Каталитические антитела – протеазы
На правах рукописи
Пономаренко Наталья Александровна КАТАЛИТИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА – ПРОТЕАЗЫ Специальность 03.00.03 - "Молекулярная биология"
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Москва - 2008
Работа выполнена в лаборатории биокатализа Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской Академии Наук.
Официальные оппоненты:
Член-корреспондент РАН, доктор химических наук, профессор Кочетков Сергей Николаевич Член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор Деев Сергей Михайлович Доктор биологических наук, профессор Георгиева София Георгиевна
Ведущая организация: Химический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова
Защита диссертации состоится 200_ года, в на заседании Диссертаци онного совета Д.002.019.01 при Институте биоорганической химии им. академиков М.М.
Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117997, ГСП-7, г. Москва, В-437, ул. Мик лухо-Маклая 16/
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.
Автореферат разослан _ 2008 года.
Ученый секретарь Специализированного совета доктор химических наук В.А. Олейников
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
.
Актуальность проблемы. В последние два десятилетия представление о биока тализе существенно расширилось в связи с обнаружением каталитической ак тивности молекул РНК и антител, альтернативных эволюционно совершенным ферментам. Каталитические антитела (абзимы) представляют интерес как с точ ки зрения механизма их возникновения и роли в функционировании иммунной системы организма, так и как потенциальные терапевтические агенты. К на стоящему моменту известно значительное число абзимов, катализирующих бо лее 30 химических реакций, для многих из которых не описано природных ферментов.
Существует несколько различных подходов для поиска каталитических антител. Наиболее изученными абзимами являются искусственные биокатализато ры, получаемые иммунизацией стабильными аналогами переходных состояний ре акций. Область их применения включает разнообразные реакции органического синтеза и, в основном, ограничивается уровнем энергетического барьера ускоряе мой реакции. Низкая иммуногенность и высокая стабильность антител в кровотоке позволяет использовать абзимы для разрушения психоактивных веществ и актива ции предшественников противоопухолевых лекарственных средств in vivo.
«Ковалентный катализ» является одним из основополагающих механизмов, обеспечивающих уникальные свойства ферментов как наиболее эффективных биокатализаторов. Способность ферментов образовывать ковалентные ком плексы с механизм-зависимыми ингибиторами позволяет проводить их отбор посредством нуклеофильных остатков, принимающих непосредственное уча стие в «ковалентном катализе». Для получения абзимов, обладающих повы шенными нуклеофильными свойствами, механизм-зависимые ингибиторы се риновых гидролаз на основе фосфонатов могут быть использованы в двух на правлениях: «реакционная иммунизация» и «реакционная селекция». Исполь зование метода фагового дисплея, в свою очередь, открывает широчайшие воз можности по дизайну новых биокатализаторов и улучшению их каталитических свойств.
Другим возможным способом создания протеолитических антител являет ся получение антиидиотипических антител к протеазам, т.е. антител, направ ленных к области связывания антигена у антител, узнающих, в свою очередь, участок активного центра протеаз. Эффективность этого метода была ранее продемонстрирована на примерах получения каталитически активных анти идиотипических антител к ацетилхолинэстеразе и -лактамазе.
Необходимо отметить, что к настоящему моменту накоплено достаточно данных о спонтанном образовании каталитических антител в организме человека и животных при аутоиммунных патологиях. Одним из таких заболе ваний является рассеянный склероз (РС) - хроническое нейродегенеративное заболевание, приводящее к разрушению миелиновой оболочки нервных воло кон. Традиционно ведущая роль в патогенезе рассеянного склероза отводилась аутореактивным CD4+ Th1 клеткам, специфичным к компонентам миелиновой оболочки, в первую очередь – основному белку миелина (ОБМ). Однако в по следнее время значительное внимание было уделено роли гуморального ответа в патогенезе РС, и сейчас непосредственное участие аутоантител к ОБМ и мие лин олигодендроцит гликопротеину (МОГ) в демиелинизации не вызывает со мнений и подтверждено экспериментально. Таким образом, вместе со связывающей компонентой иммунноглобулинового ответа, особый фундамен тальный и практический научный интерес представляет изучение роли катали тических аутоантител к ОБМ в развитии РС. Структурно-функциональные ис следования патогенных аутоантител могут оказаться весьма перспективными как с точки зрения понимания механизмов развития заболевания, разработки новых подходов к терапии и диагностики, так и для решения фундаментальных вопросов иммунологии.
Очевидной областью потенциального медицинского применения абзимов яв ляется избирательное расщепление биополимеров и, в частности, белков. Высокая вероятность спонтанного образования абзимов в ходе развития аутоиммунного процесса, а также возможность индукции каталитического ответа на различные антигены у модельных животных с аутоиммунными патологиями дают основания для определенного оптимизма в области дизайна новых биокатализаторов – протеаз на основе антител.
Структурно-функциональный анализ искусственных биокатализаторов на основе антител может обеспечить пути познания «эволюционно совершенного» биокатализатора. А конструирование на их основе «каталитических вакцин», способных целенаправленно разрушать белки, ответственные за развитие кон кретных патологий, могло бы стать одним из подходов к получению «лекарств будущего».
Цель работы и основные задачи исследования. Целью данной работы было получение протеолитических антител определенной специфичности и их струк турно-функциональный анализ. Для этого были поставлены следующие задачи:
1. Поиск протеолитических антител при различных аутоиммунных патологиях человека и модельных животных и характеристика их ферментативных свойств.
2. Индукция протеолитических антител, расщепляющих поверхностный анти ген вируса ВИЧ-1 gp120, с использованием двух различных подходов: «реакцион ной» иммунизации и иммунизации на фоне аутоиммунного процесса.
3. Получение антиидиотипических антител с протеолитической активностью к участку активного центра эндопротеиназы - субтилизина Карлсберг.
4. Селекция из полусинтетической фаг-дисплейной библиотеки абзимов, об ладающих повышенными нуклеофильными свойствами, с использованием ме ханизм-зависимых ингибиторов сериновых гидролаз на основе фосфонатов.
Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые получены данные о наличии природных антител с различной каталитической активностью у мышей линий MRL-lpr/lpr, SJL/J и NZB/NZW F1, характеризующихся как спонтанно возникающими, так и индуцируемыми аутоиммунными заболева ниями, что делает эти линии перспективной моделью для направленного полу чения и детального изучения специфических абзимов с различной активностью.
В ходе исследований впервые продемонстрирована антиген специфическая каталитическая активность аутоантител к ОБМ у больных РС и модельных животных, коррелирующая с тяжестью заболевания. Определены преимущественных сайтов расщепления молекулы ОБМ абзимами, и оценены кинетические параметры данной реакции. По отношению к фрагментам ОБМ была изучена как связывающая, так и каталитическая активности аутоантител, изолированных из сывороток крови пациентов с РС, больных с другими нейро дегенеративными заболеваниями, здоровых доноров и модельных животных.
Гидролизу абзимами во всех приведенных случаях подвергался исключительно энцефалитогенный фрагмент ОБМ81-103. Обнаруженная связывающая и сайт специфическая каталитическая активность анти-ОБМ антител при РС и других, мимикрирующих, нейродегенеративных заболеваниях позволяет вплотную по дойти к разработке новых дифференциальных методов диагностики и эффек тивного лечения данной патологии.
Исследования антиидиотипического антитела 6B8E12 к субтилизину Карлсберг показали, что данное антитело способно расщеплять эфирную, а также пептидную связь, как в составе п-нитроанилидных производных пепти дов, так и белков. Эксперименты по определению специфичности протеолити ческого антитела показали общее сходство со специфичностью исходного фер мента. Экспрессия рекомбинантного антиидиотипического антитела в виде од ноцепочечного антитела и демонстрация его каталитической активности яви лась наиболее убедительным доказательством «абзиматической» природы об наруженной активности.
Впервые показано, что полученные в результате реакционной иммуниза ции пептидил дифенил фосфонатом (LAEEE-VPhos) поликлональные антитела обладают специфичностью по отношению к пептидному фрагменту «реакцион ного» гаптена и способны ковалентно взаимодействовать с фосфонатной со ставляющей, являющейся суицидальным ингибитором сериновых протеаз.
Кроме того, было продемонстрировано, что иммунизация мышей линии SJL гиб ридным белком, состоящим из константных областей поверхностного антигена ВИЧ-1 gp120 и фрагмента ОБМ, приводит к появлению протеолитических антител, избирательно расщепляющих антиген. Было показано, что полученные антитела способны специфически гидролизовать полноразмерный гликозилированный gp120, и установлен преимущественный сайт гидролиза gp120 Pro493-Leu494, на ходящийся в константной области белка.
При селекции полусинтетической библиотеки вариабельных фрагментов генов иммуноглобулинов человека с использованием п-нитрофенил 8-метил-8 азабицикло[3.2.1]октан фенилфосфоната получены рекомбинантные одноцепо чечные антитела, ковалентно взаимодействующие с необратимыми ингибито рами сериновых гидролаз. Определены аминокислотные остатки, участвующие в «ковалентном катализе». Показано, что отобранные рекомбинантные антитела способны гидролизовать амидную связь.
Результаты данной работы способствуют более глубокому пониманию путей получения искусственных биокатализаторов. Разработанные подходы могут быть использованы для индукции протеолитических антител, расщепляющих различные белковые субстраты. Оригинальные методы анализа ферментативной активности протеолитических антител могут быть использованы для изучения различных био катализатиров.
Публикации и апробация работы. По теме диссертации опубликовано статьи и патент. Результаты диссертации были представлены на международных российских и зарубежных конференциях: Third Al-Ain International Immunology Meeting: Immunoregulation in Chronic Inflammatory Disorders, (2008, Al-Ain, United Arab Emirates);
XX зимняя международная молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», (2008 г., Москва);
Biology of B-Cells in Health and Disease, (2007, Banff, Alberta);
Международная конференция «Biocatalysis 2007: Fundamentals & Applications», (2007, Moscow - St. Petersburg, Russian Federation);
VI симпозиум «Химия про теолитических ферментов» (Москва, 2007);
20th IUBMB International Congress of Biochemistry and Molecular Biology and 11th FAOBMB Congress (2006, Kyoto, Ja pan);
научная конференция «VIII чтения памяти академика Ю.А.Овчинникова», (2006, Москва);
1st Mediterranean workshop on Clinical Immunology, (2006, Evora, Portugal);
Международная конференция «Biocatalysis 2005: Fundamentals & Ap plications» (2005, St. Petersburg-Kizhiy-Valaam, Russian Federation);
6-ая между народная Энгельгардтовская конференция по молекулярной биологии (Санкт Петербург – Москва, 2003 г.).
