Реализация патогенности бактерий burkholderia cepacia при разных формах инфекции.

На правах рукописи

ЧЕРНУХА Марина Юрьевна РЕАЛИЗАЦИЯ ПАТОГЕННОСТИ БАКТЕРИЙ BURKHOLDERIA CEPACIA ПРИ РАЗНЫХ ФОРМАХ ИНФЕКЦИИ.

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени доктора медицинских наук

Москва - 2008

Работа выполнена в ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф.Гамалеи РАМН

Научный консультант:

Доктор медицинских наук Игорь Андроникович Шагинян

Официальные оппоненты:

- Член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор Владимир Викторович Кутырев - Доктор медицинских наук, профессор Виктор Михайлович Бондаренко - Доктор медицинских наук, профессор Роман Сергеевич Козлов

Ведущая организация: ГУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН

Защита состоится «_ » 2008 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 001.007.01 в ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (123098 Москва, ул.Гамалеи 18)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН

Автореферат разослан « » 2008 г.

Ученый Секретарь Диссертационного Совета Доктор медицинских наук, профессор Е.В. Русакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. В течение последнего десятилетия были получены данные, свидетельствующие о том, что бактерии B. сepacia, ранее относимые к роду Pseudomonas, являются оппортунистическими микроорганизмами, способными вызывать госпитальные инфекции (раневые, катетер–ассоциированные инфекции, пневмонии). Особую опасность бактерии B. сepacia представляют для лиц с иммунодефицитами различного генеза больных кистозным фиброзом (или муковисцидозом) и хроническим грануломатозом, у которых данные микроорганизмы способны вызвать эндокардиты, некротизирующую пневмонию с септицемией, зачастую заканчивающуюся летальным исходом (так называемый «цепация - синдром») (Gilligan P.H.,1995, Lutter E., Lewenza S., Dennis J.J. et al.,2001). Вопрос, почему бактерии B. cepacia в одних случаях выделяются из мокроты больных муковисцидозом и не вызывают инфекционных осложнений, а в других вызывают тяжёлые поражения лёгких, приводящие к смерти, до настоящего времени остаётся открытым. В последнее время участились случаи госпитальных пневмоний, вызванных B. cepacia, у послеоперационных больных, находящихся на искусственной вентиляции лёгких. Учитывая ограниченные данные, касающиеся микробиологических свойств этого микроорганизма и патогенеза вызываемой им инфекции, можно отнести его к малоизученным возбудителям оппортунистических инфекций.

Одним из наиболее клинически значимых представителей рода Pseudomonas является вид P. aeruginosa. Бактерии P. aeruginosa нередко вызывают тяжёлые поражения лёгких у больных муковисцидозом при смешанной инфекции в ассоциации с бактериями B. cepacia. Учитывая вышесказанное, целесообразным является сравнительное изучение вирулентных свойств видов B. cepacia и P. aeruginosa для определения вирулентности бактерий B. cepacia и путей развития инфекционного процесса при инфицировании B. cepacia.

В 1992 г. вид P. cepacia на основании секвенирования гена 16S rRNA был отнесен к новому роду Burkholderia, включающему в настоящее время 22 вида, среди которых есть возбудители особо опасных инфекций человека и животных - сапа и мелиоидоза- B. mallei и B. pseudomallei. Вид B. cepacia является наименее изученным представителем этого рода.

Бактерии этого вида обитают в почве и воде, а также способны вызывать заболевания у человека, животных и растений, которые можно отнести к сапронозам (Anzai, Kim Y.H., Park J.Y. et al. 2000, Gilligan P.H.,1995, Lutter E., Lewenza S., Dennis J.J. et al.,2001, Luczak J.B., Cannon C.L., Pier G.B., 2002, Gilligan P.H.,1995). Возможность существования этих бактерий в различных средах обитания может быть обусловлена необычно большим геномом (в 2 раза больше, чем у E. coli и в 1,5 раза больше генома P. aeruginosa), а также наличием в его составе многочисленных инсерционных последовательностей и 3-х кольцевых репликонов (Mahenthiralingam E., Urban T.A., Goldberg J.B., 2005). Данные, касающиеся факторов патогенности B. cepacia и механизмов их регуляции, практически отсутствуют, так же как и недостаточно изучены причины возникновения инфекции у больных с иммунодефицитами различного генеза, механизмы и факторы её передачи и молекулярно-генетические механизмы изменчивости, обеспечивающие высокие адаптационные возможности этого микроорганизма для существования и размножения в различных условиях обитания. До середины 1990-х годов оставалось неясным, являются ли бактерии B. cepacia самостоятельными этиологическими агентами оппортунистических инфекций или они являются микроорганизмами, выявляемыми при тяжелых легочных инфекциях, вызываемых P. aeruginosa и S. aureus. В настоящее время достоверно доказана способность к колонизации B.cepacia в бронхоальвеолярных путях. У клинических штаммов B.cepacia доказано наличие таких факторов патогенности, как пили, адгезины и гемолизин, кроме этого, как и все грамотрицательные бактерии, бактерии B. cepacia имеют липополисахарид- эндотоксин. Можно предположить, что эти факторы детерминируются генами, имеющими сложную структуру и регуляцию и, возможно, обладающими свойствами мобильных генетических элементов - транспозонов, ряд из которых, вероятно, расположен на нескольких кольцевых ДНК. Подтверждением этому является чрезвычайная пластичность комплекса B. cepacia (Mahenthiralingam E. et al, 2005).

Исследования экспрессии генов факторов патогенности бактерий B. cepacia являются чрезвычайно важными для понимания адаптивной изменчивости этих микроорганизмов, проблем эволюции бактерий B. cepacia, эпидемиологии инфекций, вызываемых этими возбудителями.

Актуальным является вопрос о родстве штаммов B. cepacia, выделяемых из окружающей среды (прежде всего, почвы) и от больных. Это необходимо для понимания эволюции этих микроорганизмов и их устойчивости ко многим антимикробным препаратам, связанной, возможно, с горизонтальной передачей генов. Помимо изучения родства между штаммами B. cepacia необходимо для предупреждения тяжёлых осложнений и назначения эффективного лечения, а также для уточнения таксономии, проводить идентификацию этих бактерий. Несмотря на интенсивные исследования B. cepacia, проведенные в 1990-е годы, многие вопросы, касающиеся идентификации и типирования B. cepacia остаются недостаточно изученными. Прежде всего, это связано с несовершенством микробиологических методов, используемых для выделения и идентификации B. cepacia. В настоящее время 9 фенотипически сходных, но генетически различных видов (геномоваров) в литературе принято называть «комплексом бактерий B. cepacia». Учитывая наличие 9 геномоваров, для окончательного типирования B. cepacia необходимо использовать молекулярно-биологические методы. Бактерии B. cepacia принадлежат к патогенам, идентификация которых требует одновременного использования современных бактериологических, биохимических и молекулярно-генетических методов.

Подобным комплексом микробиологических методов исследования обладает не каждая бактериологическая клиническая лаборатория, что затрудняет быструю и эффективную диагностику. Можно полагать, что разработка оптимальной схемы идентификации и типирования позволит значительно эффективнее выявлять B. cepacia, а следовательно, решать разнообразные проблемы микробиологии и эпидемиологии ВБИ, вызываемых бактериями B. cepacia.

Цель работы: Выявление свойств B. cepacia, ассоциированных с патогенностью, и изучение путей их различной реализации при острой и персистентной формах экспериментальной инфекции.

Задачи исследования:

1. Разработать экспериментальную модель персистентной инфекции, вызванной бактериями B. cepacia и P. aeruginosa, и изучить условия и факторы, необходимые для перехода персистентной инфекции в острую форму и обратно.

2. Исследовать молекулярно-генетические механизмы перехода острой формы инфекции, вызванной бактериями B. cepacia и P. aeruginosa, в персистентную инфекцию под действием субингибирующих концентраций некоторых антибиотиков и идентифицировать гены, дифференциально экспрессирующиеся при острой и персистентной формах инфекции.

3. Выявить продукцию факторов патогенности, в том числе и способность к формированию биоплёнки, у клинических штаммов B. cepacia и определить влияние бактерий B. cepacia на клеточные иммунные реакции экспериментальных животных.

4. Изучить роль регуляторной системы «Quorum sensing» в генетическом контроле экспрессии факторов патогенности B. cepacia.

5. Оценить характер взаимодействия бактерий B. cepacia и P. aeruginosa in vitro и in vivo на разработанной экспериментальной модели инфекции.

6. Испытать действие химически синтезированных ацилгомосерин лактонов, отличающихся длиной углеродной цепи, на свойства бактерий B. cepacia и P. aeruginosa in vitro и in vivo.

7. Разработать комплексную микробиологическую систему индикации бактерий B. cepacia у больных и определить эпидемиологическую значимость штаммов, выделенных от больных пневмониями в клиниках г. Москвы.

Научная новизна работы.

- Впервые изучены свойства бактерий B. cepacia, ассоциированные с патогенностью, и пути их различной реализации при разных формах экспериментальной инфекции.

- Показано, что антибиотик ципрофлоксацин, являющийся ингибитором ДНК гиразы и подавляющий синтез белков, в субингибирующей концентрации снижает экспрессию гена cepI, регулирующего продукцию синтазы автоиндуктора, у бактерий B. cepacia и гена plcR, отвечающего за продукцию гемолизина P. aeruginosa. Экспрессия гена cepI B. cepacia, который участвует в регуляции экспрессии факторов патогенности, и гена plcR P. aeruginosa обнаружена при острой форме инфекции и подавляется при персистентной форме, созданной с использованием субингибирующей концентрации (СИК) ципрофлоксацина.

- Создана управляемая экспериментальная модель персистентной инфекции, вызванной бактериями B. cepacia, на основе полученных данных об ингибировании экспрессии факторов патогенности СИК ряда антибиотиков, позволившая изучить действие различных индукторов и супрессоров на инфекционный процесс. При оценке модели впервые учитывались четыре критерия персистенции: отсутствие гибели экспериментальных животных, высев из органов возбудителя, замедленный рост бактерий на питательных средах с изменением морфологии колоний, а также подавление экспрессии факторов патогенности. Установлено, что сигнальные молекулы лактона гидроксибутановой кислоты способствовали индукции перехода персистентной инфекции, вызываемой B. cepacia, в острую форму. Показано, что иммунодепрессант циклофосфан содействовал переходу персистентной инфекции, вызываемой P. aeruginosa, в острую форму. Критерием перехода персистентной формы в острую была гибель мышей, из селезёнки которых выделяли бактерии B. cepacia и P. aeruginosa.

