Ген протеинкиназы mak-v и ряд других генов с измененной экспрессией в опухолях и их использование в онкологии
На правах рукописи
Коробко Игорь Викторович Ген протеинкиназы MAK-V и ряд других генов с измененной экспрессией в опухолях и их использование в онкологии Специальности 03.00.26 – «молекулярная генетика» 03.00.03 – «молекулярная биология»
Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук
Москва – 2009
Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биологии гена РАН (ИБГ РАН)
Научный консультант:
академик РАН, доктор биологических наук, профессор Георгиев Георгий Павлович
Официальные оппоненты:
заслуженный деятель науки РФ, академик РАЕН, доктор медицинских наук, профессор Альтштейн Анатолий Давидович чл.-корр. РАН, доктор химических наук, профессор Габибов Александр Габибович доктор биологических наук Надеждина Елена Сергеевна Ведущая организация Государственное учреждение Медико-генетический научный центр РАМН
Защита состоится «28» декабря 2009 г. в «11» часов на заседании Диссертационного совета Д002.037.01 при Учреждении Российской академии наук Институте биологии гена РАН (ИБГ РАН) по адресу:
119334, г. Москва, ул. Вавилова, д. 34/
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН по адресу: 119991, г. Москва, ул. Вавилова, д. 32.
Автореферат разослан «» ноября 2009 года
Ученый секретарь Диссертационного совета канд. фарм. наук Грабовская Л.С.
АКТУАЛЬНОСТЬ РАБОТЫ Онкологические заболевания в настоящее время являются второй по значимости причиной смертности в мире, следуя за заболеваниями сердца и системы кровообращения и опережая смертность от несчастных случаев. В Российской Федерации в 2006 году было выявлено 1417665 новых случаев новообразований (или 993.1 на 100000 населения), а общее число зарегистрированных больных с новообразованиями составило 5121277 (или 3587.5 на 100000 населения). При этом, несмотря на значительные успехи в терапии онкозаболеваний за последние 50 лет, метастазирующие солидные опухоли остаются в своей основной массе неизлечимыми, и время жизни пациентов часто ограничено месяцами. Онкологические заболевания являются по своей природе гетерогенной патологией, в основе которой лежат изменения в молекулярных процессах в клетке. Это, с одной стороны, делает клетки опухоли уникальными и определяет их устойчивость или чувствительность к определенным видам терапии. С другой стороны, одной из характерных черт опухолевых клеток является нестабильность их генетического аппарата, что обуславливает быстрое появление новых изменений в опухолевых клетках, приводящих к гетерогенности популяции клеток в опухоли и возникновению устойчивости к терапевтическим воздействиям. Увеличение эффективности противоопухолевой терапии в настоящее время связывается с успехами в области молекулярной и клеточной биологии и генетики, а также смежных областях, что позволяет разрабатывать новые способы лечения онкологических заболеваний на рациональной основе. А именно, выявлять молекулярные изменения, характерные для клеток конкретной опухоли и существенные для ее возникновения, прогрессии и жизнеспособности опухолевых клеток, и специфически воздействовать на них. Кроме того, «молекулярный портрет» опухоли, то есть совокупность характерных для нее молекулярных изменений, позволяет проводить диагностику онкологических заболеваний, прогнозировать их развитие и чувствительность опухоли к уже используемым видам терапии, тем самым позволяя повысить эффективность лечения.
Поэтому выявление генов, характеризующихся измененной экспрессией в опухолях, исследование значимости изменения их экспрессии для развития и прогрессии опухоли является одной из первостепенных задач, решение которой может послужить отправной точкой для исследований по нескольким направлениям. Во-первых, для разработки новых способов диагностики опухолей и прогнозирования их поведения, а также определения чувствительности к различным видам терапии. Во-вторых, для исследования молекулярных механизмов, лежащих в основе развития и прогрессии опухоли, что позволяет выявлять новые молекулярные мишени для противоопухолевой терапии. В третьих, сама измененная транскрипция генов в опухолевых клетках по сравнению с неопухолевыми клетками может быть использована для разработки специфичных генно терапевтических способов лечения опухолей, основанных на аномальной активности промоторов таких генов в опухолевых клетках (опухоль-специфические промоторы).
Таким образом, понимание молекулярных механизмов прогрессии опухолей и выявление их индивидуальных особенностей является рациональной основой для создания новых диагностических, прогностических и терапевтических средств. Это позволяет повысить эффективность диагностики и лечения онкологических заболеваний, а также способствует практической реализации концепции персонализированной медицины, которая особенно актуальна в онкологии, где необходимо учитывать не только индивидуальные особенности организма пациента, но и индивидуальные особенности опухоли. Исследования молекулярных изменений, происходящих в опухолях, является первым шагом на пути исследования молекулярных механизмов развития и прогрессии опухолей и выявления их особенностей, что позволяет идентифицировать новые мишени для терапии онкозаболеваний и разрабатывать на их основе новые стратегии лечения.
Помимо этого, молекулярные особенности опухоли, связь которых с ее возникновением и прогрессией остается неясной, могут быть использованы в диагностических и прогностических целях.
Настоящая работа находится в соответствии с этими тенденциями и посвящена исследованию ряда дифференциально экспрессирующихся в опухолях генов, исследованию возможных последствий их измененной экспрессии для опухолевых клеток и исследованию возможностей и способов использования их свойств в практических целях как диагностических маркеров и/или в качестве основы для разработки новых анти неопластических средств.
ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ Целью данной работы является исследование ряда генов с дифференциальной экспрессией в опухолях в связи с возможным использованием их свойств в онкологии.
Конкретные задачи исследования состояли в следующем:
1. Исследовать свойства и функции открытой нами ранее протеинкиназы MAK-V, в частности, с учетом ее возможной роли в канцерогенезе;
2. Исследовать изменения экспрессии гена mak-v при раке молочной железы человека и генов Pdcd4 и WIF1 в опухолях легкого человека. Определить их потенциальную практическую значимость;
3. Определить возможность и оптимальные способы применения Pdcd4 как анти неопластического средства с использованием генно-терапевтических подходов;
4. Разработать и создать оптимальные экспрессионные модули на основе тимидинкиназы вируса простого герпеса 1 типа (HSV-tk) и опухоль-специфического промотора гена теломеразной обратной транскриптазы человека (hTERT) для противоопухолевой терапии на основе рекомбинантных репликативно-дефектных аденовирусов. Разработать оптимальные способы применения аденовирусных препаратов.
НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ Протеинкиназа MAK-V. Установление свойств и функций генов и кодируемых ими белков, выявление их роли и связи с определенными клеточными процессами является одной из основных задач современной молекулярной биологии и молекулярной генетики.
В свете этого проведенное нами комплексное исследование практически неизученных гена mak-v и кодируемой им протеинкиназы MAK-V является несомненно актуальным в научном плане. Нами был охарактеризован ген mak-v (в том числе и в эволюционном аспекте), включая функциональную характеристику его промоторной области. В рамках комплексного исследования протеинкиназы MAK-V была исследована ее внутриклеточная локализация и установлены потенциальные партнеры по взаимодействию с ней, на основании чего было выявлено влияние MAK-V на эндоцитоз.
Проведенные исследования позволили впервые установить участие протеинкиназы MAK V в поддержании жизнеспособности клеток, что является первой функциональной ассоциацией протеинкиназы MAK-V с определенным клеточным ответом на внешние стимулы. Результаты комплексного исследования протеинкиназы MAK-V представляют собой существенный вклад в исследование этой малоизученной протеинкиназы и установление ее функциональной роли в клетке и в организме.
Большое значение имеет открытие участия протеинкиназы MAK-V в поддержании жизнеспособности клеток, в частности, в ответ на контакт клеток со специфическими компонентами внеклеточного матрикса. Выявление этого свойства MAK-V дает импульс для дальнейших исследований в фундаментальном научном аспекте, имеющих целью установление механизмов действия MAK-V в процессах развития, в которых эта протеинкиназа предположительно может играть важную роль. А именно, MAK-V зависимая регуляция жизнеспособности клеток может являться одной из ключевых активностей MAK-V в процессах развития, в которых пермиссивные и рестриктивные сигналы от внеклеточного матрикса играют важную роль. Кроме того, выявление способности MAK-V позитивно влиять на жизнеспособность клеток имеет значение и в практическом аспекте. Характеризуясь часто увеличенной экспрессией в опухолях, эта активность MAK-V может позитивно влиять на жизнеспособность опухолевых клеток в определенных условиях, что может иметь неблагоприятные последствия и служит отправной точкой для выявления значимости увеличенной экспрессии MAK-V в опухолях как нового потенциального прогностического маркера опухолей.
Дифференциальная экспрессия генов в опухолях. В результате работы было впервые выявлено частое снижение уровня транскрипта гена супрессора опухолевого роста Pdcd в опухолях плоскоклеточного рака легкого (ПРЛ). При этом впервые продемонстрировано, что уровни транскрипта и белка Pdcd4 при ПРЛ не являются эквивалентными параметрами, что должно приниматься во внимание при разработке диагностических систем, основанных на мониторинге изменения экспрессии Pdcd4 в опухолях легкого. Аналогичные исследования, проведенные для гена WIF1, подтвердили ранее выявленное другими исследователями частое снижение уровня его транскрипции при ПРЛ и впервые позволили установить эквивалентность изменения уровней транскрипта и белка WIF1 в опухолях этого типа, а также локальный характер действия WIF1. Наконец, впервые был проведен анализ изменения экспрессии mak-v в опухолях и установлено, что уровень белка MAK-V часто увеличен в опухолях молочной железы человека.
Выявленные частые изменения экспрессии mak-v, WIF1 и Pdcd4 (включая впервые показанную нами независимость изменения уровней транскрипта и белка Pdcd4) позволяет использовать уровни их экспрессии в качестве молекулярных маркеров опухолей соответствующих типов. Это открывает перспективы их применения для диагностических и прогностических целей, а также использования при персонализированных подходах в онкологии, и является основанием для проведения дальнейших прикладных исследований в этом направлении. В частности, частое снижение уровня транскрипта WIF1 позволяет использовать этот параметр при ПРЛ для диагностических целей.