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы (369 наименований). Диссертация изложена на 279 страницах и содер жит 69 рисунков и 13 таблиц.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
.
1. ПОЛУЧЕНИЕ КАТАЛИТИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ МЕТОДОМ «РЕАКЦИОННОЙ СЕЛЕКЦИИ» 1.1. Реакционная селекция антител из синтетической библио теки генов иммуноглобулинов человека.
Механизм-зависимая селекция комбинаторных библиотек является эффек тивным инструментом для получения новых биокатализаторов. Использование необратимых ингибиторов позволяет проводить селекцию по способности ак тивных биокатализаторов образовывать с ними ковалентные комплексы. На се годняшний день примеры химической селекции в применении к фаговому дис плею антител были в основном сфокусированы на нековалентном связывании с аналогами переходного состояния реакции или на ковалентной реакционной способности суицидальных субстратов.
В работе была использована полусинтетическая библиотека сегментов ва риабельных фрагментов генов иммуноглобулинов человека Griffin.1 (MRC, Center for proteing engineering, UK). Библиотека была построена на основе заро дышевых линий 49 сегментов вариабельных регионов тяжелых цепей, а также 26 и 21 сегмента вариабельных регионов и легких цепей, соответственно.
Третий гипервариабельный участок как тяжелых, так и легких цепей был ран домизирован методом ПЦР (Griffiths, Williams et al. 1994). Гены вырожденных одноцепочечных антител (ScFv) были проклонированы в фагемидный вектор pHEN2. Представительность библиотеки составила 1,2х10. Схематически биб лиотека Griffin.1 представлена на рисунке 1.
Для проведения химической селекции и скрининга были использованы п Рис. 1. А – создание синтетического репертуара тяжелых и легких цепей (Griffiths, Williams et al. 1994). Б – карта библиотеки, построенной на основе вектора pHEN2 и синтетического репертуара сегментов генов иммуноглобулинов человека.
нитрофенил 8метил-8-азабицикло[3.2.1]октан фенилфосфонат (Х) и его биоти нилированный аналог (Bt-X) (рис. 2).
Рис. 2. Структура п-нитрофенил 8-метил-8-азабицикло[3.2.1]октан фенилфосфо ната (А) и его биотинилированного аналога (Б).
Данный фосфонат был разработан как ингибитор сериновых гидролаз (Tramontano, Ivanov et al. 2000), и ранее был использован для детекции протео литической активности у природных антител при различных аутоиммунных на рушениях (Paul, Tramontano et al. 2001). В отличие от фторпроизводных фосфо натов, данное соединение устойчиво в водных растворах и не проявляет неспе цифической активности по отношению к инертным белкам.
Для селекции активных фаговых антител, способных ковалентно взаимо действовать с Bt-X, была использована стандартная схема, с некоторыми мо дификациями. Реакцию фаговых частиц с биотинилированным фосфонатом проводили в растворе. Для достижения специфичности реакции варьировали о о концентрацию Bt-X (от 40 до 1 мкМ) и температуру реакции (22 С и 37 С). Из быток Bt-X удаляли двукратным переосаждением фаговых частиц раствором ПЭГ/NaCl. Для предотвращения неспецифической сорбции использовали кис лый Трис-глициновый буфер (рН 2,7). Элюцию фаговых частиц проводили рас твором трипсина.
По описанной выше схеме были проведены три раунда селекции. После третьего раунда селекции поликлональные одноцепочечные антитела (ScFv) были проэкспрессированы в клетках HB2151. Растворимые ScFv были выделе ны из периплазматической фрак ции методом металло-хелатной хроматографии с использованием сорбента Ni-NTA. Полученные ре комбинантные антитела были ис пользованы для реакции с Bt-X.
Продукты реакции разделяли в по лиакриламидном геле (ПААГ) и детектировали методом иммуноб Рис. 3. Иммунодетекция поликлональных лоттинга с использованием стреп ScFv после реакции с Bt-X, методом тавидина, коньюгированного с пе иммуноблоттинга. На ПААГ наносили белки, выделенные из: десяти пулированных кло- роксидазой хрена. Наличие реком нов, отобранных после третьего раунда се- бинантных ScFv, контролировали лекции (1);
общего пула клонов, отобранных гибридизацией с моноклональны после третьего (2) и второго (3) раундов се библиотеки ми антителами к шестигистидино лекции;
неселектированной Griffin.1 (5). 4 – контрольное рекомбинантное вому эпитопу (рис. 3).
антитело к тиреоглобулину;
6 - 0,1 мкг трип Полученные результаты по сина. Детекцию осуществляли с использова нием стрептавидина или моноклональных зволили сделать вывод о том, что антител к 6xHis эпитопу, конъюгированных с селекция прошла успешно, и поли пероксидазой хрена.
клональные антитела, полученные после третьего раунда, способны ковалентно взаимодействовать с Bt-X фосфо натом. Девяносто шесть клонов после третьего раунда селекции были выбраны для дальнейшего изучения. Клоны, показавшие в ПЦР анализе наличие полно размерного фрагмента одноцепочечных антител, были использованы для экс прессии. Периплазматическая фракция была выделена для каждого индиви дуального клона и использована в реакции с Bt-X фосфонатом.
Реакционные смеси были проанализированы методом иммуноблоттинга, как описано выше.
Одиннадцать эффективно экс прессирующихся ScFv были отбраны на основании специфического мече ния полосы в области 28 кДа (обозна чены «А»). Семь рекомбинантных ан Рис. 4. Иммуноферментный анализ тител, не способных к ковалентной ScFv, после реакции с Bt-X. Адсорбцию модификации (обозначены «S»), но ScFv проводили в лунках с иммобилизо ванными анти c-myc антителами. Ком показавших хороший уровень экс плекс ScFv-Bt-X детектировали при по прессии, были выделены и, после рек- мощи стрептавидина, конъюгированного ции с биотинилированным фосфона- с пероксидазой хрена. S.1, S.3, S.7, S.9, S.11, S.14, S.17 - рекомбинантные анти том, использованы для иммунофер- тела, отобранные после третьего раун ментного анализа методом ELISA. да, неспособные ковалентно взаимодей Связывание с антигеном оценивали по ствовать с Bt-X. N - ScFv из неселекти рованной библиотеки, anti-TyrFv - одно сравнению с антителом из неселекти- цепочечное антитело к тиреоглобулину, рованной библиотеки, антителом, свя- Bt-X - биотинилированный фосфонат, инкубированный с реакционным буфе зывающем тиреоглобулин, и двумя ром. A.5 и A.17 - ScFv, отобранные по антителами, способными взаимодей- сле третьего раунда и взаимодействую ствовать с Bt-X ковалентно. Данные щие с фосфонатом ковалентно.
ИФАВ результатена рисунке 4. селекции из библиотеки были отобраны хорошо приведены трех раундов экспрессирующиеся растворимые одноцепочечные антитела, способные взаи модействовать с Bt-X фосфонатом либо ковалентно, либо нековалентно.
1.2. Структурно-функциональный анализ рекомбинантных одно цепочечных антител.
Нуклеотидная последовательность была определена для всех отобранных ScFv. На основании сравнения их первичных последовательностей были выде лены 8 (из 11) уникальных «реакционных» клонов (способных взаимодейство вать с Bt-X ковалентно) и 6 (из 7) связывающих клонов. Зародышевые линии и семейства тяжелых и легких цепей всех отобранных антител приведены в таб лице 1.
Интересно отметить, что легкие цепи всех отобранных ScFv, как связы вающих, так и реакционных, за исключением S.9, принадлежат к V1 семейст ву, причем DPL-3 сегмент является наиболее распространенным. Среди связы Таблица 1. CDR3 последовательности, сегменты и семейства зародышевых линий отобранных клонов.
* AAWDDSL, GTWDSSL, NSRDSSG Указанные последовательности не варьировались в библиотеке Griffin.1.
вающих клонов встречаются VH1, VH4 и VH3 семейства тяжелых цепей, одна ко для реакционных клонов основным семейством является VH4 (только A. относится к VH1 семейству). Таким образом, для связывания с Bt-X фосфона том необходимо наличие либо V1 DPL3, либо VH4 DP-67 сегментов антител, тогда как для ковалентного взаимодействия предпочтительной является комби нация DPL3 сегмента и VH4 семейства, исключения составляют только A.17 и A.21. Третий гипервариабельный регион тяжелых цепей реакционных клонов имеет некий консервативный консенсус, а последовательность FGGQQVP встречается в двух различных клонах, что может свидетельствовать о непосред ственном участии данного фрагмента в «ковалентном катализе».
В таблице 2 приведены кинетические характеристики реакции взаимодей ствия с фосфонатом Х для всех реакционных ScFv. Можно заметить, что для большин Таблица 2. Кинетические параметры реакции ScFv с фосфонатом Х.
ства ан тител ки нетиче ские па раметры варьиру ются в очень уз ком диапазоне. Однако антитело А.17 оказалось практически на порядок более - реакционно-способным (k2=0,32 мин ). Согласно ранее опубликованным дан ным значения констант скорости реакции для бутирилхолинэстеразы, химот -1 - рипсина и трипсина с фосфонатом Х составляли 1800;
2600 и 4100 М мин, соответственно (Tramontano, Ivanov et al. 2000). Т.е., наиболее активное антите ло А.17 обладает реакционной способностью, сравнимой с таковой для природ ных сериновых гидролаз.