- Установлено, что патогенез инфекционного процесса, обусловленного B. cepacia отличается от такового, вызванного бактериями P. aeruginosa, что выражается в различных влияниях B. cepacia и P. aeruginosa на массу иммунокомпетентных органов - селезёнки и тимуса, на образование АОК мышей к гетерологичному антигену (ЭБ) и на пролиферативную активность спленоцитов мышей, вследствие реализации действия различных факторов патогенности бактериями B. cepacia и P. aeruginosa.

- Продемонстрировано, что бактерии B. cepacia обладают регуляторной системой CepI/CepR “Quorum sensing”. Регуляция экспрессии генов факторов патогенности у бактерий B. cepacia и P. aeruginosa осуществляется с помощью сходных регуляторных систем “Quorum sensing” CepI/CepR (B. cepacia) и LasI/LasR, RhlI/RhlR (P. aeruginosa), относящихся к LuxIR -типу, отличающихся незначительными различиями у автоиндукторов – ацилгомосерин лактонов, а именно длиной углеродной цепи.

- Впервые выдвинута гипотеза о том, что у штаммов B. cepacia, имеющих cepI и cepR гены, активация продукции факторов патогенности происходит под действием собственных лактонов, что может быть при моноинфекции, тогда как штаммам B. cepacia, содержащим только cepR ген, для активации продукции факторов патогенности необходимы экзогенные ацилгомосерин лактоны бактерий, имеющих полноценную регуляторную систему “Quorum sensing”. Подобное явление может происходить при смешанной инфекции, что подтверждено на модели экспериментальной смешанной инфекции in vitro и in vivo обнаружением синэргического усиления патогенности ассоциации B. cepacia и P. aeruginosa.

- Установлена возможность взаимодействия регуляторных систем этих бактерий, включая систему “Quorum sensing”, приводящего к взаимовыгодному использованию компонентов регуляторных систем.

- Впервые показано, что причиной роста вирулентности бактерий B. cepacia и P. aeruginosa при экспериментальной смешанной инфекции и в опытах с синтетическими ацилгомосерин лактонами in vitro и in vivo может быть совместное действие автоиндукторов системы “Quorum sensing” этих близкородственных микроорганизмов.

- Впервые продемонстрировано различное действие отдельных лактонов и их сочетаний на B. cepacia и P. aeruginosa на основании изучения действия искусственно синтезированных ацилгомосерин лактонов с различной длиной углеродной боковой цепи на свойства бактерий.

- Установлено, что бактерии B. cepacia и P. aeruginosa могут использовать в своей жизнедеятельности сразу несколько экзогенных лактонов, продуцируемых другими близкородственными бактериями, приспосабливаясь, таким образом, к условиям своего обитания in vitro и in vivo.

- Впервые показано, что на способность B. cepacia образовывать биоплёнки влияет одновременное добавление в среду выращивания двух ацилгомосерин лактонов с различной длиной углеродной цепи, что подтвердило роль системы “Quorum sensing” в этом процессе.

- Впервые продемонстрировано, что у штаммов, обладающих выраженной способностью к образованию биоплёнки, наиболее часто выявляются факторы патогенности (гемолитическая и хитинолитическая активность), а также гены cepI и cepR, являющиеся компонентами регуляторной системы “Quorum sensing”, что может служить доказательством взаимосвязи между наличием генов системы “Quorum sensing”, продукцией факторов патогенности и формированием биоплёнок.

- Впервые определены критерии потенциальной способности к формированию биоплёнки у исследуемых штаммов: выявление в ПЦР гена cbl, ответственного за продукцию пилей, участвующих в прикреплении бактерий к поверхности тканей, органов и поверхностей медицинского оборудования при образовании биоплёнок, и принадлежность штаммов преимущественно к 4-му геноварианту при типировании в RAPD-ПЦР.

Практическая значимость.

Собрана коллекция из 74 штаммов B. cepacia, включающая 55 клинических штаммов, выделенных от больных пневмониями в больницах г. Москвы, которые используются в лаборатории генной инженерии патогенных микроорганизмов и в лаборатории экологии возбудителей инфекций ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН в микробиологических и молекулярно-генетических исследованиях.

Разработан алгоритм индикации бактерий B. cepacia, включающий бактериологический анализ и ПЦР для идентификации геномоваров B. cepacia, генотипирование штаммов с помощью RAPD-ПЦР и выявление эпидемиологических маркеров BCESM (маркера эпидемических штаммов), ISH (гибрида двух инсерционных последовательностей), обнаруженного у эпидемических штаммов, и гена cbl. При использовании этого алгоритма установлено, что клинические штаммы, циркулирующие в различных стационарах города Москвы, относятся к геномовару IIIА, обозначенному как Burkholderia cenocepacia. Доказана эпидемиологическая значимость российских штаммов, у которых были выявлены эпидемиологические маркеры. Показано, что в стационарах г. Москвы циркулируют штаммы типичные для московского региона, и штаммы со специфическими генотипическими характеристиками для каждого стационара.

Разработанный алгоритм индикации B. cepacia оформлен в виде методических рекомендаций «Выявление и идентификация бактерий комплекса Burkholderia cepacia» (Чернуха М.Ю., Алексеева Г.В., Шагинян И.А., Москва, 2005г.) для клинических бактериологических лабораторий, которые утверждены советом по внедрению научных достижений в практику ГУ НИИЭМ им Н.Ф.Гамалеи РАМН. Алгоритм индикации B.

cepacia описан в главе «Идентификация бактерий комплекса Burkholderia cepacia с помощью ПЦР» (Алексеева Г.В., Чернуха М.Ю., Шагинян И.А.) в учебно-методическом пособии «Полимеразная цепная реакция (ПЦР) и её применение в бактериологии» (Ред.

Гинцбург А.Л.., Романова Ю.М., М., 2006). Алгоритм индикации бактерий B.cepacia используется в лаборатории молекулярной эпидемиологии госпитальных инфекций ГУ НИИЭМ им Н.Ф.Гамалеи РАМН при обследовании больных муковисцидозом для идентификации бактерий B. cepacia и может быть использован в любой бактериологической лаборатории при наличии приборов и реактивов для проведения ПЦР.

Полученные результаты позволяют представить механизм смешанной инфекции у больных муковисцидозом, вызванной бактериями B. cepacia и P. aeruginosa, обладающих сходными регуляторными системами “Quorum sensing”, и определить, что причиной тяжёлого клинического состояния пациентов является рост вирулентности этих близкородственных бактерий за счёт совместного действия ацилгомосерин лактонов компонентов системы “Quorum sensing”.

Апробация материалов диссертации. Материалы диссертации доложены на VII, VIII и IX съездах ВНПО эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 1997, 2002, 2007);

на 4-й и 5-й Всероссийских конференциях «Генодиагностика инфекционных болезней» (Москва, 2000, 2004);

международном конгрессе «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней» (Санкт-Петербург, 2003);

IY Российской научной конференции «Персистенция микроорганизмов» (Оренбург, 2003);

международном конгрессе МАКМАХ (Москва, 2006);

на конференции «Инфекции, вызываемые условно-патогенными микроорганизмами» (Москва, 2007). Апробация диссертации состоялась 25.10.07 на научной конференции отделов эпидемиологии, медицинской микробиологии и отдела генетики и молекулярной биологии бактерий ГУ НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 40 работ, в том числе статей, а также оформлены методические рекомендации, написана глава в методическое пособие.

Научные программы. Работа была выполнена в рамках грантов РФФИ и МО РФ (1997-2005гг).

Объём и структура работы. Диссертация изложена на 232 страницах машинописи и состоит из введения, обзора литературы (3 главы), описания материалов и методов исследований, 7 глав результатов собственных исследований, заключения и выводов.

Работа иллюстрирована 24 таблицами и 24 рисунками. Указатель литературы содержит источников, из них 17 отечественных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТ Ы МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Штаммы. В течение 1999 -2005 годов в лаборатории молекулярной эпидемиологии госпитальных инфекций ГУНИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи РАМН впервые в Российской Федерации собрана коллекция штаммов B. cepacia, состоящая из 74 культур. Коллекция насчитывает 55 клинических Российских штаммов B. cepacia. В коллекцию вошли штаммов, полученных в 1998 году из Волгоградского противочумного института, 8236, 8237, 8238, 8239, 8240, АТСС17558;

штаммы «почва» и «нора» (из лаборатории экологии возбудителей инфекций ГУНИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи РАМН);

2 штамма из института им.

Пастера (Франция) и 4 штамма из Германии, поступивших в 1998-1999гг., а также референс-штаммов из Бельгии (представители геномовара I – B. complex (B. cepacia sensu stricto), геномовара II (B. multivorans), геномовара IIIA- 3А16656 (B. cenocepacia), геномовара IIIB-3В18829 (B. cenocepacia), геномовара IV (B. stabilis) (2005г.)). Коллекция охарактеризована по морфологическим, биохимическим, микробиологическим свойствам.

Моделирование инфекции проводили на беспородных мышах, самцах, весом 18- г и мышах линии С57BL/6 с использованием штаммов B. cepacia 8236 и P. aeruginosa -103, выращенных с субингибирующими концентрациями (СИК) ципрофлоксацина на L бульоне. Концентрацию микробных клеток определяли с помощью «стандарта мутности» (McFarland Standard “bioMerieux”), а также высева культур на чашки с кровяным агаром.

СИК антибиотиков ципрофлоксацина и канамицина определяли методом серийных (двукратных) разведений в бульоне Мюллер-Хинтона (Holden M.T.G. et al.,1995). После приготовления бульона с серийными разведениями антибиотика осуществляли посев исследуемых штаммов в концентрации 1х105 КОЕ/мл. Штаммы выращивали при 370С в течение 18 часов и затем учитывали результаты. За СИК антибиотика принимали ту концентрацию, при которой в пробирке еще наблюдали рост культуры, тогда как в следующей за ней видимый рост отсутствовал (МИК–минимальная ингибирующая концентрация). Для штаммов B. cepacia 8236 и P. aeruginosa -103 СИК ципрофлоксацина составляет 0,06 мкг/мл.