Супрессор опухолевого роста Pdcd4 как мишень в противоопухолевой терапии.
Супрессор опухолевого роста Pdcd4 рассматривается как перспективная мишень для анти неопластической терапии. В работе было установлено, что восстановление экспрессии супрессора опухолевого роста Pdcd4 с использованием кДНК, кодирующей Pdcd «дикого» типа, может быть неэффективным подходом, и исследованы причины этого феномена. На основании полученных результатов предложен рациональный способ использования супрессора опухолевого роста Pdcd4 в биотерапевтических подходах, состоящий в применении его мутантной версии Pdcd4 (S67,71,457A), что имеет существенное значение в области разработки новых анти-неопластических средств на основе Pdcd4.
Экспрессионные модули для противоопухолевой терапии на основе рекомбинантных репликативно-дефектных аденовирусов. Были созданы экспрессионные модули c кДНК HSV-tk под контролем фрагмента промотора гена hTERT и его модификаций для получения на их основе аденовирусных противоопухолевых препаратов. Проведенный анализ позволил выявить оптимальные модификации промотора гена hTERT для достижения максимально эффективной экспрессии трансгена в опухолевых клетках. На основе двух экспрессионных модулей были созданы аденовирусные препараты Ad hTERT-TK и Ad-hTERT-CMV-TK и продемонстрирована их активность in vitro как монопрепаратов, а также совместно с рядом традиционных химиотерапевтических противоопухолевых средств. Эти аденовирусные препараты являются прототипами для выпуска опытных партий инновационных противоопухолевых фармпрепаратов для проведения доклинических и клинических испытаний.
Предложен способ увеличения специфичности экспрессии терапевтических белков в опухолевых клетках за счет использования в экспрессионных модулях 3' нетранслируемых областей, дестабилизирующих транскрипты в неделящихся клетках.
Использование этой стратегии при разработке противоопухолевых генно-терапевтических средств позволит снизить их возможное побочное действие на неопухолевые клетки.
Оптимальные способы применения аденовирусных препаратов. Результаты работы позволяют повысить эффективность применения противоопухолевых препаратов на основе рекомбинантных репликативно-дефектных аденовирусов, которые в настоящее время занимают свое место в клинической онкологии. Была выявлена способность прототипов перспективных противоопухолевых агентов – ингибиторов киназной активности и 2 2-(4-морфолинил)-8-фенил-4H-1-бензопиран-4-она (LY294002) пиперазинил-8-фенил-4H-1-бензопиран-4-она (LY303511) увеличивать эффективность экспрессии белков, кодируемых рекомбинантными репликативно-дефектными аденовирусами. Более того, была выявлена синергетичность их действия с противоопухолевыми препаратами – ингибиторами топоизомераз. Это открывает пути повышения эффективности применения противоопухолевых препаратов на основе репликативно-дефектных аденовирусов путем их совместного применения с анти неопластическими средствами на основе LY294002/LY303511.
Созданный диагностический набор «Тертоскрин» для определения присутствия транскрипта в образцах опухолевых тканей позволяет прогнозировать hTERT эффективность действия аденовирусных противоопухолевых препаратов на основе промотора гена hTERT Ad-hTERT-TK и Ad-hTERT-CMV-TK и делает возможным их адресное применение для терапии опухолей.
Рекомендации по практическому использованию результатов работы.
1. Снижение уровней транскриптов генов Pdcd4 и WIF1 и уровня белка WIF1 могут использоваться как молекулярные маркеры при плоскоклеточном раке легкого человека.
2. Снижение уровня транскрипа гена WIF1 может использоваться для диагностики плоскоклеточного рака легкого.
3. Уровни транскрипта и белка Pdcd4 следует использовать как независимые молекулярные параметры плоскоклеточного рака легкого.
4. Увеличенная иммунореактивность протеинкиназы MAK-V может использоваться в качестве молекулярного маркера рака молочной железы человека.
5. При создании анти-неопластических генно-терапевтических средств, основанных на восстановлении активности супрессора опухолевого роста оптимально Pdcd4, использование мутантной версий белка Pdcd4(S67,71,457A), а не белка «дикого» типа.
6. Рекомендовано использование 3'-нетранслируемых областей транскриптов ДНК мелилтрансферазы 1 человека DNMT1 и топоизомеразы II TOPO2A для увеличения специфичности продукции терапевтических белков в делящихся клетках при разработке новых генно-терапевтических анти-неопластических препаратов.
7. Применение LY294002/LY303511 и их производных может быть рекомендовано для увеличения эффективности противораковых терапевтических рекомбинантных репликативно-дефектных аденовирусов как самих по себе, так и совместно с ингибиторами топоизомераз.
8. Тест-набор «Тертоскрин» может быть рекомендован к использованию для выявления присутствия транскрипта гена теломеразной обратной транскриптазы человека hTERT и прогнозирования эффективности противоопухолевого действия генно-терапевтических препаратов, зависимых от активности промотора hTERT.
АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ Материалы работы докладывались на различных отечественных и международных конференциях, рабочих совещаниях и семинарах, в том числе на 5-ом Московском международном конгрессе “Биотехнология: состояние и перспективы развития” (Россия, 2009), отчетной конференции по программе фундаментальных исследований Президиума РАН “Молекулярная и клеточная биология” (Россия, 2009), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Россия, 2008), конференции “Intracellular Transport and Signal Transduction in Cancer Biomedicine” (Норвегия, 2007), конференции, посвященной 40-летию журнала «Молекулярная биология» (Россия, 2007), семинаре по комплексному проекту “Создание технологии дифференциальной протеомики и ее использование для получения новых противораковых препаратов”, выполняемому в рамках Федеральной целевой научно-технической программы “Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники” на 2002-2006 годы (Россия, 2005), Шестой научно-практической конференции «Московская наука – проблемы и перспективы» (Россия, 2005), The Second Russia-Novartis Symposium “Genome and Transcriptome targets in Medicine” (Россия, 2005), конференции “Advances in molecular cell biology” (Россия, 2004), ELSO-2003 Conference (Гемания, 2003), международной конференции “Molecular genetics of eukaryotes” (Россия, 2003), международном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология" (Россия-Белоруссия, 2001), VI Международной конференции РФФИ "Результаты Фундаментальных Исследований для Инвестиций. Молекулярная Медицина" (Россия, 2001), The 5th International Engelhard Conference on Molecular Biology (Россия, 2001), симпозиуме “Current Problems of Molecular Genetics and Cell Biology” (Россия, 2000), The 4th International Engelhardt Conference on Molecular Biology (Россия, 1999), межинститутском семинаре “Хромосома” (Россия, 2009), межинститутском семинаре “Современные проблемы генетики человека” (Россия, 2007), семинаре Department of 2002), Preclinical Veterinary Sciences, University of Edinburgh (Великобритания, межлабораторном семинаре School of Biosciences, Cardiff University (Великобритания, 2005).
ПУБЛИКАЦИИ По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ в научных журналах, 7 - в сборниках материалов конференций и симпозиумов (тезисы сообщений и докладов), получен 1 патент на изобретение Российской Федерации.
ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ Диссертация изложена на 296 страницах машинописного текста и состоит из введения, материалов и методов исследования, 5 тематических глав, заключения, выводов и списка литературы, содержащего 319 источника. Работа проиллюстрирована рисунком и 8 таблицами.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Протеинкиназа MAK-V Протеинкиназа MAK-V была идентифицирована и впоследствии клонировна нами ранее в результате сравнительного анализа киномов родственных опухолей с различными метастатическими свойствами. Эта же протеинкиназа была независимо клонирована американской группой исследователей при сравнительном анализе опухолей с различными свойствами и получила название HUNK. MAK-V принадлежит к группе AMPK-подобных протеинкиназ и является одним из малоизученных ее представителей, и ее связь с определенными процессами в клетке и в организме, а также молекулярные механизмы действия остаются по большей части неизвестными. Характер экспрессии mak-v в эмбриональном развитии мыши и Xenopus laevis [5] (Примечание. Здесь и далее даны ссылки на работы, опубликованные по теме диссертации), в дифференцировке молочной железы мыши, а также во взрослом организме и в развитии нервной системы [1] предполагают ее роль в процессах развития и в нервной системе. Кроме того, факт идентификации этой протеинкиназы двумя независимыми группами в результате сравнительного анализа опухолей с различными свойствами предполагает ее возможную связь с определенными свойствами опухолевых клеток. Это явилось предпосылкой для детальной характеристики свойств протеинкиназы MAK-V и исследованию ее функций и механизмов действия с целью установления ее возможной роли в опухолевых клетках и перспектив использования ее свойств в практическом аспекте.
1.1. Ген mak-v Ранее нами и независимо группой американских исследователей было установлено, что ген mak-v находится на хромосоме 21 человека и хромосоме 16 мыши. Анализ базы данных нуклеотидных последовательностей позволил полностью GeneBank реконструировать in silico кДНК mak-v человека, которая на 92% идентична и на 95% гомологична кДНК мыши, а также установить структуру гена mak-v человека, который занимает около 128 т.п.н. и содержит 11 экзонов [1].
1.1.1. Ген mak-v в эволюционном контексте Анализ базы данных нуклеотидных последовательностей EST выявил несколько клонов кДНК, кодирующих возможные ортологи mak-v X.laevis, которые можно разбить на две группы на основании незначительных вариаций нуклеотидных последовательностей. Определение нуклеотидной последовательности кДНК одной из групп кДНК помещена в базу данных нуклеотидных (последовательность последовательностей GeneBank, Acc. No. AY318877) показало, что кодируемый ей полипептид, состоящий их 691 аминокислотных остатков, имеет существенную гомологию (63% идентичных и 75% гомологичных аминокислотных остатков) с белком MAK-V мыши с еще большей гомологией (94% идентичности) в области каталитического домена. Филогенетический анализ каталитических доменов MAK-V и родственных ей протеинкиназ показал, что каталитический домен этой протеинкиназы X.laevis кластеризуется с доменами MAK-V мыши и человека, что позволяет сделать вывод о том, что этот белок является ортологом MAK-V X.laevis. В белке, кодируемом второй группой кДНК (последовательность помещена в базу данных нуклеотидных последовательностей GeneBank, Acc. No. AY318878), 95% аминокислотных остатков идентичны белку, кодируемому первой группой кДНК. Присутствие двух схожих, но незначительно отличающихся белков, может быть объяснено тетраплоидностью X.laevis [5].