Реакция А.17 с Bt-X фосфонатом ингибировалась прединкубацией с инги биторами сериновых протеаз, такими как: аминоэтилбензенсульфонил фторид (AEBSF) и аналоги валина и фенилаланина, карбоксильная группа которых за менена на дифенил фосфонат. В то же время прединкубация с более активными фтор фосфонатами, такими как: зарин и кумаринил этил п-трифтор ацетамидо фенилметил фосфонат, - не приводила к ингибированию реакции модификации А.17 Bt-X (рис. 5). Полученные данные свидетельствуют о специфичности ак тивного центра, отобранного в результате селекции на Bt-X фосфонат.
Наличие ковалентного взаимодействия между фосфонатом и антителами было подтверждено при помощи прямого метода масс-спектрометрии SELDI. В результате реакции одноцепочечных антител с биотинилированным фосфонатом происхо дит увеличение массы антител, соответст вующее ровно одному остатку Bt-X (646 Да).
Для определения нуклеофильного остатка, участвующего в ковалентном катализе, анти тело А.17 было промодифицировано Bt-X, Рис. 5. Иммунодетекция реакций подвергнуто исчерпывающему трипсинолизу, антитела А.17 с механизм и триптический гидролизат был проанализи- зависимыми ингибиторами сери рован методом масс-спектрометрии SELDI в новых протеаз. А.17 (1о мкМ) ин кубировали 1ч на 37 С с 5мМ сравнении с контролем (рис. 6). Было обна- AEBSF (1), 5мМ валил фосфоната ружено, что модификации подвергается пеп- (2), 5мМ фенилаланин фосфоната (3), с 100 мкМ зарина (4), тид 152 – 180 одноцепочечного антитела: мкМ кумаринил этил п VTISCSGSSSNIGNNYVSWYQQLPGTAPK трифторацетамидофенилметил (таб. 3). Данный пептид соответствует перво- фосфоната (5), 100 мкМ Х (6) и в отсутствии ингибитора (7). Затем му гипервариабельному региону легкой цепи все образцы инкубировали 1ч при о и фланкирующим его первому и второму кар- 37 С со 100 мкМ Bt-Х, разделяли в ПААГ. Детекцию осуществляли касным участкам. методом иммуноблоттинга с ис Модифицированный пептид был допол- пользованием стрептавидина, нительно очищен методом аффинной хрома- конъюгированного с пероксида зой хрена.
тографии с использованием стрептавидин сефарозы и подвергнут тандемной масс-спектрометрии. МС/МС анализ показал, что ковалентной модификации подвергается Tyr36 легкой цепи, расположен Таблица 3.
*Цистеины, выделенные жирным шрифтом, образуют дисульфидную связь.
** приведены средние молекулярные массы.
Рис. 6. SELDI масс-спектр триптического гидролизата одноцепочечного антитела А.17 (верхняя панель) и антитела А.17, модифицированного Bt-X фосфонатом (нижняя панель).
ный во втором каркасном регионе легкой цепи.
Аналогичным образом для других антител, было показано, что в «кова лентном катализе» принимает участие Tyr32, расположенный в первом гипер вариабельном регионе легкой цепи. Интересно отметить, что тирозины 32 и являются весьма консервативными аминокислотными остатками в белках им муноглобулиновой природы.
Одним из преимуществ работы с рекомбинантными антителами является возможность быстрого осуществления сайт-направленного мутагенеза. Для подтверждения масс-спектрометрических данных тирозины 32 и 36 легкой цепи А.17 и А.5 были заменены на фенилаланин, что не должно было сказаться на структуре антител, но могло кардинальным образом повлиять на их каталитиче ские свойства. Кроме того, тирозин 36 антитела А.17 был заменен на серин. Ан титела А.17 и А.5 и их мутанты были проэкспрессированы и выделены методом металл-хелатной хроматографии. Полученные препараты были использованы в реакции с Bt-X фосфонатом. В качестве отрицательного контроля использова лось одноцепочечное антитело к тиреоглобулину. Детекцию протекания реак ции вели методом иммуноблоттинга (рис. 7). Замена тирозина 32 на фенилала нин приводит к полной потере активности по отношению к Bt-X в случае анти тела А.5, однако это практически не влияет на активность антитела А.17. При этом, замена тирозина 36 на фенилаланин приводит к прямо противоположно му результату: мутанты А.17Y36F и A.17Y32,36F оказываются неактивными в реакции с фосфонатом. Неактивным оказался также и мутант A.17Y36S, содер жащий замену тирозина 36 на серин. Таким образом, результаты мутагенеза двух «реакционных» антител полностью подтвердили масс-спектрометрические исследования. Было также показано, что в случае ан титела А.17 важно не только наличие аминокис лотного остатка, содер жащего гидроксильную группу в положении легкой цепи, но и распо ложение этой гидроксиль ной группы в активном Рис. 7. Иммунодетекция антител А.17, А.5 и их мутан центре.
тов после взаимодействия с Bt-X. Комплекс детектиро А.17, как наиболее вали стрептавидином, конъюгированным с пероксида зой хрена (верхняя панель) и моноклональными анти реакционно-способный, телами к c-myc эпитопу (нижняя панель).
был проверен на амидаз ную активность на небольшой библиотеке метилкумарин амидных субстратов.
После трехстадийной хроматографической очистки одноцепочечное антитело катализировало гидролиз двух гидрофобных субстратов: Phe-MCA и Boc-Ala Ala-Phe-MCA. Амидазная активность отсутствовала в препарате мутированного антитела A.17Y36F, ингибировалась в результате прединкубации А.17 с фосфо натом X и исчезала в результате иммуноадсорбции антителами к с-myc эпито пу, иммобилизованными на агарозу. Гидролиз субстрата Phe-MCA, рекомби нантным одноцепочечным антителом А.17 подчиняется кинетической схеме -4 - Михаэлиса-Ментен (kcat = 2,1 ± 0,8 x 10 min, Km = 47 ±12 мкM).
В данном исследовании химическая селекция была применена для поиска белковых молекул, проявляющих ковалентную реакционную способность - хи мическую особенность, являющуюся универсальной для катализа. Одноцепо чечные антитела, полученные в этой работе, могут быть рассмотрены как при мер простейшего устройства активного центра ферментов и использованы в ка честве матрицы для получения новых искусственных ферментов методом целе направленного улучшения их свойств (directed enzyme evolution).
2. АНТИИДИОТИПИЧЕСКОЕ АНТИТЕЛО С ПРОТЕОЛИТИЧЕ СКОЙ ФУНКЦИЕЙ.
Данная часть работы проводилась в кооперации с коллегами из лаборато рии инженерии ферментов технологического университета Компьена (Фран ция). Идиотипическое моноклональное антитело 5-H4, полученное при имму низации мышей линии Balb/c субтилизином Карлсберг, обладало способностью связываться с активным центром фермента и специфически ингибировало его протеолитическую активность. Антиидиотипические антитела были получены при иммунизации мышей линии Balb/c антителом 5-H4. На первом этапе иссле дований методом иммуноферментного анализа (ELISA) было отобрано не сколько десятков моноклональных антител, узнающих вариабельный фрагмент идиотипа 5-H4. На следующей стадии антитела, выделенные из соответствую щих клонов, были протестированы на способность гидролизовать хромогенные субстраты субтилизина suc-AAPFpNa и suc-GGLpNa. Из всей панели проанали зированных клонов антитело 6B8-E12 наиболее эффективно катализировало гидролиз обоих субстратов и было выбрано для дальнейших исследований.
2.1. Исследование каталитической активности антиидиотипи ческого антитела 6B8-E12.
Для изучения протеолитической активности антитела были предвари тельно очищены методами аффинной хроматографии с использованием проте ин G-сефарозы и аффинного сорбента – иммобилизованных на сефарозе анти тел козы к иммуноглобулинам мыши, а также ионообменной хроматографии и гель-фильтрации.
Таб. 4. Кинетические параметры для реакций амидолиза и эстеролиза субтилизи ном Карлсберг и антителом 6B8-E12.
Полученные данные по гидролизу низкомолекулярных субстратов suc AAPFpNa и suc-GGLpNa и эстеролизу п-нитрофенилацетата приведены в Таб. 4.
Оказалось, что каталитическая эффективность (kкат/KМ) в реакции с suc AAPFpNa и для субтилизина и для антитела выше, чем для реакции suc GGLpNa, что предполагает сходную субстратную специфичность между фер ментом и антителом. В случае п-нитрофенилацетата каталитическая эффектив ность абзима и фермента сравнима, что можно объяснить слабой эстеролитиче ской активностью субтилизина.
Детекция протеолитической активности абзима проводилась при помощи метода, основанного на разгорании флуоресценции при протеолитическом рас щеплении белка, избыточно меченного флуорофорной группой. Прохождение реакции детектировалось по разго ранию флуоресценции во времени по сравнению с контролем. Суб стратом реакции являлся бычий сывороточный альбумин, избыточ но меченный флуоресцеинизотио цианатом (БСА-ФИТЦ). В качестве модельной протеазы для определе ния кинетических параметров дан ного метода использовался трип син. Протеолитическая активность наблюдалась как в случае полно- Рис. 8. Гидролиз субстрата БСА-ФИТЦ пол норазмерным антиидиотипическим антите размерного антитела 6B8-E12, так и лом 6B8-E12 (черный) и его Fab в случае его Fab-фрагмента, в то фрагментом (серый). Антитело 4H7-H3 ис пользовалось в качестве отрицательного время как увеличение флуоресцен- контроля.
ции в случае амидазного антитела 4H7-H3, гидролизующего suc-AAPFpNa, сводилась к фоновым значениям (Рис.
8). Кроме того, было показано, что антитело 6B8-E12, также как и субтилизин, способно специфически расщеплять РНКазу А.
Эндопротеиназная активность антитела 6B8-E12 уменьшалась при добав лении в реакционную смесь апротинина и, практически, сводилась до фоновых значений при действии классического ингибитора сериновых протеаз - PMSF, что предполагает участие в катализе нуклеофильного аминокислотного остатка (Рис. 9а). Кроме того, протеолитическое расщепление БСА-ФИТЦ абзимом ин а б Рис. 9. Ингибирование гидролиза БСА-ФИТЦ антителом 6B8-E12. 0,16 мкМ БСА-ФИТЦ инкубировалась: а - с 0,5 мкМ абзима (), в присутствии 1 мкМ апротинина () или мкМ PMSF (). б – с 1 мкМ 6B8-E12 в присутствии антитела 5-H4 (концентрация 5-H изменялась от 0 до 3 мкМ). Относительная активность рассчитывалась как отношение скорости гидролиза субстрата в присутствии 5-H4 к скорости гидролиза БСА-ФИТЦ в отсутствии идиотипа.