Для перехода персистентной инфекции в острую форму и обратно использовали - гидроксибутановой кислоты (2 мкг/мышь), а циклофосфан (200мкг/мышь) и лактон также антибиотики ципрофлоксацин и канамицин, использовавшиеся в субингибирующих концентрациях.

Анализ кДНК в клетках B.cepacia и P.aeruginosa по матрице иРНК.

Культуры P. aeruginosa PA103 и B. cepacia 8236 высевали в концентрации 105 КОЕ/мл в мл бульона Мюллер-Хинтона с СИК ципрофлоксацина и без него и выращивали в течение 18 ч при 370С. Полученные микробные культуры были изучены с использованием метода фингерпринтирования РНК с произвольными праймерами (Зигангирова Н.А. и авт., 2000).

Протеолитическую активность штаммов определяли на среде, содержащей 2% LA и 30% молока. Клетки тестируемых штаммов высевали уколом на эту среду и инкубировали 24-48 ч. при 28-370С. В случае, когда штаммы обладали протеолитической активностью, вокруг колоний наблюдали просветленные зоны ферментативного гидролиза казеина молока.

Хитинолитическую активность определяли методом, разработанным Monreal J., Rees E.T в 1969г.

Гемолитическую активность оценивали по зонам гемолиза вокруг колоний исследуемых штаммов на кровяном агаре.

Определение липазной активности проводили по методу, описанному Lonon M.K., Woods D.E., Straus D.C. (1988).

Антагонистическую активность тестируемых штаммов бактерий B. cepacia в отношении Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa проверяли на среде LA.

Культуры сеяли уколом и выращивали при 28-37 0С в течение 1-2 суток. Выросшие колонии обрабатывали парами хлороформа в течение 30 мин и затем, 30 мин облучали УФ-лучами. После этого чашки заливали 3-мя мл 0,6% агара, содержащего 2х микробных клеток индикаторного штамма S. aureus или P. aeruginosa и инкубировали в 18-24ч при 28-37 0С. Для определения антагонистической активности оценивали течение зоны подавления роста индикаторного штамма вокруг колоний B. cepacia.

Чувствительность к антимикробным препаратам определяли методом серийных разведений в бульоне. Исследовали устойчивость к меропенему, цефтазидиму, ципрофлоксацину, гентамицину, имипенему, тобрамицину, цефепиму и комбинациям – цефтазидиму+клавулановой кислоте и пиперациллину+тазобактаму.

АГЛ, продуцируемые бактериями B. cepacia, выявляли с помощью предоставленных двух биологических тест-систем (McClean K.H., Winson M.K., Fish L. et al.,1997).

Генетическое типирование штаммов B. cepacia осуществляли с помощью ПЦР с использованием произвольных праймеров (Першина М.Ю., Шагинян И.А. и авт., 1998).

Гены cep I и cepR регуляторной системы QS выявляли в ПЦР (Lewenza S., Conway B., Greenberg E.P., Sokol P.A.,1999).

Образование биопленок (БП) изучали с помощью определения способности штаммов В. cepacia к адгезии на поверхности 96-луночной полистероловой планшеты (Штейн И.В., Арендс И.М., Сорокина Т.А и др.,1989).

In vitro симбиотические взаимоотношения бактерий B. cepacia и P. aeruginosa исследовали при высеве культур на 5% кровяной агар для сравнения их гемолитических свойств.

In vivo взаимодействие бактерий B. cepacia и P. aeruginosa изучали в экспериментальной модели заражения беспородных мышей самцов весом 18-20г.

Суспензии культур вводили животным интраназально или внутрибрюшинно в дозе LD50, определенной предварительно. Для штамма B. cepacia 370 LD50 составляла 2х КОЕ/мышь (50мкл) по «стандарту мутности» (при высеве 108 КОЕ/мышь) в случае интраназального введения и 5х109 КОЕ/мышь (0,2 мл) по «стандарту мутности» (при высеве 2x108 КОЕ/мышь) для внутрибрюшинного введения. Для штамма P. aeruginosa PA103 дозы LD50 были, соответственно, 106 КОЕ/мышь и 3х106 КОЕ/ мышь по «стандарту мутности».

Влияние автоиндукторов на свойства штаммов B. cepacia и P. aeruginosa исследовали в опытах in vitro и in vivo. Лактоны С4 [N-(3-гидроксибутаноил)-L-гомосерин лактон], С6 [N-(3-оксогексаноил)-L-гомосерин лактон], С8 [N-(3-оксооктаноил)-L гомосерин лактон], С0 [L-гомосерин лактон-HBr] были синтезированы и очищены методом колоночной хроматографии на силикагеле 35/60 (элюент гексан-этилацетат 2:1) в НИИ Органической химии РАН. Чистота продукта (95%) подтверждена методом ВЭЖХ (прибор Gilson 302, элюент гексан-этилацетат 2:1). Идентичность (соответствие формуле) продукта подтверждена с помощью 1H ЯМР спектроскопии (растворитель DMSO d 6, прибор Bruker SF300).

Для изучения действия лактонов in vitro культуры в концентрации 105 кл/мл с добавлением лактонов в концентрациях 10, 50 и 100 нг/мл выдерживали 3 часа при 37 оС в L-бульоне. После десятикратныx разведений бактериальных суспензий по 0,1 мл культуры из каждого разведения высевали на 5 чашек с 5% кровяным агаром и инкубировали часов при 30о С. Измерение диаметров зон гемолиза вокруг колоний проводили на тех чашках, где количество колоний составляло от 50 до 200. После трёхкратного повторения эксперимента показатели концентраций микробных клеток и диаметров зон гемолиза рассчитывали с учётом доверительных интервалов и достоверности различий (Ашмарин И.П., Воробьёв А.А,1962).

Для изучения действия лактонов in vivo суспензии культур B. cepacia 370 и P. aeruginosa PA103 в дозах LD50, определённых для каждой модели предварительно, вводили животным одновременно с лактонами в следующих концентрациях: С4 – 10 нг/г, С6 -10 нг/г, С8 - 50 нг/г массы животного.

Для оценки влияния лактонов на образование биоплёнки штаммами B.cepacia 370 и P. aeruginosa PA103 культуры выращивали с добавлением различных лактонов и затем изучали образование биоплёнок.

Реакцию бласттрансформации ставили по стандартной методике. Принцип метода заключается в способности малых лимфоцитов трансформироваться в бластные клетки под влиянием митогенов. В качестве митогенов использовали конконавалин А (Kon A) в концентрации 4 мкг/мл (Т-митоген) и ЛПС E.coli 0111: B4 («Sigma») (В митоген) в концентрации 200 мкг/мл.. Результаты реакции оценивали по включению 3Н тимидина. На 4-е сутки после внутрибрюшинного заражения культурами исследованных штаммов B. cepacia 8236 и 8240 и P. aeruginosa PA 103 в дозе 1х106 КОЕ/мышь проводили учет результатов реакции бласттраснформации. Эксперименты выполнены на беспородных и линейных мышах Balb/c самцах, весом 18-20 г, полученных из питомника “Столбовая”. Животных заражали внутрибрюшинно в изученных дозах.

Выявление антителообразующих клеток (АОК), синтезирующих антитела к гетерологичному антигену (эритроциты барана - ЭБ) проводили в реакции Ерне (Jerne N.K.,1971).

С целью изучения влияния живых бактерий на иммунокомпетентные органы (тимус, селезенка) при моделировании персистентной инфекции определяли их массу у здоровых и инфицированных мышей.

Идентификация бактерий. Все штаммы были идентифицированы с помощью коммерческих тест-систем АРI 20 NE “BioMerieux” (Франция), E/NE “Crystal” (США), NEFERMtest (“Lachema”) в соответствии с инструкцией производителя. Рост на селективном агаре для В. сepacia (BCSA) (Henry D., Campbell M, McGimpsey C. et al.,1999) наблюдали при t=37°С через 24ч. и при t=30°С через 48ч. Продукцию пигмента учитывали при выращивании бактерий на L-агаре с 1% глицеролом при t=37°C в течение 24-х и часов. Рост бактерий при t=42°C в L-бульоне контролировали через 48 часов по наличию мутности.

Определение геномовара проводили с помощью ПЦР согласно методам Bauernfeind A., Schneider I., Jungwirth R. et al.,1999, Mahenthiralingam E., J. Bischof, S.K.Byrne et al., 2000.

Обнаружение эпидемиологических маркеров BCESM, ISH и cbl – гена осуществляли в ПЦР (Clode F.E., Kaufmann M.E., Malnick H. et al., 2000).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы «Exсel», численных и графических методов описательной статистики.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

1.Создание экспериментальной модели персистентной инфекции. Осуществляли два варианта разработки экспериментальной модели персистентной инфекции. В первом варианте беспородных мышей заражали внутрибрюшинно LD50 штаммов B. cepacia и P. aeruginosa (PA-103) с одновременным введением СИК ципрофлоксацина и последующими инъекциями антибиотика в течение 5 дней. Для сравнения результатов ципрофлоксацин вводили в трёх концентрациях: из расчёта СИК (1,2 мкг/мышь), в 2 раза больше СИК (2,4 мкг/мышь), в 3 раза больше СИК (3,6 мкг/мышь). Контрольную группу составили животные, которым не вводили антибиотик. При заражении B. cepacia выживаемость мышей увеличивалась только с использованием наиболее высокой концентрации ципрофлоксацина. При заражении мышей P. aeruginosa выживаемость мышей не превышала выживаемости контрольной группы.

Наиболее оптимальным был 2-й вариант модели, при котором до внутрибрюшинного заражения делали инъекции СИК ципрофлоксацина в течение 5 дней (Рис.1). Как видно на рис.1 выживаемость мышей возросла при таком заражении P. aeruginosa до 70-80% по сравнению с контролем. Только введение СИК ципрофлоксацина (1,2 мкг/мышь) не повлияло на выживаемость животных. Наиболее показательными были результаты при 2-м варианте модели и заражении мышей B. cepacia.