Дальнейший поиск ортологов MAK-V в различных организмах, проведенный in silico, позволил выявить и полностью реконструировать последовательности ортологов MAK-V рыб (Fugu rubripes) и асцидии (Ciona intestinalis), а также показал отсутствие генов, кодирующих ортологи MAK-V, в геномах беспозвоночных организмов (Drosophila melanogaster и Caenorhabditis elegans) [5]. Эти результаты позволяют предположить, что MAK-V является протеинкиназой, кодируемой только геномами хордовых организмов и отсутствующей у беспозвоночных. Это предположение нашло свое подтверждение в опубликованных результатах крупномасштабных анализов киномов различных организмов. Однако более поздние исследования установили присутствие ортолога MAK V, как и ряда других ранее считавшихся отсутствующими у беспозвоночных протеинкиназ, у морского ежа, наиболее эволюционно близкого к хордовым организма, что указывает на более ранее происхождение MAK-V в эволюционном контексте. Тем не менее, проведенный анализ показал, что протеинкиназа MAK-V является достаточно «молодой» в эволюционном аспекте, и ее появление могло быть связано с увеличивающейся сложностью организма. В практическом плане отсутствие ортологов MAK-V в таких организмах, как D.melanogaster, C.elegans и в дрожжах, не позволяет использовать эти хорошо исследованные модельные организмы для изучения данной протеинкиназы.
1.1.2. Характеристика промотора гена mak-v мыши Идентификация транскрипта mak-v в результате сравнительного анализа опухолей с различными свойствами указывает на возможное изменение транскрипционной активности промотора гена mak-v в опухолевых клетках с различными свойствами. Для исследования механизмов транскрипционной регуляции гена mak-v в результате скрининга геномной библиотеки мыши был клонирован фрагмент геномной ДНК мыши, содержащий его 5’-область. Анализ ее нуклеотидной последовательности длинною 1. т.п.н., предшествующей сайту инициации трансляции, выявил отсутствие ТАТА- и СААТ боксов. Как характерно для промоторов, лишенных ТАТА-бокса, 5’-область гена mak-v является GC-богатой и содержит CpG-«островок» в своей проксимальной части.
Аналогичный анализ последовательности промоторной области гена mak-v человека выявил ее схожее строение. Компьютерный анализ позволил установить потенциальные участки связывания транскрипционных факторов, консервативных для промоторов генов мыши и человека, которые могут принимать участие в регуляции активности промотора (Рис. 1). Используя амплификацию концевых фрагментов кДНК, было установлено, что сайт инициации транскрипции гена mak-v находится на удалении по меньшей мере 152 154 нт от сайта инициации трансляции. Интересно отметить, что последовательность, окружающая предполагаемый сайт инициации транскрипции, отличается заменой одного нуклеотида от консенсусной инициаторной Inr-последовательности, часто выполняющей роль сайта инициации транскрипции в промоторах, лишенных ТАТА-бокса. Кроме того, эта область окружена консервативными сайтами связывания фактора Sp1 (Рис. 1), который может играть роль транскрипционного активатора Inr-последовательностей.
Суммируя, можно предположить, что эта Inr-последовательность содержит сайт инициации транскрипции гена mak-v, находящийся в 156 нт от сайта инициации трансляции [8].
Анализ промоторной активности 5’-области гена mak-v мыши в клетках PC12, в которых присутствует эндогенный транскрипт mak-v, с использованием репортерного гена люциферазы показал, что область -347…+148, содержащая картированный нами сайт инициации транскрипции и сайты связывания фактора Sp1, действительно обладает транскрипционной активностью, а максимальная активность наблюдается при удлинении промоторной области до нт -508 (Рис. 2). Область -508…-347 содержит несколько консервативных для генов мыши и человека потенциальных сайтов связывания транскрипционных факторов, включая 2 сайта связывания факторов семейства E2F (Рис.
Рис. 1. Нуклеотидная последовательность 5’-фланкирующей области, экзона 1 и 5’-конца интрона А гена mak-v. Картированный сайт инициации транскрипции гена mak-v отмечен звездочками. Inr последовательность подчеркнута двойной чертой. Последовательность экзона 1 выделена серым фоном.
Кодон инициации трансляции взят в рамку. Потенциальные сайты связывания транскрипционных факторов отмечены линиями над последовательностями со знаками (-) и (+), указывающими на цепь ДНК, на которой находится последовательность сайта. Стрелками отмечены 5’-концы фрагментов геномной ДНК, клонированные в вектор pGL3-Basic.
1). Поскольку ранее было установлено, что ген mak-v является мишенью для факторов этого семейства, активирующих его транскрипцию, можно предположить, что именно сайт(ы) связывания факторов E2F отвечают за увеличение транскрипционной активности, обеспечиваемой областью -508…-347. Дальнейшее удлинение 5’-области гена mak-v (до т.п.н.) приводило к незначительному снижению активности (Рис. 2). Таким образом, изолированная нами 5’-область гена mak-v содержит функциональный промотор гена mak v с основными позитивными регуляторными элементами, расположенными в области 508…-347. Однако нами не было обнаружено регуляторных цис-элементов, которые могли бы обуславливать значительную разницу в уровне транскрипции mak-v в клетках различных линий, в то время как анализ панели клеточных линий мыши, человека и хомяка методом Норзерн-блоттинга показал существенную вариабельность в уровне транскрипта mak-v в них. В частности, транскрипт mak-v присутствует в клетках линии КСМЛ-0 и не выявляется в клетках КСМЛ-100 (Рис. 3А). При этом профиль активности Рис. 2. (A) Схемы плазмидных конструкций, содержащих репортерный ген люциферазы (Luc) под контролем различных делеционных мутантов промоторной области гена mak-v.
Сайт инициации транскрипции обозначен как (), направление транскрипции гена mak-v мыши указано стрелкой. (Б) Относительная активность репортерного гена люциферазы под контролем делеционных мутантов промоторной области гена mak-v в клетках линии PC12.
репортерного гена люциферазы под контролем различных фрагментов промотора гена mak-v в этих клетках был сходным, хотя абсолютная активность, нормированная на активность раннего промотора цитомегаловируса, в клетках линии КСМЛ-100 была на порядок ниже, чем в клетках линии КСМЛ-0 (Рис. 3Б). Это предполагает, что репертуар и активность транскрипционных факторов в клетках и/или более дистальные регуляторные элементы могут оказывать существенное влияние на транскрипцию гена mak-v. Однако возможно, что различия в активности промотора, наблюдаемые при анализе активности репортерного гена, не являются единственной причиной отсутствия транскрипта mak-v в клетках линии КСМЛ-100, что предполагает существование механизмов регуляции активности промотора mak-v, которые не оказывают влияния на активность промотора в составе трансфицированной плазмиды. Одним из таких механизмов является метилирование геномной ДНК, приводящее к ингибированию транскрипции.
Проведенный предварительный анализ статусов метилирования промоторной области гена mak-v в клетках линий КСМЛ-0 и КСМЛ-100 с использованием расщепления геномной ДНК чувствительными к метилированию рестрикционными эндонуклеазами показало, что промоторная область гена mak-v метилирована в клетках линии КСМЛ-100, но не в клетках линии КСМЛ-0 (Рис. 3В). Таким образом, статусы метилирования промоторной области гена mak-v различаются в клетках линий КСМЛ-0 и КСМЛ-100, и ее избыточное метилирование коррелирует с отсутствием транскрипта mak-v. Это позволяет предположить, что метилирование играет существенную роль в регуляции активности промотора гена mak-v и, принимая во внимание частое абберантное метилирование геномной ДНК в опухолевых клетках, может вносить вклад в появление наблюдаемых различий в уровне транскриптов mak-v в опухолевых клетках [8].
Рис. 3. (A) Норзерн-блот анализ транскрипта mak-v в клетках линий КСМЛ-0 и КСМЛ-100. Мембрану также гибридизовали с зондом GAPDH для нормализации нагрузки образцов. (Б) Относительная активность репортерного гена люциферазы под контролем делеционных мутантов промоторной области гена mak-v в клетках линий КСМЛ-0 и КСМЛ-100. (В) Саузерн-блот анализ геномной ДНК, изолированной из клеток линий КСМЛ-0 и КСМЛ-100 и гидролизованных рестрикционными эндонуклеазами NotI и Eco72I. Если указано, ДНК дополнительно расщеплялась рестрикционными эндонуклеазами MspI (M) или HpaII (H). В качестве зонда для гибридизаци был использован 32P меченный фрагмент нт -508 … -347 промоторной области гена mak-v мыши.
1.2. Внутриклеточная локализация и статус фосфорилирования MAK-V Функции и активность протеинкиназ часто контролируются посредством их фосфорилирования и изменениями во внутриклеточной локализации. Кроме того, компартментализация белков часто связана с их функциональной ролью в клетке.
Поэтому были исследована внутриклеточная локализация протеинкиназы MAK-V в клетке и ее статус фосфорилирования.
1.2.1. Локализация MAK-V на центросоме Внутриклеточная локализация трансгенно продуцируемой протеинкиназы MAK-V была исследована с помощью метода иммунофлуоресцентного анализа с анти-MAK-V антителами. В клетках линии COS-1 MAK-V характеризуется нуклео-цитоплазматической локализацией с отчетливой окраской центросом, выявленных с помощью антител против -тубулина (Рис. 4) [6,17]. Аналогичные результаты были получены и с белком MAK-V, продуцируемым как химера с зеленым флуоресцентным белком (EGFP), а также в клетках других линий (BHK-21, CHO, HeLa B). О специфичности локализации MAK-V на центросоме и ee транспорта в ядро говорит тот факт, что удаление части каталитического Рис. 5. Детекция эндогенно продуцируемой протеинкиназы MAK-V в центросомальной фракции белков. Приведены результаты Вестерн-блот анализа с анти-MAK-V антителами суммарных лизатов mak v-негативных клеток КСМЛ-100 (1) и mak-v-позитивных клеток КСМЛ- (2), а также пост-ядерного (3) и пост центросомального (5) супернатантов и центросомальной фракции (4), приготовленных из клеток КСМЛ-0.