гибировалось в присутствии идиотипического антитела 5-H4 (Рис. 9б). Полу ченные результаты свидетельствуют о том, что каталитическая активность свя зана с антителом, и активный центр находится в антигенсвязывающем центре.
Альтернативное подтверждение «абзиматического» характера обнару женной активности и отсутствия вкла да в эту активность сопутствующих ферментативных примесей было по лучено методом зимографии. Анализ зимограммы (Рис. 10) показывает на личие протеолитической активности только у белков с Mw150 кДа (до рожки 2,3), в то время как флюорес ценция контрольных антител (дорожка 1) отсутствует.
Для исследования специфично сти полученного антиидиотипическо- Рис. 10. Зимограмма препарата антите го каталитического антитела был про- ла 6B8-E12. 100 нг (дорожка 2) и 200 нг (дорожка 3) белка разделялось в 10% веден масс-спектрометрический ана- ПААГ в присутствии флуоресцентного лиз продуктов протеолиза некоторых субстрата БСА-ФИТЦ, внесенного в гель природных биоактивных пептидов при полимеризации. Трипсин в количе стве 100 пг (дорожка 4) и 1 нг (дорожка (Рис. 11). Приведенные данные сви- 5). Mab к с-Myc эпитопу (200 нг) (до рожка 1).
детельствуют о том, что боль шинство иссле дованных пеп тидных суб стратов имеют сайты расщеп ления, содер жащие арома тические и алифатические аминокислот Рис. 11. Гидролиз биоактивных пептидов антителом 6B8-E12.
Гидролизуемая связь указана черной стрелкой для антитела, ные остатки до красной – для фермента;
ароматические аминокислотные остатки или после сай (прямоугольник), алифатические аминокислотные остатки (круг).
та, что в неко Продукты гидролиза детектировались масс-спектрометрически.
торой степени соответствует субстратной специфичности «родительского антигена» - субти лизина Карлсберг.
2.2. Структурный анализ вариабельных доменов моноклональных антител 5-H4 и 6B8-E12.
Для изучения структурных особенностей антител и экспрессии абзима в гетерологичной системе вариабельные домены легких и тяжелых цепей данных антител были клонированы и определена их нуклеотидная последовательность.
В качестве источника мРНК для клонирования генов вариабельных доме нов моноклональных антител 5-H4 и 6B8-E12 использовались соответствующие гибридомы. Наработка кДНК и амплификация генов вариабельных областей тяжелых и легких цепей (FvH и FvL) проводилась методом одностадийного RТ ПЦР. Амплификация вариабельных доменов легкой цепи (VL) проводилась с использованием прямых вырожденных нуклеотидных праймеров, соответст вующих N-концевым последовательностям легких цепей мышиных антител, и обратных вырожденных праймеров, соответствующих J-фрагментам мышиных антител. Вариабельные домены тяжелой цепи (VH) амплифицировали при по мощи набора прямых вырожденных праймеров, созданных на основе основных лидерных последовательностей тяжелых цепей антител мыши, и обратных праймеров для J-фрагментов. Очищенные ПЦР-продукты, соответствующие по размеру VL- и VH-фрагментам, были лигированы в плазмиду pGEM5Zf(+), об работанную рестриктазой EcoRV. Полученными лигатами трансформировали клетки E. coli штамма DH5. Для положительных клонов была определена нук леотидная последовательность цепей ДНК и предсказана первичная структура, соответствующая FvH и FvL районам иммуноглобулинов.
Сравнение аминокислотных последовательностей антитела 5-H4 с опуб ликованными ранее (Protein Data Bank) показало высокую степень сходства с антителами – ингибиторами ферментов: с легкой цепью антитела F11.2.32, по лученного против протеазы ВИЧ 1, и легкой цепью антитела 2b-2F;
которое ин гибирует рибонуклеазную активность ангиогенина, реагируя с его ключевыми каталитическими остатками. Антитело F11.2.32 имеет интересную структурную особенность: CDR1 легкой цепи образует «выпячивание», формируя подобие «пальца», который предположительно входит в активный сайт при связывании с протеазой ВИЧ 1.
Компьютерная трехмерная модель одноцепочечного антитела 5-H4 (Рис.12) была построена с ис пользованием программного обес печения Insight II на основе двух структурных моделей из Protein Data Bank с высокой VH+VL гомо логией: 1dzb (анти-лизоцим scFv 1F9) и 1jp5 (scFv фрагмент антите ла 1696 против протеазы ВИЧ 1).
Анализ 3D-модели антитела 5-H Рис. 12. Трехмерная модель вариабельного показал наличие плоской поверх фрагмента идиотипического антитела 5-H4.
Заметны, характерные выступающая часть ности, образованной тяжелой це легкой цепи (1) и плоский участок тяжелой пью, что характерно для белок цепи (2) связывающих антител, и наличие выступающей вперед легкой цепи, которая, возможно, взаимодействует с ак тивным центром субтилизина.
Для создания 3D-модели одноцепочечного антитела 6B8-E12 в качестве матрицы использовалась последовательность 1qok (scFv против антикарцино эмбрионального антигена). При анализе этой модели было также установлено наличие плоской поверхности, типичной для белок- и пептид-связывающих ан тител, и широкой «щели» между VH и VL CDR участками с высокой концен трацией гидрофобных аминокислотных остатков, что, возможно, и определяет алифатическую и ароматическую специфичность абзима 6B8-E12.
(Рис. 13) 2.3. Экспрессия рекомби нантного антитела 6B8 E12 в виде одноцепочечного антитела.
Генетическую конструкцию для экспрессии рекомбинантного одноцепочечного антитела созда вали по следующей схеме (Рис.
Рис. 13. Трехмерная модель вариабельного 14) фрагмента антиидиотипического антитела На основании полученных 6B8-E12. Стрелками указана щель между ва данных по определению нуклео- риабельными доменами легкой и тяжелой це пей.
тидной последовательности анти тела 6B8-E12 были созданы праймеры соответствующие N-концевым последо вательностям (11, 12) и J-фрагментам (13, 14) легких и тяжелых цепей. Для кло нирования в соответствующий вектор данные праймеры содержали необходи мые сайты для эндонуклеаз рестрикции. Гибкий серин-глициновый линкер ((Ser-Gly4)3) был создан на основе праймеров 15-17. Линкер соединяли с вариа бельным доменом легкой цепи с использованием сайтов PciI и NcoI, соответст венно. Полученный фрагмент (линкер-VL) был амплифицирован с использова нием праймеров 15 и 13 и лигирован с VH последовательностью при помощи XhoI и SalI сайтов рестрикции.
Конечный фрагмент, содержащий полную последовательность одноцепо чечного антитела, был амплифицирован с использованием праймеров 12 и 13, рестрицирован эндонуклеазами NcoI и NotI и клонирован по соответствующим сайтам в плазмидный вектор pET22N, созданный на основе вектора pET22b(+) и содержащий NcoI рестриктный сайт в последовательности периплазматическо го лидера. Дополнительный фрагмент, содержащий последовательности, коди рующие эпитоп с-myc и шестигистидиновый кластер, был клонирован в конеч ную конcтрукцию по сайтам BglII и NotI (Рис. 14Б).
Для экспрессии рекомбинантных белков был выбран штамм E.coli Рис. 14. Схема создания генетической конструкции для экспрессии рекомбинантного антитела 6B8-E12 в виде одноцепочечного антитела.
BL21(DE3). Для scFv были подобраны условия культивирования, приводящие к появлению максимально возможного количества целевого белка в растворимой форме. Одноцепочечное антитело выделяли в нативных условиях методом ме талло-хелатной хроматографии с использованием сорбента Co2+-TALON. До полнительная очистка была проведена с помощью ионообменной хроматогра фии на колонке MonoQ (Amersham). Экспрессированный белок также был до полнительно охарактеризован с помощью масс-спектрометрии продуктов его трипсинолиза. Полученные результаты свидетельствуют о соответствии экспе риментально полученного белка его теоретической пептидной карте.
2.4. Исследование каталитических свойств полученного одноце почечного антитела.
Полученное рекомбинантное антитело проявляло заметную амидазную активность (Рис. 15) по от ношению к метилкумари ламидным (MCA) субстра там, содержащим алифати ческие (Met-MCA, Leu MCA) и ароматические (Phe-MCA) аминокислот ные остатки, что соответст вует данным по субстрат- Рис. 15. Гидролиз MCA-пептидов (50 мкМ) рекомби ной специфичности исход- нантным scFv6B8-E12 (0,75 мкМ). () – Met-MCA, () ного антиидиотипического – Leu-MCA, () – Phe-MCA, () – буфер PBS антитела 6B8-E12.
Кинетика данных реакций подчинялась уравнению Михаэлиса-Ментен, что позволило рассчитать их кинетические параметры (Таб. 5). При этом не удалось зарегистрировать сколько-нибудь значительную протеолитическую активность по отношению к БСА-ФИТЦ.
Таким образом, реком бинантное одноцепочечное антитело, в общих чертах, со хранило функцию исходного моноклонального антитела, что свидетельствует в пользу Таб. 5. Кинетические параметры для реакций «абзиматической» природы амидолиза рекомбинантным scFv 6B8-E12.
обнаруженной активности.
Отсутствие активности по отношению к высокомолекулярному субстрату мо жет быть обусловлено структурными особенностями рекомбинантного антитела – наличием междоменного гибкого линкера, затрудняющего правильный фол динг продукта. По всей видимости, полученный «минимальный катализатор», не способен осуществить в полной мере сложную протеолитическую функцию, присущую полноразмерному антителу.
3. КАТАЛИТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ АНТИТЕЛ ПРИ АУТОИММУННЫХ ПАТОЛОГИЯХ.