После введения всех доз ципрофлоксацина, включая СИК, выживаемость мышей увеличилась по сравнению с контролем до 80-90%. В течение всего эксперимента контролировали наличие возбудителей в селезенке животных. Бактерии B. cepacia и P. aeruginosa высевали из ткани селезенки, начиная с 5-х суток после заражения. Следует отметить, что продолжительность выделения бактерий B. cepacia составляла 20 суток, тогда как выделение синегнойной палочки только 10 суток. Можно предположить, что разница в длительности высева бактерий B. cepacia и P. aeruginosa из селезёнки связана с более высокими адаптационными возможностями B. cepacia, позволяющими этим бактериям длительно персистировать в организме. Сроки появления первых колоний B. cepacia на плотной питательной среде (ППС) выросли от обычных 24-48 часов до 5-7 суток. Разработанная модель даёт возможность оценить персистенцию бактерий B. cepacia и P. aeruginosa по следующим критериям: выживаемости животных, выделению микробов из селезенки мышей, замедленного роста бактерий после высева из органов на питательные среды, подавление экспрессии факторов патогенности.

Экспериментальная модель имеет преимущества по сравнению с другими моделями инфекций, так как позволяет оценить течение инфекции, наблюдая за выживаемостью мышей.

Для оценки воспроизводимости разработанной модели внутрибрюшинного заражения с введением ципрофлоксацина до инфицирования в течение 5 дней мы подтвердили полученные данные, используя другие штаммы B. cepacia - референс штамм 3B18829 и клинический штамм B. cepacia 370. Переход острой инфекции в персистентную форму удалось наблюдать при инфицировании мышей дозами LD100 B. cepacia 8236 и P. aeruginosa PA103 и предварительным введением СИК ципрофлоксацина.

Разработанную модель удобно использовать для изучения влияния различных условий на персистенцию B. cepacia и P. aeruginosa. На этой модели были проведены исследования по изучению влияния иммунодепрессантов и неспецифических лактонов на переход персистентной инфекции в острую форму.

Условия перехода персистентной инфекции в острую форму под действием различных индукторов. Для перевода персистентной формы инфекции в острую сначала воспроизвели разработанную ранее модель персистентной инфекции c предварительным введением животным антибиотиков. После заражения мышей возбудителем P. aeruginosa, животным однократно вводили лактон -гидроксибутановой кислоты или циклофосфан.

Аналогично проводили эксперимент при заражении животных возбудителем B. cepacia.

Критерием перехода персистентной формы в острую считали гибель мышей, из органов которых одновременно выделяли клетки B. cepacia и P. aeruginosa.

В результате проведенных исследований было показано, что переход в острую форму инфекции происходит у 10% мышей, зараженных бактериями B. cepacia, которым был введен лактон. При этом, из селезенок погибших мышей, высевали клетки B. cepacia в концентрации 106 КОЕ/мл. В контрольной группе мышей, которым не вводили индуктор лактон - гидроксибутановой кислоты, гибели животных не наблюдали. Таким образом, лактон -гидроксибутановой кислоты влиял на переход персистентной инфекции в острую форму при инфицировании бактериями B. cepacia.

Однократное введение циклофосфана мышам, зараженным B. cepacia, не вызывало перехода персистентной инфекции в острую форму ни у одного из зараженных животных.

И, напротив, у мышей зараженных P. aeruginosa (штамм РА 103), которым непосредственно после заражения однократно вводили циклофосфан, переход в острую форму инфекции наблюдали у 30% животных. В то же время однократное введение лактона - гидроксибутановой кислоты не приводило ни к гибели мышей, ни к увеличению количества клеток возбудителя, высеваемых из селезенки животных.

Различные эффекты действия циклофосфана и лактона на бактерии B. cepacia и P. aeruginosa можно объяснить, по нашему мнению, различием инфекционных процессов, вызываемых бактериями B. cepacia и Р. aeruginosa, включающих экспрессию разных факторов патогенности. Эксперименты in vivo показали, что циклофосфан может влиять на выбор бактериями P. aeruginosa пути развития острой инфекции и не оказывает значительного эффекта на развитие инфекции, вызванной B. cepacia.

2. Изучение действия субингибирующих концентраций антибиотиков на экспрессию генов, регулирующих продукцию факторов патогенности у бактерий комплекса Burkholderia cepacia и Pseudomonas aeruginosa. Следующим этапом данной работы явилось изучение на молекулярно-генетическом уровне причин перехода острой формы инфекции B. cepacia и P. aeruginosa в персистентную под действием CИК антибиотика при моделировании инфекции in vitro. Для изучения in vitro экспрессии генов факторов патогенности бактерий P. aeruginosa и B. cepacia, выращенных в различных условиях - в присутствии антибиотика ципрофлоксацина и без него - был применен метод фингерпринтирования РНК с помощью произвольных праймеров. Этот метод позволяет анализировать гены дифференцированно экспрессирующиеся в различных условиях и получить «молекулярный портрет» бактериальной клетки.

В результате проведенных исследований были получены радиоавтографы кДНК, полученных из культур P. aeruginosa и B. cepacia, выращенных в различных условиях (рис.

2). Анализ профилей кДНК показал, что в профиле кДНК штамма B. cepacia, выращенного без антибиотика, обнаружено 20 фрагментов, отсутствующих в профиле кДНК этого штамма, выращенного с СИК антибиотика. В образце, полученном из культуры B. cepacia, выращенной с СИК ципрофлоксацина выявлено 5 полос различной интенсивности, отсутствующих в кДНК культуры, выращенной без антибиотика. В фингерпринте кДНК, полученном из культуры P. aeruginosa PA103, выращенной без антибиотика, выявлено фрагментов, отсутствующих в профиле кДНК той же культуры, но выращенной с СИК ципрофлоксацина. И, напротив, в профиле кДНК из культуры P. aeruginosa PA103, выращенной с СИК ципрофлоксацина, выявлены 8 дополнительных фрагментов, различной интенсивности, отличных от фрагментов кДНК из культуры, выращенной без ципрофлоксацина. Приведенные выше результаты служат доказательством влияния антибиотиков на экспрессию генов. Ципрофлоксацин, являясь ингибитором ДНК-гиразы уменьшает экспрессию ряда генов. Так как среди 17 различных фрагментов ДНК штамма P. aerugenosa и 25 фрагментов штамма B. cepacia могли оказаться гены, кодирующие продукцию факторов патогенности, все полосы, характерные для каждой из исследованных культур, были отмечены и вырезаны из геля. Затем 7 выбранных и выделенных из агарозного геля фрагментов (размером 500 – 1000 нп) были подвергнуты дальнейшим процедурам амплификации и клонирования. Наличие клонированных фрагментов 8,10,22,33,39,42 в составе векторной плазмиды было подтверждено в ПЦР с RSP праймером. После секвенирования клонированных фрагментов проводили анализ прочитанных нуклеотидных последовательностей при сравнении с базой данных банка генов. Это позволило идентифицировать гены, экспрессия которых подвержена регуляции антибиотиками, добавляемыми к культурам в субингибирующих концентрациях.

Были получены образцы нуклеотидных последовательностей 4-х клонированных фрагментов: фрагмента 8 штамма P. aeruginosa, выращенного без ципрофлоксацина;

фрагментов 10 и 22 штамма B. cepacia, также выращенного без антибиотика;

фрагмента штамма B. cepacia, выращенного с СИК ципрофлоксацина. При анализе нуклеотидной последовательности фрагмента 22, выделенного из “молекулярного портрета” штамма B.cepacia 8236, выращенного без антибиотика, обнаружена высокая степень гомологии (83%) в позициях 1532-1645 с геном cepI. Данный ген, кодирует aцил-гомосерин синтазу (CepI), которая участвует в синтезе автоиндукторов, включенным в активацию продукции факторов патогенности. CepI относится к семейству Lux I ацилгомосерин синтаз (Таб.1).

При анализе нуклеотидных последовательностей фрагмента 8 P. aeruginosa, выращенного без ципрофлоксацина, установлено, что в позициях 144-274 он имеет высокую степень гомологии (90%) с геном plcR. Ген plcR детерминирует продукцию гемолизина или фосфолипазы С, которая является одним из факторов патогенности у штаммов вида P. aeruginosa.

При анализе нуклеотидной последовательности фрагмента 42, длиной нуклеотидов, полученного из “молекулярного портрета” B. cepacia 8236, выращенного в присутствии антибиотика, устновлена достаточная степень гомологии с геном 23 S рибосомальной РНК B. cepacia в позициях 458-577, а также с геном recA (гомология 58-72%) различных штаммов B. cepacia. В последнем случае можно полагать, что при отсутствии действия субингибирующей концентрации антибиотика данный ген не экспрессируется, в связи с чем на “молекулярном портрете” B. cepacia 8236, полученном из культуры, выращенной без ципрофлоксацина отсутствует фрагмент с аналогичной молекулярной массой. Различия в степенях гомологии идентифицированного фрагмента с нуклеотидными последовательностями разных штаммов B. cepacia объясняются высоким уровнем полиморфизма гена recA у штаммов B. cepacia. Нам представляется, что активация экспрессии гена recA под действием субингибирующих концентраций антибиотиков необходима для адаптации микроорганизмов к стрессовым условиям в присутствии антибиотика, что требует дальнейшего изучения. Сравнение полученных нуклеотидных последовательностей фрагмента 10 (B. cepacia) с известными нуклеотидными последовательностями банка генов B. cepacia, P. aeruginosa и другими известными бактериальными нуклеотидными последовательностями не позволило провести идентификацию данного гена.

Таблица 1.

Иденфицированные дифференциально экспрессирующиеся гены бактерий B.cepacia и P.aeruginosa, выращенных в различных условиях.

Ген Продукт Бактерии Бактерии Бактерии Бактерии B.cepacia, B.cepacia, P.aeruginosa, P.aeruginosa, выращенные выращенные выращенные выращенные без антибиотика с антибиотиком без антибиотика с антибиотиком Ген Ацилгомосерин + - - cepI синтаза Ген Гемолизин - - + plcR или фосфолипаза С Ген Регулятор recA генетической рекомбинации, - + - рекомбинантно го востановле ния, регулятор ответа на стресс 3. Выявление вирулентных свойств и компонентов регуляторной системы Quorum sensing у клинических штаммов бактерий Burkholderia cepacia. Первым этапом исследования было изучение фенотипических и генотипических свойств у клинических штаммов B. cepacia, выделенных от больных в ряде стационаров г. Москвы.