(6) – лизат клеток, трансгенно продуцирующих белок MAK-V с С концевым FLAG-эпитопом.
Рис. 4. Нуклеоцитоплазматическая и центросомальная локализация трансгенно продуцируемой протеинкиназы MAK-V (А), но не ее мутанта L301P (Б) в клетках COS 1. Клетки COS-1 транзиторно трансфицировали плазмидами для продукции соответствующих белков и окрашивались антителами к протеинкиназе MAK-V и тубулину. Изображения были получены на конфокальном микроскопе Leica с использованием объектива x100.
домена в белке EGFP-MAK-V или замена инвариантной аминокислоты каталитического домена L301P приводило к отсутствию окраски MAK-V на центросоме и в ядре (Рис. 4).
Эти же результаты указывают и на необходимость присутствия интактного каталитического домена для центросомальной и ядерной локализации протеинкиназы MAK-V, что подтверждается центросомальной локализацией белка с удаленным С концевым доменом и ее отсутствию при удалении N-концевой части белка MAK-V, содержащей каталитический домен. Центросомальная локализация MAK-V подтверждается присутствием в центросомальной фракции при биохимическом фракционировании клеток линии КСМЛ-0 эндогенной протеинкиназы MAK-V (Рис. 5), выявленной с помощью полученных нами антител, способных детектировать эндогенный белок MAK-V [12]. Таким образом, протеинкиназа MAK-V специфически локализуется на центросомах клеток.
Центросомальная локализация MAK-V в клетке предполагает связь между этой протеинкиназой и функциями центросомы. Центросома является основным центром организации микротрубочек, и центросомальная локализация MAK-V может указывать на связь MAK-V с микротрубочковым цитоскелетом. Интересно отметить, что родственные MAK-V протеинкиназы MARK1/2 действительно влияют на динамику микротрубочек, однако продукция MAK-V не оказывала влияния на архитектуру микротрубочкового цитоскелета и не влияла на процесс сборки микротрубочек после деполимеризации.
Другим фундаментальным клеточным процессом, в котором центральную роль играет центросома, является клеточное деление, и фосфорилирование центросомальных белков, опосредованное ассоциированными с центросомой протинкиназами, играет важную роль в контроле клеточного цикла. Это предполагает, что MAK-V может принимать участие в регуляции клеточного цикла. В пользу этой гипотезы говорит выявленная регуляция транскрипции MAK-V факторами транскрипции семейства E2F, которые играют важную роль в прогрессии клеточного цикла. Более того, предположение о роли MAK-V в регуляции клеточного цикла подтверждается данными Сакаи и соавторов, продемонстрировавших участие MAK-V в контроле пролиферативной активности клеток дистальной части почечных канальцев.
1.2.2. Фосфорилирование протеинкиназы MAK-V в клетке Фосфорилирование является одним из спсобов регуляции активности протеинкназ.
Для анализа статуса фосфорилирования протеинкиназы MAK-V белок «дикого» типа с FLAG-эпитопом и его различные мутанты были транзиторно продуцированы в клетках линии COS-7, иммунопреципитированы и их фосфорилирование было проанализировано с помощью фосфо-специфических антител. В результате анализа было установлено, что белок дикого типа и его мутантные формы фосфорилированы по остаткам серина (Рис.
Рис. 6. А, Б – Анализ фосфорилирования белка MAK-V-FLAG и его мутантов в клетках линии COS-7.
Анти-FLAG-M2 антитела (А) и анти-фосфосериновые (P-Ser) или анти-фосфотреониновыми (P-Thr) антитела (Б) использовали для Вестерн-блоттинга белков, иммунопреципитированных из лизатов клеток линии COS-7, транзиторно продуцирующих белок MAK-V-FLAG (1) или его мутантные формы UBA (2), L301P (3), K91R (4), и из лизатов нетрансфицированных клеток (5). Положения маркеров молекулярных весов (MW) отмечены слева, молекулярные веса приведены в кДа. Стрелками в (А) и (Б) отмечены белковые полосы, окрашиваемые только в лизатах клеток, продуцирующих белок MAK-V-FLAG или его мутантные формы. В (А) звездочками отмечены выявляемые при Вестерн-блоттинге цепи анти-FLAG-M моноклональных антител, частично элюируемые с аффинного матрикса. В – Анализ фосфорилирования белка MAK-V-FLAG в клетках PC12TetOn с тетрациклин-регулируемой экспрессией MAK-V-FLAG.
Вестерн-блоттинг с анти-FLAG-M2 антителами фракций фосфорилированных (Р+) и нефосфорилированных (Р-) белков клеток PC12TetOn с индуцированной (+) или неиндуцированной (-) экспрессией белка MAK-V-FLAG. – суммарные лизаты клеток до очистки на аффинном матриксе.
6А,Б) [10]. Кроме того, было обнаружено, что вместе с белком MAK-V и его мутантами ко-преципитируется фосфобелок с молекулярным весом около 90 кДа (Рис. 6А). Это белок был очищен и идентифицирован с помощью MALDI-TOF спектрометрии как белок шаперон При этом иммуноцитохимический анализ транзиторно Hsp90.
трансфицированных клеток показал, что белок MAK-V часто детектируется в структурах, предположительно являющихся агрегасомами, содержащими неправильно сложенные белки. Это предположение подтверждается декорацией этих структур белком-шапероном Hsp70, выявленной с помощью иммуноцитохимического анализа (Рис. 7). Поэтому можно сделать вывод о том, что MAK-V при экспрессии в клетках имеет тенденцию к формированию агрегатов, и ассоциация шаперона Hsp90 с белком MAK-V является следствием его неправильного фолдинга. Нефизиологичность выявленного взаимодействия MAK-V с Hsp90 подтверждается и отсутствием Hsp90 в комплексе с MAK-V при очистке протеинкиназы из клеток линии PC12TetOn с индуцибельной экспрессией MAK-V, в которых MAK-V не формирует агрегатов (см. п. 1.6.1 ниже). Для демонстрации того, что обнаруженное фосфорилирование протеинкиназы MAK-V не является артефактным из-за формирования агрегатов при транзиторной продукции белка, был проведен анализ статуса фосфорилирования MAK-V в клетках PC12TetOn, который показал, что значительная часть MAK-V присутствует во фракции фосфобелков (Рис. 6В) [10]. Таким образом, протеинкиназа MAK-V подвержена фосфорилированию в клетке, что является основанием для исследования его роли в регуляции протеинкиназы MAK-V.
Рис. 7. Ко-локализация белка EGFP-MAK-V и Hsp70 на структурах, схожих с агрегасомами.
Клетки COS-1 транзиторно трансфицировали плазмидой для продукции белка EGFP-MAK V и окрашивались антителами к Hsp70. Белок выявляли по зеленой EGFP-MAK-V флуоресценции EGFP. Изображения были получены на конфокальном микроскопе Leica с использованием объектива x100.
1.3. Потенциальные белки-партнеры по взаимодействию с MAK-V Белок-белковые взаимодействия являются одним из факторов, определяющих биологические функции белков в клетке. Идентификация партнеров по взаимодействию может позволить ассоциировать исследуемый белок с определенными молекулярными процессами и послужить отправной точкой для выявления его роли в определенной цепи молекулярных событий. Поиск потенциальных партнеров по взаимодействию с протеинкиназой MAK-V с использованием двугибридной системы в дрожжах позволил Таблица 1. Белки, взаимодействующие с протеинкиназой MAK-V в двугибридной системе в дрожжах.
Нуклеотидная Название белка Функции белка последовательность (GeneBank Acc. No.) Эффектор малых ГТФаз – регуляторов раннего Rabaptin-5 (включая и NM_ эндоцитоза Rab5 и Rab4;
выполняет функцию изоформы) платформы для взаимодействия белков.
Содержит Rap/Ran GAP-домен.
E6TP1/signal-induced NM_ proliferation-associated 1 like Протокадгерин;
супрессор опухолевого роста у mFAT1 NM_ D.melanogaster;
регулятор динамики актинового цитоскелета и клеточной полярности.
Необходим для эмбрионального развития и в Periphilin-1 NM_ нервной системе;
участвует в регуляции клеточного цикла.
Неизвестны.
BEN-domain containing protein 5 NM_ Аспарагинил гидроксилаза;
взаимодействует с Hypoxia inducible factor 1, alpha NM_ фактором, индуцируемым гипоксией-1 (HIF-1) subunit inhibitor (FIH-1) и ингибирует его транскрипционную активность.
Содержит Arf GAP-домен;
потенциальный Centaurin-3, изоформа a AF регулятор мембранного транспорта и актинового цитоскелета.
идентифицировать ряд таких белков [1-3], суммированных в Таблице 1. Среди изолированных белков, специфически взаимодействующих с MAK-V в дрожжах, присутствует сходный с белком Рабаптин-5 белок, получивший название Рабаптин-5, характеризующийся делецией 40 аминокислот в N-концевой части полипептида по сравнению с Рабаптином-5, не приводящей к сдвигу рамки считывания [2,4]. В дальнейшем было показано, что протеинкиназа MAK-V сохраняет способность взаимодействовать и с самим Рабаптином-5 (Рис. 8), а также с другой его впервые клонированной нами -изоформой с делецией 43 аминокислотных остатков (Рис. 9А) [4].