Спонтанная индукция каталитических антител при ряде аутоиммунных нарушений, таких как системная красная волчанка (СКВ), ревматоидный арт рит, склеродермия, аутоиммунный миокардит и др. является сегодня неопро вержимым фактом. Протеолитическая деградация белковых антигенов абзима ми описана для тироглобулина при аутоиммунном тироидите, вазоактивного интестинального пептида у больных бронхиальной астмой, фактора VIII свер тывания крови у больных гемофилией А. Показана протеолитическая актив ность белка Бенс-Джонса. Однако, вопрос о функциональной роли абзимов при аутоиммунных патологиях, путях и закономерностях их появления остается от крытым и требует дальнейшего изучения.
3.1. Каталитическая активность нативных антител у мышей с аутоиммунными нарушениями.
Инбредные линии мышей с аутоиммунными заболеваниями являются мо делью для изучения многих аспектов аутоиммунности. У мышей линии MRL lpr/lpr, дефицитных по FAS, с возрастом возникают аутоиммунные нарушения, во многом сходные с СКВ и ревматоидным артритом. Новозеландские гибриды NZB/NZW F1 спонтанно развивают СКВ-подобный нефрит. Линия SJL/J харак теризуется целым рядом индуцируемых аутоиммунных нарушений, в том числе развитием экспериментального аллергического энцефаломиелита (ЕАЕ) – мо дели рассеянного склероза. Таким образом, исследование природного спектра каталитических антител, образующихся у этих мышей, представляет безуслов ный интерес. В данной работе впервые был проведен сравнительный анализ ка талитической активности антител у аутоиммунных мышей линий MRL-lpr/lpr, SJL/J и NZB/NZW F1 по отношению к линии BALB/c. Активность выделенных препаратов поликлональных IgG антител была охарактеризована по трём реак циям (ДНК-гидролиз, протеолиз, эстеролиз), для которых ранее была показана возможность катализа абзимами.
Протеолитическая активность в препаратах антител детектировалясь дву мя различными методами: флуоресцентным и энзиматическим. В флуоресцент ном тесте в качестве субстрата для протеолиза использовался бычий сыворо точный альбумин, избыточно меченный флуоресцеинизотиоцианатом (БСА ФИТЦ).
Кроме того, для изучения кинетических параметров реакции расщепления белков абзимами был разработан альтернативный, принципиально новый спо соб - энзиматический тест. Принцип данного метода, основан на использовании в качестве субстрата малых количеств высокоактивного фермента - рибонук леазы А, что позволяет достичь значительного молярного избытка фермента над субстратом и, таким образом, приблизить условия изучаемой реакции про теолиза к таковым для стандартной модели нестационарной кинетики (S0E).
На рис. 16 представлены результаты тестирования протеолитической активно сти в препаратах антител, выделенных из мышей линий MRL-lpr/lpr, SJL/J, NZB/NZW F1 и BALB/c. Полученные в ходе исследований результаты свиде тельствуют о наличие природных антител с различной каталитической актив ностью у мышей, характеризующихся как спонтанно возникающими, так и ин дуцируемыми аутоиммунными заболеваниями.
Рис. 16. Определение протеолитической активности препаратов антител, выделенных из мышей линий BALB/c, NZB/NZW F1, MRL-lpr/lpr, SJL/J, флуоресцентным методом(а) и энзиматическим методом(б). а - 1 мкг БСА-ФИТЦ инкубировали с 5мкг очищенных IgG в течение 24 и 48 часов. Изменение флуоресценции определяли в % по отношению к контролю (1 мкг БСА-ФИТЦ), инкубированному в тех же условиях. б РНКазу А в концентрации 11 нM инкубировали с очищенными IgG в концентрации 3. мкM в течение 17 и 32 часов. Степень гидролиза РНКазы определяли в % как отношение измеренной рибонуклеолитической активности к таковой в начальный момент времени.
Таким образом, охарактеризованные аутоиммунные линии мышей MRL lpr/lpr, SJL/J и NZB/NZW F1 являются перспективной моделью для направлен ного получения и изучения специфических абзимов с различной активностью.
3.2. Каталитические аутоантитела при рассеянном склерозе.
Механизмы развития системных аутоиммунных заболеваний, а также этиологические факторы, приводящие к возникновению этих нарушений, сего дня остаются неясными. При этом патологическая роль аутоантител в разруше нии тканей и клеточных структур не вызывает сомнений. Среди заболеваний аутоиммунной природы рассеянный склероз (РС) представляет собой серьез ную медицинскую и социальную проблему. Факторы, приводящие к массовой демиелинизации нервных волокон при данном заболевании, неизвестны. Одна из наиболее обоснованных теорий патогенеза отводит основную роль в разру шении миелина воспалительному процессу, связанному с аутоиммунными ре акциями. В этой связи нами была высказана гипотеза о роли каталитической функции аутоантител в протеолитическом расщеплении компонентов миелино вой оболочки. На предварительном этапе настоящего исследования был прове ден анализ неспецифической протеолитической активности антител, выделен ных из сывороток крови больных РС. Для детекции абзиматической активности был использован разработанный ранее флуоресцентный тест. Тестирование сы вороток на наличие специфических аутоантител к ОБМ проводили с помощью иммуноферментного анализа (ELISA). Анализ полученных данных выявил вы сокую корреляцию (р0.001) между концентрацией аутоантител и наличием протеолитической активности в препаратах антител у больных РС.
Таким образом, безусловный интерес представляло определение катали тической активности фракции аутоантител к ОБМ по отношению к антигену у больных РС и мо дельных живот ных. Индукцию ЕАЕ у мышей ли нии SJL проводи ли по классиче ской схеме дву кратной иммуни зацией ОБМ.
Выделение поликлональных Рис. 17. Электрофореграмма (А, Б, Г) и иммуноблот (В) образцов гидролиза ОБМ (А), БСА (В) и МОГ (Г) препаратами антител, полу- IgG из сывороток ченными из сывороток крови больных РС (А, Г) и мышей линии крови пациентов с SJL c индуцированным EAE (Б, В). Показана протеолитическая ак- РС и мышей ли тивность суммарного пула иммуноглобулинов класса G (IgG фрак ция), а также сорбирующихся (IgG ОБМ+) и не сорбирующихся нии SJL с ЕАЕ (IgG ОБМ-) на иммобилизованный ОБМ антител. Легкие и тяжелые осуществляли цепи антител обозначены Lc и Hc соответственно.
хроматографией на колонке HiTrap Protein-G Sepharose (Amersham), дальнейшее получение ОБМ-связывающих антител проводили методом аффинной хроматографии с использованием в качестве сорбента иммобилизованного на сефарозе основно го белка миелина.
Активность полученных препаратов антител была охарактеризована по реакциям протеолиза с использованием неспецифических (биотинилированный бычий сывороточный альбумин, миелин-олигодендроцитарный гликопротеин (МОГ), тиоредоксин I E. сoli) и специфи ческого (основной белок миелина) суб стратов. Результаты, представленные на рис. 17, свидетель ствуют о том, что препараты антител, выделенных из сы вороток больных рассеянным склеро Рис. 18. Электрофореграммы гидролиза ОБМ препаратами зом и модельных антител, полученными из сывороток крови больных РС, по мышей линии SJL с сле выделения методом гель-фильтрации в денатурирующих условиях (A, Б) и адсорбции (В) с антителами против имму- индуцированным ноглобулинов человека (-h) и мыши (-m). На профиле EAE, обладали ката элюции обозначены анализируемые фракции, соответст вующие 150 кДа.
литической активностью только в отношении основного белка мие лина. Контрольные антитела из пулированной сыворотки здоро вых доноров проявляли фоновый уровень активности ко всем опи санным субстратам.
Подтверждение «абзимати ческого» характера обнаруженной активности и отсутствия вклада в эту активность сопутствующих Рис.19. Электрофореграмма гидролиза ОБМ Fab ферментативных примесей было фрагментами антител, полученных из сывороток крови больных РС (А). Зиммограмма сорбирую получено методами гель щихся (ОБМ+) и не сорбирующихся (ОБМ-) на фильтрации (рис.18) в денатури- иммобилизованный ОБМ IgG антител (Б). Белки рующих условиях (6М мочевина разделялись в 5-20% ПААГ в присутствии флуо ресцентного субстрата БСА-ФИТЦ, внесенного в или буфер Gly-HCl, pH 2.6) и зи гель при полимеризации. Трипсин в количестве мографии (рис. 19б). Выделенные 10 пг и 30 пг использовался в качестве положи тельного контроля.
Fab фрагменты антител также обладали гидролизующей активностью по отно шению к ОБМ (рис.19а). Кроме того, обнаруженная активность исчезала после прединкубации с иммобилизованными антивидовыми антителами (рис. 18).
При сравнительном анализе протеолитической активности аутоантител, для 24 пациентов с различными стадиями РС была выявлена корреляция между уровнем каталитической активности аутоантител и глубиной развития патоло гического процесса РС согласно общепринятой шкале EDSS (expended disability status scale). Кроме того, обнаруженная активность ингибировалась копаксоном (Copaxone), известным лекарственным средством при РС, представляющим со бой сополимер лизина, глутаминовой кислоты, аланина и тирозина.
Методами иммуногистохимии удалось показать взаимодействие ОБМ Рис.20. Иммунодетекция взаимодействия ОБМ-специфичных антител с миелиновы ми структурами мозга. (А) Иммуноблот: ОБМ (m), гомогенат мозга крысы (h), указа ны антитела, использованные для детекции. (Б) Схема среза мозга крысы. (В) Ок рашивание миелина по Райту. Г-Е – двойное окрашивание: (Г) –MAт382 (Alexa 546, красный), (Д) – антитела пациента с РС (FITC, зеленый), (Е) – колокализация Г и Д, (Ж-З) – окрашивание на серийных срезах: (Ж) – MAт382 (Alexa 546, красный), (З) – IgG антитела мыши с ЕАЕ (Alexa 488, зеленый).
специфичных абзимов с миелином на нативных срезах мозга и колокализовать их с моноклональным антителом к ОБМ МАт 382, что свидетельствует о по тенциальной возможности взаимодействия ОБМ-абзимов с миелиновыми структурами мозга (рис.20).
