласия с наблюдаемой в природных средах динамикой.
Рис. 8. Стратегии жизни комплекса видов рода Trichoderma, распространенных на современной поверхности территории РТ и глубинных горизонтах могильников и древних поселений (обозначения: треугольник – изоляты, выделенные из Раифского заповедника;
круг – из современных агроценозов;
прямоугольник – из древних захоронений) Ферментативная активность автохтонных изолятов грибов Trichoderma Антагонистическая активность Trichoderma, перспективных для сельского хозяйства как биофунгициды, определяется активностью гидролаз, в частности, целлюлаз и протеаз. Известно, что грибы рода Trichoderma являются продуцентами ксиланаз, используемых для повышения перевариваемости кормов для животных.
Нами исследовался гидролазный комплекс (ксиланазная, протеазная и целлюлазная активности) Trichoderma при культивировании на растительных отходах.
Наибольший показатель протеазной активности характерен для изолятов, выделенных из погребенных почв и могильников. Так максимальная активность протеазной активности отмечена у изолята T.323, который равен 229,7508 IUl-1, наименьший показатель протеазной активности у изолята T. 306 и равен 6,8001 IUl-1.
Наибольшей целлюлазной активностью обладают изоляты Т.328, T.harzianum (18), Т.2, их показатели, соответственно, равны 1,1986 IUml-1, 1.37 IUml-1, 1.31 IUml-1.
Ксиланазная активность превышала активность промышленного продуцента ксиланаз и составила для изолятов Т.302, Т.303 и Т.328 8, IUml-1, 8,2469 IUml-1 и 5,0275 IUml-1, соответственно.
Кинетика изолятов Trichoderma Нами проводились исследования кинетических показателей при переходе с лабораторных на природные среды и в полевых условиях. В лабораторных микроэкосистемах строго контролируются экотопические условия (влажность, темепература, освещенность) и возможна точная регистрация параметров жизнедеятельности при сохранении близкого к естественному составу сообщества богатства межорганизменных взаимоотношений. Полевые исследования проводились в защищенных грунтах (закрытый тип экосистем) и открытых экосистемах – агроценозы по выращиванию зерновых и сеянцев сосны.