Картирование участков белков, опосредующих их взаимодействие, показало, что для взаимодействия необходима N-концевая часть протеинкиназы MAK-V, содержащая каталитический и SNH/UBA-домен, а в Рабаптине-5 и его изоформах – аминокислоты 407 663 в С-концевой части, что объясняет взаимодействие с MAK-V не только Рабаптина-5, но и его изоформ, делеции в которых находятся в N-концевой части полипептидной цепи (Рис. 9). Обнаруженные взаимодействия, требующие дальнейшего исследования, в том числе и проверки их существования в клетке, служат отправной точки для детального исследования связи протеинкиназы MAK-V с молекулярными процессами, в которых участвуют ее идентифицированные потенциальные партнеры по взаимодействию Рис. 8. Анализ взаимодействия протеинкиназы MAK-V и Рабаптина-5 в дрожжевой двугибридной системе. Приведены результаты анализа активности репортерного гена LacZ в дрожжах, продуцирующих химеры MAK-V и Рабаптина-5 с ДНК-связывающим (GAL4BD) или активирующим транскрипцию (GAL4AD) доменами фактора транскрипции GAL4, соответственно.
Рис. 9. Картирование фрагментов белка Рабаптина-5 и его изоформ (А) и протеинкиназы MAK-V (Б), опосредующих их взаимодействие. Сверху приведены схемы строения Рабаптина-5 (А) и протеинкиназы MAK-V (Б) с указанием положения структурных доменов (в аминокислотных остатках). СС1-1…СС2-2 – области coiled-coil в белке Рабаптин-5. Также показаны отсутствующие участки полипептидной цепи в и изоформах Рабаптина-5 (А). Ниже приведены схематические изображения химер делеционных мутантов Рабаптина-5 с активирующим транскрипцию доменом фактора транскрипции GAL4 (GAL4AD) (А) и протеинкиназы MAK-V с ДНК-связывающим доменом GAL4 (GAL4BD) (Б). Справа приведены результаты анализа активности репортерного гена LacZ в дрожжах, ко-продуцирующих соответствующие химеры делеционных мутантов и химеру ДНК-связывающего домена GAL4 с протеинкиназой MAK-V (аминокислоты 26-714) (A) или химеру Рабаптина-5 (аминокислоты 137-862) с активирующим транскрипцию доменом фактора транскрипции GAL4 (Б).
(Таблица 1). В частности, один из таких белков, протокадгерин mFAT1, является супрессором опухолевого роста у Drosophila и играет существенную роль в формировании почек, глаза и нервной головного мозга, органов, в которых протеинкиназа MAK-V играет, как это было продемонстрировано экспериментально, определенную роль.
1.4. MAK-V как регулятор эндоцитоза Обнаруженное взаимодействие протеинкиназы MAK-V с Рабаптином-5, белком, который является эффектором малых ГТФаз Rab5 и Rab4, ключевых регуляторов раннего эндоцитоза и рециклинга ранних эндосом, соответственно, позволяет предположить ее связь с процессами эндоцитоза в клетке. Для проверки этого предположения были использованы клетки линии ВМР-0, лишенные экспрессии mak-v, в которые с помощью обмена экспрессионными кассетами, опосредованного рекомбиназой Flp, вводилась кассета для экспрессии протеинкиназы MAK-V, ее каталитически неактивного мутанта, лишенного N-концевой части, включая фрагмент каталитического домена, или «пустая» кассета. В клетках, продуцирующих протеинкиназу MAK-V, эндоцитоз жидкой фазы, измеренный по содержанию эндоцитируемой пероксидазы, в 2 раза превышал уровень эндоцитоза контрольных клеток или клеток с экспрессией каталитически неактивного делеционного мутанта MAK-V (Рис. 10) [1]. Это указывает на участие протеинкиназы MAK-V в регуляции процесса эндоцитоза, возможно, за счет взаимодействия и Рис. 10. Схемы белка MAK-V и его делеционного мутанта, продуцированных в клетках ВМР-0 в результате Flp рекомбинации (А), и количество эндоцитированной пероксидазы в клетках (в условных единицах, У.Е.) (Б) после рекомбинации кассеты для экспрессии протеинкиназы MAK-V, ее делеционного мутанта (MAK-Vkin) и «пустой» кассеты (-).
фосфорилирования Рабаптина-5, тем более что Рабаптин-5 фосфорилируется в клетке.
Однако влияние его фосфорилирования на его функции в эндоцитозе, а также протеинкиназы, ответственные за фосфорилирование Рабаптина-5, остаются на настоящий момент неизвестными. Таким образом, выявление потенциальных партнеров по взаимодействию с протеинкиназой MAK-V в двугибридной системе в дрожжах позволило установить участие протеинкиназы MAK-V в регуляции эндоцитоза в клетке.
1.5. Мыши с направленно-нарушенным геном mak-v Для исследования функций протеинкиназы MAK-V в масштабах организма были получены мыши, дефектные по функциональной протеинкиназе MAK-V. Для этого были получены клоны эмбриональных стволовых клеток, в которых в одном аллеле гена mak-v был удален экзон 4, кодирующий часть субдомена VII, субдомен VIII и часть субдомена IX каталитического протеинкиназного домена. Кроме того, удаление экзона 4 приводит к сдвигу в рамке считывания, и транслируемый с такого транскрипта белок состоит из N-концевых аминокислотных остатков белка MAK-V. Таким образом, делеция экзона гена приводит к продукции нефункционального белка MAK-V. Один из полученных клонов эмбриональных стволовых клеток мыши E14Tg2a с гомологичной рекомбинацией конструкции для делеции экзона 4 гена mak-v был использован для получения химерных мышей. В результате последующего скрещивания с мышами линии C57Bl/6J были получены мыши с герминальной передачей дефектного аллеля (mak-v-), которые подверглись скрещиванию с мышами линии C57Bl/6J на протяжении 6 поколений для получения аллеля mak-v- на «чистом» генетическом фоне. В силу отсутствия антител, пригодных для детекции эндогенного белка MAK-V, был проведен анализ транскрипта mak-v в головном мозге мышей, гомозиготных по аллелю mak-v-, с использованием ПЦР с праймерами, фланкирующими область транскрипта, соответствующей экзону 4. В то время как в мозжечке mak-v+/+ мышей детектировался фрагмент размером 826 п.н., соответствующий аллелю mak-v «дикого» типа, он отсутствовал при амплификации на матрице РНК мозжечка mak-v-/- мышей. Однако, наряду с 690 п.н. фрагментом, соответствующим делеции экзона детектировался дополнительный продукт 4, Рис. 11. (А) Схема фрагмента кДНК mak-v (экзоны 2-7). Праймера, использованные в ОТ-ПЦР, показаны стрелками. Ниже приведены схемы продуктов амплификации кДНК, транскрибируемых с аллеля mak-v «дикого типа» (wt), направленно нарушенного аллеля без экзона 4 (KOex4) и без дополнительно делетированного экзона 5 (KOex4&5) с указанием расчетных длин продуктов амплификации. (Б) Результаты ОТ-ПЦР на матрице РНК, изолированной из мозжечков мышей mak-v+/+ (1), mak-v+/- (2) и mak v-/- (3). MW – стандарт молекулярных весов ДНК в п.н. ОТ+ и ОТ- обозначают ПЦР на матрице реакций обратной транскрипции с (+) и без (-) добавления обратной транскриптазы.
амплификации размером 528 п.н., который после определения его нуклеотидной последовательности был идентифицирован как соответствующий одновременной делеции экзонов 4 и 5 (Рис. 11). Существенно, что делеция экзонов 4 и 5 не приводит к сдвигу рамки считывания и будет приводить к трансляции белка, полностью идентичного MAK V, но лишенного аминокислот 201-291, входящих в состав каталитического домена, и, поэтому, лишенного каталитической активности. У животных, гетерозиготных по нарушенному аллелю (mak-v+/-), преимущественно присутствовал транскрипт аллеля «дикого» типа (Рис. 11), причем было продемонстрировано, что это не может быть обусловлено материнской или отцовской селекцией аллеля. Преимущественное присутствие транскрипта аллеля «дикого» типа предполагает существование аллельного переключения для гена mak-v, направленного на продукцию функционального белка, или сниженную стабильность обоих альтернативно сплайсированных транскриптов.
Мыши с направленно нарушенным геном представляют собой уникальный инструмент для выявления роли продукта нарушенного гена в организме. Однако у mak-v / и mak-v+/- мышей не было выявлено каких-либо аномалий по сравнению с мышами «дикого» типа, в частности, различий в весе животного, весе почек, фертильности, продолжительности жизни, а также в простых тестах на координацию и активность (grid test и activity camera test). Таким образом, продукция нефункционального как протеинкиназа белка MAK-V не вызывает критических изменений в развитии и функционирования организма на модели мыши. Это наблюдение может быть объяснено существованием компенсаторных механизмов, возможно, с участием родственных MAK V протеинкиназ, что представляется вероятным с учетом установленной «молодости» гена mak-v в эволюционном контексте. Возможно, что для фенотипического проявления отсутствия функциональной протеинкиназы необходимо присутствие MAK-V сопутствующего дефекта в другом гене(ах), обуславливающем компенсацию функций или экстремальные воздействия на организм, которые превысят его MAK-V, компенсаторные возможности.
1.6. Роль MAK-V в поддержании жизнеспособности клеток Делеция функциональной протеинкиназы MAK-V в организме мыши не позволило на настоящем этапе выявить связанные с этим аномалии. В то же время, модель культур клеток с транзиторной продукцией MAK-V не является адекватной и физиологичной в силу тенденции MAK-V формировать агрегаты. Для возможности исследования влияния MAK-V на клеточные процессы была предпринята попытка создания клеток с индуцибельной экспрессией MAK-V, что, с одной стороны, предоставляет адекватный контроль сравнения в виде клеток без индукции экспрессии, а с другой - позволяет регулировать уровень экспрессии, что может позволить избежать формирования агрегатов. Принимая во внимания возможную роль MAK-V в нервной системе, нами были выбраны в качестве модели клетки линии PC12, способные дифференцироваться по нейрональному пути.