Определение сайт-специфичности гидролиза основного белка миелина аутоантителами.
Для определения сайт-специфичности гидролиза ОБМ аутоантителами было применено сочетание методов обращенно-фазовой хроматографии, трици нового белкового электрофореза и масспектрометрии SELDI. На первом этапе продукты гидролиза были разделены с использованием обращенно-фазовой хроматографии на колонке C4 (Рис. 21А). Далее, образцы фракций анализирова ли с использованием трицинового электрофореза, с последующей детекцией Рис. 21. Обращенно-фазовая хроматография продуктов гидролиза ОБМ аутоанти телами (А) и анализ образцов посредством трицинового электрофореза (Б): 1 - ин тактный ОБМ, 2-8 - фракции, полученные при разделении продуктов гидролиза на обращенной фазе, 9 - гидролизат без разделения;
показаны идентифицированные фрагменты. (В) основные сайты гидролиза ОБМ специфическими аутоантителами (красные стрелки). Желтым отмечены иммунодоминатные районы белка, оранже вым обозначен энцефалитогенный пептид.
низкомолекулярных пептидов при помощи флуоресцентного красителя Sypro Orange (Рис. 21Б), и SELDI-масспектрометрии.
В результате удалось идентифицировать каждый фрагмент в структуре основного белка миелина и показать присутствие шести основных сайтов гид ролиза ОБМ специфическими аутоантителами (Рис. 21В). Пять из них располо жены в иммунодоминантных районах ОБМ, опознаваемых молекулами главного комплекса гистосовместимости II класса, ассоциированными с рассеянным склерозом, а два - локализованы на энцефалитогенном пептиде – индукторе EAE у модельных животных.
Исследование субстратной специфичности анти-ОБМ аутоантител на модельных пептидах.
Дальнейшее исследование специфичности аутоантител проводили с по мощью сконструированной «эпитопной библиотеки» перекрывающихся пепти Рис. 22. (А) Схема плазмидного вектора, сконструированного для экспрессии слит ного белка тиоредоксина I E. сoli c фрагментами основного белка миелина. (Б) Ами нокислотная последовательность ОБМ человека. Показано распределение пепти дов на последовательности основного белка миелина.
дов в составе слитных белков с тиоредоксином, соответствующей полной по следовательности ОБМ. Этот подход был выбран на основании концепции предпочтительного «представления» субстратных пептидов в растворе в составе биополимера. Для изучения протеолиза изолированных эпитопов ОБМ специ фичными антителами на основе экспрессионного вектора pET-32b-CH(+) были созданы двенадцать генно-инженерных конструкций, содержащих последова тельности, кодирующие различные фрагменты основного белка миелина чело века (Рис. 22). Между тиоредоксином и последовательностью пептидов основ ного белка миелина был помещен линкер (SGGGG)3S, для придания гибкости и подвижности конструируемым рекомбинантным белкам. Наличие подобного пептидного линкера содействует корректной презентации фрагментов ОБМ в составе фьюжн-белка с тиоредоксином.
Фрагменты ДНК, кодирующие данные пептиды (ОБМ1-12) и серин глициновый линкер (Link), были наработаны методом ПЦР с использованием перекрывающихся специфических олигонуклеотидных праймеров, содержащих дополнительно сайты рестрикции (Рис. 23). Затем полученные ПЦР продукты пептидов ОБМ были рестрицированы эндонуклеазой BamHI и лигированы с ре стрицированным BglII линкером, с одновременной рестрикцией BamHI и BglII для удаления из реакционной смеси нецелевых продуктов лигирования. Лигаз ная смесь была использована для амплификации фрагментов Link-ОБМ методом ПЦР с использованием концевых специфических олигонуклеотидных праймеров.
Наработанный таким образом фрагмент ДНК был рестрицирован эндонуклеазами PciI и BclI и лигиро ван в NcoI-BamHI рестрицированный вектор pET-32b-CH(+). Полученным лигатом трансформировали клетки E.
coli штамма DH5.
Экспрессию проводили в клет ках E. coli штамма BL21(DE3) в стандартных условиях. Поскольку все рекомбинантные белки содержат Рис. 23. Схема получения экспрессионного вектора pET-32b-ОБМпептид-CH(+), содер- (His)6 кластеры, их выделение из жащего фрагменты 1-12 ОБМ клеточных лизатов проводилось с применением металл-хелатной хроматогра фии. Дальнейшая очистка велась на ионообменной смоле MonoS с последующей гель-фильтрацией на колонке Superdex75. Гомогенность полученных препаратов контролировалась электрофорезом с окрашиванием Кумасси и иммуноблот тингом с использованием моноклональных антител к c-myc эпитопу и составля ла более 95%.
Для характеристики субстрат ной специфичности антител, фьюжн белки тиоредоксина с фрагментами ОБМ инкубировались с иммуноглобу линами (суммарная IgG фракция), изолированными из сыворотки крови 26 больных рассеянным склерозом, пациентов с другими нейродегенера тивными заболеваниями (OND), здоровых доноров (HD) и мышей ау тоиммунной линии SJL с ЕАЕ. Как видно из приведенных электрофоре грамм (Рис. 24), в случае пациентов с РС и остеохондрозом протеолизу под вергались только пептиды, содержа щие энцефалитогенную последова тельность ОБМ. С другой стороны у мышей SJL c EAE, предрасположен ных к развитию аутоиммунных забо леваний, наблюдался множественный гидролиз перекрывающихся эпитопов ОБМ. Каталитические свойства про явили антитела, изолированные из 77% пациентов с прогрессирующим и 85% с ремитирующим типом течения РС. Среди больных с OND и здоровых Рис. 24. Сверху - вниз: Контроль;
гидролиз доноров каталитического ответа не модельных пептидов антителами, изолиро ванными из пациента с РС, остеохондро наблюдалось, за исключением двух зом, мышей линии SJL с ЕАЕ;
трипсином, ка случаев остеохондроза, при которых тепсином D и ММР 3.
было отмечено наличие каталитической деградации пептида ОБМ под действи ем аутоантител. Причем эти больные характеризовались значительной длитель ностью патологического процесса и серьезными нейрональными поражениями.
Контроль специфичности гидролиза осуществлялся разрезанием рекомбинант ных белков трипсином, катепсином D и металлопротеазой матрикса 3 (MMP-3) (Рис. 24).
Для всех исследованных антител методом масспектрометрии SELDI сайты гидролиза были локализованы исключительно в рекомбинантных фрагментах ОБМ (Рис. 25), и повторяют таковые в нативном белке. При детальном анализе продуктов расщепления энцефалитогенного пептида антителами было обнару Рис. 25. Последовательности пептидных фрагментов ОБМ человека. Сайты гидролиза рекомбинантных фрагментов антителами, изолированными из пациентов с рассеянным склерозом, обозначены красным;
из мышей линии SJL с EAE - отмечены белым.
жено, что сайтами гидролиза являются как Lys91 так и Arg97, причем лишь у двух пациентов степень расщепления по двум приведенным сайтам оказалась срав нимой. В большинстве случаев при РС наиболее предпочтительным для гидро лиза являлся аргининовый сайт, и антитела, специфичные к участку ОБМ81-103, составляют подавляющее большинство в общем пуле ОБМ-гидролизующих им муноглобулинов. Полученные результаты хорошо согласуются с литературны ми данными относительно В-клеток, изолированных из больных РС, и узнаю щих преимущественно данный эпитоп, а также - с фактом значительной имму нодоминантности этого фрагмента при представлении молекулами главного комплекса гистосовместимости II класса патогенных T-клеток.
Специфичность гидролиза ОБМ аутоантителами позволила разработать «модельный субстрат» для анализа сывороток больных РС и скрининга гибри дом, продуцирующих моноклональные каталитические антитела к ОБМ. Для этого на основе вектора pQЕ30 была создана генно-инженерная конструкция, экспрессирующая два флуоресцентных белка PS-CFP2 и TurboYF, соединенные пептидом ОБМ81-103, содержащим энцефалитогенную последовательность, Рис. 26. (А) Принципиальная схема FRET-подхода к исследованию кинетики абзи матической реакции. (Б,В) Расщепление белка EPeFRET абзимами и модельными протеазами соответственно. Во врезке показано изменение спектра флуоресценции во времени.
так называемый «EPeFRET» - от Encephalitogenic Peptide Fluorescence Resonance Enegy Transfer (Рис. 26А). При разрезании линкера прекращается резонансный перенос энергии и происходит падение флуоресценции (Рис. 26Б, В).
Были получены кинетические константы гидролиза EPeFRET аутоантите лами и ингибирование данной реакции слитными белками и копаксоном.
Можно предположить, что достаточно медленное, но направленное дейст вие антител по протеолизу ОБМ возможно играет определенную роль в разру шении миелиновых структур и патогенезе рассеянного склероза. Нами показано, что каталитическая активность аутоантител по отношению к ОБМ и его фраг ментам выделяет рассеянный склероз в сравнении с другими нейродегенератив ными заболеваниями значительно больше, чем связывание с данным антигеном.
Продемонстрированная сайт-специфичность в отношении основного белка мие лина и его презентированных пептидов позволяет вплотную подойти к созданию тест-систем на основе сконструированных модельных субстратов.
4. ПОЛУЧЕНИЕ КАТАЛИТИЧЕСКИХ АНТИТЕЛ, РАСЩЕПЛЯЮЩИХ ПОВЕРХНОСТНЫЙ ГЛИКОПРОТЕИН ВИЧ-1 GP Создание протеазы, способной узнавать и гидролизовать избранный белковый эпитоп, является одной из фундаментальных проблем современной биохимии и мо лекулярной биологии. В качестве белка-мишени в настоящей работе был выбран поверхностный гликопротеин gp120 вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1), яв ляющийся основным антигеном вируса и ключевым участником системы подавле ния вирусом иммунного ответа реципиента (Poignard, Saphire et al. 2001). Выбор объекта обусловлен безуспешностью попыток нейтрализовать ВИЧ in vivo антите лами, полученными непосредственно иммунизацией животных поверхностными антигенами и их аналогами (Burton 1997;
Tang, Kuhen et al. 1999;
Burton and Parren 2000), что является следствием гипервариабельности иммунодоминантных облас тей gp120 и маскирования константных частей белка в результате тримеризации gp120 и экранирования многочисленными N-связанными олигосахаридными груп пами (Pollard, Meier et al. 1991;
Blankson, Persaud et al. 2002). Расщепление gp120 в организме пациента по специфическим сайтам позволит преодолеть иммунологиче скую мимикрию вируса, нарушить упаковку поверхностного антигена, экспониро вать его константные эпитопы и обеспечить возможность элиминации или эффек тивного сдерживания инфекции ВИЧ иммунной системой пациента.