В данной работе использовали две тестерные системы, позволяющие определить продукцию большинства известных АГЛ, в том числе, описанных для B. cepacia.

Тестерная система на основе штамма C. violaceum CV026 позволяет обнаруживать с различной степенью чувствительности AГЛ с углеродными боковыми цепями, содержащими от 4-х до 8-ми ацильных (CH2) групп ( McClean K.H., Winson M.K., Fish L. et al.,1997). Репортерная система на основе Agrobacterium tumefaciens, содержaщая traG::lacZ конструкцию и регуляторный ген traR, позволяет определять алканоил-, 3-оксо и 3-гидрокси- производные гомосеринлактона с длиной боковой цепи от 6 до 12 ацильных групп (Cha C., Gao P., Chen J.C et al.,1998). Результаты анализа показали, что большинство исследованных штаммов – 31 из 33 (94 %) синтезировали АГЛ и только у двух штаммов (6%) продукции АГЛ не выявлено. Достоверно определить продукцию АГЛ, как правило, оказывалось возможным, только при использовании обеих тест-систем. Однако, необходимо отметить, что синтез АГЛ, оцениваемый по интенсивности окрашивания штриха индикаторного штамма, был более слабым по сравнению с другими изученными нами в этом отношении бактериями, например, c Chromobacterium violaceum, использованными как контроль, Pseudomonas aureofaciens, P. putida, Erwinia spp., Pseudomonas aeruginosa и др., (Штейн И.В., Арендс И.М., Сорокина Т.А и др., 1989) что согласуется с данными литературы (Loazdunski A.M., Ventre I, Aturgis U.N.,2004).

Изменение условий культивирования клинических штаммов B. cepacia, а именно, использование различных питательных сред (LA, LA c 1% глицерина или 0,2-1,0 % глюкозы, триптозного или кровяного агара), выращивание при различных температурах (от 28 до 370С) не увеличивали продукции АГЛ.

Наличие компонентов регуляторной системы QS - генов cepI и cepR, кодирующих синтез АГЛ и регуляторный белок, связывающийся с автоиндуктором, соответственно (.

Lutter E., Lewenza S., Dennis J.J. et al., 2001), у исследуемых штаммов выявляли с помощью ПЦР. Ген cepR, кодирующий регуляторный белок, выявлялся у всех исследуемых штаммов, в то время как ген cepI, кодирующий синтез АГЛ, не выявлялся у 11 штаммов из исследуемой коллекции. При этом, как было отмечено выше, продукция АГЛ, определяемая в биологических тестах, не выявлялась только у двух штаммов (420 и 427), у которых и в ПЦР не выявляется ген cepI.

Изучение продукции факторов патогенности клиническими штаммами B.cepacia. Выделенные клинические штаммы B. cepacia были исследованы на продукцию протеаз, гемолизинов, хитинолитическую и липазную активности. При определении протеолитической активности установлено, что все исследуемые штаммы B. cepacia синтезируют протеазы. Как показало определение величины зон ферментативного гидролиза казеина молока вокруг колоний этих штаммов, самой низкой протеолитическая активность была у штамма 427. У остальных штаммов величины зон существенно не различались, особенно, в случае, когда их определяли через 4 суток инкубации клеток.

Синтез протеаз наблюдался при росте клеток как при 280 так и 370С.

По данным S. Lewenza с соавт. (Lewenza S., Conway B., Greenberg E.P., Sokol P.A., 1999), мутация в гене cepI B. сepacia приводит к отсутствию синтеза АГЛ и протеолитической активности. В связи с этим, была сделана попытка выявить корреляцию между синтезом АГЛ и величиной зон гидролиза казеина у исследуемых штаммов. Такой корреляции мы не обнаружили. У ряда штаммов, например, Б-515, Б-0467, 225, 421, 423, 375, 281, при слабом синтезе АГЛ зоны гидролиза казеина были такими же, как у других штаммов с блее выраженной продукцией АГЛ. То же наблюдалось и в случае штамма 420, у которого мы не обнаружили синтеза АГЛ, а зоны просветления были обычной величины. Единственным исключением являлся штамм 427, у которого при отсутствии продукции АГЛ наблюдалась очень слабая по сравнению с другими штаммами зона гидролиза казеина, проявлявшаяся только после роста клеток в течение 4 суток.

Исследование липазной активности показало ее наличие у всех штаммов, кроме штамма Б-511;

обнаруживалась она также при 28 и 370С.

Продукция гемолизина выявлена у 13 (39.3%) штаммов B. cepacia.

4. Формирование биоплёнок клиническими штаммами бактерий комплекса Вurkholderia cepacia в зависимости от их фенотипических и генотипических характеристик. В настоящее время известно, что способность формировать биоплёнки у бактерий является маркером хронической инфекции. Следующим этапом наших исследований явилось изучение способности формирования биопленок клиническими штаммами бактерий комплекса В. серacia, выделенными от больных различных стационаров г.Москвы, за период 1999 – 2001 гг. и сравнительный анализ их фенотипических и генотипических характеристик.

Из 54 изученных клинических изолятов у 45 штаммов (83,3%) наблюдали способность к формированию биопленки. У остальных 9 штаммов (16,7%) уровень абсорбции кристалвиолета этанолом, измеренный при длине волны 540 нм на спектрофотометре в единицах оптической плотности (ОП) соответствовал фону или отрицательному контролю. Штаммы, способные формировать биопленку, на основании различий в ОП были разделены нами на три группы: I – обладающие выраженной способностью к формированию биопленки (27,8%), II – с умеренной способностью образовывать биопленки (55,6%) и III – не способные формировать биопленки (16,6%).

Разная способность к формированию биопленок может свидетельствовать о различиях в вирулентности исследуемых штаммов, а также генотипических отличиях, таких, например, как наличие в составе генома генов системы Quorum sensing cep I и cep R, а также генетических маркеров эпидемиологической значимости штаммов («эпидемиологические» маркеры Cbl, ISH, BCESM).

В связи с этим следующим этапом работы было изучение возможной корреляции продукции факторов патогенности штаммами B. cepacia с их способностью формировать биопленки.

Продукция факторов патогенности бактериями комплекса B. cepacia и их способность к формированию биопленок. Протеолитической и липазной активностью обладали штаммы всех групп, дифференцированных по способности формировать биопленку, однако по способности расщеплять хитин и обладать гемолитической активностью штаммы указанных групп отличались. Так 13.3% штаммов с выраженной способностью формировать биопленки обладали хитинолитической активностью, тогда как среди штаммов с умеренной способностью – только 3,3%, а среди штаммов, не способных образовывать биопленку таких культур не было выявлено.

Если штаммы с гемолитической активностью в I и II группе составляли около 40 и 36,6% соответственно, то среди штаммов, не обладающих способностью образовывать биопленки, их оказалось только 11,1%. Максимальной способностью образовывать пигмент у колоний обладали штаммы с выраженной способностью пленкообразования (20%). У штаммов с умеренной способностью формирования биопленки и не образующих ее пигментообразование наблюдали соответственно только у 13,3 и 12,5% культур.

Ген серR выявлялся с незначительными различиями у всех штаммов исследованных групп (100, 96,6% и 100% соответственно). Процент выявления гена cepI слабо различался среди штаммов, способных к формированию биопленки и не способных ее образовывать (73%, 66,6% и 77,7%).

Среди штаммов I группы (таб. 2), характеризующихся выраженной способностью формирования биопленок, более часто выявляются факторы патогенности, а также гены cepI и cepR, что может служить основанием для подтверждения патогенности этих штаммов. Не исключается и вероятность того, что такие штаммы, возможно, обладают большими адаптационными возможностями при изменении условий или смене ниш обитания, а исследованные нами фенотипические и генотипические признаки не обязательно непосредственно участвуют в процессе формирования биопленок.

Таблица 2.

Свойства штаммов бактерий комплекса B. cepacia с различной степенью пленкообразования.

Свойства Степень пленкообразования (в %) I II III Протеолитические свойства 100 100 Хитинолитическая активность 13,3 3,3 Гемолитическая активность 40 36,6 11, Липазная активность 86,7 100 Наличие пигмента 20,0 13,3 12, cep I % 73 66,6 77, cep R % 100 96,6 Генотипирование штаммов бактерий комплекса B. cepacia с различной способностью к формированию биопленок.

Результаты геноидентификации показали, что все клинические штаммы бактерий комплекса B. cepacia, выделенные от больных в разных клинических стационарах г.

Москвы, принадлежат к геномовару III подгруппы А (результаты представлены в следующей главе). Бактерии комплекса B. cepacia геномовара III в настоящее время получили видовое наименование B. cenocepacia.

Далее штаммы B. cenocepacia, обладающие различной способностью к формированию биопленки, были типированы с помощью ПЦР с произвольным праймером SH1.

Таблица 3.

Генотипические варианты клинических штаммов B. сenocepacia в зависимости от способности формирования биопленки.

Генотипический вариант Степень пленкообразования (% штаммов) I II III 1 33.3 - 3 - 5,3 4 66.7 42.0 5 - 5. В табл.3 видно, что штаммы, характеризующиеся выраженной способностью к формированию биопленки, принадлежат только к двум геновариантам (1 и 4).

Корреляция между наличием у штаммов «эпидемиологических» маркеров и способностью штаммов к формированию биоплёнок.