1.6.1. Клетки с индуцибельной экспрессией MAK-V как модельная система Были получены клоны клеток линии PC12TetOn с индуцибельной экспрессией белка MAK-V с C-концевым FLAG-эпитопом и его каталитически неактивным мутантом K91R. Для дальнейшей работы были выбраны по одному клону, характеризующихся низким уровнем продукции трансгена без индуктора и наиболее близко соотносящиеся по уровню продукции белков в присутствии индуктора (Рис. 12А). Важно, что по результатам иммуноцитохимического анализа индукция экспрессии белка MAK-V не приводила к формированию агрегатов, а наблюдалась только типичная локализация белка MAK-V на центросомах (Рис. 12Б,В).
Рис. 12. Клоны клеток с индуцибельной экспрессией MAK-V. (А) Вестерн-блот анализ лизатов клеток PC12TetOn (РС12) и их клонов с индуцибельной экспрессией белка MAK-V-FLAG (клон 14) и его мутанта K91R (клон KR5), обработанных (+) и необработанных (-) индуктором (доксициклин). (Б, В) Иммуноцитохимический анализ клеток клона 14, необработанных (DOX-) или обработанных доксициклином для индукции экспрессии белка MAK-V-FLAG (DOX+), с анти-FLAG антителами и антителами к -тубулину. Изображения были получены на конфокальном микроскопе Radiance (BioRad) с использованием объектива x63.
1.6.2. MAK-V и Mn2+-индуцированная цитотоксичность Клетки PC12 широко используются как модель для анализа токсичности различных веществ, в частности, бивалентных ионов. Проведенный анализ показал, что экспрессия MAK-V задерживает гибель клеток, вызванную ионами Mn2+ (Рис. 13), длительное воздействие которых на клетки нервной системы приводит к проявлению черт, характерных для болезни Паркинсона, и сопряжена с уменьшением активации про апоптотических каспаз, что свидетельствует о супрессии апоптотических процессов при экспрессии MAK-V. Учитывая выраженную экспрессию MAK-V в клетках нервной системы, на основании полученных результатов можно сделать предположение о роли MAK-V в защите клеток нервной системы от ассоциированной с ионами марганца токсичности.
Рис. 13. Экспрессия протеинкиназы MAK-V задерживает Mn2+-индуцированную клеточную гибель. Клетки клона 14 засевали в покрытые ламинином лунки 96-луночного планшета и обрабатывали (DOX+) или не обрабатывали доксициклином с последующей (DOX-) обработкой 2 мМ хлоридом марганца в течение часов. После этого определяли жизнеспособность клеток по количеству внутриклеточного АТФ (А) и активацию каспаз 3/7 (Б) с использованием люминометрических методов анализа. Данные приведены в относительных единицах люминисценции (ОЕ).
*, P=0.0089;
**, P=0.0011.
1.6.3. Влияние MAK-V на дифференцировку клеток PC12TetOn по нейрональному пути Учитывая возможную роль MAK-V в нервной системе, было исследовано влияние MAK-V на дифференцировку клеток линии PC12TetOn по нейрональному пути под действием нейронального фактора роста. Индукция экспрессии MAK-V в клетках, культивируемых на коллагене IV, приводила к появлению большего абсолютного числа клеток с отростками по сравнению с клетками, не обработанными индуктором (Рис. 14). В то же время, было отмечено большее общее число клеток при экспрессии MAK-V к 7-му дню дифференцировки, а доля клеток с отростками была приблизительно одинаковой вне зависимости от экспрессии MAK-V. Это предполагает, что MAK-V не влияет непосредственно на процесс дифференцировки, но увеличивает жизнеспособность клеток, что подтверждается отсутствием различий в средней длине отростков и их усредненном количестве на клетку для популяций клеток, обработанных и не обработанных индуктором.
Рис. 14. Одинаковое количество клеток клона (~30000 клеток) высевали на покрытые коллагеном IV чашки и культивировали в присутствии нейронального фактора роста с (DOX+) или без (DOX-) доксициклина.
Приведены данные по процентному составу клеток с отростками (А) и общему числу клеток (Б) через 6 дней инкубации для двух независимых экспериментов (Эксп. 1 и Эксп. 2).
1.6.4. MAK-V и клеточный ответ на компоненты внеклеточного матрикса Увеличение жизнеспособности клеток PC12TetOn в ответ на продукцию протеинкиназы MAK-V может быть обусловлено увеличением пролиферативной активности клеток или супрессией их гибели. Анализ жизнеспособности клеток показал, что коллаген IV, но не ламинин, вызывает гибель клональной производной клеток с индуцибельной экспрессией При этом гибель клеток PC12TetOn MAK-V.
сопровождалась активацией про-апоптотических каспаз и супрессировалась при экспрессии MAK-V (Рис. 15). Специфичность эффекта продукции MAK-V на увеличение жизнеспособности клеток подтверждается отсутствием аналогичного эффекта при продукции каталитически неактивного мутанта MAK-V. Полученные результаты позволяют сделать вывод о положительном влиянии MAK-V на жизнеспособность клеток.
Интересно отметить, что этот вывод подтверждается данными двух независимых анализов участия протеинкиназ в поддержании жизнеспособности клеток, выявивших MAK-V как одну из таких протеинкиназ, значимость которой, однако, зависит от типа клеток. Таким образом, продукция протеинкиназы может позитивно влиять на MAK-V жизнеспособность клеток в определенном контексте, в частности, в ответ на контакт клеток с определенным типом внеклеточного матрикса. Поскольку контакты клеток с внеклеточным матриксом играют важную роль в процессе развития, обнаруженный феномен может являться ключом к роли MAK-V в процессах развития, а также быть существенным для опухолевых клеток, характеризующихся увеличенным уровнем продукции протеинкиназы MAK-V.
1.7. Продукция MAK-V в опухолях молочной железы человека Клонирование кДНК протеинкиназы и ее способность влиять на MAK-V жизнеспособность клеток явились предпосылками для исследования экспрессии MAK-V в опухолях. Для анализа были выбраны опухоли молочной железы человека так как Рис. 15. Протеинкиназа MAK-V супрессирует коллаген IV-индуцированную апоптотическую гибель клеток PC12TetOn. (А) Количество жизнеспособных клеток клонов 14 и KR5 с индуцибельной экспрессией протеинкиназы MAK-V или ее мутанта K91R, соответственно, после инкубации клеток на коллагене IV.
(Б) Количество жизнеспособных клеток клона 14 после инкубации клеток на коллагене IV или ламинине.
(В) Высвобождение лактат дегидрогеназы в культуральную среду из клеток клона 14 и исходной линии PC12TetOn при их культивации на коллагене IV. *, P0.0001. (Г) Активность каспаз-3/7 в клетках клона и исходных клетках линии PC12TetOn при их культивации на коллагене IV или ламинине. **, P=0.0013.
(Д) Детекция апоптотических клеток клона 14, культивируемых на коллагене IV, окрашенных аннексином V-FITC, с помощью цитофлуориметрии. (Е) Детекция активной расщепленной каспазы-3 в клетках клона 14, культивируемых на коллагене IV. DOX+ - клетки, обработанные индуктором экспрессии доксициклином;
DOX- - клетки, не обработанные индуктором экспрессии.
дифференциальная экспрессия mak-v наблюдалась в опухолях молочной железы мыши.
Иммуногистохимический анализ с анти-MAK-V антителами 17 образцов случайно выбранных опухолей молочной железы человека выявил увеличенную иммунореактивность в 57% случаев. В 43% опухолей, а также в прилегающем нормальном эпителии, продукции MAK-V отсутствовала [7,15,16]. При этом не наблюдалось связи между уровнем MAK-V и рядом клинико-патологических параметров Таблица 2. Увеличенная продукция протеинкиназы MAK-V в опухолевых клетках и клинико патологические факторы для группы из 17 случайно выбранных опухолей молочной железы человека.
Для статистического анализа использовался тест Фишера. Для параметра Возраст величина P приведена для категорий 60 и 60. Для параметра Гистотип величина P приведена для категорий дольковый и протоковый.
Увеличенная продукция Число MAK-V/Hunk Величина P случаев нет да Возраст (лет) 39-49 4 2 0. 50-59 5 3 60 7 2 Размер опухоли 2.0 см 7 4 3 0. 2.1 см 9 4 Гистотип дольковый 6 1 0. протоковый 8 6 другие 3 1 Метастазирование да 6 3 3 1. нет 11 5 (Таблица 2) за исключением тенденции к увеличенной продукции MAK-V в опухолях долькового рака по сравнению с протоковым. Исследования 35 образцов протокового рака молочной железы, разбитых на 4 группы по наличию или отсутствию метастазов и по реакции с онкобелком c-ErbB-2, показали, что, как и при случайной выборке, около половины (54%) образцов были MAK-V-позитивными. Сопоставление статуса продукции MAK-V показало отсутствие его связи с метастазированием, статусом рецепторов стероидных гормонов и окраской ядерного антигена пролиферирующих клеток (PCNA) и выявило преимущественное увеличение продукции MAK-V в опухолях, позитивных по c ErbB-2 (Таблица 3), выделяя при этом среди них группу MAK-V-позитивных опухолей [7]. Суммируя, увеличенная продукция MAK-V часто наблюдается в опухолях молочной железы, что позволяет использовать его в качестве молекулярного опухолевого маркера.
Кроме того, увеличенная продукция MAK-V уникально выделяет группу опухолей по этому признаку, что может отражать специфические особенности молекулярных процессов в этих опухолевых клетках и в дальнейшем использоваться в прогностических целях или как мишень в противоопухолевой терапии, однако установление таких возможностей требует проведения дальнейших исследований. Существенно, что выявленная способность MAK-V поддерживать жизнеспособность клеток в определенных случаях, в частности, при контактах с молекулами внеклеточного матрикса, может приводить к появлению преимуществ опухолевых клеток с высокой продукцией MAK-V и, соответственно, являться негативным фактором.