Как уже отмечалось выше, природные протеолитические антитела часто обна руживались при аутоиммунных патологиях. Одновременно с этим было показано, что при иммунизации аналогом переходного состояния реакции гидролиза сложных эфиров (фосфонатом) мышей линий SJL и MRL/lpr, склонных к аутоиммунным па тологиям, частота появления гидролитических абзимов значительно выше, чем в случае контрольной линии Balb/c (Tawfik, Chap et al. 1995).
На основании всего вышесказанного для получения антител, расщепляющих gp120, было предложено использовать два различных подхода: «реакционную им мунизацию» и индукцию антиген-специфического каталитического ответа на фоне аутоиммунного процесса.
4.1. Индукция эпитоп-специфического каталитического отве та методом «реакционной иммунизации».
Суть метода «реакционной иммунизации» заключается в индукции анти тел, которые в отличие от «традиционных» связываются с гаптеном ковалентно.
Образование ковалентного интермедиата с фторпроизводными фосфонатов бы ло показано для каталитических эстеролитических антител 17Е8 (Zhou, Guo et al. 1994;
Guo, Huang et al. 1995) и 9А8 (Kolesnikov, Kozyr et al. 2000). Эти факты позволяют предположить, что ковалентный каталитический аппарат сериновых гидролаз в абзимах может быть воспроизведен. Для получения специфического абзима методом реакционной иммунизации необходимо, чтобы гаптен пред ставлял собой структуру, «голова» которой содержит механизм-зависимый ин гибитор протеазы, а «хвост» – пептидильную цепь, соответствующую по длине участку, взаимодействующему в активном центре фермента.
В качестве полипептидной цепи была выбрана небольшая последователь ность Leu-Ala-Glu-Glu-Glu-Val, соответствующая аминокислотным остаткам 265-270 гликопротеина вируса иммунодефицита человека 1 (ВИЧ-1) – gp120.
Ранее было показано (Pollard, Meier et al. 1991), что специфичное расщепление по этому сайту приводит к тому, что gp120 теряет свою способность связывать ся с рецептором CD4, что не позволяет вирусу инфицировать CD4+ клетки.
Данный пептид был модифицирован по С-концевой аминокислоте группой ме ханизм-зависимого ингибитора – дифенил фосфонатом. Такой пептид относит ся к пептидил -аминоалкилфосфонатам. Схема его синтеза и структура пред ставлены на рис. 27. Необходимо отметить, что важным свойством выбранного гаптена является низкая неспецифическая реакционная способность и высокая стабильность в водных растворах.
Рис. 27. Схема синтеза пептидил фосфоната – LAEEEV-Phos.
Поскольку известно, что малые молекулы, в большинстве случаев, являют ся слабыми иммуногенами, для проведения эффективной иммунизации синте зированные реакционные пептиды были конъюгированы с KLH. Для присоеди нения N-концевой аминогруппы пептида к доступным аминогруппам KLH был выбран метод с предварительной активацией носителя при помощи бис[сулфосукцинимидилсуберата] (BS, Pierce) и последующим присоединени ем гаптена. Для эффективной детекции каталитических антител N-конец синте зированного пептидил фосфоната был модифицирован активированным эфиром биотина.
Для получения эпитоп специфических абзимов использовали три линии мышей: MRL/lpr, NZB/NZW F1 и SJL – яв ляющихся моделями раз личных аутоиммунных за болеваний. Иммунизацию мышей данных линий про Рис. 28. Иммуноферментный анализ сывороток крови иммунизированных мышей. Адсорбцию про- водили по ранее опублико водили в лунках с иммобилизованными антигена ванной схеме получения ми. Комплекс детектировали при помощи антиви каталитических антител к довых антител, конъюгированных с пероксидазой хрена. аналогам переходного со стояния ферментативных реакций (Tawfik, Chap et al. 1995). Сравнительный анализ специфического им мунного ответа на антиген у разных иммунизированных мышей всех трех ли ний (рис. 28) проводили методом иммуноферментного анализа (ELISA). В каче стве антигена был использован исходный пептидилфосфонат, меченный биоти ном;
биотинилированный Val-фосфонат и нитрофенилметил-п биотинилфенилметил фосфонат (Bt-Y), для которого ранее была показана спе цифическая ковалентная модификация активного центра абзимов (Kolesnikov, Kozyr et al. 2000). Для всех трех линий иммунизированных мышей оказалось, что антитела обладают высокой специфичностью к модифицированному пеп тидному фрагменту антигена, не взаимодействуют в условиях данного экспе римента со свободным Val-фосфонатом, и, в то же время, связываются с более активным и менее специфичным модифицирующим агентом - Bt-Y.
Дальнейшее изучение типа взаимодействия полученных антител с реакци онным пептидом проводилось на аффинно-очищенных препаратах IgG. Иммо билизованный на мембране ковалентный комплекс антиген–антитело детекти ровали методом иммуноблоттинга. Результаты данного эксперимента (рис. 29) свидетельствуют о наличии в препаратах поликлональных антител, выделенных из аутоиммунных мышей, иммунизированных «реакционным» пептидом LAEEEV-Phos, как легких, так и тяжелых цепей иммуноглобулинов, способных к ковалентной модификации пептидом.
Т.е. в ре зультате ре акционной иммунизации образовались антитела, спо собные кова лентно взаи модейство вать с гапте ном и строго Рис. 29. Электрофореграмма и иммуноблоттинг поликлональных ан специфичные тител (1 мкг), выделенных из иммунизированных мышей линий SJL, MRL и NZB/NZW F1 после реакции с пептидил фосфонатом - LAEEEV- к его пептид Phos (0,1 мкМ). Трипсин (1 мкг), БСА (5 мкг) и поликлональные IgG, выделенные из мыши линии BALB/c (1 мкг), были использованы в ной компо качестве положительного и отрицательного контролей, соответст- ненте.
венно.
В резуль тате скрининга панели гибридом, полученных из селезенок опытных мышей, были отобраны 7 моноклональных антител, способных к ковалентной модифи кации реакционным пептидил фосфонатом. Причем в двух случаях модифика ции подвергались легкие цепи антител, а в пяти – тяжелые.
ДНК, соответствующая вариабельным доменам данных антител, была на работана методом ПЦР, и определена нуклеотидная последовательность. Одно цепочечные антитела были экспрессированны в прокариотической системе. Ре комбинантные антитела Е11 и Е6 обладали каталитической активностью по от ношению к низкомолекулярному субстрату LAEEEV-MCA. Кинетические па -3 - раметры гидролиза амидной связи составили: kcat = 1,1 ± 0,5 x 10 min, Km = -4 - 53 ±14 мкM для антитела Е6 и kcat =3,2 ± 0,7 x 10 min, Km = 48 ±11 мкM для антитела Е11.
Проведенные эксперименты показали принципиальную возможность по лучения специфичных к антигену каталитических антител методом реакцион ной иммунизации.
4.2. Получение каталитических антител, специфичных к gp120, на фоне индуцированного аутоиммунного заболевания.
Для целей настоящего исследования была выбрана линия мышей SJL, разви вающая ЕАЕ при иммунизации иммунодоминантным пептидом ОБМ 85-97 (Sakai, Zamvil et al. 1988;
Tan, Kennedy et al. 1992).
Была разработана оригинальная схема индукции антиген-специфического про теолитического иммунного ответа при иммунизации животных слитным белком, состоящим из константных областей gp120 и пептида ОБМ 85-101.
Получение слитных белков для иммунизации и изучения свойств ан тител Исходя из опубликованных исследований по структуре, иммуногенности и функциональной активности gp120 (Hansen, Lund et al. 1996;
Shioda, Oka et al. 1997;
Sullivan, Sun et al. 1998) были определены участки белка с относительно констант ной последовательностью. Для дальнейшего использования был выбран химерный полипептид, состоящий из трех фрагментов gp120 (аббревиатуры I, II, III) c делеци ей первого, второго и третьего гипервариабельных регионов и окружающих их гид рофобных альфа-спиральных участков 1, 2;
также был удален лидерный пептид gp120 и С-концевой альфа-спиральный участок 6. В качестве исходной матрицы для получения “минимального” белка была использована последовательность гена HXB2-env, соответстующий клон был предоставлен AIDS Research and Reference Reagent Program, Division of AIDS, NIH.
Был получен набор генетических конструкций, кодирующих выбранные фраг менты gp120, тиоредоксин I E.coli, гексагистидиновые кластеры, эпитоп человече ского белка р62c-myc и пептид ОБМ 85-101, в различных комбинациях (рис. 30).
Для экспрессии рекомбинантных белков был выбран штамм E.coli BL21(DE3). Полипептиды trx, и 1-3 выделяли методом металло-хелатной хро матографии в нативных условиях, тогда как для продуктов конструкций 4- использовали денатурирующие условия. Полученные белки были охарактери зованы масс-спектрометрически.
Для исследования сайт-специфичности протеолитических антител была также получена растворимая форма белка trx-gp120I-III при экспрессии в штамме E.coli Origami B (DE3), с последующей преципитацией белка сульфатом аммония, метал ло-хелатной хроматографией и анионообменной хроматографей.
Рис. 30. Схема участков экспрессионных конструкций, кодирующих рекомбинантные белки. Названия рекомбинантных белков приведены справа, номера конструкций – слева.
Поскольку нативный gp120 содержит 22-24 N-связанные олигосахаридные группы (Yeh, Seals et al. 1993), гликозилированный полноразмерный gp120 для це лей настоящего исследования был получен в бакуловирусной системе экспресии.