И, наконец, представляло интерес, существует ли корреляция между наличием у штаммов B.cenocepacia предполагаемых «эпидемиологических» маркеров и способностью к формированию биопленок. С этой целью штаммы были исследованы на наличие нуклеотидных последовательностей cbl, BCESM и ISH маркеров (Clode F.E., Kaufmann M.E., Malnick H. et al.,2000). Почти у трети (31,5%) клинических штаммов B. cenocepacia выявлялся хотя бы один эпидемический маркер. При этом частота выявления хотя бы одного эпидемического маркера в I группе штаммов составила 46,7 %, а во II и III – 23,3 и 33,3 % соответственно. По данным литературы – маркер ВСESM (маркер эпидемических штаммов) присутствует только у штаммов 3-го геномовара. В наших экспериментах BCESM был выявлен у 18,5% всех исследованных штаммов с приблизительно равной долей штаммов в каждой из трех сравниваемых групп (20%, 13,3% и 33,3% соответственно). ISH маркер чаще выявлялся в III группе штаммов (11,1%). Ген cbl, ответственный за продукцию пилей cbl, участвующих в прикреплении бактерий к поверхности ткани, органа, поверхности медицинского прибора при образовании биопленок, выявлен у 22,2% штаммов, причем в I группе, характеризующейся выраженной способностью к формированию биопленок, его выявляли более чем в два раза чаще, чем во II и III группах штаммов (26,3%, 13.3% и 11,1% соответственно). Таким образом, ген cbl, выявлявшийся в 1-й группе штаммов с выраженной способностью к формированию биопленок может считаться, вероятно, не только «эпидемиологическим» маркером, но и маркером потенциальной способности формирования биопленок у штаммов B. cenocepacia.

Изучение антибиотикочувствительности штаммов с разной способностью к формированию биоплёнки. Последним этапом изучения фено- и генотипических свойств клинических штаммов B. cenocepacia было изучение их чувствительности к антимикробным препаратам, рекомендованным для лечения заболеваний, вызываемых грамотрицательными неферментирующими бактериями, и наиболее часто употребляемым в настоящее время для лечения.

При анализе чувствительности штаммов В. сеnocepacia к антибиотикам имипенему (IPM) и ципрофлоксацину (CIP), наблюдали наиболее вариабельные результаты. При этом для демонстративности полученных результатов чувствительным считали штамм, если он обладал чувствительностью хотя бы к одному из этих двух антибиотиков. В I группе чувствительных штаммов выявлено только 13,3%, во II группе их было в два раза больше 33,3% и в III – 44,4%. Таким образом, клинические штаммы B. cenocepacia с выраженной способностью к формированию биопленок характеризуются большим спектром резистентности к антибиотикам.

Таким образом, фено- и генотипические характеристики клинических штаммов бактерий комплекса B. cepacia, свидетельствуют о том, что более 83% последних способны формировать биопленку, а следовательно колонизировать поверхности органов и тканей (прежде всего, легких, ран) и вызывать хроническую госпитальную инфекцию.

Выявление в ПЦР гена cbl, а также принадлежности штаммов преимущественно к 4-му геноварианту при типировании в RAPD-ПЦР, обнаружение у штаммов хитинолитической способности могут считаться маркерами эпидемиологической значимости клинических штаммов B. cepacia с потенциально выраженной способностью к формированию биопленки, а, следовательно, штаммов, способных вызывать хронические госпитальные инфекции или формировать хронические резервуары возбудителя на медицинских приборах, оборудовании и в госпитальной среде.

5. Роль регуляторной системы «Quorum sensing» в симбиотическом взамодействии бактерий B. cepacia и P. aeruginosa при смешанной инфекции.

Взаимоотношения бактерий P. aeruginosa и B. cepacia in vitro.

Антагонистическая активность штаммов B. cepacia по отношению к бактериям P. aeruginosa была проверена in vitro. При совместном инкубировании культур тестируемых штаммов B. cepacia и культуры P. aeruginosa РА103 вокруг колоний всех исследованных штаммов B. cepacia отсутствовали зоны подавления роста индикаторного штамма P. aeruginosa. Таким образом, у бактерий B. cepacia не обнаружено антагонистической активности по отношению к бактериям P. aeruginosa in vitro.

Далее нами были изучены симбиотические взаимоотношения бактерий B. cepacia и P. aeruginosa in vitro. При посеве на одной чашке культур штаммов B. cepacia 370 и P.

aeruginosa РА103 зоны гемолиза увеличивались у одной и у другой культуры, по сравнению с зонами гемолиза, образуемыми культурами при раздельном посеве. Было отмечено, что чем ближе росли культуры, тем больше были зоны гемолиза. Если гемолиз у колоний B. cepacia проявлялся через 48 часов, а у P. aeruginosa через 24 часа инкубации, то при посеве «крест на крест» двух культур на одной чашке гемолиз отчетливо был виден через 24 часа. То есть, симбиотические отношения двух исследуемых культур в этом тесте in vitro проявлялись в усилении синтеза фосфолипазы С одной из тестируемых культур или двумя сразу, что фенотипически выявлялось в увеличении зон просветления на чашках с кровяным агаром. Поскольку фосфолипаза С является одним из факторов патогенности обоих возбудителей следующим этапом работы была проверка вирулентности штаммов в опытах in vivo.

Взаимоотношение B. cepacia 370 и P. aeruginosa PA103 in vivo. При одновременном заражении животных культурами B. cepacia 370 и P. aeruginosa PA103 в дозе LD50 для каждой из них наблюдали усиление их вирулентных свойств, так как в течение суток наблюдали гибель всех животных, т.е. доза заражения из LD50 становилась LD100. Полученные данные позволяют выдвинуть предположение, что симбиотические взаимоотношения исследуемых бактерий in vivo также выражаются в увеличенной продукции факторов патогенности и утяжелении инфекционного процесса у животных.

Влияние автоиндукторов (лактонов) системы QS на свойства B. cepacia и P.

aeruginosa in vitro. Для выявления роли отдельных компонентов системы QS на экспрессию факторов патогенности нами было изучено прямое действие химически синтезированных лактонов С4, С6, С8 на свойства бактерий B. cepacia и P. aeruginosa в опытах in vitro. Для экспериментов in vitro культуры штаммов B. cepacia 370 и P. aeruginosa PA103 выращивали в питательной среде, в которую добавляли полученные лактоны по отдельности в концентрациях 10нг/мл, 50 нг/мл и 100нг/мл. Концентрации лактонов были выбраны, учитывая результаты, полученные ранее для лактона -гидроксибутановой кислоты. Оптимальными дозами лактонов, вызывающими ускорение роста клеток B. cepacia в проведенных экспериментах оказались: для С4 - 10 нг/мл, для С6 - 10 нг/мл, и для С8 - 50 нг/мл. При этом, инкубация бактерий с каждым из лактонов в выбранных концентрациях не влияла на изменение диаметров зон гемолиза, размеров и форм быстро растущих колоний (Табл. 4). Таким образом, действие лактонов выражалось в ускорении размножения бактерий и не влияло на размеры и форму колоний, а также на гемолитические свойства штамма.

Таблица 4.

Характеристика свойств бактерий B.cepacia и P.aeruginosa при добавлении в среду инкубации лактонов.

Инкубация бактерий с КОЕ/мл Форма Размер Наличие Диаметр зон гемолиза лактонами бактерий колоний колоний Гемолиза (в мм) (%) (в мм) B.cepacia без лактона 100 Круглая 2,1±0,12 + 4,2±0, (4,6х –контроль КОЕ/мл) B.cepacia+С4 180 Та же 2,2±0,09 + 4,1±0, B.cepacia+С6 160 Та же 2,5±0,11 + 4,4±0, B.cepacia+С8 180 Та же 2,3±0,08 + 4,4±0, B.cepacia+С4С6 100 Та же 2,2±0,10 - B.cepacia+С6С8 100 Эллипсо 4,1±0,11 + 6,3±0, видная B.cepacia+С4С8 100 Та же 2,3±0,12 - B.cepacia+С4С6С8 100 Та же 2,1±0,13 + 7,4±0, P.aeruginosa без 100 Та же 3,5±0,10 + 7,5±0, (5х104 КОЕ/мл) лактона –контроль P.aeruginosa+С4 80 Та же 2,3±0,14 + 4,3±0, P.aeruginosa+С6 180 Та же 4,6±0,11 + 10,3±0, P.aeruginosa+С8 120 Та же 4,5±0,13 + 10,2±0, P.aeruginosa+С4С6 100 Та же 4,1±0,09 + 10,1±0, P.aeruginosa+С4С8 100 Та же 2,4±0,10 + 4,4±0, P.aeruginosa+С6С8 170 Та же 3,2±0,13 + 7,3±0, P.aeruginosa+С4С6С8 160 Та же 4,4±0,10 + 10,3±0, При исследовании влияния лактонов на свойства бактерий P. aeruginosa, использовали те же концентрации, что и для клеток B. cepacia. Было показано, что лактоны различно влияют на скорость роста клеток B. cepacia и P. aeruginosa (Табл.4). В отличие от B. cepacia, добавление лактона С4 приводило не к увеличению количества колоний, а, наоборот, к снижению КОЕ/мл P. aeruginosa на 20 %. Добавление лактона С также как и у B. cepacia вызывало увеличение КОЕ/мл. Число колоний при этом на 80% превышало показатели в контрольной группе. Добавление С8 – увеличивало КОЕ/мл только на 20%. Однако, в случае P. aeruginosa мы наблюдали различное действие отдельных лактонов: уменьшение или увеличение размера колоний без изменения их формы, а также зон гемолиза вокруг них. Так, под действием лактона С4 выросшие колонии были меньше в диаметре по сравнению с контрольными и зоны гемолиза вокруг них были меньше контрольных. Действие же лактонов С6 и С8, напротив, выражалось в увеличении размера колоний P. aeruginosa и зон гемолиза. Таким образом, если исследуемые лактоны активировали только скорость размножения бактерий B. cepacia, то в случае P. aeruginosa лактон С4 не только снижал скорость размножения бактерий, что, по видимому, и приводило к уменьшению размера колоний и к ингибированию или снижению уровня продукции гемолизина. Действие лактонов С6 и С8 на P. aeruginosa было аналогично действию на B. cepacia что выражалось в ускорении скорости размножения бактерий, и, соответственно, в увеличении размера колоний и увеличении диаметра зон гемолиза вокруг них.

Нами, с помощью биологических тест-систем было показано, что бактерии B. cepacia продуцируют лактоны группы С4 - С8 и группы С6 - С12 (см. выше). Поэтому, далее нами были проведены эксперименты по изучению сочетанного действия имеющихся в нашем распоряжении лактонов на бактерии B. cepacia и P. aeruginosa. Культуру B. cepacia выращивали в L-бульоне с добавлением лактонов в определенных ранее оптимальных концентрациях. Было показано, что сочетанное действие лактонов влияет на проявление гемолитических свойств (Табл.4). Наиболее выраженный гемолиз наблюдали при добавлении в среду одновременно трех лактонов - С4, С6, С8. Добавление к лактонам С или С8 лактона С4 приводило к тому, что диаметр зон гемолиза уменьшался до 0 мм, в отличии от экспериментов по изучению раздельного действия лактонов С6 и С8.