Таблица 3. Увеличенная продукция протеинкиназы MAK-V в опухолевых клетках для группы из 35 случаев протокового рака молочной железы человека. Продукция MAK-V в опухолевых клетках табулировалась как (отсутствие окраски), 0.5 (слабая окраска, 0.5+), 1 (позитивные по окраске, 1+), 2 (сильно позитивные по окраске, 2+), и 3 (очень сильно позитивные по окраске, 3+) и использовалась для вычисления среднего значения и стандартного отклонения (ср.знач.ст.откл.). Опухоли группировались по признаку наличия (мет+) или отсутствия (мет-) метастазов, или разбивались на группы c-ErbB2/Neu-позитивных (3+) и c ErbB2/Neu-негативных опухолей (Neu3+ и Neu-, соответственно). Для статистического анализа использовались непарный t-тест (*) и тест Фишера (**).
Продукция Продукция Продукция MAK-V/Hunk ср.знач. MAK-V/Hunk MAK-V/Hunk P* P** P** ст.откл.
0.5 1 2 3 00.5 13 01 мет+ (n=18) 2 7 5 3 1 9 9 14 0.970..6660.7380. мет (n=17) 2 5 5 4 1 7 10 12 1.090. Neu3+ (n=18) 1 5 5 5 2 6 12 11 1.310..0343.1811. Neu (n=17) 3 7 5 2 0 10 7 15 0.740. 2. Исследование изменения экспрессии генов при немелкоклеточном раке легкого Рак легкого занимает одно из первых мест среди онкологических заболеваний при отсутствии в настоящее время эффективных способов его лечения. Понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе агрессивного поведения опухолевых клеток рака легкого, в том числе и исследование дифференциальной экспрессии генов, позволит, как ожидается, улучшить эффективность лечения за счет персонализации лечения и рационального выбора использующихся терапевтических средств и идентификации новых мишеней для инновационных способов лечения, а также позволит улучшить диагностическую и прогностическую составляющие.
2.1. Супрессор опухолевого роста Pdcd Экспрессия супрессора опухолевого роста Pdcd4 часто снижена в опухолях различного происхождения, в том числе и в аденокарциномах легкого, однако снижения экспрессии Pdcd4 в опухолях плоскоклеточного рака легкого (ПРЛ) ранее установлено не было. Анализ 27 образцов опухолей немелкоклеточного рака легкого (НМКРЛ), 23 из которых являлись ПРЛ, и прилегающих к ним неопухолевых тканей методом полу количественной ПЦР выявило частую (в 56.5%) и статистически достоверную (Р0.0001) супрессию транскрипта Pdcd4 при ПРЛ [13,14,19-21]. При этом анализ уровня белка Pdcd в 14 образцах показал, что уровень белка Pdcd4, несмотря на супрессию транскрипта, часто остается высоким. Отсутствие падения уровня белка Pdcd4 было подтверждено и с Таблица 4. Уровни транскрипта и белка Pdcd4 в тканях опухолей ПРЛ относительно прилегающих неопухолевых тканей для 14 проанализированных пар образцов.
Пара #1 #2 #3 #4 #5 #6 #7 #8 #9 #10 #11 #12 #13 # образцов Транскрипт 3.3 2.0 1.1 0.3 1.9 0 0 0.1 0.04 0.7 0.8 0.3 0.4 0. Белок 4.2 3.6 2.3 0.6 4.8 1.7 1.3 1.3 1.1 4.8 5 5 5 помощью иммуногистохимического анализа срезов опухолей с анти-Pdcd4 антителами [13]. Этот факт указывает на существование механизмов пост-трансляционной регуляции экспрессии Pdcd4, что подтверждается значительным разбросом значений соотношения уровней транскрипта и белка Pdcd4 в линиях клеток рака легкого (Таблица 4). Механизм пост-трансляционной регуляции экспрессии Pdcd4 действительно был выявлен в работах других исследователей, и в нем ключевую роль играет фосфоинозитид 3-киназный (PI3K)/Akt/mammalian target of rapamycin (mTOR) сигнальный путь, индуцирующий протеолитическую деградацию Pdcd4. Возможно, что причиной дерегулированного соотношения уровней транскрипта и белка Pdcd4 в опухолях легкого являются дефекты в системе протеолитической деградации Pdcd4, в частности, потеря TRCP, субъединицы Е3 убиквитин лигазы, ответственной за убиквитинилирование Pdcd4, которая часто наблюдается в опухолях легкого. Суммируя, как и в аденокарциномах легкого, при ПРЛ часто наблюдается супрессия транскрипта Pdcd4, что позволяет использовать уровень транскрипта в качестве молекулярного маркера ПРЛ, например, для Pdcd персонализации терапии пациентов с ПРЛ. Существенно, что анализ уровня белка Pdcd4 в ПРЛ не может быть использован как эквивалент анализа изменения уровня транскрипта Pdcd4, и уровень белка Pdcd4 может рассматриваться как независимый молекулярный параметр для ПРЛ.
2.2. Ингибитор Wnt-сигнального пути WIF Аномальная активация Wnt-сигнального пути часто наблюдается в опухолях различного происхождения и вносит свой вклад в формирование и прогрессию опухолевого фенотипа, в частности, в случае опухолей легкого. Одним из негативных внеклеточных регуляторов Wnt-сигнального пути является белок WIF1, экспрессия которого часто супрессирована в опухолях различных типов [9]. Анализ 21 образца НМКРЛ (из них 17 – ПРЛ) и прилегающих неопухолевых тканей показал, что в 14 случаях (из них 13 – ПРЛ) наблюдается снижение уровня транскрипта WIF1 в ткани опухоли, что соответствует ранее опубликованным результатам других исследований и дополняет их, увеличивая статистическую значимость [11,19,22]. Анализ уровня белка WIF1 в 6 парах образцов лизатов тканей опухолей и прилегающих неопухолевых тканей показал, что падение транскрипции WIF1 сопровождается и падением уровня белка [11]. Это наблюдение позволяет использовать как равнозначные маркеры для диагностических целей уровни транскрипта и белка WIF1. Существенно отметить, что продукция WIF1 в прилегающей нормальной ткани оставалась на высоком уровне, что позволяет сделать вывод о локальном характере действия WIF1 и отсутствии компенсации падения уровня WIF1 в опухоли за счет его секреции прилегающими тканями [11].
Супрессор опухолевого роста как мишень для 3. Pdcd противоопухолевой терапии Супрессор опухолевого роста Pdcd4 рассматривается как перспективная мишень для терапии онкологических заболеваний. Это определяется его частой супрессией в опухолях различного происхождения и тем, что в различных модельных системах восстановление экспрессии Pdcd4 приводило к ингибированию пролиферативнолй активности клеток, снижению их подвижности и инвазивности, апоптотической гибели клеток, их сенсибилизации к действию противоопухолевых агентов и другим анти неопластическим эффектам [14]. Для ответа на вопрос о возможности использования восстановления экспрессии Pdcd4 в опухолях легкого в качестве анти-неопластической терапии были исследованы последствия восстановления экспрессии Pdcd4 в клетках линий рака легкого. Заражение клеток линий NCI-H1299, NCI-H358, Calu-I и A аденовирусом для продукции химеры белка Pdcd4 с зеленым флуоресцентным белком (EGFP) не приводило к изменению их пролиферативной активности и не влияло на эффективность действия ряда химиотерапевтических средств. Эти результаты предполагают, что экспрессия Pdcd4 в клетках рака легкого может быть неэффективной как способ восстановления активности Pdcd4. Действительно, транзиторная экспрессия Pdcd4 при трансфекции экспрессионной конструкции в клетки линии NCI-H позволяла достичь продукции трансгенного белка Pdcd4 лишь на низком уровне (Рис. 16) и не оказывало влияния на AP-1-зависимую транскрипционную активность, которая считается основной мишенью для Pdcd4 как супрессора опухолевого роста (Рис. 17).
Рис. 16. Экспрессия химеры EGFP с Pdcd4 и его мутантами в клетках линии NCI-H1299.
Эндогенный и трансгенно Pdcd продуцируемые химеры Pdcd4 с EGFP детектировали с помощью анти-Pdcd4 антител.
Для нормализации образцов использовали уровень продукции неомицин фосфотрансферазы II (NPT), кодируемой плазмидой для экспрессии химеры EGFP с Pdcd4 и его мутантами. Внизу приведены относительные количества химер Pdcd4 и его мутантов с EGFP после нормализации на уровень продукции NPT.
Рис. 17. Экспрессия мутанта Pdcd4S67,71,457A, но не белка Pdcd4 «дикого» типа, ингибирует AP 1-зависимую транскрипцию в клетках NCI H1299. Приведена активность люциферазы в клетках, трансфицированных указанными экспрессионными векторами и плазмидой с AP 1-зависимой транскрипцией репортерного гена люциферазы. *, P=0.002;
**, P=0.0075.
Потеря экспрессии Pdcd4 в опухолевых клетках может быть обусловлена супрессией транскрипции гена, в том числе из-за гиперметилирования промоторной области гена, микроРНК miR-21-зависимой деградации транскрипта и ингибирования трансляции, а также пост-трансляционно благодаря PI3K/Akt/mTOR/S6 киназа 1 (S6K1) зависимой протеолитической деградации белка. При транзиторной трансфекции супрессия транскрипции гена Pdcd4 и микроРНК-зависимое ингибирование экспрессии не могут оказать влияния на продукцию трансгенного белка в силу использования гетерологичного промотора и отсутствия в экспрессионной конструкции сайта связывания микроРНК miR-21, соответственно. Однако остается возможной PI3K/Akt/mTOR/S6K1 зависимая деградация белка, которая опосредуется фосфорилированием серина-67 Pdcd киназой 1 с последующим фосфорилированием серинов-71 и и S6 - убиквитинилированием белка. Действительно, обработка клеток ингибитором mTOR рапамицином приводило к существенному увеличению уровня как эндогенного, так и транзиторно продуцируемого белков Pdcd4 (Рис. 18). Помимо S6 киназы 1, протеинкиназа может сама фосфорилировать серины-67 и что, как было Akt -457 Pdcd4, продемонстрировано ранее, приводит к снижению активности Pdcd4. Замена серинов-67, 71 и -457 на их нефосфорилируемый аналог аланин приводила к выраженному увеличению продукции белка в клетках линии NCI-H1299, на которую не оказывал Рис. 18. EGFP-Pdcd4 (A), но не EGFP-Pdcd4S67,71,457A (Б) стабилизируется рапамицином (rap) в клетках NCI-H1299 cells.