Были использованы вектор pMelBacB и фрагмент гена env из плазмиды HXB2-env, соответствующий зрелому gp120. Целевой белок был выделен из супернатанта культуры и очищен до гомогенности по ДСН-ПААГ. Идентичность очищенного gp120 была подтверждена N-концевым секвенированием и энзиматическим N дегликозилированием;
электрофоретическая подвижность дегликозилированного gp120 соответствовала теоретической массе (56 кДа). Таким образом, был получен набор рекомбинантных белков, достаточный для иммунизации животных, изучения параметров иммунного ответа и характеризации каталитических антител.
Индукция экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита у мышей.
Индукция ЕАЕ у мышей линии SJL была проведена при помощи слитного белка gp120I-IIImbp или пептида ОБМ85-97 в соответствии со стандартным прото колом (Miller and Karpus 1996). Распределение мышей по опытным и контрольным группам приведено в таб. 6.
Развитие ЕАЕ у мышей, иммунизированных gp120I-IIImbp или пептидом ОБМ85-97, было дополнительно исследовано путем гистологического анализа, про веденного через 30 дней после начала иммунизации. На срезах тканей были зафик сированы изменения, типичные для развивающегося ЕАЕ (Schwartz 1993), что по казывает возможность индукции ЕАЕ пептидом ОБМ85-101 в составе слитного белка.
Группа животных SJL-1 SJL-2 SJL-3 SJL-4 SJL-5 SJL-6 Balb-1 Balb- Пептид gp120I Иммуноген ОБМ Gp120I-IIImbp gp120I-III IIImbp 85- Доза, мкг 170 150 300 150 300 - - - + + + + - + trx-gp120I-III - - + + + + - + trx- gp120I-II - - + + + + - + trx- gp120III - + + + - - - + trx-mbp - + + + - - - + ОБМ85-97 – БСА - - - - - - - Trx Таб. 6. Специфический иммунный ответ мышей линии SJL, по данным ИФА. Результат ИФА считали положительным, если для всех мышей из исследуемой группы величина сиг нала в три и более раз превышала фоновое значение. Разведение исследуемых сыворо ток при анализе варьировалось для разных антигенов. Все группы состояли из 5 мышей.
Каталитические свойства полученных антител Исследование протеолитических свойств антител иммунизированных мышей проводилось с помощью ранее разработанного флуоресцентного теста. В качестве специфического субстрата использовался gp120I-III, избыточно меченый флюорес цеинизотиоцианатом (ФИТЦ). Как видно из Рис. 32, при иммунизации мышей слитным белком gp120I-III-mbp происходит значительное увеличение протеолити ческой активности антител по отношению к антигену, достигающее 9-ти раз при иммунизации gp120I-III-mbp в дозе 150 мкг/мышь, по сравнению с контролями.
Уменьшение активности антител в случае иммунизации gp120I-III-mbp в дозе мкг/мышь, может быть объяснено более интенсивным маскирова нием субстрата связывающими антителами. Также следует отме тить, что уровень протеолитиче ской активности антител по от ношению к неспецифическому субстрату ФИТЦ-БСА практиче ски одинаков для иммунизиро Рис. 32. Протеолитическая активность антител. ванных и интактных мышей SJL Увеличение интенсивности флюоресценции gp120I- (данные не приводятся).
III-ФИТЦ при распаде субстрата. Относительное увеличение интенсивности флюоресценции вычис- Установление сайт лено как отношение разности интенсивности флюо- специфичности протеоли ресценции в момент времени t (Ft) и интенсивности тических антител к gp флюоресценции в момент начала реакции (F0) к ин Специфичность протеолиза, тенсивности флюоресценции в момент начала реак ции (F0): A=(Ft-F0)/F0. Приведены средние значения катализируемого исследуемыми для трех независимых измерений и стандартное от антителами, была исследована клонение.
при использовании в качестве субстрата gp120I-III и гликозилированного полноразмерного gp120, а также кон трольного субстрата – БСА. Продукты гидролиза анализировали при помощи ДСН ПААГ и блоттинга (Рис. 32). Распад контрольного субстрата БСА под действием антител не наблюдался ни в одном из случаев. В то же время при инкубации анти тел, выделенных из мышей группы SJL-3, с gp120I-III и гликозилированным gp наблюдалось появление единственного крупного продукта расщепления, обозна ченного треугольником. В случае негликозилированного gp120I-III разница в моле кулярной массе субстрата и продукта гидролиза, рассчитанная по изменению под вижности полос, составила около 3 кДа, что соответствует расположению сайта гидролиза в районе C-конца gp120 перед гексагистидиновым кластером либо в N концевой части белка.
Для точного определения сайта гидролиза gp120 антителами был использован слитный белок Trx-gp120I-III, полученный в растворимой форме. Он содержит оди ночный гексагистидиновый кластер между доменами тиоредоксина и gp120 и два кластера на C-конце белка. Для отделения пептидных продуктов протеолиза gp и точного измерения их молекулярной массы была применена масс-спектометрия SELDI. Наличие у предполагаемых продуктов реакции гексагистидиновых класте Рис. 32. Катализируемый антителами гидролиз gp120I-III по данным ДСН-ПААГ (A), глико зилированного gp120 по данным ДСН-ПААГ (Б) и иммуноблоттинга (В);
отсутствие гидролиза биотинилированного БСА по данным ДСН-ПААГ (Г) и иммуноблоттинга (Д). Гели окрашивали серебром (А, Б, Г) либо проводили иммуноблоттинг с использованием конъюгата нейтрави дина и пероксидазы хрена (В, Д). Молекулярные массы полос маркера указаны стрелками и приведены в кДа, тяжелые цепи IgG, легкие цепи и продукты распада gp120 отмечены над писями Hc, Lc и треугольником, соответственно. Ат – антитела.
ров позволило использовать мишень, содержащую иммобилизованные комплексы нитрилтриуксусной кислоты и ионов никеля. Масс-спектрометрический анализ продуктов гидролиза Trx-gp120I-III под действием антител показал (рис. 33), что основной пик на опытном спектре соответствует пептиду с молекулярной массой 5526.8 Да, что соответствует расположению сайта гидролиза между остатками Pro493 и Leu494 (позиции обозначены в соответствии с номенклатурой HXB2CG).
В молекуле слитного белка Trx-gp120I-III этот сайт соответствует позициям 484 485;
теоретическая молекулярная масса отщепляемого пептида – 5528 Да, что соот ветствует ошибке определения 0,02%.
Выявленный сайт гидролиза находится в относительно консервативной облас ти gp120. Согласно сведениям базы данных, содержащей большинство известных вариантов последовательностей белка gp120 ВИЧ-1 (HIV Sequence Database, 2002), 12-членный пептид, окружающий сайт гидролиза, содержится полностью в 34% по следовательностей. 7-членные пептиды, содержащие сайт гидролиза и составляю щие типичный линейный эпитоп, узнаваемый антителами, содержатся целиком в 48% последовательностей (среднее значение для 6 возможных пептидов). Таким Рис. 33. Масс-спектрометрический анализ гидролиза gp120 антителами.
По оси абсцисс отложено отношение массы молекулярных ионов к их за ряду, по оси ординат - интенсивность сигнала. Основной пик, соответст вующий C-концевому пептиду trx gp120I-III, обозначен стрелкой. Кон трольные спектры сдвинуты вниз, молекулярные массы приведены в Да.
образом, около половины из охарактеризованных вариантов ВИЧ-1 потенциально чувствительны к действию изучаемых протеолитических антител.
ВЫВОДЫ.
1. Впервые продемонстрирована каталитическая активность природных антител у мышей с SPF статусом линий MRL-lpr/lpr, SJL/J и NZB/NZW F1, характери зующихся как спонтанно возникающими, так и индуцируемыми аутоиммунны ми заболеваниями, что делает эти линии перспективной моделью для направ ленного получения и детального изучения специфических абзимов с различной активностью.
2. Впервые показана антиген-специфическая каталитическая активность аутоан тител к основному белку миелина (ОБМ) у больных рассеянным склерозом (РС) и модельных животных, коррелирующая с тяжестью заболевания. Определены шесть преимущественных сайтов расщепления молекулы ОБМ абзимами, и оценены кинетические параметры данной реакции. По отношению к фрагмен там ОБМ была изучена как связывающая, так и каталитическая активности ау тоантител, выделенных из сывороток крови пациентов с РС, больных с другими нейродегенеративными заболеваниями, здоровых доноров и модельных живот ных. Гидролизу абзимами во всех приведенных случаях подвергался исключи тельно энцефалитогенный фрагмент ОБМ81-103. Обнаруженная связывающая и сайт-специфическая каталитическая активность анти-ОБМ антител при РС и других, мимикрирующих, нейродегенеративных заболеваниях позволила соз дать основу для новых дифференциальных методов диагностики РС.
3. На примере антитела 6B8E12 к субтилизину Карлсберг впервые показано, что антиидиотипические антитела, полученные к протеазе, могут осуществлять ка талитическую функцию, схожую с первичным антигеном. Экспрессия антитела 6B8E12 в виде рекомбинантного одноцепочечного антитела и демонстрация его каталитической активности явилась наиболее убедительным доказательством «абзиматической» природы обнаруженной активности.
4. Впервые показано, что полученные в результате реакционной иммунизации пептидил дифенил фосфонатом (LAEEE-VPhos) поликлональные антитела об ладают специфичностью по отношению к пептидному фрагменту «реакционно го» гаптена и способны ковалентно взаимодействовать с фосфонатной состав ляющей, являющейся суицидальным ингибитором сериновых протеаз.
5. Разработана оригинальная схема иммунизации мышей линии SJL гибридным белком, состоящим из константных областей поверхностного антигена ВИЧ- gp120 и фрагмента ОБМ, приводящая к появлению протеолитических антител, из бирательно расщепляющих антиген. Показано, что полученные антитела способны специфически гидролизовать полноразмерный гликозилированный gp120, и уста новлен преимущественный сайт гидролиза gp120 Pro493-Leu494, находящийся в константной области белка. Разработанный подход может быть использован для получения «каталитических вакцин», способных целенаправленно разрушать белки, ответственные за развитие конкретных патологий.