Необходимо отметить, что добавление изучаемых лактонов к культуре B. cepacia в различных сочетаниях не влияло на скорость роста бактерий B. cepacia и количество колоний не изменялось по сравнению с контролем.

Аналогичное исследование сочетанного действия лактонов на бактерии P. aeruginosa показало, что добавление к культуре одновременно двух лактонов С4+ С или С4+С8 не вызывало увеличения скорости размножения клеток по сравнению с контролем (Табл.4). При этом сочетанное действие лактонов С4+С6 не влияло на размер колоний и диаметр зон гемолиза в отличие от влияния одного лактона С6. Действие лактона С4 вместе с лактоном С8 выражалось в уменьшении размера колоний и зон гемолиза по сравнению с действием одного лактона С8. Добавление к лактону С6 лактона С8 или двух лактонов С4+С8 приводило к активации cкорости размножения, однако процент увеличения КОЕ/мл был ниже, чем при воздействии лактона С6. Сочетанное использование лактонов С6+С8, по сравнению с применением одного лактона С6, уменьшало размер колоний P. aeruginosa и диаметр зоны гемолиза. Таким образом, действие трёх лактонов одновременно не отличалось от действия одного лактона С6 и выражалось в ускорении роста бактерий P. aeruginosa, увеличении размера колоний и диаметров зон гемолиза.

Таким образом, в результате экспериментов были получены данные, свидетельствовавшие о том, что добавление лактонов С4, С6, С8 к растущим культурам B. cepacia и P. aeruginosa отдельно или в различных сочетаниях по-разному влияет на эти родственные бактерии. Лактоны могут влиять на скорость размножения клеток, размер и форму колоний, а также активировать или подавлять продукцию такого фактора патогенности этих бактерий как гемолизин.

Влияние автоиндукторов (лактонов) системы QS на свойства B. cepacia и P. aeruginosa in vivo. Для выяснения действия С4,С6,С8 на вирулентные свойства исследуемых штаммов B.cepacia и P.aeruginosa in vivo использовали экспериментальные модели внутрибрюшинного и интраназального заражения мышей. Животных заражали клетками B. cepacia и P. aeruginosa в дозе LD50, предварительно, как и в опытах in vitro, в течение 3-х часов проинкубированных с добавлением лактонов при 37°С. Лактоны С4, С6, и С8 добавляли отдельно или в сочетаниях, аналогично опытам in vitro. Дозы лактонов в бактериальной суспензии для заражения были рассчитаны, исходя из опытов in vitro ( нг/г, 10 нг/г, 50 нг/г массы животного). Контрольное введение животным одних лактонов в тех же концентрациях, что при заражении, не вызывало гибели мышей. Результаты, полученные при внутрибрюшинном инфицировании, не показали усиления вирулентности штаммов под действием лактонов. При использовании интраназального заражения мышей были получены данные, подтверждающие усиление вирулентности B. cepacia и P. aeruginosa под действием лактонов С4,С6,С8. Было показано, что только сочетание трёх лактонов в суспензии бактерий B. cepacia вызывало возрастание гибели животных на 20% (погибало 80% мышей по сравнению с 60%-ой гибелью в контрольной группе). В случае P. aeruginosa рост показателя гибели животных наблюдали не только при внесении в культуру трёх лактонов одновременно, но и при добавлении только одного лактона С6.

При добавлении лактона С6 процент гибели животных увеличивался на 20%, а при добавлении трёх лактонов одновременно - на 10% по сравнению с контрольной группой, где наблюдали 60%-ю гибель мышей.

Влияние автоиндукторов на образование биоплёнок у бактерий B. cepacia и P. aeruginosa. Исследовали действие лактонов С0 (гомосерин без углеродной боковой цепи), С4, С6, С8 и их сочетаний С4+С6, С4+С8, С6+С8, С4+С6+С8 на изменение оптической плотности бактериальной суспензии B. cepacia и P. aeruginosa через 1 сутки, 2-е суток и образование биоплёнки на поверхности полистероловой планшеты. Культуры штаммов B. cepacia 370 и P. aeruginosa PA103 в концентрации 105 кл/мл сеяли в L-бульон в пробирки по 5 мл с добавлением лактонов в концентрациях, которые были определены в опытах in vitro (С0,С4,С6-10нг/мл;

С8-50нг/мл). Пробирки помещали в термостат при 300С на 24 часа. Затем суточные бульонные культуры вносили в полистероловые плоскодонные планшеты и измеряли оптическую плотность (ОП) проб (P0,05). При определении ОП планктонных клеток B. cepacia сразу после внесения в планшеты показано, что культура B. cepacia, выращенная с добавлением трёх лактонов С4+С6+С8, имела показатель ОП в 2 раза больше, чем контрольная культура без добавления лактонов (Рис.3). Таким образом, лактоны С4,С6,С8 в сочетании активировали рост культуры B. cepacia. ОП планктонных клеток P. aeruginosa, выращенных в присутствии лактонов С4+С8 и С6+С8, превышала показатель контроля (культуры без лактонов) соответственно в 2,4 и в 2,35 раза (Рис.4). То есть лактоны С4,С8 и С6С8 в сочетании активировали рост культуры P. aeruginosa. При измерении ОП культуры P. aeruginosa, которую выращивали вместе с лактономи, было показано, что показатели ОП не отличались от контроля без лактонов, кроме показателей пробы с добавлением С0 (гомосерина без углеродной боковой цепи). ОП планктонных клеток P. aeruginosa, культивированных в присутствии С0 в 1,6 раза была ниже контроля, что может свидетельствовать о торможении роста культуры P. aeruginosa в присутствии лактона С0. В результате измерения показателей ОП спиртового раствора кристалвиолета, полученного после обработки окрашенных биоплёнок спиртом, было показано, что биоплёнка образуется в 1,39 и 1,29 раза интенсивнее при выращивании бактерий B. cepacia вместе с лактонами С4+С8 и С6+С8. Показатель роста биоплёнки при выращивании P. aeruginosa с лактонами был ниже показателя контроля без лактонов в 1,9 раза при выращивании с С4, в 1,8 раза при культивировании с С8 или с С4+С6, в 2,2 и 2,3 раза соотвественно при добавлении лактонов С4+С8 или С6+С8. Лактон С0 ингибировал образование биоплёнки в 7,1 раза (Рис.4). Лактоны С6 и С4+С6+С8 практически не влияли на показатели ОП спиртового раствора после обработки биоплёнки по сравнению с контролем. Таким образом, было показано, что лактоны С4+С6+С8 в сочетании активируют рост бактерий B. cepacia, а лактоны С4+С8 и С6+С8 при добавлении в среду культивирования усиливают рост биоплёнки B. cepacia. Лактоны С4+С8 и С6+С активируют рост культуры P. aeruginosa, а С0 подавляет её рост. При анализе показателей ОП биоплёнки P. aeruginosa было обнаружено, что лактоны С4,С8, С4+С6, С4+С8, С6+С тормозят образование биоплёнки. Наиболее выраженным было снижение показателя ОП биоплёнки P. aeruginosa при выращивании культуры с лактоном С0.

1, 1, 1, 1, ОП 0, 0, 0, 0, 0 С4С6С С4С С4С С6С С С С С К К инок.1сут. пл.кл.2 сут. ОП краски биоплёнок Рис. 3. Влияние лактонов на рост планктонных клеток и биопленок у B.cepacia.

По оси абсцисс –голубые столбики- ОП инокулируемой культуры, коричневые- ОП – планктонных клеток, жёлтые –ОП окрашенного спирта после обработки биоплёнок;

по оси ординат – показатели оптической плотности.

1, 1, 0, ОП 0, 0, 0, С0 С4 С6 С8 С4С6 С4С8 С6С8 С4С6С8 К К инок.1сут. пл.кл.2 сут. ОП краски биоплёнок Рис. 4. Влияние лактонов на рост планктонных клеток и биопленок у P.aeruginosa.

По оси абсцисс – голубые столбики- ОП инокулируемой культуры, коричневые- ОП планктонных клеток, жёлтые – ОП окрашенного спирта после обработки биоплёнок;

по оси ординат – показатели оптической плотности.

6. Влияние бактерий Burkholderia cepacia и Pseudomonas aeruginosa на клеточные иммунные реакции экспериментальных животных.

Показано, что введение вирулентного штамма P. aeruginosa в дозе 1х107 КОЕ/мышь сопровождалось увеличением массы селезенки и снижением массы тимуса более чем в раза по сравнению с органами контрольной группы животных. Штамм B. cepacia 8236 в дозе 4,5х108 КОЕ/мышь более чем в два раза вызывал увеличение массы селезенки и более низких доз, 7,5х107 КОЕ/мышь и 7,5х тимуса. При введении КОЕ/мышь, масса селезенки и тимуса соответствовала таковой у контрольной группы животных.

Зависимые от дозы изменения массы иммунокомпетентных органов оказывал штамм B. cepacia 8240. Введение бактерий в дозе 2х107 КОЕ/мышь сопровождалось гипоплазией тимуса и селезенки, тогда как заражение дозой 2х105 КОЕ/мышь приводило к увеличению массы обоих органов.

Таким образом, оценка массы иммунокомпетентных органов животных, зараженных микробными клетками P.aeruginosa PA 103, B.cepacia 8236 и свидетельствовала о развитии выраженной спленомегалии и одновременно гиперплазии или гипоплазии тимуса у всех исследованных штаммов.

Для оценки иммуномодулирующей активности трех отобранных штаммов проводили определение АОК в селезенке инфицированных мышей.

Введение клеток P. aeruginosa PA 103 приводило к выраженной супрессии образования АОК, синтезирующих антитела к гетерологичному антигену, по сравнению с аналогичным показателем интактной группы мышей (Р0,05). В то же время введение живых бактерий B. cepacia 8236 существенно усиливало функциональную активность B лимфоцитов, синтезирующих антитела к гетерологичному антигену (Р0,05). Эффект воздействия B. cepacia 8240 характеризовался снижением уровня АОК к гетерологичному антигену, подобно штамму P. aeruginosa PA 103, выраженным в меньшей степени (Р 0,05).