Рис. 19. Стабилизация эндогенного белка Pdcd4 в клетках NCI-H1299 LY294002 (LY), рапамицином (rap) и ингибитором протеасом MG132 (MG).
влияния рапамицин (Рис. 18, 19). Это указывает на то, что именно активация PI3K/Akt/mTOR-сигнального пути, часто происходящая в опухолевых клетках, является причиной супрессии уровня Pdcd4 в клетках NCI-H1299. Более того, анализ уровней продукции белков, содержащих только мутацию S457A, показал, что фосфорилирование серина-457, как и серинов-67 и -71, также приводит к снижению уровню белка, что впервые указывает на роль фосфорилирования Pdcd4 по серину-457 в контроле его стабильности. При этом было установлено, что максимальный уровень продукции Pdcd достигается при комбинации этих мутаций (Рис. 16). Существенно, что экспрессия мутанта Pdcd4 (S67,71,457A) приводила к супрессии АР-1-зависимой транскрипционной активности (Рис. 17), что свидетельствует о восстановлении активности Pdcd4 как супрессора опухолевого роста. Таким образом, впервые показано, что PI3K/Akt/mTOR сигнальный путь может вносить существенный вклад в ингибирование активности супрессора опухолевого роста Pdcd4 в опухолевых клетках за счет дестабилизации белка (однако нельзя исключить и непосредственное влияние фосфорилирования на активность Pdcd4). Полученные нами результаты демонстрируют, что рациональным способом восстановления активности Pdcd4 в опухолевых клетках является использование нечувствительного к PI3K/Akt/mTOR-сигнальному пути мутанта Pdcd4 (S67,71,457A) [14,21].
4. Экспрессионные модули на основе тимидинкиназы вируса простого герпеса 1 типа для терапии опухолей Генно-терапевтические подходы являются многообещающими в терапии различных заболеваний, в том числе и онкологических, и некоторые из них уже используются в клинической практике. При лечении онкологических заболеваний одной из основных проблем является проблема специфичности воздействия на опухолевые клетки, которая может решаться различными путями, в том числе и с использованием свойств генов, активность промоторов которых специфична для опухолевых клеток.
Одним из таких дифференциально транскрибируемых генов, транскрипционная активность которого отсутствует в подавляющем большинстве клеток организма и часто (около 85%) присутствует в опухолевых клетках, является ген теломеразной обратной транскриптазы человека (hTERT), промотор которого по результатам многочисленных работ может быть использован для обеспечения опухоль-специфической транскрипции терапевтического гена. В рамках практической реализации концепции создания отечественных противоопухолевых генно-терапевтических препаратах были созданы экспрессионные модули для продукции тимидинкиназы вируса простого герпеса 1 типа (HSV-tk) под контролем фрагмента промотора гена hTERT и его модификаций.
4.1. Дизайн экспрессионных модулей Хорошо известно, что ~200 п.н. фрагмент промотора гена hTERT достаточен для обеспечения эффективной транскрипции в hTERT-позитивных опухолевых клетках, при этом обеспечивая высокую специфичность транскрипции в них по сравнению с hTERT негативными клетками. В созданных экспрессионных модулях был использован фрагмент промотора, покрывающий 206 п.н. вверх от старта инициации транскрипции. Для увеличения эффективности в промоторную область экспрессионных модулей были также включены 37 п.н. гена hTERT вниз от старта транскрипции, что, по результатам ранее проведенного исследования, не оказывает влияния на специфичность промотора, однако, существенно увеличивает его активность в клетках, содержащих белок Е6 вируса папилломы человека (HPV) типа 16. Это, учитывая онкогенность этого вируса, позволяет ожидать повышенной эффективности такой генно-терапевтических конструкций на основе промотора гена hTERT в HPV-позитивных опухолях. Промотор гена hTERT является G/C-богатым и не содержит канонических TATA- и CAAT-мотивов. Ранее было продемонстрировано, что введение в промотор гена hTERT синтетического TATA-бокса или минимальным ранним промотором цитомегаловируса позволяет увеличить его активность без потери специфичности по отношению к hTERT-позитивным клеткам.
Поэтому нами были созданы варианты экспрессионных модулей с фрагментом промотора гена hTERT -206…+37, а также с его модификациями синтетическим TATA-боксом (hTERT-TATA) и минимальным ранним промотором цитомегаловируса (hTERT-CMV) для проведения их сравнительного анализа и выбора оптимального вараинта. В качестве действующего начала была использована кДНК HSV-tk. В присутствии ганцикловира последний эффективно конвертируется HSV-tk, но не клеточными тимидинкиназами, в ганцикловир-монофосфат с последующим его фосфорилированием клеточными ферментами в токсичный аналог тимидин-трифосфата, ганцикловир-трифосфат, включение которого в ДНК при репликации приводит к ее остановке и гибели клеток.
Помимо прямого действия на клетку, продуцирующую HSV-tk, присутствует и ганцикловир-зависимая гибель близлежащих клеток (bystander effect) за счет попадания ганцикловир-монофосфата и его производных в соседние клетки.
4.2. Оптимизация промоторной активности Сравнительный анализ транскрипционной активности промотора гена hTERT 206…+37 и его модификаций был проведен на панели опухолевых клеточных линий различного происхождения с использованием репортерного гена люциферазы. В результате анализа было установлено, что промоторная активность модифицированного промотора hTERT-CMV не ниже, а часто превосходит активность немодифицированного промотора и его модификации ТАТА-боксом (за исключением клеток меланомы MelKor) (Таблица 5), что делает предпочтительным использование промотора hTERT-CMV.
Таблица 5. Влияние модификаций промотора hTERT на его активность в опухолевых клеточных линиях.
«-» - промотор без модификаций;
CMV – модификация минимальным ранним промотором цитомегаловируса;
ТАТА – модификация синтетическим ТАТА-боксом.
Линия NCI Calu-I HCT116 HT1080 T47D Panc-1 AsPC-1 A431 MelKor MelCher клеток H 1.00± 1.00± 1.00± 1.00± 1.00± 1.00± 1.00± 1.00± 1.00± 1.00± 0.16 0.16 0.16 0.16 0.16 0.16 0.16 0.16 0.16 0. 1.15± 1.76± 1.02± 0.74± 1.15± 1.32± 1.68± 2.20± 0.95± 2.63± TATA 0.09 0.21 0.02 0.08 0.01 0.04 0.01 0.34 0.06 0. 1.97± 2.51± 8.05± 1.76± 1.42± 3.41± 4.39± 1.33± 1.47± 1.33± CMV 0.07 0.30 0.04 0.04 0.01 0.08 0.01 0.14 0.04 0. 4.3. Эффективность экспрессионных модулей in vitro 4.3.1. Эффективность плазмидных конструкций Эффективность экспрессионных модулей была оценена в модели ганцикловир зависимого ингибирования роста транзиторно трансфицированных клеток линии NCI H1299 в культуре. Введение плазмид, содержащих экспрессионные модули, приводило к выраженному ганцикловир-зависимому ингибированию роста клеток (Рис. 20). При этом модуль с промотором hTERT-CMV обладал несколько большей активностью, что соответствует результатам анализа транскрипционной активности промотора гена hTERT и его модификаций в клетках NCI-H1299. Таким образом, созданные экспрессионные модули способны обеспечивать продукцию HSV-tk и их введение в опухолевые клетки вызывает ганцикловир-зависимое ингибирование их роста.
Рис. 20. Жизнеспособность клеток трансфицированных NCI-H1299, плазмидой для экспрессии HSV-tk под контролем промотора hTERT без модификаций или (hTERT), модифицированного минимальным ранним промотором цитомегаловируса (hTERT-СМV) или синтетическим ТАТА-боксом (hTERT-ТАТА), после обработки ганцикловиром (Ganc) в указанных концентрациях.
4.3.2. Эффективность аденовирусных препаратов Ad-hTERT-HSV-tk и Ad-hTERT CMV-HSV-tk Экспрессионные модули и были hTERT-HSV-tk hTERT-CMV-HSV-tk использованы для создания репликативно-дефектных аденовирусов 5 серотипа с целью последующего создания на их основе противоопухолевых препаратов и оценки их безопасности и эффективности в доклинических и клинических испытаниях. Нами была проведена оценка эффективности этих препаратов (Ad-hTERT-HSV-tk и Ad-hTERT-CMV HSV-tk) на панели клеточных линий рака легкого (клетки линий NCI-H1299, NCI-H358, Рис. 21. Пример ганцикловир зависимой гибели опухолевых клеток, зараженных препаратами аденовируса Ad-hTERT-HSV-tk или Приве Ad-hTERT-CMV-HSV-tk.
дены результаты определения жизнеспособность клеток NCI H1299, обработанных препаратом аденовируса Ad-hTERT-HSV-tk (А) и клеток NCI-H358, обработанных аденовирусными препаратами Ad hTERT-HSV-tk или Ad-hTERT CMV-HSV-tk (Б) с указанными множественностями заражения и ганцикловиром в (MOI) указанных концентрациях Ganc).
Рис. 22. Пример влияния совместной обработки опухолевых клеток аденовирусным и химиотерапевтическими препаратами. Клетки линии А549 обрабатывали Ad-hTERT-CMV-HSV-tk в присутствии или отсутствии ганцикловира (Ganc) и химиотерапевтических препаратов в указанных концентрациях. Количество жизнеспособных клеток определяли по их дегидрогеназной активности (MTS-анализ, А) или по количеству внутриклеточного АТФ (Б).
Calu-I и A549). Проведенный анализ показал, что оба препарата при множественности заражения 3-30 бляшкообразующих единиц на клетку вызывают выраженное ганцикловир-зависимое ингибирование роста всех исследованных опухолевых клеток, что свидетельствует об их эффективности (Рис. 21).