Развитие иммунного ответа сопровождается активацией лимфоидных клеток, которая заканчивается их пролиферацией и дифференциацией. Бласттрансформация иммунокомпетентных клеток является результатом кооперативного взаимодействия Т-, В лимфоцитов и А-клеток. Интенсивность реакции характеризует иммуномодулирующее влияние инфекционных агентов на развитие клеточного иммунного ответа. Поэтому нами также было проведено определение пролиферативной активности спленоцитов инфицированных мышей.

Результаты исследования показали увеличение пролиферативной активности спленоцитов в присутствии Т- и В- митогенов при заражении P. aeruginosa PA 103 по сравнению с аналогичными показателями контрольной группы животных (Р0,05).

Штамм B.cepacia 8236 вызывал слабо выраженное усиление пролиферации Т-лимфоцитов.

Уровень включения 3Н тимидина клетками селезенки в присутствии ЛПС (В-митоген) соответствовал аналогичному показателю интактных мышей.

Введение мышам штамма B. cepacia 8240 не влияло на митогенную активность спленоцитов в присутствии Т- и В-митогенов (Р0,05).

Результаты проведенных исследований выявили различный характер пролиферативной активности спленоцитов мышей, инфицированных штаммами P. aeruginosa и B. cepacia.

Полученные результаты позволяют полагать, что каждый из исследованных штаммов - P. aeruginosa PA 103, B. cepacia 8236 и B. cepacia 8240- характеризующийся отличными друг от друга факторами патогенности, обладает различной модулирующей активностью на клеточные иммунные реакции экспериментальных животных. Развитие экспериментальной персистентной инфекции у мышей характеризуется изменением лимфоидных органов (селезенка, тимус), проявляющееся в спленомегалии и гипоплазии тимуса.

Полученные нами данные косвенно указывают на то, что различные дозы возбудителя в организме экспериментальных животных могут вызывать развитие различных форм инфекционного процесса – острую инфекцию, персистенцию или, когда доза заражения недостаточна, бактерии могут легко выводиться из организма, не вызывая воспалительных процессов. При этом, как для каждого вида возбудителя - P. aeruginosa и B. cepacia, так и для разных штаммов одного вида - B. cepacia (штаммы 8236 и 8240), развитие инфекционного процесса происходит индивидуально. Следовательно, было подтверждено, что факторы патогенности и механизмы патогенеза инфекций, вызываемых данными штаммами, различны.

7. Разработка системы идентификации бактерий Burkholderia cepacia.

Разработанная схема идентификации штаммов включает 2 последовательных этапа исследования (Рис.3): применение бактериологических методов и молекулярно биологических методов.

Бактериологические методы позволяют провести первоначальную селекцию штаммов и определить их фенотипические свойства, именно пигментообразование, оксидазную, липазную, гемолитическую активность, способность расти при различных температурах, ферментировать различные соединения (биохимические тесты), способность образовывать биоплёнку, антибиотикоустойчивость. Данные исследования возможно провести в течение 5-7 суток как установлено нами. Фенотипические методы позволяют только отнести исследуемые штаммы к бактериям комплекса B. cepacia, но не идентифицировать бактерии до определённых геномоваров.

Принадлежность всех исследованных 55 штаммов к бактериям комплекса В. cepacia была подтверждена с помощью биохимических коммерческих тест-систем. Все 100% штаммов росли на BCSA-селективном агаре, обладали оксидазной и липазной активностью. Гемолитической активностью обладали 28,8% штаммов. Пигмент имели 11,5% исследованных штаммов бактерий и 63,5% из них обладали способностью расти 420 С. Cогласно схеме, предложенной D. A. Henry, E. Mahenthiralingam и авт. (95) при мы оценили биохимическую активность штаммов с целью изучения их биохимических свойств, а также принадлежность к определенному геномовару. Установлено, что практически все штаммы ферментировали лизин (LYS), орнитин (ORN), эскулин (ESC), глюкозу (GLU) и не ферментировали адонитол (ADO). Лактозу (LAC) и мальтозу (MLT) ферментировали 55,8% штаммов, сахарозу (SUC) 65,4%, и -галактозидазу (ONP) 30,8%. Была исследована способность штаммов образовывать биоплёнку. Показано, что более 83% штаммов способны формировать биоплёнку, что подтверждает потенциальную возможность развития хронической инфекции. При анализе фенотипических свойств удалось определить, что все штаммы в одинаковой степени проявляют свойства, характерные для I, III и IV геномоваров – то есть B. cepacia, B. cenocepacia и B. stabilis.

Геномовары I, III и IV обладают крайне похожими фенотипическими свойствами, вследствие чего трудно только с использованием фенотипических методов точно определить принадлежность к какому- либо одному геномовару.

Практически все штаммы были чувствительны к меропенему, цефтазидиму, цефтазидиму/клавуланату и пиперациллину/тазобактаму. Все штаммы были устойчивы к аминогликозидам: гентамицину и тобрамицину (что является видовым признаком).

Анализ антибиотикограмм не позволил выявить клональности по спектру антибиотикочувствительности у изучаемых штаммов, но обнаружил возрастание устойчивости к цефепиму, ципрофлоксацину и имипенему по годам. Если в 1999 году к ципрофлоксацину были устойчивы и умеренно устойчивы 56% штаммов, то в 2001 году 93,7%. В 1999 году к цефепиму были устойчивы и умеренно устойчивы 44,4% выделенных бактерий, а в 2001 году 75%. К имипинему были устойчивы в 1999 году 25,9% штаммов, в 2000 году 16,7% и в 2001 году 38,5% изолятов.

Зарубежные штаммы, как и отечественные, были устойчивы и умеренно устойчивы к аминогликозидам (амикацину, тобрамицину, гентамицину), аугментину, ванкомицину и чувствительны к азлоциллину, цефтазидиму и ципрофлоксацину.

Молекулярно-биологические методы. Использование молекулярно биологических методов позволяет точно идентифицировать и типировать штаммы на геномовары, выявлять их эпидемиологическую значимость, определять их потенциальную способность быть патогенными для человека. Молекулярно-генетические методы могут включать: ПЦР для выявления 16S и 23S рибосомальной ДНК, позволяющей отнести штаммы к I-V геномоварам;

ПЦР для идентификации recA гена, обладающего полиморфизмом, с праймерами, специфичными для бактерий комплекса B.cepacia и геномовар-специфическими праймерами. Для определения эпидемиологической значимости штаммов можно использовать ПЦР для выявления эпидемиологических маркеров: cbl гена, ISH, BCESM- маркеров. У эпидемических штаммов, принадлежащих к геномовару IIIА, присутствуют контагиозные пили, посредством которых происходит специфическое связывание с муцинкарбогидратами и эпителиальными клетками. Одним из эпидемиологических маркеров бактерий комплекса B. cepacia является cbl ген.

Другими эпидемиологическими маркерами у бактерий комплекса B. cepacia являются гибрид двух инсерционных последовательностей IS 402 и IS 1356 (ISH), маркер эпидемических штаммов BCESM - консервативная открытая рамка считывания длиной 1.4 kb. ISH, BCESM- маркеры выявляются только у эпидемических штаммов и отсутствуют у штаммов B.cepacia, вызывающих спорадические случаи заболеваний (Sun L. et al. 1995 Tyler S.D., K.R.Rozee, W.M. Johnson,1996, van Pelt C., C.M. Verduin, W.H.F.

Goessens et al.,1999). К молекулярно-биологическим методам, которые целесообразно использовать для исследования штаммов бактерий комплекса B. cepacia можно отнести RAPD-ПЦР для выявления внутривидового многообразия штаммов, а также для установления идентичности исследуемых штаммов. К комплексу молекулярно генетических методов можно отнести ПЦР для выявления cepI и cepR генов, являющихся компонентами регуляторной системы “Quorum sensing”, ответственной за экспрессию факторв патогенности.

Все вышеперечисленные молекулярно-биологические методы были использованы для исследования клинических штаммов нашей коллекции.

Исследование штаммов в ПЦР для выявления 16S rРНК показало, что в результате реакции с ДНК большинства (89%) штаммов был получен репликон размером 463 нп. Это позволило предварительно отнести штаммы к группе, включающей I-V геномовары.

При исследовании наличия recA гена, которому свойственен полиморфизм, в ПЦР с различными праймерами было установлено, что штаммы, выделенные в клиниках Москвы, принадлежали к III –му геномовару, группе IIIA. Зарубежные штаммы из Франции и Германии принадлежали к группе IIIB, кроме одного немецкого штамма, который принадлежал к I -му геномовару Генетическое типирование Российских штаммов с помощью RAPD –ПЦР привело к тому, что был обнаружено 23 профиля ПЦР - фрагментов, что свидетельствует о генетическом разнообразии бактерий комплекса B.cepacia. Анализ полученных данных показал, что в различных московских стацинарах циркулируют как свои, характерные для каждого стационара штаммы, так и общие для Москвы. Зарубежные штаммы (из института им. Пастера (Франция), из Германии, полученные в 1998-1999гг. 5 референс штаммов из Бельгии отличались от Российских.

Изучение штаммов на предмет наличия эпидемиологических маркеров показало, что у 8 (16%) московских штаммов была обнаружена открытая рамка считывания (BCESM), у 9 (18%) cbl – ген и ни один штамм не обладал ISH эпидемиологическим маркером. Ни у одного из штаммов, выделенных от больных с раневой инфекцией, не был обнаружен ни один из эпидемиологических маркеров. По сравнению с Российскими штаммами все немецкие штаммы имели ISH эпидемический маркер, один из которых обладал открытой рамкой считывания BCESM. Из двух французских штаммов у одного была обнаружена последовательность, кодирующая синтез контагиозных пилей cbl.

Процент штаммов, выделенных в различных стационарах, у которых было обнаружено несколько эпидемиологических маркеров, был характерен для каждой клиники.

Например, наибольшее количество (31,6%) штаммов из клиники НИИ Нейрохирургии, выделенных только от больных пневмонией, обладали cbl-геном. Среди штаммов, выделенных от больных в ГКБ им. Боткина, наибольшее число (30%) обладало BCESM эпидемиологическим маркером.